Summary
Администрация двух аналогов тимидина, EDU и BrdU, у беременных мышей позволяет проводить анализ клеточного цикла в нервной и клеток-предшественников в эмбриональном мозге мыши. Этот метод полезен для определения последствий генотоксического стресса, в том числе ионизирующего излучения, во время развития мозга.
Abstract
Нейроны коры головного мозга генерируются во время развития мозга от различных видов нервных стволовых и клеток-предшественников (NSPC), которые образуют псевдомногослойный эпителий накладки боковых желудочков эмбрионального мозга. Генотоксические стрессы, такие как ионизирующего излучения, имеют весьма негативное влияние на развивающийся мозг, связанной с высокой чувствительностью NSPC. Выяснение клеточных и молекулярных механизмов, вовлеченных зависит от характеристик ответа на повреждения ДНК этих конкретных типов клеток, что требует точный метод для определения прогрессирования NSPC через клеточного цикла в поврежденной ткани. Здесь показан способ, основанный на последовательных внутрибрюшинных инъекций ОБР и BrdU у беременных мышей и дальнейшего обнаружения этих двух тимидина аналогов в корональных секций эмбрионального мозга. EDU и BrdU оба включены в ДНК реплицирующихся клеток во время S фазы и обнаруживаются двух различных методов (азидных илиспецифическое антитело, соответственно), которые облегчают их одновременное обнаружение. EDU и окрашивание BrdU затем определяются для каждого ядра NSPC в зависимости от удаленности от желудочка перевесом в стандартной области спинной мозге. Таким образом эта двойная техника маркировки позволяет выделить клетки, которые в ходе освоения клеточного цикла от тех, которые активировали контрольную точку клеточного цикла, ведущих к остановке клеточного цикла в ответ на повреждение ДНК.
Пример эксперимента представлена, в котором EDU вводили до облучения и BrdU сразу после и проведение анализа в 4 ч после облучения. Этот протокол обеспечивает точный анализ повреждений ДНК ответ острой из NSPC в зависимости от фазы клеточного цикла, на котором они были облучены. Этот метод легко транспозонов и во многих других системах, чтобы определить воздействие конкретного лечения на прогрессирование клеточного цикла в живых тканях.
Introduction
Во время эмбрионального развития головного мозга, проекционные нейроны коры головного мозга генерируются в вентрикулярной зоне, псевдомногослойный эпителий состоит из различных типов нейронных стволовых и клеток-предшественников (NSPC), что линии боковые желудочки. Среди NSPC, радиальные глиальные клетки (RGC), которые служат нервных стволовых клеток, претерпевают интеркинетической ядерного миграции (INM): они выполняют митоз на поверхности желудочка и S-фазе при базальном предела вентрикулярной зоне (ВЗ) 1, 2,3. Они могут разделить либо симметрично, чтобы генерировать два RGC или асимметрично, чтобы генерировать один RGC и один нейрон или промежуточной клеток-предшественников (IPC) 4, 5. МПК мигрировать в слое покрывающей пролиферирующих называемой субвентрикулярной зоне (SVZ), где после одного последнего симметричного деления они создают два незрелых проекционные нейроны 6-8. Вопреки РГК, МПК не подвергаются INM (обзор в 9). Вновь созданный нейроны Migrели радиально вдоль радиальных волокон через промежуточную зону (ИЗ), чтобы достичь конечного пункта назначения в кортикальной пластинки (СР) 10, 8. Идеальное время всех этих событий имеет важное значение для правильного развития коры. Например переход от распространения в дифференциации нервных населения предшественников контролируется продолжительности G1 фазы 11, 12. Таким образом, удлинение фазе G1 коррелирует с клеточной дифференцировки.
