Summary
Administration av två analoger av tymidin, EDU och BrdU, i gravida möss kan analys av cellcykelprogression i neurala och progenitorceller i den embryonala mushjärna. Denna metod är användbar för att bestämma effekterna av genotoxisk stress, inklusive joniserande strålning, under hjärnans utveckling.
Abstract
Neuroner i hjärnbarken genereras under hjärnans utveckling från olika typer av neurala stamceller och progenitorceller (NSPC), vilka bildar en pseudostratified epitel kantar laterala ventriklarna hos den embryonala hjärnan. Genotoxiska påfrestningar, såsom joniserande strålning, har mycket skadliga effekter på den växande hjärnan i samband med den höga känsligheten hos NSPC. Klarläggande av de cellulära och molekylära mekanismer som är inblandade beror på karakterisering av DNA-skador svar på dessa särskilda typer av celler, vilket kräver en noggrann metod för att bestämma NSPC progression genom cellcykeln i den skadade vävnaden. Här visas en metod som bygger på varandra följande injektion i bukhålan EDU och BrdU i dräktiga möss och ytterligare upptäckt av dessa två tymidinanaloger i frontala delar av embryonala hjärnan. EDU och BrdU är båda inkorporeras i DNA av replikerande celler under S-fasen och detekteras av två olika tekniker (azid elleren specifik antikropp, respektive), vilket underlättar deras samtidig detektion. EDU och BrdU färgning skall sedan bestämmas för varje NSPC kärna som funktion av dess avstånd från kammar marginalen i en standard region i rygg telencefalon. Således denna dubbla märkningsteknik möjliggör att skilja celler som utvecklats genom cellcykeln från dem som har aktiverat en cellcykelkontrollpunkten som leder till cellcykelarrest som svar på DNA-skador.
Ett exempel på experiment presenteras, där Edu injicerades före bestrålning och BrdU direkt efter och analyser som utförs inom 4 timmar efter bestrålning. Detta protokoll ger en korrekt analys av den akuta DNA-skador svar av NSPC i funktion av fasen av cellcykeln där de har bestrålats. Denna metod är lätt överföras till många andra system för att bedöma effekten av en viss behandling på cellcykelprogression i levande vävnader.
Introduction
Under embryohjärnutveckling är projektions neuroner i hjärnbarken som genereras i den ventrikulära zonen en pseudostratified epitel sammansatt av olika typer av neurala stam och progenitorceller (NSPC) som linjer de laterala ventriklarna. Bland NSPC de radiella gliaceller (RGC), som tjänar som neurala stamceller, genomgå interkinetic nukleär migrering (INM): de utför mitos vid ytan av ventrikeln och S-fas vid den basala gränsen för den ventrikulära zonen (VZ) 1, 2,3. De kan dela antingen symmetriskt för att generera två RGC eller asymmetriskt för att generera en RGC och en neuron eller en mellan stamcellstransplantation (IPC) 4, 5. IPC migrera till ett överliggande förökar skikt kallas subventrikulära zonen (SVZ), där efter en sista symmetrisk delning de genererar två omogna projektion nervceller 6-8. I motsats till RGC behöver IPC inte genomgår INM (över i 9). Newly generated neurons stråt radiellt längs radiella fibrerna genom den mellanliggande zonen (IZ) för att nå sin slutdestination i kortikala plattan (CP) 10, 8. Den perfekta tiden för alla dessa händelser är avgörande för en korrekt kortikal utveckling. Till exempel övergången från proliferation till differentiering av neurala progenitorceller populationer styrs av G1 fasvaraktighet 11, 12. I förlängningen av G1 fasen korrelerar således med celldifferentiering.
