Summary
Toediening van twee analogen van thymidine, Edu en BrdU, bij zwangere muizen maakt de analyse van de celcyclus en in neurale voorlopercellen in de embryonale hersenen van muizen. Deze werkwijze is nuttig om de effecten van genotoxische stress, zoals ioniserende straling, tijdens de hersenontwikkeling bepalen.
Abstract
Neuronen van de cerebrale cortex ontstaan tijdens hersenontwikkeling van verschillende soorten neurale stamcellen en progenitorcellen (NSPC), die een pseudo-epitheel langs de laterale ventrikels van de embryonale hersenen vormen. Genotoxisch benadrukt, zoals ioniserende straling, hebben zeer schadelijke effecten op de ontwikkelende hersenen verband met de hoge gevoeligheid van NSPC. Opheldering van de cellulaire en moleculaire mechanismen afhankelijk van de karakterisering van de DNA schade respons van deze specifieke soorten cellen, die een nauwkeurige methode vereist NSPC progressie bepalen door de celcyclus in het beschadigde weefsel. Hier wordt een methode waarbij opeenvolgende intraperitoneale injecties van Edu en BrdU bij zwangere muizen en verdere detectie van deze twee thymidine analogen coronale secties van de embryonale hersenen. Edu en BrdU zijn beide opgenomen in DNA van replicerende cellen in S-fase en worden gedetecteerd door twee verschillende technieken (azide ofeen specifiek antilichaam, respectievelijk), die de gelijktijdige detectie vergemakkelijken. Edu en BrdU kleuring worden vervolgens voor elk NSPC kern als functie van de afstand van de ventriculaire marge in een standaard deel van de dorsale telencephalon. Dus deze dubbele labeling techniek kan onderscheiden cellen die doorliep de celcyclus van degenen die een celcyclus leidt tot celcyclus geactiveerd in respons op DNA beschadiging.
Een voorbeeld van een experiment wordt gepresenteerd, waarin Edu voor de bestraling en BrdU werd geïnjecteerd onmiddellijk na en analyses uitgevoerd binnen de 4 uur na bestraling. Dit protocol geeft een nauwkeurige analyse van de acute DNA schade respons van NSPC in functie van de fase van de celcyclus waarin zij zijn bestraald. Deze methode gemakkelijk worden toegepast op vele andere systemen om het effect van een bepaalde behandeling op celcyclusprogressie in levende weefsels te bepalen.
Introduction
Tijdens de embryonale ontwikkeling van de hersenen, zijn projectie neuronen van de cerebrale cortex opgewekt in de ventriculaire zone, een pseudo-epitheel uit verschillende soorten neurale stamcellen en progenitorcellen (NSPC) lijnen die de laterale ventrikels. Onder NSPC de radiale gliacellen (RGC), die als neurale stamcellen ondergaan interkinetic nucleaire migratie (INM) die mitose treden op het oppervlak van het ventrikel en S-fase bij de basale grens van de ventriculaire zone (VZ) 1, 2,3. Ze kunnen ofwel symmetrisch verdelen twee RGC genereren of asymmetrisch een RGC en een neuron of een tussenproduct progenitor cel (IPC) 4, 5 genereren. IPC migreren naar een bovenliggende uitdijende laag genaamd subventriculaire zone (SVZ), waarna een laatste symmetrische verdeling genereren ze twee onvolwassen projectie neuronen 6-8. In tegenstelling tot RGC, hoeft IPC ondergaan INM (beoordeeld 9). Nieuw gegenereerde neuronen migraten radiaal langs de radiale vezels via de tussenliggende zone (IZ) naar hun eindbestemming te bereiken in de corticale plaat (CP) 10, 8. De perfecte timing van al deze gebeurtenissen is essentieel voor een goede ontwikkeling van de hersenschors. Bijvoorbeeld de overgang van proliferatie differentiatie van neurale populaties wordt geregeld door de G1 faseduur 11, 12. De verlenging van de G1 fase correleert dus met celdifferentiatie.