Генотоксический стресс, такие как ионизирующего излучения, строго отрицательно воздействовать на развитие головного мозга (обзор 13). Мы и другие показали, что NSPC весьма склонны к радиационно-индуцированного апоптоза 14 15,16. Ионизирующих излучений вызывать ДНК двойные разрывы цепи, которые являются наиболее серьезный ущерб пролиферирующих клеток. Один из важнейших компонентов повреждения ДНК реагирования (РДР) в велосипедных клеток является активация контрольно-пропускных пунктах клеточного цикла в / M переходов G1 / S или G2 или во время Sфаза (внутри-S контрольно-пропускной пункт) 17-21. Они блокируют прогрессирование клеточного цикла, чтобы предоставить время для ремонта повреждений ДНК или ликвидации слишком поврежденных клеток. Следовательно, гибель клеток, а также ход клеточного цикла задерживается может изменить развитие мозга в ответ на ионизирующего излучения экспозиции 22-24. Таким образом, было интересно разработать метод оценки активацию клеточного цикла контрольно-пропускных пунктов в NSPC в облученной мышиных эмбриональных мозга.
Прогрессирование клеточного цикла следует регулярно использующих включение тимидина аналоговых, 5-бром-2'-дезоксиуридина (BrdU). BrdU вводят во время S-фазе клеточного цикла, когда ДНК репликацию. Использование антитела против BrdU позволяет впоследствии обнаружение клеток, которые были в S фазе в течение импульса BrdU.
Новый аналог тимидина, 5-этинил-2'-дезоксиуридина (ОБР) детектируется посредством флуоресцентного азида. Различные способы обнаружения EDU и В РДУ не перекрестно реагируют 25, что позволяет одновременное обнаружение обоих аналогов тимидина, что полезно для изучения клеточного цикла. Обычно клетки сначала импульсно Edu, а затем импульсно BrdU, где время между обеими инкорпорации длится пару часов 25, 26. Добавление BrdU в культуральной среде, содержащей ОБР приводит к включению предпочтительно BrdU в ДНК с вытеснением ОБР, в то время как одновременное добавление ОБР 25 с эквимол рным или половина эквимол рном BrdU к результатам медиа только в BrdU включения 27. Это упрощает двойной протокол маркировки, устраняя шаги мыть, которые обычно требуют, чтобы удалить первую метку из культуральной среды перед добавлением второй этикетке. Это также относится к особый интерес для в естественных условиях исследования, где шаги стиральные невозможно, чтобы определить точные сроки ввода S фазы или выходе из клеточной популяции.
т "> Недавно был предложен способ маркировки двойного импульса в эмбрионального мозга мыши с использованием ОБР и BrdU 23, 24,22 была разработана для анализа прогрессии клеточного цикла и INM из NSPC после облучения в матке. Более того было показано, что в ходе S фазы, клетки мыши повторить вначале Эухроматин регионы и затем перицентрического гетерохроматина 28,29,30. Интересно, перицентрический гетерохроматина разных хромосом сосредоточены в интерфазовыми ядер с образованием гетерохроматиновых очаги также известный как хромоцентров и легко обнаруживаемый окрашиванием DAPI как яркий очагов. Таким образом, дифференциальные EDU и BrdU окрашивание из эухроматина и хромоцентров помогли нам проанализировать точнее S фазы прогрессирования NSPC.Этот метод позволил демонстрацию очевидного отсутствия G1 / S контрольно-пропускном пункте в НМТП 22-24, что вполне удивительно, так как это контрольно-пропускной пункт, как предполагается, является критическим для стабильности генома. Несколько ехрerimental проекты, основанные на различных комбинациях EDU и BrdU импульсов были использованы для анализа прогрессию клеточного цикла в брюшной и спинной мозге. Здесь мы приведем пример протоколов, позволяющих изучение острого повреждения ДНК NSPC в течение первых 4 часов следующего внутриутробное облучения эмбрионов E14.5 мыши.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Процедуры животных
Этот протокол был разработан в соответствии с Директивой Европейского Совета Сообщества от 24 ноября 1986 года (86/609/EEC) и была одобрена нашей институциональной комитета по защите животных (CETEA-ЦЭА DSV IDF).
- Инъекции с EDU / BrdU и облучения E14.5 беременных мышей (рис. 2а).
- Готовят раствор ОБР при концентрации 1 мг / мл и BrdU в 5 мг / мл в PBS. Выполните внутрибрюшинную инъекции (IP) 100 мкл раствора EDU с помощью иглы 25 G в беременных мышей. 1,5 ч. Через облучать мышей (общее облучение тела) при 0 Гр или 2 Гр (0,6 Гр / мин). Сразу же после инъекции (IP) 200 мкл раствора BrdU с помощью 25 G иглу в беременных мышей.