Genotoxisk stress, såsom joniserande strålning, vilket allvarligt försämrar hjärnans utveckling (översikt i 13). Vi och andra har visat att NSPC är mycket utsatta för strålning-inducerad apoptos 14, 15,16. Joniserande strålning inducerar DNA-dubbelsträngsbrott, som är den allvarligaste skada på prolifererande celler. En viktig del av DNA-skador svar (DDR) i cykel celler är aktiveringen av cellcykelkontrollpunkter vid G1 / S eller G2 / M övergångar eller under Sfas (intra-S checkpoint) 17-21. De blockerar cellcykelprogression att ge tid för DNA-skada reparation eller eliminering av alltför skadade celler. Följaktligen kan celldöd samt försenade cellcykelprogressionen förändrar hjärnans utveckling som svar på joniserande strålning 22-24. Det var därför intressant att utveckla en metod för att bedöma aktivering av cellcykelkontrollpunkter i NSPC i det bestrålade musen embryonala hjärnan.
Progressionen av cellcykeln är rutinmässigt med användning av inkorporering av en tymidin-analog, 5-brom-2'-deoxiuridin (BrdU). BrdU införlivas under S-fasen av cellcykeln, när DNA replikerar. Användningen av en antikropp mot BrdU tillåter därefter detektion av celler som var i S-fasen under pulsen av BrdU.
A novel tymidin-analog, 5-etynyl-2'-deoxiuridin (EDU) detekteras genom en fluorescerande azid. De olika sätt att upptäcka EDU och B RDU inte korsreagerar 25, vilket möjliggör samtidig detektion av både tymidinanaloger, som är användbar för studium av cellcykelprogression. Vanligtvis celler först pulsas med EDU och sedan pulsades med BrdU, där tiden mellan de båda inkorporeringar varar några timmar 25, 26. Tillsats av BrdU i odlingsmedier innehållande edu leder preferentiellt inkorporering av BrdU i DNA med undantag av EDU, medan samtidig tillsats av EDU 25 med ekvimolär mängd eller halv ekvimolär BrdU till media resulterar i endast BrdU-inkorporering 27. Detta förenklar dubbel märkning protokoll, genom att avlägsna tvättstegen som normalt krävs för att ta bort den första etiketten från odlingsmediet före tillsatsen av den andra etiketten. Detta är också av särskilt intresse för in vivo-undersökning, där tvättningsstegen inte är möjligt att fastställa den exakta tidpunkten för S-fas in på eller lämnar cellpopulationen.
t "> Nyligen, en metod med dubbla pulsmärkning i embryonala mus hjärnan med EDU och BrdU 23, 24,22 är utvecklad för att analysera cellcykelprogression och INM av NSPC efter in utero-bestrålning. Vidare har det visats att, under S-fasen, musceller replikerar först de eukromatin regionerna och sedan den pericentric heterokromatin 28,29,30. Intressant att pericentric heterokromatin olika kromosomer klustrade i interphasic kärnor bildar heterochromatic härdar även känd som chromocenters och enkelt upptäckas av DAPI färgning som ljusa härdar. Därför differential EDU och BrdU färgningar av eukromatin och chromocenters hjälpt oss att mer exakt analysera S-fasen progression av NSPC.Denna metod tillät demonstration av den uppenbara bristen på G1 / S checkpoint i NSCP 22-24, vilket är ganska förvånande eftersom denna kontrollpunkt är tänkt att vara avgörande för genomet stabilitet. Flera experimental konstruktioner baserade på olika kombinationer av EDU och BrdU-pulserna har använts för att analysera cellcykelprogression i den ventrala och dorsala telencephalon. Här ger vi ett exempel på protokoll som medger undersökning av den akuta skador på DNA av NSPC inom de första 4 tim efter i livmodern bestrålning av embryon E14.5 mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Djurförsök
Detta protokoll har utformats i enlighet med Europeiska gemenskapernas direktiv av den 24 november 1986 (86/609/EEG) och har godkänts av vårt institutionella kommitté för djurskydd (CETEA-CEA DSV IdF).
- Injektioner med edu / BrdU och bestrålning av E14.5 dräktiga möss (Figur 2A).
- Bered en lösning av edu vid 1 mg / ml och BrdU vid 5 mg / ml i PBS. Utför ett intraperitonealt injektion (IP) av 100 pl EDU-lösning med hjälp av en 25 G nål i dräktiga möss. 1,5 h senare, bestråla möss (helkroppsbestrålning) vid 0 Gy eller 2 Gy (0,6 Gy / min). Omedelbart därefter injicera (IP) 200 pl av BrdU-lösning med användning av en 25 G nål i gravida möss.