Genotoxische stress, zoals ioniserende straling, ernstige aantasting hersenontwikkeling (besproken in 13). Wij en anderen hebben aangetoond dat NSPC zijn zeer gevoelig voor straling geïnduceerde apoptose 14, 15,16. Ioniserende straling veroorzaken DNA dubbelstrengs breuken die het meest ernstige schade aan delende cellen. Een essentieel onderdeel van DNA-schade Response (DDR) in delende cellen is de activering van de celcyclus checkpoints op de G1 / S of G2 / M overgangen of tijdens Sfase (intra-S checkpoint) 17-21. Ze blokkeren de voortgang van de celcyclus te tijd te geven voor DNA-schadeherstel of eliminatie van te beschadigde cellen. Bijgevolg kan celdood en vertraagde celcyclusprogressie hersenontwikkeling veranderen in reactie op ioniserende straling 22-24. Het was dus interessant om een werkwijze voor de activering van celcyclus in NSPC in de bestraalde muis embryonale hersenen beoordelen.
De progressie van de celcyclus wordt routinematig gevolgd met de opname van een thymidine analoog, 5-broom-2'-deoxyuridine (BrdU). BrdU opgenomen in de S-fase van de celcyclus, bij DNA replicatie. Het gebruik van een antilichaam tegen BrdU kan daarna de detectie van cellen die gedurende de puls van BrdU in S-fase waren.
Een nieuw thymidine analoog, 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EDU) wordt gedetecteerd door een fluorescerende azide. De verschillende manieren om te detecteren EDU en B RDU geen kruisreactie 25, die gelijktijdige detectie van thymidine analogen, die nuttig is voor de studie van de celcyclus. Meestal cellen worden eerst gepulst met Edu en vervolgens gepulseerd met BrdU, waarbij het tijdsverloop tussen beide oprichtingen duurt paar uur 25, 26. Toevoeging van BrdU in kweekmedia die edu leidt voorkeur opname van BrdU in het DNA met uitzondering van EDE, terwijl gelijktijdige toevoeging van edu 25 met equimolaire of halve equimolaire BrdU de media resultaten slechts BrdU incorporatie 27. Dit vereenvoudigt de dubbele labeling protocol door eliminatie van de wasstappen die normaal nodig zijn om het eerste label van het kweekmedium voorafgaand aan de toevoeging van het tweede label te verwijderen. Dit is ook van bijzonder belang zijn voor in vivo onderzoek, waar de was-niet mogelijk zijn, om de precieze timing van de S-fase-of uitreis van de cel bevolking te bepalen.
t "> Onlangs, een werkwijze dual-pulse labeling embryonale muizenhersenen met edu en BrdU 23, 24,22 is ontwikkeld om celcyclusprogressie en INM van NSPC onderzoeken na de bestraling in utero. Bovendien is aangetoond dat bij S-fase, muis cellen repliceren eerst de euchromatin regio en vervolgens de pericentric heterochromatin 28,29,30. Interessant pericentric heterochromatin van verschillende chromosomen geclusterd in interfase kernen te heterochromatic brandpunten ook wel bekend als chromocenters en gemakkelijk door DAPI kleuring zo helder brandpunten vormen. Daarom is de differentiële Edu en BrdU kleuringen van euchromatine en chromocenters ons geholpen om meer precies S-fase progressie van NSPC analyseren.Deze methode kon de demonstratie van het schijnbare gebrek aan G1 / S checkpoint in NSCP 22-24, dat is heel verrassend aangezien dit ijkpunt zou van cruciaal belang voor stabiliteit van het genoom te zijn. Verschillende experimental ontwerpen op basis van verschillende combinaties van onderwijs en BrdU pulsen gebruikt om celcyclusprogressie te analyseren in de ventrale en dorsale telencephalon. Hier geven we een voorbeeld van protocollen waardoor de studie van de acute DNA schade NSPC binnen de eerste 4 uur na bestraling in utero van E14.5 muizenembryo's.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Animal Procedures
Dit protocol is ontworpen in overeenstemming met de Richtlijn Europese Gemeenschappen van de Raad van 24 november 1986 (86/609/EEG) en is door onze institutionele commissie inzake dierenwelzijn (CETEA-CEA DSV IdF) goedgekeurd.
- Injecties met Edu / BrdU en bestraling van E14.5 zwangere muizen (Figuur 2A).
- Bereid een oplossing van EDU 1 mg / ml en BrdU bij 5 mg / ml in PBS. Voer een intra-peritoneale injectie (IP) van 100 ul van Edu oplossing om met een 25 G naald in zwangere muizen. 1,5 uur later bestralen de muizen (totale lichaamsbestraling) op 0 of 2 Gy Gy (0,6 Gy / min). Onmiddellijk na, injecteren (IP) 200 pl BrdU oplossing om met een 25 G naald in de zwangere muizen.
