Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

تقييم التقدم دورة الخلية الجذعية العصبية من الخلايا والسلف في تطوير الدماغ ماوس بعد الإجهاد السمية الوراثية

doi: 10.3791/51209 Published: May 7, 2014

Summary

إدارة اثنين من النظير ثيميدين، ايدو وBrdU، في الفئران الحوامل يسمح للتحليل تطور دورة الخلية العصبية في والخلايا الاصلية في مخ الفأر الجنينية. وهذه الطريقة مفيدة لتحديد آثار الإجهاد السمية، بما في ذلك الإشعاعات المؤينة، أثناء نمو المخ.

Abstract

تتولد الخلايا العصبية في القشرة الدماغية أثناء نمو المخ من أنواع مختلفة من الخلايا الجذعية العصبية والسلف (NSPC)، والتي تشكل ظهارة مطبقة كاذبة بطانة البطينات الجانبية من الدماغ الجنينية. الضغوط السمية، مثل الإشعاع المؤين، يكون لها آثار ضارة للغاية على الدماغ النامية فيما يتعلق حساسية عالية من NSPC. توضيح الآليات الخلوية والجزيئية تشارك يعتمد على توصيف استجابة الحمض النووي من التلف من هذه أنواع معينة من الخلايا، الأمر الذي يتطلب وسيلة دقيقة لتحديد NSPC التقدم من خلال دورة الخلية في الأنسجة التالفة. هنا يظهر أسلوب يستند على حقن داخل الصفاق المتعاقبة من ايدو وBrdU في الفئران الحوامل وكذلك الكشف عن هذه نظائرها ثيميدين اثنين في أقسام الاكليلية من الدماغ الجنينية. على حد سواء أدرجت ايدو وBrdU في الحمض النووي للخلايا تكرار خلال المرحلة S ويتم الكشف عنها من قبل اثنين من تقنيات مختلفة (أو أزيدالأجسام المضادة المحددة، على التوالي)، التي تسهل الكشف عنها في وقت واحد. EDU وBrdU تلطيخ ثم يتم تحديدها لكل نواة NSPC في وظيفة من المسافة التي تفصله عن الهامش البطين في المنطقة مستوى لل telencephalon الظهرية. وبالتالي هذه التقنية وضع العلامات مزدوج يسمح تمييز الخلايا التي تقدم من خلال دورة الخلية من تلك التي تم تنشيطها نقطة تفتيش دورة الخلية مما يؤدي إلى اعتقال دورة الخلية ردا على الحمض النووي من التلف.

ويرد مثال على التجربة، التي تم حقن EDU قبل التشعيع وBrdU مباشرة بعد وتحليلات أجريت داخل ساعة 4 التالية التشعيع. يوفر هذا البروتوكول تحليلا دقيقا للاستجابة حادة من الحمض النووي من التلف NSPC في وظيفة من مرحلة من مراحل دورة الخلية التي كانت قد تعرضت للإشعاع. هذه الطريقة بسهولة القابلة للنقل لكثير من النظم الأخرى من أجل تحديد أثر علاج خاص على تقدم دورة الخلية في الأنسجة الحية.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

أثناء نمو المخ الجنينية، يتم إنشاء الخلايا العصبية الإسقاط من قشرة الدماغ في منطقة البطين، وهي تتألف من ظهارة مطبقة كاذبة أنواع مختلفة من الخلايا الجذعية العصبية والسلف (NSPC) أن خطوط البطينين الوحشي. بين NSPC، والخلايا الدبقية شعاعي (RGC)، والتي تكون بمثابة الخلايا الجذعية العصبية، والخضوع الهجرة النووية interkinetic (الحركة الوطنية العراقية): أنها تؤدي الانقسام على سطح البطين وS-المرحلة في حد القاعدية من منطقة البطين (VZ) 1، 2،3. يمكن يتقاسمونها إما بشكل متناظر لتوليد اثنين RGC أو غير متماثلة لتوليد RGC واحد والخلايا العصبية واحد أو خلية متوسطة السلف (IPC) 4، 5. IPC الهجرة إلى طبقة الفوقية المتكاثرة تسمى منطقة subventricular (SVZ)، حيث بعد تقسيم متماثل مشاركة واحدة أنها تولد اثنين من الخلايا العصبية الإسقاط غير ناضجة 6-8. خلافا للRGC، IPC لا تخضع الحركة الوطنية العراقية (مراجعة في 9). الخلايا العصبية ولدت حديثا migrأكلت شعاعيا على طول الألياف شعاعي من خلال منطقة وسطى (IZ) للوصول إلى وجهتهم النهائية في لوحة القشرية (CP) 10، 8. توقيت مثالي من كل هذه الأحداث أمر ضروري لتطوير القشرية الصحيح. على سبيل المثال يتم التحكم في التحول من الانتشار إلى التفريق بين السكان السلف العصبية قبل مدة المرحلة G1 11، 12. إطالة المرحلة G1 يرتبط بالتالي مع تمايز الخلايا.