- Beredning av koronalt skivor av embryonala hjärnor.
- Vid 1 timme eller 4 timmar efter bestrålning, avliva de dräktiga möss med koldioxid.
- Öppna buken cavity över tre centimeter med hjälp av en sax. Separera de två livmoderhornen från resten av livmodern genom sektione båda ändar hornen. Överför livmoderhornen i en petriskål med PBS 0,6% glukos. Öppna livmoderhornen med pincett för att isolera de embryon. Ta fostersäcken av varje embryo med hjälp av pincett.
- Dissekera embryonala huvuden med pincett och fixa dem genom nedsänkning i 4% paraformaldehyd (PFA, pH = 7,4) O / N vid 4 ° C.
- Skölj embryonala huvuden i PBS för åtminstone en natt vid 4 ° C. Huvuden kan förvaras i PBS under flera dagar.
- Bädda huvuden i paraffin med hjälp av en vakuuminfiltrationsprocessor som anges i tabell 1. Kan Heads inbäddning också utföras under en kemisk huva för etanol och xylen bad, och sedan i en 65 ° C ugn för paraffin bad.
- Förbered 5-ìm tjocka koronala sektioner med en mikrotom.
- Montera på polylysin-belagda objektglas. </ Li>
- Objektglasen kan förvaras vid rumstemperatur (RT) under flera månader.
2. Edu / BrdU färgning
- Avparaffinering och antigen demaskera
- Avparaffinera de paraffininbäddade hjärnsektioner genom nedsänkning av objektglasen i tre baden i toluen under 5 min.
- Rehydrera i 3 min i 2 bad av varje lösningar med minskande etanolkoncentration som följande: etanol 100%, etanol 95%, etanol 70%, och 5 min i H2O Objektglasen kan förvaras i avjoniserat vatten under flera timmar.
- Koka skivor under 10 minuter i citrat-lösning (10 mM, pH 6) och sedan inkubera i avjoniserat vatten i 5 min.
- EDU färgning
- Utför edu detektering enligt tillverkarens protokoll. Permeabilisera cellerna med 0,5% Triton X-100 i PBS under 10 min.
- Bered 1X EDU buffert tillsats genom utspädning av 10X-lösning i avjoniserat vatten. Denna lösning ska nybakade och användas på samma day.
- Förbered EDU reaktion cocktail, inklusive EDU Alexa Fluor 488-azid. Det är viktigt att tillsätta ingredienserna i den ordning som listas i tabell 2, i annat fall kommer reaktionen inte fortgå optimalt. Använd EDU reaktion cocktail inom 15 minuter efter framställningen.
- Avlägsna permeabilization buffert (steg 2.1.1), sedan tvätta två gånger med PBS.
- Addera 150 pl av EDU reaktion cocktail, lägga ett täckglas och inkubera under 30 minuter i mörker vid RT.
- Ta ENE reaktion cocktail, sedan tvätta en gång med PBS.
- BrdU-färgning
- Förbered mättnadsbuffert med 7,5% getserum och 7,5% fetalt bovint serum i PBS. Addera 150 pl av mättnadsbuffert på hjärnskivor, lägg på ett täckglas och inkubera under 1 timme vid rumstemperatur för att blockera icke-specifik antikroppsbindning.
- Ta bort täckglas. Tillsätt 150 l av mus-anti-BrdU primär antikropp utspädd till 1/300 under mättnadsbuffert, satte ett täckglas och inkubera O /N vid 4 ° C.
- Ta bort täckglas, sedan tvätta 3 gånger i PBS.
- Addera 150 pl av get-anti-mus-Alexa594 sekundär antikropp utspädd till 1/400 i mättnadsbuffert, placera ett täckglas och inkubera under 1 h vid RT.
- Ta bort täckglas, sedan tvätta en gång i PBS.
- Nukleär färgning: lägga 150 l av 4 ',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) på 1 ng / ml i PBS, satte ett täckglas och inkubera i 2 minuter vid RT.
- Montera bilder i monteringsmedel.