- Voorbereiding van de coronale plakjes embryonale hersenen.
- Op 1 uur of 4 uur na bestraling, euthanaseren de zwangere muizen door kooldioxide.
- Open de buik Cavity meer dan drie centimeter met een schaar. Scheid de twee baarmoederhoorns van de rest van de baarmoeder door snijden beide uiteinden van de hoorns. Breng de baarmoederhoorns in een petrischaal met PBS 0,6% glucose. Open de baarmoederhoorns met de tang om de embryo's te isoleren. Verwijder de vruchtzak van elk embryo behulp van een tang.
- Ontleden embryonale hoofden met een tang en zet ze vast door onderdompeling in 4% paraformaldehyde (PFA, pH = 7,4) O / N bij 4 ° C.
- Spoel embryonale hoofden in PBS gedurende ten minste een nacht bij 4 ° C. Koppen in PBS bewaard gedurende enkele dagen.
- Embed heads in paraffine met een vacuüm infiltratie processor zoals aangegeven in tabel 1. Heads inbedding kan worden onder een chemische kap uitgevoerd ethanol en xylen baden, en daarna in een 65 ° C oven gedurende de paraffinebaden.
- Bereid 5-pm dikke coronale secties met een microtoom.
- Monteren op-polylysine gecoate objectglaasjes. </ Li>
- Dia's kunnen bij kamertemperatuur (RT) bewaard gedurende enkele maanden.
2. Edu / BrdU kleuring
- Deparaffineren en antigeen ontmaskering
- Deparaffinize de paraffine ingebedde hersencoupes door onderdompeling dia in 3 baden tolueen gedurende 5 minuten.
- Hydrateren gedurende 3 min in 2 baden elk oplossingen afnemende ethanolconcentratie als volgt: ethanol 100%, 95% ethanol, 70% ethanol en 5 min in H2O Dia's kunnen in gedeïoniseerd water worden bewaard voor meerdere hr.
- Kook de schijfjes gedurende 10 min in citraat-oplossing (10 mM, pH 6) en incubeer in gedeïoniseerd water gedurende 5 minuten.
- EDU kleuring
- Voer Edu detectie volgens protocol van de fabrikant. Permeabilize cellen met 0,5% triton X-100 in PBS gedurende 10 minuten.
- Bereid 1X edu buffer additief door verdunning van de 10X oplossing in gedemineraliseerd water. Deze oplossing moet vers worden gemaakt en gebruikt op dezelfde day.
- Bereid edu reactie cocktail, met inbegrip van Edu Alexa Fluor 488 azide. Het is belangrijk om de ingrediënten toe in de volgorde tabel 2, anders zal de reactie niet optimaal verlopen. Gebruik de EDU reactie cocktail binnen 15 minuten na de bereiding.
- Verwijder de permeabilisatie buffer (stap 2.1.1), vervolgens tweemaal wassen met PBS.
- Voeg 150 ul van edu reactiecoctail, zet een dekglaasje en incubeer gedurende 30 minuten in het donker bij kamertemperatuur.
- Verwijder de EDU reactie cocktail, vervolgens een keer wassen met PBS.
- BrdU kleuring
- Bereid verzadiging buffer met 7,5% geitenserum en 7,5% foetaal runderserum in PBS. Voeg 150 ul van verzadigingsbuffer op hersenenplakken, zet een dekglaasje en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur om niet-specifiek antilichaam blokkeert binding.
- Verwijder het dekglaasje. Voeg 150 ul van de muis anti-BrdU primair antilichaam verdund tot 1/300 in verzadiging buffer, zet een dekglaasje en incubeer O /N bij 4 ° C.
- Verwijder het dekglaasje, daarna wassen 3 keer in PBS.
- Voeg 150 ul van geit anti-muis secundair antilichaam alexa594 verdund 1/400 in verzadigingsbuffer, zet een dekglaasje en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Verwijder het dekglaasje, vervolgens een keer wassen in PBS.
- Nucleaire kleuring: voeg 150 ul van 4 ',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) en 1 ug / ml in PBS, zet een dekglaasje en incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
- Monteer dia's in montage medium.