الإجهاد السمية، مثل الإشعاع المؤين، نمو الدماغ يضعف بشدة (إعادة النظر في 13). نحن وآخرون أظهرت أن NSPC عرضة للغاية لالإشعاع الناجم عن موت الخلايا المبرمج 14، 15،16. الإشعاعات المؤينة لحث على الحمض النووي المزدوج فواصل حبلا التي هي أشد ضررا على الخلايا المتكاثرة. أحد المكونات الأساسية لاستجابة الحمض النووي من التلف (DDR) في الخلايا ركوب الدراجات هو تفعيل نقاط التفتيش في دورة الخلية G1 / S أو G2 / M التحولات أو أثناء Sالمرحلة (نقطة تفتيش داخل S) 17-21. انهم منع تطور دورة الخلية لتوفير الوقت لإصلاح التلف في الحمض النووي أو التخلص من الخلايا التالفة أيضا. بالتالي، موت الخلايا وكذلك تأخير تقدم دورة الخلية قد يغير نمو الدماغ ردا على التعرض للإشعاعات المؤينة 22-24. ولذا كان من المثير للاهتمام أن وضع طريقة لتقييم تفعيل نقاط التفتيش دورة الخلية في NSPC في مخ الفأر الجنينية المشع.

ويتبع تطور دورة الخلية بشكل روتيني باستخدام إدماج التناظرية ثيميدين، 5-برومو-2'-deoxyUridine (BrdU). أدرج BrdU خلال المرحلة S من دورة الخلية، عندما يتم تكرار الحمض النووي. استخدام الأجسام المضادة ضد BrdU يسمح بعد ذلك للكشف عن الخلايا التي كانت في المرحلة S خلال نبض BrdU.

يتم الكشف عن التناظرية ثيميدين الرواية، 5-إيثينيل-2'-deoxyUridine (EDU) من قبل أزيد الفلورسنت. الطرق المختلفة للكشف عن وباء EDU RDU لا تتفاعل عبر 25، وتمكن من الكشف في وقت واحد من كل من النظير ثيميدين، وهو أمر مفيد لدراسة تقدم دورة الخلية. وعادة ما تكون الخلايا الأولى مع نابض EDU ثم نابض مع BrdU، حيث الفترة الزمنية بين كل من المعلومات المدرجة تستمر بضع ساعات 25 و 26. إضافة BrdU في وسائل الإعلام الثقافة التي تحتوي على EDU النتائج في تفضيلي إدماج BrdU في الحمض النووي مع استبعاد كل من ايدو، بينما في وقت واحد بالإضافة EDU 25 مع BrdU متساوي المولية أو نصف متساوي المولية لنتائج سائل الإعلام إلا في BrdU التأسيس 27. هذا يبسط بروتوكول وضع العلامات المزدوجة من خلال القضاء على خطوات غسل التي تكون مطلوبة عادة لإزالة التسمية الأولى من وسائل الإعلام الثقافة قبل إضافة التسمية الثانية. وهذا هو أيضا من اهتمام خاص لفي الجسم الحي الدراسة، حيث الخطوات الغسيل ليست ممكنة، لتحديد التوقيت الدقيق لدخول مرحلة S أو الخروج من سكان الخلية.

ر "> في الآونة الأخيرة، وقد تم تطوير وسيلة لوضع العلامات المزدوجة نبض في الدماغ الجنينية الماوس باستخدام EDU وBrdU 23، 24،22 لتحليل تطور دورة الخلية والحركة الوطنية العراقية من NSPC في الرحم بعد التشعيع. وعلاوة على ذلك فقد ثبت أنه، خلال المرحلة S، خلايا فأر تكرار أول المناطق كروماتين حقيقي ثم المغاير pericentric 28،29،30. ومن المثير للاهتمام، المغاير pericentric من الكروموسومات مختلفة تتجمع في نواة لتشكيل بؤر interphasic heterochromatic المعروف أيضا باسم chromocenters وكشفها بسهولة عن طريق تلطيخ دابي كما بؤر مشرق. لذلك، والفرق EDU وBrdU stainings من كروماتين حقيقي وchromocenters ساعدتنا على تحليل أكثر تحديدا المرحلة S تطور NSPC.

يسمح هذا الأسلوب المظاهرة من النقص الواضح في نقطة تفتيش G1 / S في دعم البلاغات الوطنية 22-24، والذي يثير الدهشة تماما منذ يفترض هذا الحاجز أن تكون حاسمة للاستقرار الجينوم. عدة إكسبوقد استخدمت تصاميم erimental يعتمد على تركيبات مختلفة من ايدو BrdU والبقول لتحليل تقدم دورة الخلية في الدماغ الانتهائي بطني وظهري. هنا، نعطي مثالا على بروتوكولات السماح دراسة الحمض النووي من التلف الحاد في NSPC ضمن أول 4 ساعة التالية في الرحم تشعيع الأجنة E14.5 الماوس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. الإجراءات الحيوان

وقد تم تصميم هذا البروتوكول وفقا لتوجيهات مجلس الجماعات الأوروبية من 24 نوفمبر 1986 (86/609/EEC) وتمت الموافقة من قبل لجنة مؤسسية لدينا على الرفق بالحيوان (CETEA-CEA DSV جيش الدفاع الإسرائيلي).