3. Analys
- Undersök hjärnan sektioner under ett fluorescensmikroskop med ett 20X objektiv eller ett konfokalmikroskop och få bilder i tre kanaler (488 nm, 594 nm och UV) som separerar filer.
- Stapla bilder med Photoshop.
- Analysera hjärnan sektioner i en standard sektor av dorsomedial cerebral väggen. Denna sektor är 100 | im i dess mediala-laterala dimension och är uppdelad i 18 lagerplatser (eller flera) av 10 μm höjd i dess radiella dimension med hjälp av ett rutnät ovanpå bilder (figur 1) som tidigare beskrivits 31.
- Rikta gallret såsom den första facket är på den ventrikulära yta, med sin långa axel parallell med den ventrikulära gränsen. Sedan numrera den märkta edu, BrdU och / eller pyknotiska kärnor (motsvarande apoptotiska kärnor) i varje fack. Numrera en kärna som ligger på gränsen mellan två lagerplatser i soptunnan som innehåller den större delen, eller i nedre facket, när kärnan upptar lika stora områden inom de två papperskorgar.
- Statistisk analys.
Analysera minst två kortikala skivor per embryo. Upprepa experiment på minst 3 embryon från olika kullar. Resultaten ges som medelvärde ± standardfelet för medelvärdet (SEM). Statistiska analyser genomförs med Graphpad Prism med tvåvägs ANOVA och Bonferroni multipla jämförelse posthoc tester.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I experimentet som beskrivs i figur 2, var EDU administreras 1,5 h före bestrålning och BrdU strax efter bestrålning. Fyra typer av celler har sedan särskiljas i kortikala skivor framställda vid 1 eller 4 timmar efter bestrålning, beroende på inkorporeringen av antingen edu eller BrdU, båda eller ingen (figurerna 2A och 2B). Viktigt är varken EDU eller BrdU-inkorporering förändrat strålningsnivån apoptos (data ej visade). Vidare är färgningsmetoder tillåter endast detektionen av EDU och BrdU införlivas under DNA-replikation i S-fas, men inte har den känslighet för att detektera DNA-syntes som är förknippad med reparation, även efter bestrålning. I själva verket i) varken EDU eller BrdU-färgning observerades vid 1 h efter bestrålning (PI) i celler av den kortikala plattan, där finns postmitotiska neuroner vid G0 fas och ii) antalet EDU (+) och / eller BrdU (+ ) ökade inte i bestrålade jämfört med unirradiated hjärnor.
Edu (+) BrdU (+) kärnor
Edu (+) BrdU (+) kärnor motsvarar NSPC som var i S-fas före och efter 0 tim PI. De var därmed bestrålas i S-fasen. Såsom visas i figurerna 3B och 3C deras eukromatin är EDU (+) och kan vara även BrdU (+). Deras chromocenters var antingen BrdU (+) eller BrdU (-). Beroende på S-fasen avslutad vid tidpunkten för avlivandet Figur 2B visar att vid en hr PI ades EDU (+) BrdU (+) kärnor lokaliserad i S-fas korgar (dvs. kärl 4-10, där NSPC är kända för att utföra S-fas 31. Deras fördelning och antal inte påverkades av bestrålning. tyder på att strålning inte framkalla ett helt block av DNA-syntes vid denna tid.
Konsekvent med basala till apikala kärn migration under G2-fasen var de flesta EDU (+) BrdU (+) kärnor av NSPC hittades nära ventrikeln vid 4 tim PI i obestrålad brains (figur 2C). Detta skedde inte i 2 Gy bestrålade hjärnor där kärnor kvar i S-fas soptunnor, många av dem är apoptotiska. Sammantaget dessa data visade att NSPC bestrålas i S-fas aktiveras intra-S kontrollpunkter i association med fördröjd INM och celldöd.