3. Analyse
- Onderzoek hersenen secties onder een fluorescentiemicroscoop met een 20X objectief of een confocale microscoop en het verwerven van afbeeldingen in drie kanalen (488 nm, 594 nm en UV) als scheidt bestanden.
- Stack beelden met Photoshop-software.
- Analyseer hersenen secties in een standaard sector van de dorsomediale cerebrale muur. Deze sector is 100 micrometer op zijn mediale-laterale dimensie en is verdeeld in 18 bakken (of meer) van 10 μm lengte in de radiale afmeting met een raster gesuperponeerd op de beelden (fig. 1) zoals eerder beschreven 31.
- Breng het rooster zoals de eerste bak op de ventriculaire oppervlak met de lengteas evenwijdig aan de ventriculaire grens. Nummer dan de gelabelde Edu, BrdU en / of pyknotische kernen (overeenkomend met apoptotische kernen) in elke bak. Nummer een kern op de grens van twee containers in de bak waarin het grootste gedeelte, of het onderste vak, bevat als de kern inneemt gelijke oppervlakken binnen twee bakken.
- Statistische analyse.
Analyseer tenminste twee corticale schijfjes per embryo. Herhaalde bepalingen ten minste 3 embryo's van verschillende nesten. Resultaten moeten worden opgegeven als gemiddelde ± standaardafwijking van het gemiddelde (SEM). Statistische analyses worden uitgevoerd met Graphpad Prism behulp van twee-weg ANOVA en Bonferroni meervoudige vergelijking posthoc testen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In de in figuur 2 beschreven proef werd edu toegediend 1,5 uur voor bestraling en BrdU net na bestraling. Vier typen cellen werden vervolgens onderscheiden in de corticale schijfjes bereid bij 1 en 4 uur na bestraling volgens de incorporatie van zowel edu of BrdU, beide of geen (figuren 2A en 2B). Belangrijk, geen EDU of BrdU incorporatie veranderde de mate van door straling geïnduceerde apoptose (data niet getoond). Bovendien, de kleuringen staan alleen de detectie van EDE en BrdU opgenomen tijdens DNA replicatie in S-fase maar de gevoeligheid voor DNA synthese die is geassocieerd met herstel zelfs na bestraling sporen hebben. Inderdaad, i) noch EDU of BrdU kleuring werd waargenomen bij 1 uur na bestraling (PI) in cellen van de corticale plaat, waar bevinden zich postmitotische neuronen G0 fase en ii) het aantal EDU (+) en / of BrdU (+ ) werd niet bestraald gestegen ten opzichte unirradiated hersenen.
EDU (+) BrdU (+) kernen
EDU (+) BrdU (+) kernen overeen met NSPC die waren in de S-fase voor en na 0 uur PI. Ze werden dus bestraald in de S-fase. Zoals getoond in figuren 3B en 3C zijn euchromatine is EDU (+) en kunnen ook BrdU (+). Hun chromocenters waren ofwel BrdU (+) of BrdU (-). Afhankelijk S-fase voltooid op het moment van opoffering Figuur 2B toont dat in 1 uur PI, EDU (+) BrdU (+) kernen werden gelokaliseerd in S-fase bakken (dwz bins 4 tot 10, waarbij NSPC bekend dat de S-fase 31 uitgevoerd. hun verdeling en nummers werden niet beïnvloed door bestraling. Dit suggereert dat de straling volledig blok van DNA-synthese niet induceerde op dit moment.
Consequent met de basale tot apicale nucleaire migratie tijdens de G2-fase, de meeste EDU (+) BrdU (+) kernen van NSPC werden gevonden in de buurt van de ventrikel op 4 uur PI in bestraald brains (figuur 2C). Deze niet veranderde 2 Gy bestraald hersenen waarin kernen gebleven S-fase bakken, velen zijn apoptotische. Al met al deze gegevens bleek dat NSPC bestraald in de S-fase geactiveerd intra-S checkpoints in samenwerking met vertraagde INM en celdood.