  1. الحقن مع EDU / BrdU وتشعيع E14.5 الفئران الحوامل (الشكل 2A).
    1. يعد حل EDU في 1 ملغ / مل وBrdU في 5 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني. إجراء حقن داخل الصفاق (IP) من 100 ميكرولتر من الحل EDU باستخدام إبرة 25 G في الفئران الحوامل. في وقت لاحق 1.5 ساعة، أشرق الفئران (مجموع تشعيع الجسم) في غراي 0 أو 2 غراي (0.6 جراى / دقيقة). على الفور بعد، وضخ (IP) 200 ميكرولتر من الحل BrdU باستخدام 25 G الإبرة في الفئران الحوامل.
  2. إعداد شرائح الاكليلية من العقول الجنينية.
    1. في 1 ساعة أو 4 ساعات بعد التشعيع، الموت ببطء الفئران الحوامل بواسطة ثاني أكسيد الكربون.
    2. فتح جوف البطنتاي أكثر من ثلاثة سنتيمترات باستخدام المقص. فصل قرني الرحم عن بقية الرحم بواسطة باجتزاء كلا الأطراف من القرون. نقل قرون الرحم في طبق بتري تحتوي على برنامج تلفزيوني 0.6٪ الجلوكوز. فتح قرون الرحم مع ملقط من أجل عزل الأجنة. إزالة الكيس الذي يحيط بالجنين من كل جنين باستخدام ملقط.
    3. تشريح رؤساء الجنينية مع ملقط واصلاحها عن طريق الغمر في بارافورمالدهيد 4٪ (PFA، ودرجة الحموضة = 7.4) O / N عند 4 درجة مئوية.
    4. شطف رؤساء الجنينية في برنامج تلفزيوني لمدة ليلة واحدة على الأقل في 4 درجات مئوية. يمكن أن تظل رؤساء في برنامج تلفزيوني لعدة أيام.
    5. رؤساء تغرس في البارافين باستخدام معالج فراغ تسلل كما هو مبين في الجدول رقم 1. رؤساء التضمين يمكن أيضا أن تتم تحت غطاء الكيميائية لإنتاج الإيثانول والحمامات xylen، ومن ثم في الفرن 65 درجة مئوية لمدة حمامات البارافين.
    6. إعداد 5 ميكرون المقاطع الاكليلية سميكة مع مشراح.
    7. جبل على الشرائح المجهر المغلفة متعدد الليزين. </ لى>
    8. يمكن أن تبقى الشرائح في درجة حرارة الغرفة (RT) لعدة أشهر.

2. EDU / BrdU تلطيخ

  1. Deparaffinization وفضح مستضد
    1. Deparaffinize أقسام الدماغ جزءا لا يتجزأ من البارافين عن طريق الغمر من الشرائح في 3 حمامات التولوين لمدة 5 دقائق.
    2. ترطيب لمدة 3 دقائق في 2 حمامات كل الحلول لخفض تركيز الإيثانول على النحو التالي: الإيثانول بنسبة 100٪، والإيثانول 95٪، والإيثانول 70٪، و 5 دقائق في H 2 O. يمكن أن تبقى الشرائح في الماء منزوع الأيونات لعدة ساعة.
    3. غلي شرائح لمدة 10 دقيقة في محلول سيترات (10 ملي، ودرجة الحموضة 6)، ثم احتضان في الماء منزوع الأيونات لمدة 5 دقائق.
  2. EDU تلطيخ
    1. تنفيذ الكشف EDU وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. Permeabilize الخلايا مع 0.5٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني ل 10min.
    2. إعداد 1X العازلة EDU المضافة عن طريق تمييع الحل 10X في الماء منزوع الأيونات. هذا الحل يجب أن تقدم طازجة وتستخدم في نفس داذ.
    3. إعداد EDU رد فعل الكوكتيل، بما في ذلك EDU اليكسا فلور 488 أزيد. فمن المهم لإضافة المكونات التالية النظام المدرجة في الجدول 2، وإلا فإن رد الفعل لا المضي قدما على النحو الأمثل. استخدام رد فعل كوكتيل EDU في غضون 15 دقيقة من التحضير.
    4. إزالة المخزن المؤقت permeabilization (الخطوة 2.1.1)، ثم يغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني.
    5. إضافة 150 ميكرولتر من رد فعل EDU الكوكتيل، وضع ساترة، واحتضان لمدة 30 دقيقة في الظلام في RT.
    6. إزالة رد فعل كوكتيل EDU، ثم يغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني.
  3. BrdU تلطيخ
    1. إعداد العازلة التشبع مع 7.5٪ مصل الماعز و 7.5٪ مصل بقري جنيني في برنامج تلفزيوني. إضافة 150 ميكرولتر من العازلة التشبع على شرائح الدماغ، ووضع ساترة، واحتضان لمدة 1 ساعة على RT لمنع الأجسام المضادة غير محددة ملزمة.
    2. إزالة ساترة. إضافة 150 ميكرولتر من الماوس مكافحة BrdU الأجسام المضادة الأولية مخففة في 1/300 العازلة التشبع، ووضع ساترة واحتضان O /N عند 4 درجة مئوية.
    3. إزالة ساترة، ثم يغسل 3 مرات في برنامج تلفزيوني.
    4. إضافة 150 ميكرولتر من الماعز المضادة للماوس-Alexa594 الأجسام المضادة الثانوية المخفف في 1/400 في المخزن التشبع، ووضع ساترة، واحتضان لمدة 1 ساعة على RT.
    5. إزالة ساترة، ثم يغسل مرة واحدة في برنامج تلفزيوني.
    6. تلطيخ النووية: إضافة 150 ميكرولتر من 4 '،6-diamidino-2-phenylindole (دابي) في 1 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني، ووضع ساترة واحتضان لمدة 2 دقيقة في RT.
    7. جبل الشرائح في تصاعد المتوسط.