Edu (+) BrdU (-) kärnor
Edu (+) BrdU (-) kärnor motsvarar celler som var i S-fas före och inte efter bestrålning. Chromocenters av dessa kärnor är EDU (+), vilket indikerar att cellerna var i sen S-fas när EDU injicerades i möss (Figur 3A). Eftersom G2 / M faser NSPC senaste 2 tim i utvecklings musen hjärnan, EDU (+) BrdU (-) NSPC var i G2 vid 0 tim PI. Consistently, mest EDU (+) BrdU (-) kärnor hittades i det första facket i obestrålade hjärnor nära kammaren vid en hr PI. Detta är en konsekvens av INM i NSPC, efter S-fasen, där många av dem bildade typiska mitotiska former (Figur 2B). Vid1 hr PI, antalet EDU (+) BrdU (-) kärnor signifikant reducerad vid den ventrikulära yta och ingen mitotiska figur kunde detekteras i bestrålade hjärnor. Dessa data visar tydligt att celler bestrålas i G2 aktiverat G2 / M checkpoint inom 1 timme PI. Vidare, de flesta av EDU (+) BrdU (-) av dessa kärnor var apoptotiska vid 4 tim PI visar att NSPC är mycket strålkänslig under G2 (figur 2C).
Edu (-) BrdU (-) kärnor
Celler med en EDU (-) BrdU (-) kärna motsvara antingen celler i G0 (främst omogna nervceller) eller NSPC som återstod i G1 från EDU inkorporering till djuroffer (figur 3E). Jämförelse mellan 1 timme och 4 timmar i figur 2C visar interkinetic kärn migration gör att kärnor som var nära ventrikeln i G1 på 1 timme gick sin apikala till basala migration på 4 timmar, medan kärnor som var i S-fasen gick mot ventricular yta.
Såsom visas i figur 2C många av dessa kärnor var apoptotiska vid 4 tim PI. Antalet apoptotiska EDU (-) BrdU (-) kärnor var maximal i närheten av den ventrikulära yta och minskningar i övre fack. Dessa data antyder därför att strålningsframkallad apoptos inträffade i NSPC som har bestrålats under tidig G1 fas och / eller post-mitotiska migrerar neuroner. Däremot har ingen eller mycket få apoptotiska kärnor som finns i den kortikala plattan. Detta är i enlighet med strålningsresistansen av nervceller som har nått sin slutdestination.
Edu (-) BrdU (+) kärnor
Edu (-) BrdU (+) kärnor motsvarar celler som trätt S-fas efter bestrålning. Typiskt vid en hr PI, visade de en diffus BrdU märkning av eukromatin, men inte av chromocenters. Alltså de var i början av S-fas vid den tiden (Figur 3D). Vid 1 timme PI antal och lokalisering inom S PHAe korgar för EDU (-) BrdU (+) kärnor är likartad mellan kontroller och bestrålade hjärnor. Således S-fas posten under 1: a hr PI inte påverkades av strålning i musen utvecklar hjärnan (Figur 2B). Intressant nog visar jämförelse av 1 h och 4 h PI i bestrålade hjärnor en nedgång i antalet EDU (-) BrdU (+) kärnor och de flesta av dessa kärnor var apoptotiska vid 4 tim PI. Detta tyder på att celler som trädde S-fasen efter strålning aktiveras inom S kontrollpunkter och genomgick apoptos därefter (figur 2C).