EDU (+) BrdU (-) kernen
EDU (+) BrdU (-) kernen overeen met cellen die waren S-fase vóór en niet na bestraling. Chromocenters van deze kernen zijn EDU (+), wat aangeeft dat de cellen waren in de late S-fase toen Edu werd ingespoten bij muizen (figuur 3A). Sinds G2 / M fasen van NSPC laatste 2 uur in de ontwikkelende hersenen van muizen, EDU (+) BrdU (-) NSPC waren in G2 bij 0 uur PI. Altijd meeste EDU (+) BrdU (-) kernen werden gevonden in de eerste bak bij ventrikel bestraalde hersens 1 uur PI. Dit is een gevolg van INM van NSPC na S-fase, waar veel van hen gevormde typische mitotische figuren (figuur 2B). Bij1 uur PI, het aantal EDU (+) BrdU (-) kernen werd significant gereduceerd bij het ventriculaire oppervlak en geen mitotische figuur detecteerbaar in bestraalde hersenen. Deze gegevens tonen duidelijk aan dat de cellen bestraald in G2 geactiveerd de G2 / M checkpoint binnen 1 uur PI. Bovendien hebben de meeste EDU (+) BrdU (-) van deze kernen apoptotisch bij 4 uur PI tonen dat NSPC zeer stralingsgevoelige tijdens G2 (Figuur 2C).
Edu (-) BrdU (-) kernen
Cellen met een EDU (-) BrdU (-) kern overeen met ofwel cellen in G0 (voornamelijk onvolwassen neuronen), of NSPC die nog in G1 van Edu integratie in het offeren van dieren (figuur 3E). Vergelijking tussen 1 uur en 4 uur in figuur 2C toont interkinetic nucleaire migratie maken van die kernen die dicht bij het ventrikel waren in G1 op 1 uur ondergingen hun apicale basale migratie op 4 uur, terwijl kernen die in de S-fase waren ging naar de ventricular oppervlak.
Zoals getoond in Figuur 2C veel van deze kernen apoptotisch bij 4 uur PI. Het aantal apoptotische Edu (-) BrdU (-) kernen was het grootst in de buurt van de ventriculaire oppervlak en dalingen in de bovenste bakken. Deze gegevens stellen daarom voor dat-straling geïnduceerde apoptose vond plaats in NSPC die zijn bestraald tijdens de vroege G1 fase en / of post-mitotische migrerende neuronen. Daarentegen geen of zeer weinig apoptotische kernen werden gevonden in de corticale plaat. Dit is in overeenstemming met de stralingsweerstand van neuronen hun eindbestemming bereikt.
Edu (-) BrdU (+) kernen
EDU (-) BrdU (+) kernen overeen met cellen die S-fase ingevoerd na bestraling. Gewoonlijk 1 uur PI, toonden zij een diffuse BrdU labeling van euchromatin, maar niet die van chromocenters. Zo waren ze in het begin van de S-fase in die tijd (Figuur 3D). Op 1 uur PI het aantal en de lokalisatie binnen S phase bakken van Edu (-) BrdU (+) kernen is vergelijkbaar tussen controles en bestraalde hersenen. Aldus S-fase invoer in de 1 e uur PI werd niet beïnvloed door straling in de muis ontwikkelende hersenen (Figuur 2B). Interessant vergelijking van 1 uur en 4 uur PI bestraalde hersenen toont een daling van het aantal EDU (-) BrdU (+) kernen en de meeste van deze kernen apoptotisch bij 4 uur PI. Dit suggereert dat cellen die S fase ingegaan na bestraling geactiveerd intra-S checkpoints en onderging apoptose daarna (figuur 2C).
Figuur 1. Analyse van de afdeling Brain Coronale deel van de cerebrale hemisfeer van E14.5 muis embryo's gekleurd met Dapi. Edu en BrdU kleuring evenals nucleaire morfologie worden geanalyseerd in een standaard sector van de dorsomediale cerebral wand met een raster verdeeld in 18 bakken (of meer) zoals beschreven in de tekst. Schaalbalk:. 20 pm Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Celcyclus van bestraalde neurale stamcellen en voorlopercellen cel (Figuur van Roque et al.., Stamcellen, 2012). (A) Schematische weergave van de experimentele opzet en DAPI (blauw), Edu (groen), en BrdU (rode) vlekken patronen gevonden in coronale corticale plakjes op 1 en 4 uur PI (2 Gy). . Schaal bar = 20 micrometer (B, C) Aantallen / bin van edu (+) BrdU (-), Edu (+) BrdU (+), Edu (-) BrdU (+), of Edu (-) BrdU (- ) kernen met een normale morphology in niet-bestraalde controles (blauw) en met een normaal (rood) of apoptotische (pyknotische, zwart) morfologie in bestraalde (2 Gy) cortex bij 1 uur (B) of 4 uur PI (C). Geen apoptotische kernen werden gedetecteerd op 1 uur PI (B). Statistische analyse werd uitgevoerd met Bonferroni post hoc proeven. Afkortingen: BrdU, 5-broom-2'-deoxyuridine; DAPI, 4'-6-diamidino-2-fenylindol; EDU, 5-ethynyl-2'deoxyuridine; IZ, intermediaire zone; SVZ, subventriculaire zone; VZ, ventriculaire zone. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
. Figuur 3 Differentieel Edu en BrdU kleuring van euchromatine en chromocenters Bovenste paneel: Z-stackconfocale beelden van Edu (groen), BrdU (rode) vlekken en DNA tegengekleurd met DAPI (blauw) waardoor de detectie van chromocenters zo helder blauw brandpunten. Kleuringen werden uitgevoerd op een embryonale sectie hersenen verzameld op 1 uur PI in experimenten waar Edu werd afgeleverd 1,5 uur voor de bestraling en BrdU 0 uur PI (alleen de niet-bestraalde controle wordt weergegeven) (Schaal bar: 5 micrometer). Klik hier om te bekijken grotere versie van deze figuur.
Onderste panelen tonen voorbeelden van de 5 verschillende patronen van Edu en BrdU kleuring gedetecteerd in coronale hersenen plakjes. Samenvoegen afbeelding en enkele kanalen worden getoond (Schaal bar: 2 micrometer):
A) Nucleus met EDU (+) chromocenters en EDU (+) of Edu (-) euchromatin. Edu is dus opgenomen in de late S-fase tijdens de replicatie van pericentric heterochromatin: de cellen waren in G2 bij 0 uur PI.
B) Nucleus met EDU (+) euchromatin en BrdU (+) chomocenters: Edu is opgenomen in het begin van de S-fase toen de meeste van euchromatine wordt gerepliceerd en BrdU is opgenomen in de late S-fase: de cellen in de S-fase op 0 uur PI .
C) Nucleus met EDU (+) BrdU (+) euchromatin en Edu (-) BrdU (-) chromocenters. Edu en BrdU zijn opgenomen in het eerste deel van de S-fase: De cellen waren vroege S-fase bij 0 uur PI.
D) Nucleus met BrdU (+) euchromatin en Edu (-) BrdU (-) chromocenter. BrdU is opgenomen in het begin van de S-fase. De cellen werden in de late G1 bij 0 uur PI en ging de S-fase daarna.
E) Nucleus met Edu (-) BrdU (-) euchromatin en chromocenters. De cellen werden in G0 (onrijpe neuronen) of in G1 fase en heeft de S-fase niet invoeren tijdens Edu en BrdU pulsen.
| Oplossing | Incubatie | Temperatuur | Druk | Agitatie | |
| 1 | Alcohol 70% | 30 min | 35 ° C | op | op |
| 2 | alcohol 95% | 15 min | 35 ° C | op | op |
| 3 | alcohol 95% | 30 min | 35 ° C | op | op |
| 4 | alcohol 95% | 45 min | 35 ° C | op | op |
| 5 | alcohol 100% | 15 min | 35 ° C | op | op |
| 6 | alcohol 100% | 30 min | 35 ° C | op | op |
| 7 | alcohol 100% | 1 uur | 35 ° C | op | op |
| 8 | Tolueen 100% | 30 min | 35 ° C | op | op |
| 9 | Tolueen 100% | 45 min | 35 ° C | op | op |
| 10 | Tolueen 100% | 1 uur | 35 ° C | op | op |
| 11 | Paraffine | 30 min | 58 ° C | op | op |
| 12 | Paraffine | 1 uur | 58 ° C | op | op |
| 13 | Paraffine | 1 uur | 58 ° C | op | op |
| 14 | Paraffine | 1.5 hr | 58 ° C | op | op |
TafelVacuüm infiltratie processor programma 1. Voor paraffine inbedding.
| Reactie componenten voor 1 glijbaan | |
| 1X EDU reactie buffer | 128,64 pi |
| CUSO4 | 6 pl |
| Edu Alexa Fluor azide | 0.36 pi |
| 1X Edu Reaction buffer additief | 15 pl |
| Totale volume | 150 gl |
Tabel 2. Edu reactie cocktails.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De proefopzet hier beschreven gebaseerd op integratie van Edu 1,5 uur voor de bestraling en incorporatie van BrdU onmiddellijk na bestraling toegestaan de demonstratie die NSPCs kunnen S en G2 / M checkpoints te activeren, maar niet de G1 / S checkpoint tijdens de 1 e uur na een genotoxische stress in de foetale hersenen van muizen. We voerden andere experimenten waarin Edu is geïnjecteerd op verschillende tijdstippen na bestraling en BrdU, op slechts 1 uur voor muizen offers, waardoor we specifiek waarderen de snelheid van de S-fase binnenkomst. Deze experimenten hebben aangetoond dat NSPC geen G1 / S arrestatie na een genotoxische stress in vivo 22,23 activeren.
Daarom is de keuze tussen DNA-reparatie en apoptose niet ten G1 / S controlepunt waarbij de vraag van de aard van de mechanismen guarantying stabiliteit van het genoom in deze cellen.
Het protocol is eenvoudig en snel. De verschillendestappen vormen geen voor de hand liggende problemen. Deze techniek is een alternatief voor het gebruik van chloor-deoxyuridine (CldU) en jood-deoxyuridine (IDU) waarvan is aangetoond dat kruisreactie 32.
Een breed panel van toepassingen kan worden beschouwd, aangezien het protocol is gemakkelijk flexibel en aanpasbaar aan verschillende biologische vragen. Voorbeelden van wijzigingen worden voorgesteld in Roque en medewerkers 23, Etienne en medewerkers 22, en in Rousseau en medewerkers 24. Het kan ook worden gecombineerd met immunofluorescentie detectie van verschillende cel markers of eiwitten die betrokken zijn bij DNA-schade reactie bijvoorbeeld. Merk op, dat in dit geval zowel BrdU en EDU detectie kan worden uitgevoerd met verschillende fluoroforen die gecommercialiseerd, immuun detectie van andere markers bevorderen.
Edu en BrdU in vivo incorporatie in NSPC kan ook worden gebruikt celsortering door flow cytometrie voor verdere biochemische analyse. Tenslotte this de methode kan worden uitgevoerd op celcyclusprogressie van NSPC monitoren in verschillende mutante muizen of nadat andere soorten genotoxische stress (anders dan ioniserende straling) of andere behandelingen die de celcyclus. Bovendien kan gemakkelijk worden aangepast aan andere weefsels repliceren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Het onderzoek dat leidt tot deze resultaten heeft financiering van de Europese Unie Zevende Kaderprogramma (FP7/2007-2013) onder subsidieovereenkomst ontvangen n ° 323267, van Electricite de France (EDF) en van l'Agence Nationale de la Recherche - Sante-Environnement et Sante-Travail (ANR-minst goed zichtbaar, Neurorad).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EdU | Life Technologies | A10044 | 1 mg/ml |
| BrdU | Life Technologies | B5002 | 5 mg/ml |
| IBL 637 | CIS BIO International | ||
| Tissu Tek VIP | Leica | ||
| Microtome | Leica | RM 2125 RT | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Click-iT EdU Alexa 488 imaging kit | Life Technologies | C10083 | |
| Anti-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1/300 |
| Goat anti mouse-Alex594 | Life Technologies | A11001 | 1/400 |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Polysine slide | Thermo scientific | J2800AMNZ | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-068 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Microscope BX51 | Olympus | ||
| Confocal microscope SPE | Leica | ||
| Prism software | Graphpad | Version 5.0c | |
| Photoshop software | Adobe |
References
- Rakic, P. Specification of cerebral cortical areas. Science. 241, 170-176 (1988).
- Sauer, F. Mitosis in he neural tube. J Comp Neurol. , 377-399 (1935).
- Taverna, E., Huttner, W. B. Neural progenitor nuclei IN motion. Neuron. 67, 906-914 (2010).
- Committee, B. Embryonic vertebrate central nervous system: revised terminology. Anat Rec. 166, 257-261 (1970).
- Bystron, I., Blakemore, C., Rakic, P. Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited. Nature Reviews. Neuroscience. 9, 110-122 (2008).
- Miyata, T., et al. Asymmetric production of surface-dividing and non-surface-dividing cortical progenitor cells. Development. 131, 3133-3145 (2004).
- Haubensak, W., Attardo, A., Denk, W., Huttner, W. B. Neurons arise in the basal neuroepithelium of the early mammalian telencephalon: a major site of neurogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 3196-3201 (2004).
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7, 136-144 (2004).
- Merot, Y., Retaux, S., Heng, J. I. Molecular mechanisms of projection neuron production and maturation in the developing cerebral cortex. Seminars in Cell & Developmental Biology. 20, 726-734 (2009).
- Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex. Trends Neurosci. 27, 392-399 (2004).
- Salomoni, P., Calegari, F. Cell cycle control of mammalian neural stem cells: putting a speed limit on G1. Trends Cell Biol. 20, 233-243 (2010).
- Calegari, F., Haubensak, W., Haffner, C., Huttner, W. B. Selective lengthening of the cell cycle in the neurogenic subpopulation of neural progenitor cells during mouse brain development. J Neurosci. 25, 6533-6538 (2005).
- Andres-Mach, M., Rola, R., Fike, J. R. Radiation effects on neural precursor cells in the dentate gyrus. Cell Tissue Res. 331, 251-262 (2008).
- Semont, A., et al. Involvement of p53 and Fas/CD95 in murine neural progenitor cell response to ionizing irradiation. Oncogene. 23, 8497-8508 (2004).
- Nowak, E., et al. Radiation-induced H2AX phosphorylation and neural precursor apoptosis in the developing brain of mice. Radiat Res. 165, 155-164 (2006).
- Gatz, S. A., et al. Requirement for DNA ligase IV during embryonic neuronal development. J Neurosci. 31, 10088-10100 (2011).
- Denekamp, J. Cell kinetics and radiation biology. International Journal of Radiation Biology and Related Studies in Physics, Chemistry, and Medicine. 49, 357-380 (1986).
- Hartwell, L. H., Weinert, T. A. Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events. Science. 246, 629-634 (1989).
- Weinert, T. A., Hartwell, L. H. Characterization of RAD9 of Saccharomyces cerevisiae and evidence that its function acts posttranslationally in cell cycle arrest after DNA damage. Mol Cell Biol. 10, 6554-6564 (1990).
- Tolmach, L. J., Jones, R. W., Busse, P. M. The action of caffeine on X-irradiated HeLa cells. I. Delayed inhibition of DNA synthesis. Radiat Res. 71, 653-665 (1977).
- Painter, R. B., Young, B. R. Radiosensitivity in ataxia-telangiectasia: a new explanation. Proc Natl Acad Sci U S A. 77, 7315-7317 (1980).
- Etienne, O., Roque, T., Haton, C., Boussin, F. D. Variation of radiation-sensitivity of neural stem and progenitor cell populations within the developing mouse brain. Int J Radiat Biol. 88, 694-702 (2012).
- Roque, T., et al. Lack of a p21waf1/cip -dependent G1/S checkpoint in neural stem and progenitor cells after DNA damage in vivo. Stem Cells. 30, 537-547 (2012).
- Rousseau, L., et al. In vivo importance of homologous recombination DNA repair for mouse neural stem and progenitor cells. PLoS One. 7, 12 (2012).
- Bradford, J. A., Clarke, S. T. Dual-pulse labeling using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) and 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) in flow cytometry. Curr Protoc Cytom. , (2011).
- Deckbar, D., et al. The limitations of the G1-S checkpoint. Cancer Res. 70, 4412-4421 (2010).
- Manual, Click-iT EdU Imaging Kit. , http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp10338.pdf (2011).
- Weidtkamp-Peters, S., Rahn, H. P., Cardoso, M. C., Hemmerich, P. Replication of centromeric heterochromatin in mouse fibroblasts takes place in early, middle, and late S phase. Histochem Cell Biol. 125, 91-102 (2006).
- Wu, R., Terry, A. V., Singh, P. B., Gilbert, D. M. Differential subnuclear localization and replication timing of histone H3 lysine 9 methylation states. Mol Biol Cell. 16, 2872-2881 (2005).
- Wu, R., Singh, P. B., Gilbert, D. M. Uncoupling global and fine-tuning replication timing determinants for mouse pericentric heterochromatin. J Cell Biol. 174, 185-194 (2006).
- Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness Jr, V. S. The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15, 6046-6057 (1995).
- Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. J Vis Exp. , (2010).