3. تحليل

  1. دراسة أقسام الدماغ تحت المجهر مضان مع الهدف 20X أو المجهر متحد البؤر والحصول على صور في ثلاث قنوات (488 نانومتر، 594 نانومتر، والأشعة فوق البنفسجية) كما يفصل الملفات.
  2. كومة الصور مع برنامج فوتوشوب.
  3. تحليل أقسام الدماغ في قطاع القياسية الجدار الدماغي ظهراني إنسي. هذا القطاع هو 100 ميكرون في بعدها الإنسي الأطراف، وينقسم إلى 18 صناديق (أو أكثر) من 10 μارتفاع متر في بعدها شعاعي باستخدام شبكة متراكبة على الصور (الشكل 1) كما هو موضح سابقا 31.
    1. محاذاة الشبكة مثل بن الأول هو على السطح البطيني، بما لديها المحاذي للحدود طويلة البطين. ثم ترقيم EDU المسمى، BrdU و / أو نوى تغلظي (الموافق نوى أفكارك) في كل حاوية. عددهم نواة تقع على الحدود اثنين من صناديق في سلة المهملات والذي يحتوي على الجزء الأكبر منها، أو في أقل بن، عندما تحتل نواة مساحات متساوية داخل صناديق اثنين.
  4. التحليل الإحصائي.

تحليل اثنين على الأقل من شرائح القشرية في الجنين. تكرار التجارب على الأجنة لا يقل عن 3 من الفضلات المختلفة. وينبغي إيلاء النتائج على النحو الخطأ يعني ± المعياري للمتوسط ​​(SEM). وتجرى التحليلات الإحصائية مع Graphpad بريزم باستخدام اتجاهين أنوفا وBonferroni متعددة اختبارات المقارنة posthoc.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

في التجربة وصفها في الشكل 2، كانت تدار EDU 1.5 ساعة قبل التشعيع وبعد التشعيع BrdU. أربعة أنواع من الخلايا ثم تميزوا في شرائح القشرية التي أعدت في 1 أو 4 ساعات بعد التشعيع، وفقا لإدماج إما EDU أو BrdU، على حد سواء أو لا شيء (أرقام 2A و 2B). الأهم من ذلك، لا EDU ولا BrdU التأسيس تغيير مستوى الخلايا التي يسببها الإشعاع (لا تظهر البيانات). وعلاوة على ذلك، فإن أساليب تلطيخ تسمح فقط للكشف عن EDU وBrdU أدرجت خلال تكرار الحمض النووي في S-المرحلة ولكن لم يكن لديك حساسية للكشف عن تركيب الحمض النووي مقترن إصلاح حتى بعد التشعيع. في الواقع، ط) لوحظ لا EDU ولا BrdU تلطيخ في 1 ساعة آخر التشعيع (PI) في الخلايا من لوحة القشرية، حيث توجد الخلايا العصبية في مرحلة تالية للتفتل G0 وب) عدد EDU (+) و / أو BrdU (+ ) لم يزد في المشع مقارنة unirradiated العقول.

EDU (+) BrdU (+) نوى

EDU (+) BrdU (+) نوى تتوافق مع NSPC التي كانت في المرحلة S قبل وبعد 0 ساعة PI. وهكذا فإنها المشع في المرحلة S. كما هو مبين في أرقام 3B و 3C كروماتين حقيقي بهم EDU (+) ويمكن أيضا أن تكون BrdU (+). كانت chromocenters بهم إما BrdU (+) أو BrdU (-). اعتمادا على استكمال المرحلة S في وقت التضحية ويبين الشكل 2B أنه في 1 ساعة PI، تم المترجمة EDU (+) BrdU (+) نوى في صناديق المرحلة S (أي صناديق 4-10، حيث من المعروف أن NSPC لتنفيذ المرحلة S 31. لم تتأثر التوزيع وأعدادهم من قبل التشعيع. هذا يشير إلى أن الإشعاع لم لحث على كتلة كاملة من توليف الحمض النووي في هذا الوقت.