- Подготовка корональных ломтиками эмбриональных мозгов.
- В 1 час или 4 часа после облучения, усыпить беременных мышей углекислым газом.
- Откройте в животе Кавити в течение трех сантиметров, используя ножницы. Отделите две рога матки от остальной части матки секционирования обе конечности рога. Перенесите рога матки в чашку Петри, содержащую PBS 0,6% глюкозы. Откройте рога матки с пинцетом, чтобы изолировать эмбрионов. Удалить амниотической полости каждого эмбриона с помощью щипцов.
- Проанализируйте эмбриональных головы щипцами и исправить их путем погружения в 4% параформальдегида (PFA, рН = 7,4) O / N при 4 ° С.
- Промыть эмбриональных головы в PBS в течение по крайней мере одной ночи при 4 ° С. Головки могут быть сохранены в PBS в течение нескольких дней.
- Код для вставки головки в парафин с использованием процессора вакуумной пропитки, как указано в таблице 1. Главы вложения также может быть выполнена в соответствии с химической капот для этанола и Ксилен ванны, а затем в печь 65 ° С в течение парафиновые аппликации.
- Подготовка толстые корональные разделы 5-мкм с микротоме.
- Установите на полилизиновых покрытием микроскопа. </ Li>
- Слайды можно хранить при комнатной температуре (RT) в течение нескольких месяцев.
2. EDU / BrdU окрашивание
- Депарафинирование и антиген разоблачение
- Deparaffinize разделы мозга в парафин погружением слайдов в 3 ванны толуола в течение 5 мин.
- Увлажняет в течение 3 мин в 2 ваннами каждого решений уменьшением концентрации этанола следующим образом: этанол 100%, этанол 95%, этанол 70%, а 5 мин в H 2 O. Слайды можно хранить в деионизированной воде в течение нескольких часов.
- Варить ломтики в течение 10 мин в растворе цитрата (10 мМ, рН 6), а затем инкубируют в деионизированной воде в течение 5 мин.
- Окрашивание EDU
- Выполните обнаружение EDU соответствии с протоколом производителя. Проницаемыми клетки с 0,5% тритона Х-100 в ЗФР в течение 10 минут.
- Подготовка 1X буферного ОБР добавку путем разбавления раствора 10X в деионизированной воде. Это решение должно быть недавно сделанный и использовать на одном дау.
- Подготовка EDU реакции коктейль, в том числе EDU Alexa Fluor 488 азида. Важно, чтобы добавить следующие ингредиенты порядке, указанном в таблице 2, в противном случае, реакци не будет действовать в оптимальном режиме. Используйте реакции коктейль Edu течение 15 мин подготовки.
- Снимите буфер пермеабилизации (шаг 2.1.1), затем промыть дважды PBS.
- Добавить 150 мкл EDU реакции коктейля, положить покровное и инкубировать в течение 30 мин в темноте при комнатной температуре.
- Извлечь тестовую коктейль EDU, то мыть один раз с PBS.
- Окрашивание BrdU
- Получают буфер насыщения с 7,5% козьей сывороткой и 7,5% фетальной бычьей сыворотки в PBS. Добавить 150 мкл буфера насыщения на срезах мозга, положить покровное и инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре, чтобы блокировать неспецифическую связывания антитела.
- Удалить покровное. Добавить 150 мкл мышиного антитела против BrdU первичного антитела, разведенного в 1/300 в буфере насыщения, положить покровное и инкубировать O /N при 4 ° С.
- Удалить покровное, затем промыть 3 раза в PBS.
- Добавить 150 мкл козьего антитела против мышиного-Alexa594 вторичного антитела, разбавленного в 1/400 в буфере насыщения, положить покровное и инкубировать 1 час при комнатной температуре.
- Удалить покровное, то мыть один раз в PBS.
- Ядерное окрашивание: добавить 150 мкл 4 ',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) на 1 мкг / мл в PBS, положить покровное и инкубировать в течение 2 мин при комнатной температуре.
