Summary
Administration af to analoger af thymidin, Edu og BrdU, i gravide mus tillader analyse af cellecyklus progression i neurale og stamceller i embryonale mus hjernen. Denne metode er nyttig til at bestemme virkningerne af genotoksisk stress, herunder ioniserende stråling under hjernens udvikling.
Abstract
Neuroner i hjernebarken genereres under hjernens udvikling af forskellige typer af neurale stam-og progenitorceller (NSPC), som danner en pseudostratified epitel foring laterale ventrikler i den embryonale hjerne. Genotoksiske belastninger, såsom ioniserende stråling, har meget skadelige virkninger på hjernens udvikling relateret til den høje følsomhed NSPC. Belysning af de cellulære og molekylære mekanismer, der er involveret afhænger karakterisering af DNA beskadigelse respons af disse særlige typer af celler, som kræver en nøjagtig metode til at bestemme NSPC progression gennem cellecyklus i det beskadigede væv. Her er vist en metode baseret på successive intraperitoneale injektioner af edu og BrdU i gravide mus og yderligere påvisning af disse to thymidinanaloger i kronafsnit af embryonale hjernen. Edu og BrdU begge inkorporeret i DNA af replikerende celler under S-fasen og er opdaget af to forskellige teknikker (azid elleret specifikt antistof, henholdsvis), som letter deres samtidige detektion. Edu og BrdU farvning derefter bestemmes for hver NSPC kerne i funktion af dets afstand fra den ventrikulære margen i en standard region af dorsale telencephalon. Således denne dobbelte mærkning teknik gør det muligt at skelne mellem celler, som skred gennem cellecyklussen fra dem, der har aktiveret en cellecyklus checkpoint fører til cellecyklus i respons på DNA beskadigelse.
Et eksempel på eksperiment præsenteret, hvor Edu blev injiceret før bestråling og BrdU umiddelbart efter og analyser udføres inden 4 timer efter bestråling. Denne protokol giver en nøjagtig analyse af den akutte DNA beskadigelse respons NSPC som funktion af fasen af cellens cyklus, hvor de er blevet bestrålet. Denne metode er let overføres til mange andre systemer med henblik på at fastslå virkningen af en bestemt behandling på cellecyklusprogression i levende væv.
Introduction
Under fosterudviklingen hjernen, er projektion neuroner i hjernebarken genereret i ventrikulær zone, en pseudostratified epithel er sammensat af forskellige typer af neurale stam-og progenitorceller (NSPC) at linjer laterale ventrikler. Blandt NSPC de radiale glialceller (RGC), der tjener som neurale stamceller undergår interkinetic nuklear migration (INM): de udfører mitose ved overfladen af ventriklen og S-fase ved den basale grænse af ventrikulær zone (VZ) 1, 2,3. De kan dele enten symmetrisk til at generere to RGC eller asymmetrisk for at generere en RGC og en neuron eller en mellemliggende progenitorcelle (IPC) 4, 5. IPC migrere til en overliggende prolifererende lag kaldet subventricular zone (SVZ), hvor efter en sidste symmetrisk division, de genererer to umodne projektion neuroner 6-8. I modsætning til RGC, behøver IPC ikke undergår INM (revideret i 9). Nyligt genererede neuroner migrspiste radialt langs de radiale fibrene gennem den mellemliggende zone (IZ) for at nå deres endelige bestemmelsessted i det kortikale plade (CP) 10, 8. Den perfekte timing af alle disse begivenheder er afgørende for en korrekt kortikal udvikling. For eksempel skifte fra proliferation til differentiering af neurale progenitorpopulationer styres af G1 fasevarighed 11, 12. Forlængelse af G1 fasen korrelerer således med celledifferentiering.