باستمرار مع القاعدية للهجرة النووية قمي خلال المرحلة G2، تم العثور على معظم EDU (+) BrdU (+) نوى NSPC بالقرب من البطين في 4 ساعة PI في الدماغ غير المشعنانوثانية (الشكل 2C). هذا لم يحدث في 2 جراى المشع في العقول التي لا تزال نوى في أحد صناديق المرحلة، وكثير منهم من أفكارك. تماما هذه البيانات أظهرت أن NSPC المشع في المرحلة S تفعيلها داخل أحد نقاط التفتيش بالتعاون مع الحركة الوطنية العراقية تأخر وموت الخلايا.

EDU (+) BrdU (-) نوى

EDU (+) BrdU (-) نوى تتوافق مع الخلايا التي كانت في المرحلة S قبل وليس بعد التشعيع. Chromocenters من هذه النوى هي EDU (+)، مما يشير إلى أن الخلايا كانت في أواخر S-المرحلة عندما تم حقن الفئران EDU في (الشكل 3A). منذ مراحل G2 / M من NSPC الماضي 2 ساعة في مخ الفأر النامية، EDU (+) BrdU (-) كانت NSPC في G2 في 0 ساعة PI. باستمرار، ومعظم EDU (+) BrdU (-) تم العثور على نوى في الأول بن بالقرب من البطين في أدمغة غير المشع في 1 ساعة PI. هذا هو نتيجة الحركة الوطنية العراقية من NSPC، بعد المرحلة S، حيث العديد منهم شكلت الشخصيات الإنقسامية نموذجي (الشكل 2B). في1 ساعة PI، وعدد من ايدو (+) BrdU (-) تم تخفيض نوى بشكل كبير على السطح البطيني وكان الرقم لا يمكن كشفها الإنقسامية في أدمغة المشع. هذه البيانات تظهر بوضوح أن الخلايا المشع في G2 تنشيط G2 / M نقطة تفتيش في حدود 1 ساعة PI. وعلاوة على ذلك، فإن معظم EDU (+) BrdU - وكانت هذه نواة أفكارك في 4 ساعة PI مما يدل على أن NSPC هي إشعاع عالية خلال G2 (الشكل 2C) ().

EDU (-) BrdU (-) نوى

الخلايا مع EDU (-) BrdU (-) نواة تتوافق مع أي خلايا في G0 (الخلايا العصبية غير ناضج بشكل أساسي)، أو NSPC التي بقيت في G1 من EDU التأسيس إلى التضحية الحيوانية (الشكل 3E). مقارنة بين 1 ساعة و 4 ساعة في الشكل 2C يبين الهجرة النووية interkinetic جعل تلك النوى التي كانت على مقربة من البطين في G1 في 1 ساعة وخضع لقمية الهجرة القاعدية في 4 ساعات، في حين نوى التي كانت في المرحلة S ذهب نحو ventricسطح جزيئية.

كما هو مبين في الشكل 2C العديد من هذه النوى كانت أفكارك في 4 ساعة PI. (-) BrdU (-) كان نوى القصوى بالقرب من السطح البطيني والنقصان في صناديق العلوي عدد أفكارك EDU. وتشير هذه البيانات وبالتالي حدثت أن الإشعاع الناجم عن موت الخلايا المبرمج في NSPC التي تم المشع في أوائل المرحلة G1 و / أو آخر الإنقسامية-المهاجرة الخلايا العصبية. على النقيض من ذلك، تم العثور على لا شيء أو عدد قليل جدا من نوى أفكارك في لوحة القشرية. هذا هو وفقا لمقاومة الإشعاع من الخلايا العصبية التي وصلت إلى وجهتها النهائية.

EDU (-) BrdU (+) نوى

EDU (-) BrdU (+) نوى تتوافق مع الخلايا التي دخلت مرحلة S بعد التشعيع. عادة في 1 ساعة PI، فإنها أظهرت وضع العلامات BrdU منتشر من كروماتين حقيقي، ولكن ليس من chromocenters. هكذا كانوا في مرحلة مبكرة S في ذلك الوقت (الشكل 3D). في 1 ساعة PI عدد والتعريب داخل S phasصناديق البريد من EDU (-) BrdU (+) نوى مشابه بين الضوابط والعقول المشع. وبالتالي لم تتأثر دخول S-المرحلة خلال ساعة PI 1 الحادي بواسطة الإشعاع في تطوير الدماغ الماوس (الشكل 2B). ومن المثير للاهتمام، مقارنة 1 ساعة و 4 ساعة PI في أدمغة المشع يظهر انخفاضا في عدد EDU (-) BrdU (+) نوى ومعظم هذه النوى كانت أفكارك في 4 ساعة PI. هذا يشير إلى أن الخلايا التي دخلت مرحلة S بعد الإشعاع تنشيط نقاط التفتيش داخل S وخضع بعد ذلك موت الخلايا المبرمج (الشكل 2C).