- Установите слайды по монтажу среду.
3. Анализ
- Изучить срезы головного мозга под флуоресцентным микроскопом с целью 20X или конфокальной микроскопии и получать изображения в трех каналах (488 нм, 594 нм и UV) в качестве отделяет файлов.
- Стек изображения с программным обеспечением Photoshop.
- Анализ срезы головного мозга в стандартном секторе дорсомедиальной головного стене. Этот сектор составляет 100 мкм в медиальной-поперечный размер и делится на 18 бункеров (или более) из 10 μВысота м в его радиального размера с использованием сетки, наложенной картинки (рис. 1), как описано выше 31.
- Выравнивание сетки, такие как первый бункер находится на поверхности желудочков, с его длинной оси, параллельной желудочка границы. Тогда номер меченого EDU, BrdU и / или пикнотические ядра (соответствующий апоптоза ядер) в каждом мусорном ведре. Число а ядро, расположенный на границе двух бункеров в мусорное ведро, которое содержит его большую часть, или в нижнем бункере, когда ядро занимает равные площади в течение двух бункеров.
- Статистический анализ.
Анализ по меньшей мере два кортикальных срезов за эмбриона. Повторите эксперименты по крайней мере 3 эмбрионов из разных пометов. Результаты должны быть заданы как среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM). Статистический анализ проводятся с GraphPad Prism с помощью двусторонней ANOVA и Бонферрони несколько тестов сравнения posthoc.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В эксперименте, описанном на фиг.2, ОБР вводили 1,5 ч перед облучением и BrdU только после облучения. Четыре типа Затем клетки отличаются в корковых срезов, полученных на 1 или 4 ч после облучения, в соответствии с введением либо ОБР или BrdU, оба или ни (фигуры 2A и 2B). Важно отметить, что ни Эду, ни BrdU включение изменили уровень радиационно-индуцированного апоптоза (данные не представлены). Кроме того, методы окраски разрешить только обнаружение EDU и BrdU включены во время репликации ДНК в S-фазе, но не имеют чувствительности для обнаружения синтез ДНК, связанный с ремонтом даже после облучения. В самом деле, я) ни Эду, ни окрашивание BrdU наблюдался в 1 час сообщению облучения (PI) в клетках кортикальной пластинки, где расположены постмитотических нейроны в G0 фазе и б) количество Эду (+) и / или BrdU (+ ) не был увеличен в облученных по сравнению с unirradiated мозги.
Эду (+) BrdU (+) ядра
Эду (+) BrdU (+) ядра соответствуют NSPC, которые были в S фазе до и после 0 ч PI. Таким образом, они облучали в S фазе. Как показано на фиг 3B и 3C их эухроматин является Эду (+) и может быть также BrdU (+). Их хромоцентров были либо BrdU (+) или BrdU (-). В зависимости от фазы S завершения на время умерщвления фиг.2В показывает, что при 1-часовой PI, ОБР (+) BrdU (+) ядра были локализованы в S фазе бункеров (т.е. бункеров 4 до 10, где NSPC как известно, выполняют этап S 31. Их распределение и число не пострадали от облучения. Это означает, что излучение не вызывает полную блок синтеза ДНК в это время.
Последовательно с базальной к апикальной миграции ядер во время G2 фазе, большинство Эду (+) BrdU (+) ядра NSPC были найдены недалеко от желудочка при 4 ч PI в необлученных Braiнс (рис. 2в). Это не произошло в 2 Гр облучении мозги, в которых ядра остались в фазовых бункеров с, многие из которых были апоптоза. В целом это данные показали, что NSPC облучении в S фазе активации внутри-S контрольно-пропускных пунктов в связи с задержкой INM и гибели клеток.