Figur 1. Analys av hjärnsektion coronal sektion av den cerebrala hemisfären av embryon E14.5 mouse färgades med DAPI. EDU och BrdU-färgning samt nukleär morfologi analyserades i en standard sektor av dorsomedial cerebral vägg med ett rutnät indelat i 18 papperskorgar (eller fler) som beskrivs i texten. Skala bar:. 20 um Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Cellcykelprogressionen av bestrålat neurala stam-och progenitorceller (Bild från Roque et al., Stamceller, 2012). (A) Schematisk beskrivning av experimentell design och DAPI (blå), EDU (grön), och BrdU (röd) färgningsmönster som finns i frontala kortikala skivor på 1 och 4 tim PI (2 Gy). . Scale bar = 20 ^ m (B, C) Numbers / bin av EDU (+) BrdU (-), EDU (+) BrdU (+), EDU (-) BrdU (+) eller EDU (-) BrdU (- ) kärnor med en normal morphology i icke-bestrålad kontroller (blå) och med en vanlig (röd) eller apoptotiska (pyknotiska, svart) morfologi i bestrålade (2 Gy) cortex på 1 h (B) eller 4 tim PI (C). Inga apoptotiska cellkärnor detekterades vid en hr PI (B). Statistisk analys utfördes med användning av Bonferroni post hoc-tester. Förkortningar: BrdU, 5-brom-2'-deoxiuridin; DAPI, 4'-6-diamidino-2-fenylindol; Edu, 5-etynyl-2'-deoxiuridin; IZ, mellanområde; SVZ, subventrikulära zonen; VZ, ventrikulära zonen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
. Figur 3 Differential EDU och BrdU färgning av eukromatin och chromocenters Övre panel: Z-stackkonfokala bilder av EDU (grön), BrdU (röd) färgning och DNA motfärgades med DAPI (blå) gör det möjligt att upptäcka chromocenters som klarblå härdar. Färgningar utfördes på en embryonal hjärna avsnitt samlas in på 1 timme PI i experiment där EDU levererades 1,5 tim före bestrålning och BrdU 0 tim PI (endast den obestrålade kontroll visas) (Skala bar: 5 ìm). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bottenpanelema visar exempel på de 5 olika mönster av EDU och BrdU-färgning detekterades i coronal hjärnsnitt. Slå ihop bild och enkla kanaler visas (Skala bar: 2 ^ m):
A) Nucleus med EDU (+) chromocenters och EDU (+) eller EDU (-) eukromatin. Edu har därmed införlivats i sen S-fas under replikering av pericentric heterochromatin: cellerna var jagn G2 vid 0 tim PI.
B) Nucleus med EDU (+) eukromatin och BrdU (+) chomocenters: EDU har införlivats i tidig S-fas när de flesta av eukromatin replikeras och BrdU har införlivats i slutet av S-fasen: Cellerna i S-fas vid 0 tim PI .
C) Nucleus med EDU (+) BrdU (+) eukromatin och EDU (-) BrdU (-) chromocenters. EDU och BrdU har införlivats i den första delen av S-fasen: Cellerna i tidig S-fas vid 0 tim PI.
D) Nucleus med BrdU (+) eukromatin och EDU (-) BrdU (-) chromocenter. BrdU har införts i början av S-fasen. Cellerna var i sen G1 vid 0 tim PI och trädde S-fasen därefter.
E) Nucleus med EDU (-) BrdU (-) eukromatin och chromocenters. Cellerna var i G0 (omogna nervceller) eller i G1 fas och inte in S-fas under EDU och BrdU pulser.
| Lösning | Inkubation | Temperatur | Lufttryck | Omröring | |
| 1 | Alkohol 70% | 30 minuter | 35 ° C | på | på |
| 2 | alkohol 95% | 15 minuter | 35 ° C | på | på |
| 3 | alkohol 95% | 30 minuter | 35 ° C | på | på |
| 4 | alkohol 95% | 45 minuter | 35 ° C | på | på |
| 5 | alkohol 100% | 15 minuter | 35 ° C | på | på |
| 6 | alkohol 100% | 30 minuter | 35 ° C | på | på |
| 7 | alkohol 100% | 1 hr | 35 ° C | på | på |
| 8 | Toluen 100% | 30 minuter | 35 ° C | på | på |
| 9 | Toluen 100% | 45 minuter | 35 ° C | på | på |
| 10 | Toluen 100% | 1 hr | 35 ° C | på | på |
| 11 | Fotogen | 30 minuter | 58 ° C | på | på |
| 12 | Fotogen | 1 hr | 58 ° C | på | på |
| 13 | Fotogen | 1 hr | 58 ° C | på | på |
| 14 | Fotogen | 1,5 tim | 58 ° C | på | på |
BordVakuum infiltration processorprogram för paraffininbäddning 1..
| Reaktions komponenter för 1 slide | |
| 1X edu reaktionsbuffert | 128,64 il |
| CUSO4 | 6 | il |
| Edu Alexa Fluor azid | 0,36 | il |
| 1X edu reaktionsbuffert tillsats | 15 | il |
| Total volym | 150 | il |
Tabell 2. EDU reaktions cocktails.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den experimentella designen som beskrivs här grundar sig på inkorporering av edu 1,5 h före bestrålning och inkorporeringen av BrdU omedelbart efter bestrålning tillät demonstration av att NSPCs kan aktivera S och G2 / M kontrollpunkter, men inte G1 / S checkpoint under en st h efter en genotoxisk stress i fostrets musen hjärnan. Vi utförde andra experiment där EDU har injicerats vid olika tidpunkter efter bestrålning och BrdU, bara 1 timme före möss uppoffringar, vilket tillåter oss att särskilt uppskatta graden av S-fasen posten. Dessa experiment har visat att NSPC inte aktiverar en G1 / S gripandet efter en genotoxisk stress i vivo 22,23.
Därför har valet mellan DNA-reparation och apoptos inte ske på G1 / S checkpoint lyfta frågan om vilken typ av mekanismer guarantying genomet stabilitet i dessa celler.
Protokollet är enkelt och snabbt. De olikasteg utgör någon uppenbar svårighet. Denna teknik är ett alternativ till användningen av klor-deoxiuridin (CldU) och jod-deoxiuridin (IDU), som har visat sig korsreagera 32.
En bred panel av ansökningar kan betraktas, som protokoll är lätt flexibel och anpassningsbar till flera biologiska frågor. Exempel på ändringar föreslås i Roque och kollaboratörer 23, Etienne och kollaboratörer 22, och i Rousseau och medarbetare 24. Det kan också kombineras med immunofluorescens detektion av flera cellmarkörer eller proteiner involverade i DNA-skador svar till exempel. Notera, att i detta fall, båda BrdU och EDU detektion skulle kunna utföras med olika fluoroforer som kommersialiseras, att gynna immun detektering av andra markörer.
EDU och BrdU in vivo-inkorporering i NSPC skulle också kunna användas i cellsortering genom flödescytometri för vidare biokemisk analys. Slutligen thär metoden kan utföras för att övervaka cellcykelprogressionen av NSPC i olika typer av muterade möss eller efter andra typer av genotoxiska påfrestningar (andra än joniserande strålning) eller någon annan behandling som påverkar cellcykelprogression. Dessutom kan det enkelt anpassas till andra repliker vävnader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har någon intressekonflikt.
Acknowledgments
Den forskning som lett fram till dessa resultat har erhållit finansiering från EU: s sjunde ramprogram (FP7/2007-2013) enligt bidragsavtal n ° 323.267, från Electricité de France (EDF) och från l'Agence Nationale de la Recherche - Santé-Environnement et Santé-Travail (ANR-SEST, Neurorad).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EdU | Life Technologies | A10044 | 1 mg/ml |
| BrdU | Life Technologies | B5002 | 5 mg/ml |
| IBL 637 | CIS BIO International | ||
| Tissu Tek VIP | Leica | ||
| Microtome | Leica | RM 2125 RT | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Click-iT EdU Alexa 488 imaging kit | Life Technologies | C10083 | |
| Anti-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1/300 |
| Goat anti mouse-Alex594 | Life Technologies | A11001 | 1/400 |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Polysine slide | Thermo scientific | J2800AMNZ | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-068 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Microscope BX51 | Olympus | ||
| Confocal microscope SPE | Leica | ||
| Prism software | Graphpad | Version 5.0c | |
| Photoshop software | Adobe |
References
- Rakic, P. Specification of cerebral cortical areas. Science. 241, 170-176 (1988).
- Sauer, F. Mitosis in he neural tube. J Comp Neurol. , 377-399 (1935).
- Taverna, E., Huttner, W. B. Neural progenitor nuclei IN motion. Neuron. 67, 906-914 (2010).
- Committee, B. Embryonic vertebrate central nervous system: revised terminology. Anat Rec. 166, 257-261 (1970).
- Bystron, I., Blakemore, C., Rakic, P. Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited. Nature Reviews. Neuroscience. 9, 110-122 (2008).
- Miyata, T., et al. Asymmetric production of surface-dividing and non-surface-dividing cortical progenitor cells. Development. 131, 3133-3145 (2004).
- Haubensak, W., Attardo, A., Denk, W., Huttner, W. B. Neurons arise in the basal neuroepithelium of the early mammalian telencephalon: a major site of neurogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 3196-3201 (2004).
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7, 136-144 (2004).
- Merot, Y., Retaux, S., Heng, J. I. Molecular mechanisms of projection neuron production and maturation in the developing cerebral cortex. Seminars in Cell & Developmental Biology. 20, 726-734 (2009).
- Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex. Trends Neurosci. 27, 392-399 (2004).
- Salomoni, P., Calegari, F. Cell cycle control of mammalian neural stem cells: putting a speed limit on G1. Trends Cell Biol. 20, 233-243 (2010).
- Calegari, F., Haubensak, W., Haffner, C., Huttner, W. B. Selective lengthening of the cell cycle in the neurogenic subpopulation of neural progenitor cells during mouse brain development. J Neurosci. 25, 6533-6538 (2005).
- Andres-Mach, M., Rola, R., Fike, J. R. Radiation effects on neural precursor cells in the dentate gyrus. Cell Tissue Res. 331, 251-262 (2008).
- Semont, A., et al. Involvement of p53 and Fas/CD95 in murine neural progenitor cell response to ionizing irradiation. Oncogene. 23, 8497-8508 (2004).
- Nowak, E., et al. Radiation-induced H2AX phosphorylation and neural precursor apoptosis in the developing brain of mice. Radiat Res. 165, 155-164 (2006).
- Gatz, S. A., et al. Requirement for DNA ligase IV during embryonic neuronal development. J Neurosci. 31, 10088-10100 (2011).
- Denekamp, J. Cell kinetics and radiation biology. International Journal of Radiation Biology and Related Studies in Physics, Chemistry, and Medicine. 49, 357-380 (1986).
- Hartwell, L. H., Weinert, T. A. Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events. Science. 246, 629-634 (1989).
- Weinert, T. A., Hartwell, L. H. Characterization of RAD9 of Saccharomyces cerevisiae and evidence that its function acts posttranslationally in cell cycle arrest after DNA damage. Mol Cell Biol. 10, 6554-6564 (1990).
- Tolmach, L. J., Jones, R. W., Busse, P. M. The action of caffeine on X-irradiated HeLa cells. I. Delayed inhibition of DNA synthesis. Radiat Res. 71, 653-665 (1977).
- Painter, R. B., Young, B. R. Radiosensitivity in ataxia-telangiectasia: a new explanation. Proc Natl Acad Sci U S A. 77, 7315-7317 (1980).
- Etienne, O., Roque, T., Haton, C., Boussin, F. D. Variation of radiation-sensitivity of neural stem and progenitor cell populations within the developing mouse brain. Int J Radiat Biol. 88, 694-702 (2012).
- Roque, T., et al. Lack of a p21waf1/cip -dependent G1/S checkpoint in neural stem and progenitor cells after DNA damage in vivo. Stem Cells. 30, 537-547 (2012).
- Rousseau, L., et al. In vivo importance of homologous recombination DNA repair for mouse neural stem and progenitor cells. PLoS One. 7, 12 (2012).
- Bradford, J. A., Clarke, S. T. Dual-pulse labeling using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) and 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) in flow cytometry. Curr Protoc Cytom. , (2011).
- Deckbar, D., et al. The limitations of the G1-S checkpoint. Cancer Res. 70, 4412-4421 (2010).
- Manual, Click-iT EdU Imaging Kit. , http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp10338.pdf (2011).
- Weidtkamp-Peters, S., Rahn, H. P., Cardoso, M. C., Hemmerich, P. Replication of centromeric heterochromatin in mouse fibroblasts takes place in early, middle, and late S phase. Histochem Cell Biol. 125, 91-102 (2006).
- Wu, R., Terry, A. V., Singh, P. B., Gilbert, D. M. Differential subnuclear localization and replication timing of histone H3 lysine 9 methylation states. Mol Biol Cell. 16, 2872-2881 (2005).
- Wu, R., Singh, P. B., Gilbert, D. M. Uncoupling global and fine-tuning replication timing determinants for mouse pericentric heterochromatin. J Cell Biol. 174, 185-194 (2006).
- Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness Jr, V. S. The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15, 6046-6057 (1995).
- Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. J Vis Exp. , (2010).