الشكل 1
الشكل 1. تحليل القسم الدماغ الاكليل الجزء من نصف الكرة المخية الأجنة E14.5 الماوس ملطخة دابي. EDU وBrdU تلطيخ وكذلك يتم تحليل مورفولوجيا النووية في القطاع القياسية من أمخاخ ظهراني إنسيل الجدار باستخدام الشبكة موزعة على 18 صناديق (أو أكثر) كما هو موضح في النص. شريط النطاق: 20 ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. تقدم دورة الخلية العصبية الجذعية من المشع والخلية السلف (الشكل من روكي وآخرون، الخلايا الجذعية، 2012). (أ) رسم تخطيطي لتصميم التجارب ودابي (الأزرق)، ايدو (الأخضر)، وBrdU (أحمر) أنماط تلطيخ وجدت في شرائح القشرية الاكليلية في 1 و 4 ساعة PI (2 جراى). . مقياس بار = 20 ميكرومتر (B، C) أرقام / بن لEDU (+) BrdU (-)، ايدو (+) BrdU (+)، ايدو (-) BrdU (+)، أو EDU (-) BrdU (- ) نوى مع مو طبيعيrphology في الضوابط nonirradiated (الازرق) ومع العادي (أحمر) أو أفكارك (تغلظي والأسود) في التشكل المشع (2 جراى) القشور في 1 ساعة (B) أو 4 ساعة PI (C). تم الكشف عن أي نوى أفكارك في 1 ساعة PI (B). تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام Bonferroni آخر مخصص الاختبارات. الاختصارات: BrdU، 5 برومو 2'-deoxyuridine؛ دابي، 4'-6-diamidino-2-phenylindole؛ EDU، 5-إيثينيل-2'deoxyuridine؛ IZ، منطقة وسطى؛ SVZ، منطقة subventricular؛ VZ، منطقة البطين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3
. الرقم 3 التفاضلية EDU وBrdU تلطيخ كروماتين حقيقي وchromocenters العلوي لوحة: Z-كومةالصور متحد البؤر من ايدو (الأخضر)، BrdU (أحمر) وتلطيخ DNA counterstained مع دابي (الأزرق) والسماح للكشف عن chromocenters كما بؤر زرقاء لامعة. أجريت Stainings على قسم المخ الجنينية التي تم جمعها في 1 ساعة PI في التجارب حيث تم تسليم EDU 1.5 ساعة قبل التشعيع وBrdU 0 ساعة PI (يظهر فقط السيطرة غير المشع) (شريط مقياس: 5 ميكرون). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تظهر لوحات أسفل أمثلة على 5 أنماط مختلفة من ايدو وBrdU تلطيخ الكشف في شرائح الدماغ الاكليلية. دمج الصورة وتظهر قنوات واحد (شريط مقياس: 2 ميكرون):

A) نواة مع EDU (+) chromocenters وEDU (+) أو EDU (-) كروماتين حقيقي. وبالتالي تم دمج EDU في أواخر المرحلة S خلال تكرار المغاير pericentric: كانت الخلايا ط ن G2 في 0 ساعة PI.

B) مع نواة EDU (+) كروماتين حقيقي وBrdU (+) chomocenters: كانت الخلايا في المرحلة S في 0 ساعة PI: وقد أدرجت EDU في المرحلة S في وقت مبكر عندما يتم نسخ معظم كروماتين حقيقي، وأدرجت BrdU في أواخر المرحلة S .

C) مع نواة EDU (+) BrdU (+) كروماتين حقيقي وEDU (-) BrdU (-) chromocenters. وقد أدرجت ايدو وBrdU في الجزء الأول من المرحلة S: كانت الخلايا في مرحلة مبكرة في S 0 ساعة PI.

D) مع نواة BrdU (+) كروماتين حقيقي وEDU (-) BrdU (-) جسيم نووي. وقد أدرجت BrdU في بداية المرحلة S. كانت الخلايا في أواخر G1 عند 0 ساعة PI ودخلت مرحلة S بعد ذلك.

E) مع نواة EDU (-) BrdU (-) كروماتين حقيقي وchromocenters. كانت الخلايا في G0 (الخلايا العصبية غير ناضجة) أو في المرحلة G1 ولم تدخل مرحلة S خلال EDU BrdU والبقول.

النظام = "0" بطانة الخلايا = "0" هوامش الخلية = "0" العرض = "415">
حل حضانة درجة الحرارة الضغط الإثارة
1 الكحول 70٪ 30 دقيقة 35 ° C في في
2 الكحول 95٪ 15 دقيقة 35 ° C في في
3 الكحول 95٪ 30 دقيقة 35 ° C في في
4 الكحول 95٪ 45 دقيقة 35 ° C في في
5 الكحول 100٪ 15 دقيقة 35 ° C في في
6 الكحول 100٪ 30 دقيقة 35 ° C في في
7 الكحول 100٪ 1 ساعة 35 ° C في في
8 التولوين 100٪ 30 دقيقة 35 ° C في في
9 التولوين 100٪ 45 دقيقة 35 ° C في في
10 التولوين 100٪ 1 ساعة 35 ° C في في
11 البارافين 30 دقيقة 58 ° C في في
12 البارافين 1 ساعة 58 ° C في في
13 البارافين 1 ساعة 58 ° C في في
14 البارافين 1.5 ساعة 58 ° C في في

جدول1. برنامج معالج فراغ تسلل لالبارافين التضمين.