Эду (+) BrdU (-) ядра
Эду (+) BrdU (-) ядер соответствуют клеток, которые были в S фазе до и не после облучения. Хромоцентров этих ядер ОБР (+), что указывает на клетки в конце S-фазе, когда ОБР вводили мышам (фиг.3А). С G2 / M фазах NSPC Последние 2 часа в развивающихся мозг мыши, Эду (+) BrdU (-) NSPC были в G2 при 0 ч PI. Последовательно, наиболее Эду (+) BrdU (-) ядер были найдены в первом бункере близ желудочка в необлученных мозги на 1 час PI. Это является следствием INM от NSPC, после S фазы, где многие из них формируется типичные фигуры митоза (рис. 2б). В1 час PI, количество ОБР (+) BrdU (-) ядра была значительно снижена при желудочковой поверхности и не митотический показатель не был обнаружен в облученных мозга. Эти данные ясно показывают, что клетки, облученные в G2 активировал G2 / M контрольно-пропускной пункт в течение 1 ч PI. Кроме того, большинство ОБР (+) BrdU (-) этих ядер были апоптоза при 4 ч PI демонстрации того, что NSPC очень радиочувствительны в течение G2 (рис. 2в).
Эду (-) BrdU (-) ядра
Клетки со Эду (-) BrdU (-) ядро соответствуют либо клетки в G0 (главным незрелые нейроны), или NSPC, что осталось в G1 от Edu включения в жертву животных (рис. 3Е). Сравнение между 1 ч и 4 ч в фиг.2С показывает интеркинетической ядерной миграции делает, что ядра, которые были близко к желудочка в G1 на 1 час прошел их апикальных к миграции базальных на 4 ч, в то время как ядра, которые были в S фазе пошел к желудочкаулар поверхность.
Как показано на фиг.2С многие из этих ядер были апоптоза при 4 ч PI. Количество апоптоза Эду (-) BrdU (-) ядер была максимальна вблизи желудочковой поверхности и уменьшается в верхних бункеров. Эти данные свидетельствуют о том, что поэтому радиационно-индуцированный апоптоз происходит в NSPC, которые были облучены во время ранней G1 фазе и / или постмитотических миграции нейронов. С другой стороны, ни один или очень мало апоптоза ядер не были найдены в кортикальной пластинки. Это в соответствии с радиационной стойкости нейронов, которые достигли своего конечного пункта назначения.
Эду (-) BrdU (+) ядра
Эду (-) BrdU (+) ядра соответствуют клеток, вступивших S фазу после облучения. Обычно на 1 час PI, они показали диффузное BrdU маркировки эухроматина, но не хромоцентров. Таким образом, они были в начале фазы S в то время (рис. 3D). На 1 час PI количество и локализация в пределах S PHAsе бункеров Эду (-) BrdU (+) ядра подобна между элементами управления и облученных мозгов. Таким образом запись S-фазы в течение часа PI 1-го не было пострадавших от радиации в мыши развивающегося мозга (рис. 2В). Интересно, что сравнение 1 ч и 4 ч PI в облученных мозгов показывает снижение количества Эду (-) BrdU (+) ядер и большинство из этих ядер были апоптоза в 4 часа PI. Это говорит о том, что клетки, которые вступили S фазу после излучения активизируется внутри S контрольно-пропускные пункты и подверглись апоптозу после (рис. 2С).
Рисунок 1. Анализ мозга разделе корональной части полушария головного мозга эмбрионов E14.5 мыши окрашивали Dapi. EDU и окрашивания BrdU, а также ядерная морфология анализируются в стандартном секторе дорсомедиальной Cerebraл стена с использованием сетки, разделенный на 18 бункеров (или больше), как описано в тексте. Шкала бар:. 20 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Прогрессирование облученного нервных стволовых и клеток-предшественников Рисунок 2. Клеточного цикла (Рисунок из Роке и соавт., Стволовые клетки, 2012 г.). (А) Принципиальная схема опытно-конструкторских и DAPI (синий), Эду (зеленый) и BrdU (красный) модели окрашивания, найденные в корональных корковых ломтиками в 1 и 4 ч PI (2 Гр). . Шкала бар = 20 мкм (B, C) Числа / бункер Эду (+) BrdU (-), Эду (+) BrdU (+), Эду (-) BrdU (+), или Эду (-) BrdU (- ) ядер с нормальной месrphology в необлученных управления (синий) и с нормальным (красный) или апоптоза (пикнотическими, черный) морфологии в облученных (2 Гр) коры на 1 час (В) или 4 часа PI (С). Нет апоптоза ядер не были обнаружены на 1 час PI (B). Статистический анализ проводили с использованием Бонферрони постфактум тесты. Сокращения: BrdU, 5-бром-2'-дезоксиуридина; DAPI, 4'-6-диамидино-2-фенилиндол; EDU, 5-этинил-2'deoxyuridine; И.З., промежуточная зона; СВЗ, субвентрикулярной зона; В.З., желудочковая зона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Дифференциальный EDU и BrdU окрашивание эухроматина и хромоцентров Верхняя панель: Z-Stackконфокальные образы Эду (зеленый), BrdU (красный) окрашивания и ДНК контрастно с DAPI (синий) позволяет обнаруживать хромоцентров как ярко-синего очагов. Окрашивание проводили на зачаточном разделе мозга, собранной на 1 час PI в экспериментах, где EDU был доставлен 1,5 часа до облучения и BrdU 0 час PI (только необлученных управления показана) (Шкала бар: 5 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное рисунке.
Нижние панели показывают примеры 5 разных форм EDU и BrdU окрашивание обнаруженного в корональных срезах мозга. Слияние изображение и отдельные каналы показаны (Шкала бар: 2 мкм):
А) Ядро с Эду (+) хромоцентров и Эду (+) или Эду (-) эухроматин. EDU этом было включено в конце S фазы в процессе репликации перицентрического гетерохроматина: клетки были, ян G2 при 0 ч PI.
Б) Ядро с Эду (+) эухроматин и BrdU (+) chomocenters: EDU была включена в ранней фазе S, когда большинство эухроматина репликации и BrdU была включена в конце S фазы: Клетки в S фазе при 0 ч PI .
С) ядра с Эду (+) BrdU (+) эухроматин и Эду (-) BrdU (-) хромоцентров. EDU и BrdU были включены в первой части S фазы: Клетки в ранней фазе S при 0 ч PI.
D) Ядро с BrdU (+) эухроматин и Эду (-) BrdU (-) хромоцентр. BrdU была включена в начале S фазы. Клетки в конце G1 при 0 ч PI и вошел S фазу после этого.
Е) Ядро с Эду (-) BrdU (-) эухроматин и хромоцентров. Клетки в G0 (незрелые нейроны) или в фазе G1 и не ввести S фазу во EDU и BrdU импульсов.
| Решение | Инкубация | Температура | Давление | Агитация | |
| 1 | Алкоголь 70% | 30 мин | 35 ° C | на | на |
| 2 | алкоголь 95% | 15 мин | 35 ° C | на | на |
| 3 | алкоголь 95% | 30 мин | 35 ° C | на | на |
| 4 | алкоголь 95% | 45 мин | 35 ° C | на | на |
| 5 | алкоголь 100% | 15 мин | 35 ° C | на | на |
| 6 | алкоголь 100% | 30 мин | 35 ° C | на | на |
| 7 | алкоголь 100% | 1 час | 35 ° C | на | на |
| 8 | Толуол 100% | 30 мин | 35 ° C | на | на |
| 9 | Толуол 100% | 45 мин | 35 ° C | на | на |
| 10 | Толуол 100% | 1 час | 35 ° C | на | на |
| 11 | Парафин | 30 мин | 58 ° C | на | на |
| 12 | Парафин | 1 час | 58 ° C | на | на |
| 13 | Парафин | 1 час | 58 ° C | на | на |
| 14 | Парафин | 1,5 ч. | 58 ° C | на | на |
Стол1. Программа процессора Вакуумная инфильтрация для парафин.
| Компоненты реакции на 1 слайд | |
| 1X EDU реакционного буфера | 128,64 мкл |
| CuSO 4 | 6 мкл |
| EDU Alexa Fluor азид | 0,36 мкл |
| 1X EDU буфер Реакция добавка | 15 мкл |
| Общий объем | 150 мкл |
Таблица 2. EDU реакции коктейли.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Схема эксперимента описана здесь на основе включения ОБР 1,5 ч перед облучением и включение BrdU сразу после облучения позволило демонстрацией того, что NSPCs способны активировать S и G2 / M контрольные точки, но не контрольных точек G1 / S в течение 1-го часа после генотоксичным напряжение в мозг плода мыши. Мы выполнили другие эксперименты, в которых EDU была введена в разное время после облучения и BrdU, всего в 1 час до жертвоприношений мышей, что позволяет нам специально оценить скорость S фазы записи. Эти эксперименты показали, что NSPC не активировать G1 / S арест после генотоксического стресса в естественных условиях 22,23.
Таким образом, выбор между репарации ДНК и апоптоза не происходит в G1 / S контрольно-пропускном пункте поднимая вопрос о характере механизмов гарантируя стабильность генома в этих клетках.
Протокол легко и быстро. Отличаетсяшаги не представляют очевидную трудность. Этот метод является альтернативой использованию хлор-дезоксиуридина (CldU) и йод-дезоксиуридина (ПИН), который, как было показано перекрестной реакции 32.
Необходима широкая панель приложений можно считать, как протокол легко гибкими и адаптироваться к несколько биологических вопросов. Примеры изменений предлагается в Роке и сотрудников 23, Этьен и сотрудники 22, и у Руссо с сотрудниками 24. Это может быть также в сочетании с обнаружением иммунофлюоресценции нескольких маркеров или белков, участвующих в реакции на повреждения ДНК, например клеток. Обратите внимание, что в этом случае, как BrdU и обнаружение ОБР может быть выполнена с различными флуорофоров, которые коммерциализированных, в пользу иммунной обнаружение других маркеров.
ОБР и BrdU в естественных условиях введения в NSPC также могут быть использованы в сортировки клеток с помощью проточной цитометрии для дальнейшего биохимического анализа. Наконец, тыс.является способ может осуществляться следить за прогрессирование клеточного цикла NSPC в различных типах мутантных мышей или после других видов генотоксических напряжений (кроме ионизирующего излучения) или любой другой обработки, влияющих прогрессию клеточного цикла. Кроме того, он может быть легко адаптированы к другим тиражирование тканей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют конфликта интересов.
Acknowledgments
Исследование приводит к этим результатам получил финансирование от Седьмой рамочной программе Европейского союза (FP7/2007-2013) под грантового соглашения N ° 323267 от Электрисите де Франс (EDF) и от Национальное агентство De La Recherche - Sante-ENVIRONNEMENT др. Здоровье-Travail (ANR-SEST, Neurorad).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EdU | Life Technologies | A10044 | 1 mg/ml |
| BrdU | Life Technologies | B5002 | 5 mg/ml |
| IBL 637 | CIS BIO International | ||
| Tissu Tek VIP | Leica | ||
| Microtome | Leica | RM 2125 RT | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Click-iT EdU Alexa 488 imaging kit | Life Technologies | C10083 | |
| Anti-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1/300 |
| Goat anti mouse-Alex594 | Life Technologies | A11001 | 1/400 |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Polysine slide | Thermo scientific | J2800AMNZ | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-068 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Microscope BX51 | Olympus | ||
| Confocal microscope SPE | Leica | ||
| Prism software | Graphpad | Version 5.0c | |
| Photoshop software | Adobe |
References
- Rakic, P. Specification of cerebral cortical areas. Science. 241, 170-176 (1988).
- Sauer, F. Mitosis in he neural tube. J Comp Neurol. , 377-399 (1935).
- Taverna, E., Huttner, W. B. Neural progenitor nuclei IN motion. Neuron. 67, 906-914 (2010).
- Committee, B. Embryonic vertebrate central nervous system: revised terminology. Anat Rec. 166, 257-261 (1970).
- Bystron, I., Blakemore, C., Rakic, P. Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited. Nature Reviews. Neuroscience. 9, 110-122 (2008).
- Miyata, T., et al. Asymmetric production of surface-dividing and non-surface-dividing cortical progenitor cells. Development. 131, 3133-3145 (2004).
- Haubensak, W., Attardo, A., Denk, W., Huttner, W. B. Neurons arise in the basal neuroepithelium of the early mammalian telencephalon: a major site of neurogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 3196-3201 (2004).
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7, 136-144 (2004).
- Merot, Y., Retaux, S., Heng, J. I. Molecular mechanisms of projection neuron production and maturation in the developing cerebral cortex. Seminars in Cell & Developmental Biology. 20, 726-734 (2009).
- Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex. Trends Neurosci. 27, 392-399 (2004).
- Salomoni, P., Calegari, F. Cell cycle control of mammalian neural stem cells: putting a speed limit on G1. Trends Cell Biol. 20, 233-243 (2010).
- Calegari, F., Haubensak, W., Haffner, C., Huttner, W. B. Selective lengthening of the cell cycle in the neurogenic subpopulation of neural progenitor cells during mouse brain development. J Neurosci. 25, 6533-6538 (2005).
- Andres-Mach, M., Rola, R., Fike, J. R. Radiation effects on neural precursor cells in the dentate gyrus. Cell Tissue Res. 331, 251-262 (2008).
- Semont, A., et al. Involvement of p53 and Fas/CD95 in murine neural progenitor cell response to ionizing irradiation. Oncogene. 23, 8497-8508 (2004).
- Nowak, E., et al. Radiation-induced H2AX phosphorylation and neural precursor apoptosis in the developing brain of mice. Radiat Res. 165, 155-164 (2006).
- Gatz, S. A., et al. Requirement for DNA ligase IV during embryonic neuronal development. J Neurosci. 31, 10088-10100 (2011).
- Denekamp, J. Cell kinetics and radiation biology. International Journal of Radiation Biology and Related Studies in Physics, Chemistry, and Medicine. 49, 357-380 (1986).
- Hartwell, L. H., Weinert, T. A. Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events. Science. 246, 629-634 (1989).
- Weinert, T. A., Hartwell, L. H. Characterization of RAD9 of Saccharomyces cerevisiae and evidence that its function acts posttranslationally in cell cycle arrest after DNA damage. Mol Cell Biol. 10, 6554-6564 (1990).
- Tolmach, L. J., Jones, R. W., Busse, P. M. The action of caffeine on X-irradiated HeLa cells. I. Delayed inhibition of DNA synthesis. Radiat Res. 71, 653-665 (1977).
- Painter, R. B., Young, B. R. Radiosensitivity in ataxia-telangiectasia: a new explanation. Proc Natl Acad Sci U S A. 77, 7315-7317 (1980).
- Etienne, O., Roque, T., Haton, C., Boussin, F. D. Variation of radiation-sensitivity of neural stem and progenitor cell populations within the developing mouse brain. Int J Radiat Biol. 88, 694-702 (2012).
- Roque, T., et al. Lack of a p21waf1/cip -dependent G1/S checkpoint in neural stem and progenitor cells after DNA damage in vivo. Stem Cells. 30, 537-547 (2012).
- Rousseau, L., et al. In vivo importance of homologous recombination DNA repair for mouse neural stem and progenitor cells. PLoS One. 7, 12 (2012).
- Bradford, J. A., Clarke, S. T. Dual-pulse labeling using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) and 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) in flow cytometry. Curr Protoc Cytom. , (2011).
- Deckbar, D., et al. The limitations of the G1-S checkpoint. Cancer Res. 70, 4412-4421 (2010).
- Manual, Click-iT EdU Imaging Kit. , http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp10338.pdf (2011).
- Weidtkamp-Peters, S., Rahn, H. P., Cardoso, M. C., Hemmerich, P. Replication of centromeric heterochromatin in mouse fibroblasts takes place in early, middle, and late S phase. Histochem Cell Biol. 125, 91-102 (2006).
- Wu, R., Terry, A. V., Singh, P. B., Gilbert, D. M. Differential subnuclear localization and replication timing of histone H3 lysine 9 methylation states. Mol Biol Cell. 16, 2872-2881 (2005).
- Wu, R., Singh, P. B., Gilbert, D. M. Uncoupling global and fine-tuning replication timing determinants for mouse pericentric heterochromatin. J Cell Biol. 174, 185-194 (2006).
- Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness Jr, V. S. The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15, 6046-6057 (1995).
- Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. J Vis Exp. , (2010).