Genotoksisk stress, såsom ioniserende stråling, alvorligt forringe hjernens udvikling (revideret i 13). Vi og andre har vist, at NSPC er meget tilbøjelige til stråling-induceret apoptose 14, 15,16. Ioniserende stråling inducerer DNA dobbelt streng pauser, der er de mest alvorlige skader på prolifererende celler. En væsentlig bestanddel af DNA skade responset (DDR) i cykling celler er aktiveringen af cellecykluskontrolpunkter ved G1 / S eller G2 / M overgange eller under Sfase (intra-S checkpoint) 17-21. De blokerer cellecyklusprogression at give tid til DNA-beskadigelse reparation eller fjernelse af for beskadigede celler. Derfor kan celledød samt forsinket cellecyklusprogression ændre hjernens udvikling som reaktion på ioniserende stråling 22-24. Det var derfor interessant at udvikle en metode til at vurdere aktiveringen af cellecykluskontrolpunkter i NSPC i det bestrålede mus embryonale hjerne.
Progression af cellecyklus rutinemæssigt fulgt ved hjælp af inkorporering af en thymidin-analog, 5-brom-2'-deoxyuridin (BrdU). BrdU inkorporeret under S-fasen af cellecyklussen, da DNA replikeres. Anvendelsen af et antistof mod BrdU tillader derefter påvisning af celler, der var i S-fase under pulsen BrdU.
En ny thymidinanalog, 5-ethynyl-2'-deoxyuridin (edu) detekteres af en fluorescerende azid. De forskellige måder at opdage Edu og B RDU ikke krydsreagerer 25 muliggør samtidig påvisning af såvel thymidinanaloger, hvilket er nyttigt til undersøgelse af cellecyklusprogression. Normalt cellerne først pulses med edu og derefter pulset med BrdU, hvor tiden mellem de to incorporations varer par timer 25, 26. Tilsætning af BrdU i dyrkningsmedier indeholdende edu resulterer i fortrinsvis inkorporering af BrdU i DNA'et med undtagelse af edu mens samtidig tilsætning af edu 25 med ækvimolær eller halv ækvimolær BrdU til medierne resulterer kun BrdU inkorporering 27. Dette forenkler den dobbelte mærkning protokol ved at fjerne de vasketrin, der normalt kræves for at fjerne den første etiket fra dyrkningsmediet før tilsætning af det andet mærke. Dette er også en særlig interesse for in vivo-undersøgelse, hvor vasketrinene ikke er muligt, at bestemme den præcise timing af ind-eller udrejse af cellepopulation S-fasen.
t "> For nylig en metode til dual-pulsmærkning i embryonale mus hjerne ved hjælp af Edu og BrdU 23, 24,22 er blevet udviklet til at analysere cellecyklusprogression og INM af NSPC efter in utero bestråling. Desuden er det blevet påvist, at under S-fasen, museceller replikerer først de eukromatin regioner og derefter pericentric heterochromatin 28,29,30. Interessant, at pericentric heterochromatin af forskellige kromosomer grupperet i interphasic kerner danner heterochromatic foci også kendt som chromocenters og let kan påvises ved DAPI farvning så lyse foci. Derfor differential edu og BrdU farvninger af eukromatin og chromocenters hjulpet os til at analysere mere præcist S fase progression af NSPC.Denne fremgangsmåde tillod påvisning af den tilsyneladende mangel på G1 / S checkpoint i NSCP 22-24, hvilket er ganske overraskende, da dette kontrolpunkt formodes at være kritisk for genom stabilitet. Adskillige experimental design baseret på forskellige kombinationer af edu og BrdU pulser er blevet anvendt til at analysere cellecyklusprogression i den ventrale og dorsale telencephalon. Her giver vi et eksempel på protokoller der tillader undersøgelse af den akutte DNA-skader i NSPC inden for de første 4 timer efter in utero bestråling af E14.5 musefostre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Dyreforsøg
Denne protokol er designet i overensstemmelse med De Europæiske Fællesskabers direktiv af November 24, 1986 (86/609/EØF), og er blevet godkendt af vores institutionelle udvalg om dyrevelfærd (CETEA-CEA DSV IDF).
- Injektioner med Edu / BrdU og bestråling af E14.5 gravid mus (figur 2A).
- Forbered en opløsning af Edu ved 1 mg / ml og BrdU ved 5 mg / ml i PBS. Udfør en intra-peritoneal injektion (IP) af 100 ul Edu løsning ved hjælp af en 25 G kanyle i gravide mus. 1,5 timer senere bestråle mus (helkropsbestråling) ved 0 Gy eller 2 Gy (0,6 Gy / min.) Umiddelbart efter injiceres (IP) 200 pi BrdU opløsning under anvendelse af en 25 G nål ind i de drægtige mus.
- Fremstilling af koronal skiver af embryonale hjerner.
- Efter 1 time eller 4 timer efter bestråling, aflive de drægtige mus af kuldioxid.
- Åbn abdominal cavity over tre centimeter med en saks. Adskille de to Uterushornene fra resten af livmoderen ved at inddele begge enderne af hornene. Overfør Uterushornene i en petriskål indeholdende PBS 0,6% glucose. Åbn Uterushornene med pincet for at isolere embryonerne. Fjern fosterhinden af hvert foster ved hjælp af pincet.
- Dissekere embryonale hoveder med pincet og løse dem ved nedsænkning i 4% paraformaldehyd (PFA, pH = 7,4) O / N ved 4 ° C.
- Skyl embryonale hoveder i PBS i mindst én nat ved 4 ° C. Hoveder kan opbevares i PBS i flere dage.
- Integrer hoveder i paraffin ved hjælp af et vakuum infiltration processor som angivet i tabel 1.. Heads indlejring kan også udføres under en kemisk hætte til ethanol og xylen bade, og derefter i en 65 ° C ovn i paraffin bade.
- Forbered 5-um tyk kronafsnit med en microtome.
- Montere på polylysin-coatede objektglas. </ Li>
- Slides kan opbevares ved stuetemperatur (RT) i flere måneder.
2.. Edu / BrdU Farvning
- Afparaffinering og antigen demaskering
- Afparaffiniser paraffinindstøbte hjerne sektioner ved nedsænkning af dias i 3 bade toluen i 5 min.
- Rehydrere 3 min i 2 bade af hver opløsninger med faldende ethanolkoncentrationen som følgende: ethanol 100%, ethanol 95%, ethanol 70%, og 5 min i H 2 O. Slides kan holdes i deioniseret vand i flere timer.
- Kog udsnit til 10 minutter i citratopløsning (10 mM, pH 6), og derefter inkuberes i deioniseret vand i 5 minutter.
- Edu farvning
- Udfør edu påvisning ifølge fabrikantens protokol. Permeabilisere celler med 0,5% triton X-100 i PBS i 10 min.
- Forbered 1X edu buffer additiv ved at fortynde 10X opløsning i deioniseret vand. Denne opløsning skal være frisk lavet og bruges på samme day.
- Forbered Edu reaktion cocktail, herunder Edu Alexa Fluor 488 azid. Det er vigtigt at tilføje ingredienserne i den rækkefølge, der er anført i tabel 2, ellers vil reaktionen ikke fortsætte optimalt. Brug Edu reaktion cocktail inden for 15 minutter forberedelse.
- Fjern permeabilization buffer (trin 2.1.1), vask derefter to gange med PBS.
- Tilføj 150 pi uddan reaktion cocktail, sætte et dækglas, og inkuberes i 30 minutter i mørke ved stuetemperatur.
- Fjern Edu reaktion cocktail, vask derefter en gang med PBS.
- BrdU farvning
- Forbered mætningsbuffer med 7,5% gedeserum og 7,5% kalvefosterserum i PBS. Tilføj 150 pi mætningsbuffer på hjernesnit, sætte et dækglas og inkuberes i 1 time ved stuetemperatur for at blokere ikke-specifik antistofbinding.
- Fjern dækglasset. Tilføj 150 pi muse-anti-BrdU primære antistof fortyndet ved 1/300 i mætningsbuffer, sætte et dækglas og inkuber O /N ved 4 ° C.
- Fjern dækglasset, derefter vaskes 3 gange i PBS.
- Tilføj 150 pi gede-anti-muse-Alexa594 sekundært antistof fortyndet 1/400 i mætningsbuffer, sætte et dækglas og inkuberes i 1 time ved stuetemperatur.
- Fjern dækglasset, derefter vaskes en gang i PBS.
- Nuklear farvning: Tilsæt 150 pi 4 ',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) ved 1 ug / ml i PBS, sætte et dækglas og inkuberes i 2 minutter ved stuetemperatur.
- Monter dias i montage medium.
3. Analyse
- Undersøg hjerne sektioner under et fluorescens mikroskop med en 20X objektiv eller en konfokal mikroskop og erhverve billeder i tre kanaler (488 nm, 594 nm og UV), som adskiller filer.
- Stak billeder med Photoshop software.
- Analyser hjernesnit i en standard sektor af dorsomedial cerebral væg. Denne sektor er 100 um i sin medial-lateral dimension og er opdelt i 18 beholdere (eller mere) på 10 μm højde i dens radiale dimension ved hjælp af et gitter oven på billeder (figur 1) som tidligere beskrevet 31.
- Juster gitteret som det første bin er på den ventrikulære overflade, med sin lange akse parallelt med ventrikulære grænse. Så nummerere det mærkede edu BrdU og / eller pyknotiske kerner (svarende til apoptotiske kerner) i hvert bin. Antallet en kerne er placeret på grænsen af to placeringer i skraldespanden, som indeholder dens større del, eller i den nederste bin, når kernen optager lige områder inden for de to siloer.
- Statistisk analyse.
Analyser mindst to kortikale skiver pr foster. Gentag eksperimenter på mindst 3 embryoner fra forskellige kuld. Resultaterne bør gives som gennemsnit ± standardafvigelse på middelværdien (SEM). Statistiske analyser udført med Graphpad Prism hjælp af to-vejs ANOVA og Bonferroni multiple sammenligning posthoc tests.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I forsøget, der er beskrevet i figur 2 blev edu administreres 1,5 time før bestråling og BrdU lige efter bestråling. Fire typer af celler blev derefter adskilles i de cortikale skiver fremstillet på 1 eller 4 timer efter bestråling i henhold til inkorporering af enten edu eller BrdU, begge eller ingen (figur 2A og 2B). Vigtigere er det, hverken edu eller BrdU inkorporering ændret stråling-induceret apoptose (data ikke vist). Desuden farvningsfremgangsmåder kun tillader påvisning af EDU og BrdU inkorporeret under DNA-replikation i S-fase, men ikke har følsomheden til at detektere DNA-syntese, der er forbundet med reparation, selv efter bestråling. Faktisk i) hverken edu eller BrdU farvning blev observeret ved 1 time efter bestråling (PI) i celler af kortikale plade, hvor der er placeret postmitotiske neuroner ved G0 fase og ii) antallet af edu (+) og / eller BrdU (+ ) blev ikke forøget i bestrålet i forhold til unirradiated hjerner.
Edu (+) BrdU (+) kerner
Edu (+) BrdU (+) kerner svarer til NSPC der var i S-fasen før og efter 0 hr PI. De blev således bestrålet i S-fase. Som vist i figur 3B og 3C deres euchromatin er edu (+) og kan også være BrdU (+). Deres chromocenters var enten BrdU (+) eller BrdU (-). Afhængigt af S-fase er afsluttet på tidspunktet for aflivning Figur 2B viser, at efter 1 time PI blev edu (+) BrdU (+) kerner lokaliseret i S-fase placeringer (dvs. siloer 4 til 10, hvor NSPC er kendt for at udføre S fase 31. distribution og tal ikke var påvirket af bestråling. Dette antyder, at stråling ikke inducerer en komplet blok af DNA-syntese på dette tidspunkt.
Konsekvent med den basale til apikale nuklear migration under G2 fase blev de fleste Edu (+) BrdU (+) kerner af NSPC fundet nær ventrikel på 4 timer PI i ubestrålet brains (Figur 2C). Dette skete ikke i 2 Gy bestrålede hjerner i hvilke kerner forblev i S-fase siloer, mange af dem er apoptotiske. Tilsammen viste disse data, at NSPC bestrålet i S-fasen aktiveret intra-S checkpoints i forbindelse med forsinket INM og celledød.
Edu (+) BrdU (-) kerner
Edu (+) BrdU (-) kerner svarer til celler, der var i S-fase før og ikke efter bestråling. Chromocenters disse kerner er edu (+) indikerer, at cellerne var i slutningen af S-fasen, når edu blev injiceret i mus (fig. 3A). Da G2 / M faser af NSPC sidste 2 hr i udviklingslandene mus hjernen, Edu (+) BrdU (-) NSPC var i G2 ved 0 hr PI. Konsekvent fleste Edu (+) BrdU (-) kerner blev fundet i første bin nær ventriklen i ubestrålet hjerner på 1 time PI. Dette er en konsekvens af INM af NSPC, efter S-fasen, hvor mange af dem dannede typiske mitotiske tal (figur 2B). På1 time PI, antallet af edu (+) BrdU (-) kerner blev reduceret signifikant ved den ventrikulære overflade og ikke mitotiske tal var påviselig i bestrålede hjerner. Disse data viser klart, at celler bestrålet i G2 aktiveret G2 / M checkpoint inden for 1 hr PI. Endvidere er de fleste uddan (+) BrdU (-) af disse kerner apoptotiske på 4 timer PI viser, at NSPC er meget radiosensitive i G2 (figur 2C).
Edu (-) BrdU (-) kerner
Celler med en Edu (-) BrdU (-) kerne svarer til enten celler i G0 (hovedsagelig umodne neuroner), eller NSPC der forblev i G1 fra Edu iblanding til dyr offer (figur 3E). Sammenligning mellem 1 time og 4 timer i figur 2C viser interkinetic nuklear migration gør at kerner, der var tæt på ventriklen i G1 på 1 time gennemgik deres apikal til basal migration på 4 timer, mens kerner, der var i S-fasen gik mod ventricular overflade.
Som vist i figur 2C mange af disse kerner apoptotiske på 4 timer PI. Antallet af apoptotiske Edu (-) BrdU (-) kerner var maksimal nær den ventrikulære overflade og fald i øverste placeringer. Disse data tyder derfor på, at stråling-induceret apoptose forekom i NSPC, der er blevet bestrålet i begyndelsen G1 fase og / eller post-mitotiske migrerer neuroner. Derimod blev ingen eller meget få apoptotiske kerner findes i kortikale plade. Dette er i overensstemmelse med den modstand af neuroner, der har nået deres endelige bestemmelsessted stråling.
Edu (-) BrdU (+) kerner
Edu (-) BrdU (+) kerner svarer til celler, der trådte S fasen efter bestråling. Typisk efter 1 time PI, viste de et diffust BrdU mærkning af eukromatin, men ikke chromocenters. Således var de i begyndelsen af S-fasen dengang (figur 3D). Ved 1 hr PI antal og lokalisering inden for S struke siloer af Edu (-) BrdU (+) kerner er ens mellem kontrol og bestrålede hjerner. Således indgang S-fase under 1. hr PI ikke var påvirket af stråling i mus hjernens udvikling (figur 2B). Interessant sammenligning af 1 time og 4 timer PI i bestrålede hjerner viser et fald i antallet af Edu (-) BrdU (+) kerner og de fleste af disse kerner var apoptotic på 4 timer PI. Dette tyder på, at celler, der trådte S fase efter stråling aktiveret intra-S checkpoints og gennemgik apoptose derefter (figur 2C).
Figur 1.. Analyse af Brain sektion Koronale afsnit af hjernehalvdel af E14.5 museembryoer farves med Dapi. Edu og BrdU farvning samt kernemorfologi analyseres i en standard del af dorsomedial cerebral væggen ved hjælp af et gitter opdelt i 18 beholdere (eller mere) som beskrevet i teksten. Skala bar:. 20 um Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Cellecyklusprogression af bestrålet neurale stamceller og progenitorceller (figur Roque et al. Stamceller 2012). (A) Skematisk diagram af det eksperimentelle design og DAPI (blå), Edu (grøn), og BrdU (rød) farvningsmønstre fundet i koronale kortikale skiver på 1 og 4 hr PI (2 Gy). . Skala bar = 20 m (B, C) Tal / bin uddan (+) BrdU (-), Edu (+) BrdU (+), Edu (-) BrdU (+) eller Edu (-) BrdU (- ) kerner med en normal morphology i bestrålet kontrol (blå) og med en normal (rød) eller apoptotiske (pyknotiske, sort) morfologi i bestrålede (2 Gy) cortex på 1 time (B) eller 4 timer PI (C). Ingen apoptotiske kerner blev påvist på 1 time PI (B). Statistisk analyse blev udført under anvendelse af Bonferroni post-hoc test. Forkortelser: BrdU, 5-brom-2'-deoxyuridin; DAPI, 4'-6-diamidino-2-phenylindol; Edu 5-ethynyl-2'deoxyuridine; IZ, mellemliggende zone; SVZ, subventricular zone; VZ, ventrikulær zone. Klik her for at se en større version af dette tal.
. Figur 3. Differential Edu og BrdU farvning af eukromatin og chromocenters Overpanel: Z-stackkonfokal billeder af Edu (grøn), BrdU (rød) farvning og DNA modfarvet med DAPI (blå), der tillader påvisning af chromocenters som lyse blå foci. Farvninger blev udført på en embryonale hjerne sektion indsamles på 1 time PI i eksperimenter, hvor Edu blev leveret 1,5 time før bestråling og BrdU 0 hr PI (kun ubestrålet kontrol er vist) (skala bar: 5 m). Klik her for at se en større version af dette tal.
Bottom paneler viser eksempler på de 5 forskellige mønstre af edu og BrdU farvning påvist i koronale hjernen skiver. Flet billede og enkeltværelser kanaler vises (Scale bar: 2 um):
A) Nucleus med Edu (+) chromocenters og Edu (+) eller Edu (-) eukromatin. Edu er således indarbejdet i sen S fase under replikering af pericentric heterochromatin: cellerne var jegn G2 ved 0 hr PI.
B) Nucleus med Edu (+) eukromatin og BrdU (+) chomocenters: Edu er blevet indarbejdet i den tidlige S fase, hvor de fleste af eukromatin replikeres og BrdU er blevet indarbejdet i slutningen af S-fasen: Cellerne blev i S-fasen ved 0 hr PI .
C) Nucleus med Edu (+) BrdU (+) eukromatin og Edu (-) BrdU (-) chromocenters. Edu og BrdU er blevet indarbejdet i den første del af S-fasen: Cellerne var i begyndelsen af S-fasen ved 0 hr PI.
D) Nucleus med BrdU (+) eukromatin og Edu (-) BrdU (-) chromocenter. BrdU er blevet indarbejdet i begyndelsen af S-fasen. Cellerne var i slutningen af G1 ved 0 hr PI og trådte S fasen derefter.
E) Nucleus med Edu (-) BrdU (-) eukromatin og chromocenters. Cellerne var i G0 (umodne neuroner), eller i G1 fase og S-fasen ikke ind under edu og BrdU pulser.
| Opløsning | Inkubation | Temperatur | Pressure | Agitation | |
| 1 | Alkohol 70% | 30 min | 35 ° C | på | på |
| 2 | alkohol 95% | 15 min | 35 ° C | på | på |
| 3 | alkohol 95% | 30 min | 35 ° C | på | på |
| 4. | alkohol 95% | 45 min | 35 ° C | på | på |
| 5. | alkohol 100% | 15 min | 35 ° C | på | på |
| 6 | alkohol 100% | 30 min | 35 ° C | på | på |
| 7 | alkohol 100% | 1 time | 35 ° C | på | på |
| 8. | Toluen 100% | 30 min | 35 ° C | på | på |
| 9 | Toluen 100% | 45 min | 35 ° C | på | på |
| 10 | Toluen 100% | 1 time | 35 ° C | på | på |
| 11 | Paraffin | 30 min | 58 ° C | på | på |
| 12 | Paraffin | 1 time | 58 ° C | på | på |
| 13 | Paraffin | 1 time | 58 ° C | på | på |
| 14 | Paraffin | 1,5 time | 58 ° C | på | på |
Bord1.. Vacuum infiltration processor program for paraffinfiksering.
| Reaction komponenter til 1 dias | |
| 1X Edu Reaktionsbufferen | 128,64 pi |
| CuSO4 | 6 pi |
| Edu Alexa Fluor azid | 0,36 pi |
| 1X Edu Reaktionsbuffer tilsætningsstof | 15 pi |
| Samlet volumen | 150 pi |
Tabel 2.. Edu reaktions cocktails.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det eksperimentelle design her beskrevet baseret på inkorporering af Edu 1,5 time før bestråling og inkorporering af BrdU umiddelbart efter bestråling tilladt demonstrationen som NSPC-koder er i stand til at aktivere S og G2 / M checkpoints men ikke G1 / S kontrolpost i 1. timer efter en genotoksisk stress i føtal musehjerne. Vi har udført andre forsøg, hvor Edu er blevet indsprøjtet på forskellige tidspunkter efter bestråling og BrdU, bare 1 time før mus ofre, hvilket giver os mulighed for specifikt at værdsætte hastigheden af S-fasen indrejse. Disse eksperimenter har vist, at NSPC ikke aktiverer en G1 / S anholdelse efter et genotoksisk stress in vivo 22,23.
Derfor har valget mellem DNA-reparation og apoptose ikke forekomme på G1 / S checkpoint rejser spørgsmålet om karakteren af de mekanismer guarantying genom stabilitet i disse celler.
Protokollen er nemt og hurtigt. De forskelligetrin udgør nogen indlysende vanskeligheder. Denne teknik er et alternativ til anvendelsen af chlor-deoxyuridin (CldU) og iod-deoxyuridin (IDU), der har vist sig at krydsreagere 32.
Et bredt panel af ansøgningerne kan betragtes, som protokol er let fleksibel og kan tilpasses til flere biologiske spørgsmål. Foreslås Eksempler på ændringer i Roque og samarbejdspartnere 23, Etienne og samarbejdspartnere 22, og i Rousseau og samarbejdspartnere 24. Det kan også kombineres med immunfluorescens påvisning af flere cellemarkører eller proteiner involveret i DNA beskadigelse respons for eksempel. Bemærk, at i dette tilfælde kan både BrdU og uddannelse detektion udføres med forskellige fluoroforer, der kommercialiseres at favorisere immunpåvisning af andre markører.
Edu og BrdU in vivo iblanding i NSPC kunne også anvendes i celle sortering ved flowcytometri til yderligere biokemiske analyser. Endelig ther metode kan udføres for at overvåge cellecyklusprogression af NSPC i forskellige typer af mutantmus eller efter andre typer af genotoksiske belastninger (undtagen ioniserende stråling) eller enhver anden behandling, der påvirker cellecyklusprogression. Desuden er det let kunne tilpasses til andre replikerende væv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Den forskning, der fører til disse resultater, har modtaget støtte fra Den Europæiske Union syvende rammeprogram (FP7/2007-2013) under tilskudsaftale n ° 323.267, fra Electricité de France (EDF) og fra l'Agence Nationale de la Recherche - Santé-Environnement et Santé-Travail (ANR-SEST, Neurorad).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EdU | Life Technologies | A10044 | 1 mg/ml |
| BrdU | Life Technologies | B5002 | 5 mg/ml |
| IBL 637 | CIS BIO International | ||
| Tissu Tek VIP | Leica | ||
| Microtome | Leica | RM 2125 RT | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Click-iT EdU Alexa 488 imaging kit | Life Technologies | C10083 | |
| Anti-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1/300 |
| Goat anti mouse-Alex594 | Life Technologies | A11001 | 1/400 |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Polysine slide | Thermo scientific | J2800AMNZ | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-068 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Microscope BX51 | Olympus | ||
| Confocal microscope SPE | Leica | ||
| Prism software | Graphpad | Version 5.0c | |
| Photoshop software | Adobe |
References
- Rakic, P. Specification of cerebral cortical areas. Science. 241, 170-176 (1988).
- Sauer, F. Mitosis in he neural tube. J Comp Neurol. , 377-399 (1935).
- Taverna, E., Huttner, W. B. Neural progenitor nuclei IN motion. Neuron. 67, 906-914 (2010).
- Committee, B. Embryonic vertebrate central nervous system: revised terminology. Anat Rec. 166, 257-261 (1970).
- Bystron, I., Blakemore, C., Rakic, P. Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited. Nature Reviews. Neuroscience. 9, 110-122 (2008).
- Miyata, T., et al. Asymmetric production of surface-dividing and non-surface-dividing cortical progenitor cells. Development. 131, 3133-3145 (2004).
- Haubensak, W., Attardo, A., Denk, W., Huttner, W. B. Neurons arise in the basal neuroepithelium of the early mammalian telencephalon: a major site of neurogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 3196-3201 (2004).
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7, 136-144 (2004).
- Merot, Y., Retaux, S., Heng, J. I. Molecular mechanisms of projection neuron production and maturation in the developing cerebral cortex. Seminars in Cell & Developmental Biology. 20, 726-734 (2009).
- Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex. Trends Neurosci. 27, 392-399 (2004).
- Salomoni, P., Calegari, F. Cell cycle control of mammalian neural stem cells: putting a speed limit on G1. Trends Cell Biol. 20, 233-243 (2010).
- Calegari, F., Haubensak, W., Haffner, C., Huttner, W. B. Selective lengthening of the cell cycle in the neurogenic subpopulation of neural progenitor cells during mouse brain development. J Neurosci. 25, 6533-6538 (2005).
- Andres-Mach, M., Rola, R., Fike, J. R. Radiation effects on neural precursor cells in the dentate gyrus. Cell Tissue Res. 331, 251-262 (2008).
- Semont, A., et al. Involvement of p53 and Fas/CD95 in murine neural progenitor cell response to ionizing irradiation. Oncogene. 23, 8497-8508 (2004).
- Nowak, E., et al. Radiation-induced H2AX phosphorylation and neural precursor apoptosis in the developing brain of mice. Radiat Res. 165, 155-164 (2006).
- Gatz, S. A., et al. Requirement for DNA ligase IV during embryonic neuronal development. J Neurosci. 31, 10088-10100 (2011).
- Denekamp, J. Cell kinetics and radiation biology. International Journal of Radiation Biology and Related Studies in Physics, Chemistry, and Medicine. 49, 357-380 (1986).
- Hartwell, L. H., Weinert, T. A. Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events. Science. 246, 629-634 (1989).
- Weinert, T. A., Hartwell, L. H. Characterization of RAD9 of Saccharomyces cerevisiae and evidence that its function acts posttranslationally in cell cycle arrest after DNA damage. Mol Cell Biol. 10, 6554-6564 (1990).
- Tolmach, L. J., Jones, R. W., Busse, P. M. The action of caffeine on X-irradiated HeLa cells. I. Delayed inhibition of DNA synthesis. Radiat Res. 71, 653-665 (1977).
- Painter, R. B., Young, B. R. Radiosensitivity in ataxia-telangiectasia: a new explanation. Proc Natl Acad Sci U S A. 77, 7315-7317 (1980).
- Etienne, O., Roque, T., Haton, C., Boussin, F. D. Variation of radiation-sensitivity of neural stem and progenitor cell populations within the developing mouse brain. Int J Radiat Biol. 88, 694-702 (2012).
- Roque, T., et al. Lack of a p21waf1/cip -dependent G1/S checkpoint in neural stem and progenitor cells after DNA damage in vivo. Stem Cells. 30, 537-547 (2012).
- Rousseau, L., et al. In vivo importance of homologous recombination DNA repair for mouse neural stem and progenitor cells. PLoS One. 7, 12 (2012).
- Bradford, J. A., Clarke, S. T. Dual-pulse labeling using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) and 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) in flow cytometry. Curr Protoc Cytom. , (2011).
- Deckbar, D., et al. The limitations of the G1-S checkpoint. Cancer Res. 70, 4412-4421 (2010).
- Manual, Click-iT EdU Imaging Kit. , http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp10338.pdf (2011).
- Weidtkamp-Peters, S., Rahn, H. P., Cardoso, M. C., Hemmerich, P. Replication of centromeric heterochromatin in mouse fibroblasts takes place in early, middle, and late S phase. Histochem Cell Biol. 125, 91-102 (2006).
- Wu, R., Terry, A. V., Singh, P. B., Gilbert, D. M. Differential subnuclear localization and replication timing of histone H3 lysine 9 methylation states. Mol Biol Cell. 16, 2872-2881 (2005).
- Wu, R., Singh, P. B., Gilbert, D. M. Uncoupling global and fine-tuning replication timing determinants for mouse pericentric heterochromatin. J Cell Biol. 174, 185-194 (2006).
- Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness Jr, V. S. The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15, 6046-6057 (1995).
- Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. J Vis Exp. , (2010).