رد فعل لمكونات الشريحة 1
1X العازلة رد فعل EDU 128.64 ميكرولتر
كبريتات النحاس 4 6 ميكرولتر
EDU اليكسا فلور أزيد 0.36 ميكرولتر
1X العازلة رد فعل EDU المضافة 15 ميكرولتر
إجمالي حجم 150 ميكرولتر

الجدول 2. EDU الكوكتيلات رد الفعل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

التصميم التجريبي وصفها هنا على أساس إدماج EDU 1.5 ساعة قبل التشعيع وإدماج BrdU مباشرة بعد التشعيع يسمح التظاهرة التي NSPCs قادرون على تفعيل S ونقاط التفتيش G2 / M ولكن لا حاجز G1 / S خلال شارع في ساعة 1 بعد الإجهاد سمية جينية في الدماغ الماوس الجنين. أجرينا التجارب الأخرى التي تم حقنها EDU في أوقات مختلفة بعد التشعيع وBrdU، ساعة فقط 1 قبل الفئران التضحيات، مما يسمح لنا أن نقدر على وجه التحديد معدل دخول المرحلة S. وقد أثبتت هذه التجارب أن NSPC لا تنشيط اعتقال G1 / S بعد الإجهاد السمية في الجسم الحي 22،23.

لذلك، لا يحدث الاختيار بين إصلاح الحمض النووي وموت الخلايا المبرمج في نقطة تفتيش G1 / S رفع سؤال حول طبيعة الآليات الكفيلة الاستقرار الجينوم في هذه الخلايا.

البروتوكول هو سهل وسريع. مختلفخطوات تقديم أي صعوبة واضحة. هذا الأسلوب هو بديل لاستخدام كلورو deoxyuridine (CldU) وiodo-deoxyuridine (إيدو) والتي ثبت للرد عبر 32.

يمكن اعتبار لوحة واسعة من التطبيقات، كبروتوكول بسهولة مرنة وقابلة للتكيف مع العديد من الأسئلة البيولوجية. واقترح أمثلة على التغيرات في روكي والمتعاونين 23، اتيان والمتعاونين 22، وروسو والمتعاونين 24. فإنه يمكن الجمع أيضا مع الكشف المناعي العديد من علامات الخلية أو البروتينات المشاركة في الحمض النووي ردا الضرر على سبيل المثال. ملاحظة، أنه في هذه الحالة، سواء BrdU وكشف EDU يمكن أن يؤديها مع fluorophores المختلفة التي يتم تسويقها، لصالح كشف المناعي للعلامات أخرى.

ويمكن أيضا أن EDU وBrdU التأسيس في الجسم الحي في NSPC استخدامها في الخلية الترتيب بواسطة التدفق الخلوي لمزيد من التحليل البيوكيميائية. أخيرا، الهي طريقة يمكن أن يؤديها لرصد تطور دورة الخلية من NSPC في أنواع مختلفة من الفئران الطافرة أو بعد أنواع أخرى من الضغوط السمية الوراثية (عدا الإشعاع المؤين) أو أي معاملة أخرى تؤثر على تقدم دورة الخلية. علاوة على ذلك فإنه يمكن تكييفها بسهولة إلى الأنسجة الأخرى تكرار.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

والكتاب ليس لديهم تضارب في المصالح.

Acknowledgments

تلقت البحوث التي تؤدي إلى هذه النتائج على تمويل من البرنامج الإطاري السابع للاتحاد الأوروبي (FP7/2007-2013) بموجب اتفاقية منحة رقم 323267، من كهرباء فرنسا (EDF) وL'من الوكالة الوطنية دي لا بحوث - سانتيه-للبيئة وآخرون سانتي-العناء (ANR-SEST، Neurorad).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EdU Life Technologies A10044 1 mg/ml
BrdU Life Technologies B5002 5 mg/ml
IBL 637 CIS BIO International
Tissu Tek VIP Leica
Microtome Leica RM 2125 RT
Triton X-100 Sigma-Aldrich 93443
Click-iT EdU Alexa 488 imaging kit Life Technologies C10083
Anti-BrdU GE Healthcare RPN202 1/300
Goat anti mouse-Alex594 Life Technologies A11001 1/400
Fluoromount SouthernBiotech 0100-01
Polysine slide Thermo scientific J2800AMNZ
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
PBS Life Technologies 20012-068
DAPI Sigma-Aldrich D9542
Microscope BX51 Olympus
Confocal microscope SPE Leica
Prism software Graphpad Version 5.0c
Photoshop software Adobe

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rakic, P. Specification of cerebral cortical areas. Science. 241, 170-176 (1988).
  2. Sauer, F. Mitosis in he neural tube. J Comp Neurol. 377-399 (1935).
  3. Taverna, E., Huttner, W. B. Neural progenitor nuclei IN motion. Neuron. 67, 906-914 (2010).
  4. Committee, B. Embryonic vertebrate central nervous system: revised terminology. Anat Rec. 166, 257-261 (1970).
  5. Bystron, I., Blakemore, C., Rakic, P. Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited. Nature Reviews. Neuroscience. 9, 110-122 (2008).
  6. Miyata, T., et al. Asymmetric production of surface-dividing and non-surface-dividing cortical progenitor cells. Development. 131, 3133-3145 (2004).
  7. Haubensak, W., Attardo, A., Denk, W., Huttner, W. B. Neurons arise in the basal neuroepithelium of the early mammalian telencephalon: a major site of neurogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 3196-3201 (2004).
  8. Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7, 136-144 (2004).
  9. Merot, Y., Retaux, S., Heng, J. I. Molecular mechanisms of projection neuron production and maturation in the developing cerebral cortex. Seminars in Cell & Developmental Biology. 20, 726-734 (2009).
  10. Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex. Trends Neurosci. 27, 392-399 (2004).
  11. Salomoni, P., Calegari, F. Cell cycle control of mammalian neural stem cells: putting a speed limit on G1. Trends Cell Biol. 20, 233-243 (2010).
  12. Calegari, F., Haubensak, W., Haffner, C., Huttner, W. B. Selective lengthening of the cell cycle in the neurogenic subpopulation of neural progenitor cells during mouse brain development. J Neurosci. 25, 6533-6538 (2005).
  13. Andres-Mach, M., Rola, R., Fike, J. R. Radiation effects on neural precursor cells in the dentate gyrus. Cell Tissue Res. 331, 251-262 (2008).
  14. Semont, A., et al. Involvement of p53 and Fas/CD95 in murine neural progenitor cell response to ionizing irradiation. Oncogene. 23, 8497-8508 (2004).
  15. Nowak, E., et al. Radiation-induced H2AX phosphorylation and neural precursor apoptosis in the developing brain of mice. Radiat Res. 165, 155-164 (2006).
  16. Gatz, S. A., et al. Requirement for DNA ligase IV during embryonic neuronal development. J Neurosci. 31, 10088-10100 (2011).
  17. Denekamp, J. Cell kinetics and radiation biology. International Journal of Radiation Biology and Related Studies in Physics, Chemistry, and Medicine. 49, 357-380 (1986).
  18. Hartwell, L. H., Weinert, T. A. Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events. Science. 246, 629-634 (1989).
  19. Weinert, T. A., Hartwell, L. H. Characterization of RAD9 of Saccharomyces cerevisiae and evidence that its function acts posttranslationally in cell cycle arrest after DNA damage. Mol Cell Biol. 10, 6554-6564 (1990).
  20. Tolmach, L. J., Jones, R. W., Busse, P. M. The action of caffeine on X-irradiated HeLa cells. I. Delayed inhibition of DNA synthesis. Radiat Res. 71, 653-665 (1977).
  21. Painter, R. B., Young, B. R. Radiosensitivity in ataxia-telangiectasia: a new explanation. Proc Natl Acad Sci U S A. 77, 7315-7317 (1980).
  22. Etienne, O., Roque, T., Haton, C., Boussin, F. D. Variation of radiation-sensitivity of neural stem and progenitor cell populations within the developing mouse brain. Int J Radiat Biol. 88, 694-702 (2012).
  23. Roque, T., et al. Lack of a p21waf1/cip -dependent G1/S checkpoint in neural stem and progenitor cells after DNA damage in vivo. Stem Cells. 30, 537-547 (2012).
  24. Rousseau, L., et al. In vivo importance of homologous recombination DNA repair for mouse neural stem and progenitor cells. PLoS One. 7, 12 (2012).
  25. Bradford, J. A., Clarke, S. T. Dual-pulse labeling using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) and 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) in flow cytometry. Curr Protoc Cytom. (2011).
  26. Deckbar, D., et al. The limitations of the G1-S checkpoint. Cancer Res. 70, 4412-4421 (2010).
  27. Manual, Click-iT EdU Imaging Kit. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp10338.pdf (2011).
  28. Weidtkamp-Peters, S., Rahn, H. P., Cardoso, M. C., Hemmerich, P. Replication of centromeric heterochromatin in mouse fibroblasts takes place in early, middle, and late S phase. Histochem Cell Biol. 125, 91-102 (2006).
  29. Wu, R., Terry, A. V., Singh, P. B., Gilbert, D. M. Differential subnuclear localization and replication timing of histone H3 lysine 9 methylation states. Mol Biol Cell. 16, 2872-2881 (2005).
  30. Wu, R., Singh, P. B., Gilbert, D. M. Uncoupling global and fine-tuning replication timing determinants for mouse pericentric heterochromatin. J Cell Biol. 174, 185-194 (2006).
  31. Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness Jr, V. S. The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15, 6046-6057 (1995).
  32. Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. J Vis Exp. (2010).
تقييم التقدم دورة الخلية الجذعية العصبية من الخلايا والسلف في تطوير الدماغ ماوس بعد الإجهاد السمية الوراثية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Etienne, O., Bery, A., Roque, T., Desmaze, C., Boussin, F. D. Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress. J. Vis. Exp. (87), e51209, doi:10.3791/51209 (2014).More

Etienne, O., Bery, A., Roque, T., Desmaze, C., Boussin, F. D. Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress. J. Vis. Exp. (87), e51209, doi:10.3791/51209 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter