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Neuroscience

Évaluation de la progression du cycle cellulaire des cellules souches neurales et progénitrices dans le développement du cerveau de souris après un stress génotoxique

doi: 10.3791/51209 Published: May 7, 2014

Summary

L'administration de deux analogues de la thymidine, et EdU BrdU, dans des souris gravides permet l'analyse de la progression du cycle cellulaire dans les neurones et les cellules progénitrices dans le cerveau de souris embryonnaire. Cette méthode est utile pour déterminer les effets du stress génotoxique, y compris les rayonnements ionisants, au cours du développement du cerveau.

Abstract

Les neurones du cortex cérébral sont générées lors du développement du cerveau à partir de différents types de cellules souches et progénitrices neurales (CNPS), qui forment un épithélium pseudo tapisse les ventricules latéraux du cerveau embryonnaire. Stress génotoxiques, tels que les rayonnements ionisants, ont des effets très néfastes sur le développement du cerveau liée à la grande sensibilité de la NSPC. L'élucidation des mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dépend de la caractérisation de la réponse aux dommages de l'ADN de ces types particuliers de cellules, ce qui nécessite une méthode précise pour déterminer la progression NSPC à travers le cycle cellulaire dans les tissus endommagés. Ici on trouve une méthode basée sur des injections intrapéritonéales successives de EdU et BrdU chez les souris enceintes et en outre la détection de ces deux analogues de la thymidine en coupes coronales du cerveau embryonnaire. EdU BrdU et sont tous les deux incorporés dans l'ADN pendant la replication des cellules en phase S et sont détectés par deux techniques différentes (azide ouun anticorps spécifique, respectivement), ce qui facilite leur détection simultanée. EdU BrdU et la coloration sont ensuite déterminés pour chaque noyau NSPC en fonction de sa distance à partir de la marge ventriculaire dans une région standard du télencéphale dorsal. Ainsi, cette technique de double marquage permet de distinguer les cellules qui ont progressé à travers le cycle cellulaire à partir de ceux qui ont activé un point de contrôle du cycle cellulaire, conduisant à un arrêt du cycle cellulaire en réponse à des dommages à l'ADN.

Un exemple d'expérience est présentée, dans laquelle Edu a été injectée avant l'irradiation et BrdU immédiatement après et les analyses effectuées dans le 4 h après l'irradiation. Ce protocole fournit une analyse précise de la réponse aiguë de lésions de l'ADN de NSPC en fonction de la phase du cycle cellulaire à laquelle ils ont été irradiées. Ce procédé est aisément transposable à d'autres systèmes en vue de déterminer l'incidence d'un traitement particulier sur la progression du cycle cellulaire dans les tissus vivants.

Introduction

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Au cours du développement embryonnaire du cerveau, les neurones de projection du cortex cérébral sont générés dans la zone ventriculaire, un épithélium pseudo composée de différents types de cellules neuronales souches et de cellules progénitrices (NSPC) qui tapisse les ventricules latéraux. Parmi NSPC, les cellules radiales gliales (RGC), qui servent de cellules souches neurales, subissent une migration nucléaire interkinetic (INM): ils effectuent la mitose à la surface du ventricule et de la phase S à la limite de base de la zone ventriculaire (VZ) 1, 2,3. Ils peuvent se diviser de manière symétrique à générer deux RGC ou asymétrique pour générer un RGC et un neurone ou une cellule intermédiaire progénitrices (IPC) 4, 5. IPC migrent à une couche sus-jacente en prolifération dite zone sous-ventriculaire (SVZ), où, après une dernière division symétrique ils génèrent deux neurones de projection immatures 8.6. Contrairement à RGC, l'IPC ne subissent pas l'INM (revue dans 9). Neurones nouvellement générés émigrésmangé radialement le long des fibres radiales dans la zone intermédiaire (IZ) pour atteindre leur destination finale dans la plaque corticale (CP) 10, 8. Le timing parfait de tous ces événements est essentielle pour un développement cortical correct. Par exemple, le passage de la prolifération de la différenciation des populations de cellules progénitrices neurales est contrôlée par la durée de la phase G1 11, 12. L'allongement de la phase G1 corrèle donc avec la différenciation cellulaire.

Stress génotoxique, tels que les rayonnements ionisants, le développement du cerveau sérieusement affaiblir (revue dans 13). Nous et d'autres avons montré que CNPS sont très sujettes à l'apoptose induite par le rayonnement 14, 15,16. Les rayonnements ionisants induisent cassures double brin qui sont les plus graves dommages aux cellules proliférantes. Une composante essentielle de la réponse de l'ADN de dommages (DDR) dans les cellules de cyclisme est l'activation des points de contrôle du cycle cellulaire au G1 / S ou G2 / M transitions ou pendant Sphase (intra-S checkpoint) 17-21. Ils bloquent la progression du cycle cellulaire pour fournir des temps de réparation de l'ADN ou de l'élimination des cellules trop endommagés. Par conséquent, la mort cellulaire ainsi que la progression du cycle cellulaire retardée peuvent altérer le développement du cerveau en réponse à l'exposition au rayonnement ionisant de 22 à 24. Il était donc intéressant de développer une méthode pour évaluer l'activation des points de contrôle du cycle cellulaire dans NSPC chez la souris irradiée cerveau embryonnaire.

La progression du cycle cellulaire est habituellement suivie en utilisant l'incorporation d'un analogue de la thymidine, la 5-bromo-2'-désoxyuridine (BrdU). BrdU est incorporé au cours de la phase S du cycle cellulaire, lorsque l'ADN se réplique. L'utilisation d'un anticorps contre BrdU permet par la suite de la détection de cellules qui étaient en phase S pendant l'impulsion de BrdU.

Un nouvel analogue de la thymidine, la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (EDU) est détectée par un azoture fluorescent. Les différentes façons de détecter EdU et B RDU ne cross-réagit pas 25, ce qui permet la détection simultanée de deux des analogues de la thymidine, qui est utile pour l'étude de la progression du cycle cellulaire. Habituellement cellules sont d'abord marquées avec Edu puis puisées avec BrdU, où le temps entre les deux incorporations dure deux heures 25, 26. L'addition de BrdU dans des milieux de culture contenant EdU entraîne préférentiellement incorporation de BrdU dans l'ADN, à l'exclusion de EdU, alors que l'addition simultanée de 25 EdU avec BrdU équimolaire ou équimolaire par rapport à la moitié des résultats de médias dans seulement l'incorporation de BrdU 27. Cela simplifie le protocole de marquage double en supprimant les étapes de lavage qui sont normalement requises pour éliminer la première étiquette à partir du milieu de culture avant l'addition de la deuxième étiquette. C'est également un intérêt particulier pour l'étude in vivo, où les étapes de lavage ne ​​sont pas possibles, afin de déterminer le moment précis de l'entrée ou de sortie de la population de cellules en phase S.

t "> Récemment, un procédé de marquage à double impulsion dans le cerveau de souris embryonnaire en utilisant EdU et BrdU 23, 24,22 a été développé pour analyser la progression du cycle cellulaire et l'INM de NSPC après l'irradiation in utero. En outre, il a été démontré que, lors de phase S, les cellules de souris reproduire d'abord les régions euchromatine et l'hétérochromatine alors péricentrique 28,29,30. intéressant, hétérochromatine péricentrique de chromosomes différents clusters dans les noyaux interphasiques pour former des foyers d'hétérochromatine aussi connu comme chromocentres et facilement détectable par coloration DAPI comme foyers lumineux. Par conséquent, les différentiels Edu et BrdU colorations de l'euchromatine et chromocentres nous ont aidés à analyser plus précisément la progression de la phase S du CNPS.

Cette méthode a permis la démonstration de l'absence apparente de G1 / S checkpoint dans NSCP 22-24, ce qui est assez surprenant, car ce point de contrôle est censé être critique pour la stabilité du génome. Plusieurs expconceptions de erimental basés sur diverses combinaisons d'impulsions edu et BrdU ont été utilisées pour analyser la progression du cycle cellulaire dans le télencéphale ventral et dorsal. Ici, nous donnons un exemple de protocoles permettant l'étude des dommages de l'ADN aiguë de NSPC dans le 4 premières heures suivant l'irradiation in utero d'embryons de souris E14.5.

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Protocol

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1. Procédures d'animaux

Ce protocole a été conçu en conformité avec la directive du Conseil des Communautés européennes du 24 Novembre 1986 (86/609/CEE) et a été approuvé par notre comité institutionnel sur la protection des animaux (Cetea-CEA DSV IdF).

  1. Injections avec Edu / BrdU et l'irradiation des souris gravides de E14.5 (figure 2A).
    1. Préparer une solution de EdU à 1 mg / ml et de BrdU à 5 mg / ml dans du PBS. Effectuez une injection intra-péritonéale (IP) de 100 pi de solution edu à l'aide d'une aiguille 25 G dans des souris enceintes. 1,5 heures plus tard, les souris ont irradier (irradiation corporelle totale) à 0 Gy ou 2 Gy (0,6 Gy / min). Immédiatement après, injecter (IP) 200 pi de solution de BrdU aide d'une aiguille G 25 dans les souris enceintes.
  2. Préparation de coupes coronales de cerveau embryonnaire.
    1. À 1 h ou 4 h après l'irradiation, euthanasier les souris enceintes par le dioxyde de carbone.
    2. Ouvrez la cavi abdominaleté sur trois centimètres à l'aide de ciseaux. Séparer les deux cornes utérines du reste de l'utérus en sectionnant les deux extrémités des cornes. Transférer les cornes utérines dans une boîte de Pétri contenant du PBS 0,6% de glucose. Ouvrir les cornes utérines avec la pince afin d'isoler les embryons. Retirer le sac amniotique de chaque embryon en utilisant une pince.
    3. Disséquer têtes embryonnaires avec une pince et les fixer par immersion dans du paraformaldéhyde 4% (PFA, pH = 7,4) O / N à 4 ° C.
    4. Rincer têtes embryonnaires dans du PBS pendant au moins une nuit à 4 ° C. Les têtes peuvent être conservés dans du PBS pendant plusieurs jours.
    5. Têtes Intégrer dans la paraffine en utilisant un processeur d'infiltration sous vide comme indiqué dans le tableau 1. Chefs d'enrobage peuvent également être effectuées sous une hotte chimique pour l'éthanol et bains Xylen, puis dans une étuve à 65 ° C pour les bains de paraffine.
    6. Préparer 5 um coupes coronales d'épaisseur avec un microtome.
    7. Monter sur des lames de microscope polylysine enduit. </ Li>
    8. Diapositives peuvent être conservés à température ambiante (TA) pendant plusieurs mois.

2. Edu / BrdU coloration

  1. Déparaffinage et démasquage antigénique
    1. Déparaffiner les coupes de cerveau paraffine par immersion des lames dans 3 bains de toluène pendant 5 min.
    2. Réhydrater pendant 3 min dans 2 bains de chacune des solutions de la diminution de la concentration en éthanol de la manière suivante: 100% de l'éthanol, de l'éthanol à 95%, éthanol à 70%, et 5 min dans H 2 O. Diapositives peuvent être conservés dans de l'eau déminéralisée pour plusieurs heures.
    3. Faire bouillir les tranches pendant 10 minutes dans une solution de citrate (10 mM, pH 6), puis incuber dans de l'eau désionisée pendant 5 min.
  2. EdU coloration
    1. Effectuer une détection EdU selon le protocole du fabricant. Perméabiliser les cellules avec 0,5% de triton X-100 dans du PBS pendant 10 min.
    2. Préparer additif tampon 1X EdU par dilution de la solution 10X dans de l'eau désionisée. Cette solution doit être fraîchement préparé et utilisé sur la même day.
    3. Préparer EdU réaction cocktail, y compris EdU Alexa Fluor 488 azoture. Il est important d'ajouter les ingrédients dans l'ordre indiqué dans le tableau 2, sinon, la réaction ne sera pas procéder de manière optimale. Utilisez la réaction cocktail EdU dans les 15 minutes de préparation.
    4. Retirez le tampon de perméabilisation (étape 2.1.1), puis laver deux fois avec PBS.
    5. Ajouter 150 pi de EdU réaction cocktail, mettre une lamelle et incuber pendant 30 minutes dans l'obscurité à la température ambiante.
    6. Retirer la réaction cocktail EdU, puis laver une fois avec PBS.
  3. BrdU coloration
    1. Préparer du tampon de saturation avec 7,5% de sérum de chèvre et 7,5% de sérum fœtal bovin dans du PBS. Ajouter 150 ul de tampon de saturation sur des tranches de cerveau, mettre une lamelle couvre-objet, et incuber pendant 1 heure à température ambiante pour bloquer la liaison d'anticorps non spécifique.
    2. Retirer la lamelle. Ajouter 150 pi de souris anti-BrdU anticorps primaire dilué à 1/300 dans le tampon de saturation, mettre une lamelle et incuber O /N à 4 ° C.
    3. Retirer la lamelle, puis laver 3 fois en PBS.
    4. Ajouter 150 ul d'anticorps de chèvre anti-souris-Alexa594 anticorps secondaire dilué au 1/400 dans du tampon de saturation, placer une lamelle couvre-objet, et incuber pendant 1 heure à température ambiante.
    5. Retirer la lamelle, puis lavez une fois dans du PBS.
    6. Coloration nucléaire: ajouter 150 ul de 4 ',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) à 1 pg / ml dans du PBS, mettre une lamelle et incuber pendant 2 minutes à température ambiante.
    7. Monter les lames dans un milieu de montage.

3. Analyse

  1. Examiner des coupes de cerveau sous un microscope à fluorescence avec un objectif 20X ou un microscope confocal et acquérir des images à trois voies (488 nm, 594 nm et UV) comme sépare fichiers.
  2. Empilez les images avec le logiciel Photoshop.
  3. Analyser des coupes de cerveau dans un secteur standard de la paroi cérébrale dorsomédial. Ce secteur est de 100 um dans sa dimension médiane-latérale et est divisée en 18 bacs (ou plus) de 10 μm de hauteur dans sa dimension radiale à l'aide d'une grille superposée sur les images (figure 1) comme précédemment décrit 31.
    1. Aligner la grille tel que le premier bac est à la surface ventriculaire, avec son grand axe parallèle à la frontière ventriculaire. Numéroter la EdU marqué, BrdU et / ou noyaux pycnotiques (correspondant à noyaux apoptotiques) dans chaque bac. Compter un noyau situé sur la limite de deux bacs dans le bac qui contient sa plus grande partie, ou dans le bac inférieur, lorsque le noyau occupe des aires égales dans les deux bacs.
  4. L'analyse statistique.

Analyser au moins deux tranches de cortex par embryon. Répétez expériences sur au moins 3 embryons de différentes portées. Les résultats doivent être données en tant que moyenne ± erreur type de la moyenne (SEM). Les analyses statistiques sont effectuées avec Graphpad Prism utilisant ANOVA à deux voies et de multiples tests de comparaison POSTHOC Bonferroni.

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Representative Results

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Dans l'expérience décrite dans la figure 2, on a administré EdU 1,5 h avant l'irradiation et la BrdU juste après l'irradiation. Quatre types de cellules ont ensuite été distingués dans les tranches de cortex préparés en 1 ou 4 heures après l'irradiation, selon la constitution de l'une ou EdU BrdU, les deux ou aucun (Figures 2A et 2B). Surtout, ni EdU ni l'incorporation de BrdU changé le niveau d'apoptose radio-induite (données non présentées). En outre, les méthodes de coloration ne permettent que la détection de la BrdU incorporée EDU et lors de la réplication de l'ADN dans la phase S, mais n'ont pas la sensibilité pour détecter la synthèse d'ADN qui est associée à la réparation, même après irradiation. En effet, i) ni EdU ni BrdU coloration a été observée à 1 h après irradiation (PI) dans les cellules de la plaque corticale, où sont situés les neurones post-mitotiques à la phase G0 et ii) le nombre de Edu (+) et / ou BrdU (+ ) n'a pas été augmenté en irradié par rapport à unirradiated cerveau.

Edu (+) BrdU (+) des noyaux

Edu (+) BrdU (+) des noyaux correspondent à CNPS qui étaient en phase S avant et après 0 h PI. Ils ont ainsi été irradiées en phase S. Comme représenté sur les figures 3B et 3C leur euchromatin est EdU (+) et peut être également BrdU (+). Leurs chromocentres étaient soit BrdU (+) ou BrdU (-). Fonction de la phase S achèvement au moment du sacrifice La figure 2B montre que, à 1 h PI, EdU (+) BrdU (+) des noyaux ont été localisés dans des bacs en phase S (par exemple bacs 4 à 10, où NSPC sont connus pour réaliser la phase S 31. Leur répartition et le nombre n'ont pas été affectées par l'irradiation. Ceci suggère que le rayonnement n'a pas induit d'un bloc complet de la synthèse d'ADN à ce moment.

En cohérence avec la base de la migration apicale nucléaire pendant la phase G2, la plupart des EDU (+) BrdU (+) des noyaux de NSPC ont été trouvés près du ventricule à 4 h PI en brai non irradiéns (figure 2C). Cela ne se produit pas dans 2 Gy irradié cerveau dans laquelle les noyaux sont restés dans les bacs en phase S, beaucoup d'entre eux étant apoptotique. Au total, ces données ont montré que la NSPC irradié en phase S activé intra-S points de contrôle en association avec l'INM retard et la mort cellulaire.

Edu (+) BrdU (-) noyaux

EdU (+) BrdU (-) correspondent à des noyaux de cellules qui étaient en phase S avant et non après irradiation. Chromocentres de ces noyaux sont EdU (+), ce qui indique que les cellules étaient en phase S tardive lorsque EdU a été injecté chez les souris (figure 3A). Depuis G2 / M phases de NSPC dernier 2 h dans le cerveau de souris en développement, l'éducation (+) BrdU (-) NSPC étaient en G2 à 0 h PI. Constamment, la plupart EdU (+) BrdU (-) noyaux ont été trouvées dans la première poubelle près du ventricule dans le cerveau non irradiés à 1 h PI. Ceci est une conséquence de l'INM de NSPC, après la phase S, où beaucoup d'entre eux formés mitoses typiques (figure 2B). À1 h PI, le nombre de Edu (+) BrdU (-) noyaux a été considérablement réduite à la surface ventriculaire et aucun chiffre mitotique était détectable dans le cerveau irradiés. Ces données montrent clairement que les cellules irradiées en G2 activés G2 / M checkpoint dans 1 h PI. En outre, la plupart des EdU (+) BrdU (-) de ces noyaux étaient apoptotique à 4 h PI démontre que CNPS sont très radiosensibles pendant G2 (figure 2C).

Edu (-) BrdU (-) noyaux

Les cellules avec un EdU (-) BrdU (-) correspondent à noyau soit des cellules en G0 (neurones immatures principalement), ou CNPS qui restait dans G1 de EdU incorporation de sacrifices d'animaux (figure 3F). Comparaison entre 1 h et 4 h dans la figure 2C montre la migration nucléaire interkinetic faire que les noyaux qui étaient proches du ventricule dans G1 à 1 h subi leur apicale de migration de base à 4 h, alors que les noyaux qui étaient en phase S se dirigèrent vers la ventricsurface culier.

Comme le montre la figure 2C nombre de ces noyaux apoptotiques étaient à 4 h PI. Le nombre de apoptotique EdU (-) BrdU (-) noyaux est maximale près de la surface ventriculaire et diminue dans les bacs supérieurs. Ces données suggèrent donc que l'apoptose induite par le rayonnement s'est produite dans NSPC qui ont été irradiées lors de la phase G1 précoce et / ou post-mitotique de la migration des neurones. En revanche, aucun ou très peu de noyaux apoptotiques ont été trouvées dans la plaque corticale. Ceci est en accord avec la résistance de rayonnement de neurones qui ont atteint leur destination finale.

Edu (-) BrdU (+) des noyaux

Edu (-) BrdU (+) des noyaux correspondent aux cellules qui sont entrés dans la phase S après l'irradiation. Typiquement à 1 h PI, ils ont montré un marquage BrdU diffuse de euchromatin, mais non de chromocentres. Ainsi, ils étaient en phase S précoce à l'époque (figure 3D). À 1 h PI le nombre et la localisation dans S PVVIHbacs e de Edu (-) BrdU (+) des noyaux est similaire entre les contrôles et les cerveaux irradiés. Ainsi, l'entrée en phase S au cours de la 1 ère heure PI n'a pas été affectée par le rayonnement dans le développement du cerveau de la souris (figure 2B). Fait intéressant, la comparaison de 1 h et 4 h PI dans les cerveaux irradiés montre une baisse du nombre de Edu (-) BrdU (+) des noyaux et la plupart de ces noyaux étaient apoptotique à 4 h PI. Ceci suggère que les cellules qui sont entrés dans la phase S après rayonnement activés points de contrôle intra-S et ont subi l'apoptose par la suite (figure 2C).

Figure 1
Figure 1. Analyse de l'article de cerveau Coupe frontale de l'hémisphère cérébral des embryons de souris E14.5 colorées avec Dapi. EdU et BrdU coloration ainsi que la morphologie nucléaire sont analysés dans un secteur standard de la cerebra dorsomédiall mur à l'aide d'une grille divisée en 18 bacs (ou plus), comme décrit dans le texte. Barre d'échelle:. 20 pm S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Progression du cycle cellulaire de souches irradié et cellules progénitrices neurales (figure de Roque et al., Cellules souches, 2012). (A) Schéma de la conception expérimentale et DAPI (bleu), Edu (vert), et BrdU (rouge) des profils de coloration trouvés en tranches corticales frontales à 1 et 4 h PI (2 Gy). . Barre d'échelle = 20 um (B, C) ​​Numéros / bin de Edu (+) BrdU (-), Edu (+) BrdU (+), Edu (-) BrdU (+), ou Edu (-) BrdU (- noyaux) avec un mo normalerphology dans les contrôles non irradiées (en bleu) et avec une normale (rouge) ou apoptotique (noir pycnotique) morphologie irradié (2 Gy) cortex à 1 h (B) ou 4 h PI (C). Pas de noyaux apoptotiques ont été détectées à 1 h PI (B). L'analyse statistique a été réalisée à l'aide des tests post hoc de Bonferroni. Abréviations: BrdU, 5-bromo-2'-désoxyuridine; DAPI, 4'-6-diamidino-2-phénylindole; Edu, 5-éthynyl-2'deoxyuridine; IZ, zone intermédiaire; SVZ, zone sous-ventriculaire; VZ, zone ventriculaire. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
. Figure 3 différentiels EdU et BrdU coloration de l'euchromatine et chromocentres Panneau supérieur: Z-stackimages confocales de Edu (vert), BrdU (rouge) et la coloration de l'ADN DAPI (bleu) permettant la détection de foyers chromocentres que bleu. Colorations ont été effectuées sur une section du cerveau embryonnaire recueillies à 1 h PI dans des expériences où Edu a été livré 1,5 heure avant l'irradiation et BrdU 0 h PI (seul le contrôle non irradié est affiché) (barre d'échelle: 5 um). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une une plus grande version de cette figure.

Panneaux inférieurs montrent des exemples de 5 modèles différents de EdU et BrdU coloration détecté en tranches coronales de cerveau. Fusionner l'image et canaux simples sont présentés (barre d'échelle: 2 pm):

A) Nucleus avec Edu (+) chromocentres et Edu (+) ou Edu (-) euchromatine. Edu a été ainsi incorporée dans la phase S tardive lors de la réplication de l'hétérochromatine péricentrique: les cellules sont in G2 à 0 h PI.

B) Nucleus avec Edu (+) euchromatine et BrdU (+) chomocenters: EDU a été incorporé dans la phase S précoce quand la plupart des euchromatine est répliquée et BrdU a été incorporé dans la phase S tardive: les cellules étaient en phase S à 0 h PI .

C) Nucleus avec Edu (+) BrdU (+) euchromatine et Edu (-) BrdU (-) chromocentres. Edu et BrdU ont été incorporées dans la première partie de la phase S: ​​Les cellules étaient en phase S précoce à 0 h PI.

D) Nucleus avec BrdU (+) euchromatine et Edu (-) BrdU (-) chromocentre. BrdU a été incorporé dans le début de la phase S. Les cellules ont été à la fin de G1 à 0 h PI et sont entrés en phase de S par la suite.

E) Nucleus avec Edu (-) BrdU (-) euchromatine et chromocentres. Les cellules étaient en G0 (neurones immatures) ou en phase G1 et ne sont pas entrés en phase S pendant Edu et BrdU impulsions.

Solution Incubation Température Pression Agitation
1 Alcool à 70% 30 min 35 ° C sur sur
2 de l'alcool à 95% 15 min 35 ° C sur sur
3 de l'alcool à 95% 30 min 35 ° C sur sur
4 de l'alcool à 95% 45 min 35 ° C sur sur
5 de l'alcool à 100% 15 min 35 ° C sur sur
6 de l'alcool à 100% 30 min 35 ° C sur sur
7 de l'alcool à 100% 1 heure 35 ° C sur sur
8 Toluène 100% 30 min 35 ° C sur sur
9 Toluène 100% 45 min 35 ° C sur sur
10 Toluène 100% 1 heure 35 ° C sur sur
11 Paraffine 30 min 58 ° C sur sur
12 Paraffine 1 heure 58 ° C sur sur
13 Paraffine 1 heure 58 ° C sur sur
14 Paraffine 1,5 h 58 ° C sur sur

Table1. Programme de traitement sous vide d'infiltration pour inclusion dans la paraffine.

composants de réaction pour une diapositive
Tampon de réaction 1X EdU 128,64 pi
CuSO 4 6 pi
EdU Alexa Fluor azoture 0,36 pi
1X EdU additif tampon de réaction 15 ul
Le volume total 150 pl

Tableau 2. EdU cocktails de réaction.

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Discussion

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Le dispositif expérimental décrit ici sur la base de l'incorporation de EdU 1,5 heure avant l'irradiation et l'incorporation de BrdU immédiatement après irradiation a permis la démonstration que NSPCs sont capables d'activer S et G2 / M points de contrôle, mais pas au point de contrôle G1 / S au cours de la 1 ère heure après un stress génotoxique dans le cerveau de fœtus de souris. Nous avons effectué d'autres expériences dans lesquelles Edu a été injecté à différents temps après l'irradiation et BrdU, à seulement 1 h avant souris sacrifices, nous permettant d'apprécier précisément le taux d'entrée en phase S. Ces expériences ont démontré que la NSPC ne pas activer un G1 / S arrestation après un stress génotoxique in vivo 22,23.

Par conséquent, le choix entre la réparation de l'ADN et l'apoptose ne se produit pas au point de contrôle G1 / S qui soulève la question de la nature des mécanismes garantissant la stabilité du génome de ces cellules.

Le protocole est simple et rapide. L'autreétapes ne présentent aucune difficulté évidente. Cette technique est une alternative à l'utilisation de chloro-désoxyuridine (CldU) et iodo-désoxyuridine (IDU), dont on a montré une réaction croisée 32.

Un large panel d'applications peut être considéré, comme le protocole est facilement flexible et adaptable à plusieurs questions biologiques. Des exemples de changements sont proposés dans Roque et ses collaborateurs 23, Etienne et ses collaborateurs 22, et dans Rousseau et ses collaborateurs 24. Il peut être également combiné avec une détection par immunofluorescence de plusieurs marqueurs cellulaires ou des protéines impliquées dans la réponse aux dommages à l'ADN, par exemple. Veuillez noter, que dans ce cas, à la fois BrdU et la détection EdU pourraient être réalisées avec différents fluorophores qui sont commercialisés, pour favoriser la détection immunitaire d'autres marqueurs.

EdU et incorporation de BrdU dans vivo dans NSPC pourraient également être utilisés dans le tri cellulaire par cytométrie de flux pour d'autres analyses biochimiques. Enfin, eest procédé pourrait être réalisée pour surveiller la progression du cycle cellulaire de NSPC dans différents types de souris mutantes ou après d'autres types de stress génotoxiques (autres que les rayonnements ionisants), ou tout autre traitement qui affecte la progression du cycle cellulaire. En outre, il pourrait être facilement adapté à d'autres tissus de réplication.

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Disclosures

Les auteurs n'ont pas de conflit d'intérêt.

Acknowledgments

Les recherches menant aux présents résultats ont bénéficié du financement du septième programme-cadre de l'Union européenne (FP7/2007-2013) sous convention de subvention n ° 323267, d'Électricité de France (EDF) et de l'Agence Nationale de la Recherche - Santé-Environnement et Santé-Travail (ANR-SEST, Neurorad).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EdU Life Technologies A10044 1 mg/ml
BrdU Life Technologies B5002 5 mg/ml
IBL 637 CIS BIO International
Tissu Tek VIP Leica
Microtome Leica RM 2125 RT
Triton X-100 Sigma-Aldrich 93443
Click-iT EdU Alexa 488 imaging kit Life Technologies C10083
Anti-BrdU GE Healthcare RPN202 1/300
Goat anti mouse-Alex594 Life Technologies A11001 1/400
Fluoromount SouthernBiotech 0100-01
Polysine slide Thermo scientific J2800AMNZ
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
PBS Life Technologies 20012-068
DAPI Sigma-Aldrich D9542
Microscope BX51 Olympus
Confocal microscope SPE Leica
Prism software Graphpad Version 5.0c
Photoshop software Adobe

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rakic, P. Specification of cerebral cortical areas. Science. 241, 170-176 (1988).
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Évaluation de la progression du cycle cellulaire des cellules souches neurales et progénitrices dans le développement du cerveau de souris après un stress génotoxique
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Etienne, O., Bery, A., Roque, T., Desmaze, C., Boussin, F. D. Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress. J. Vis. Exp. (87), e51209, doi:10.3791/51209 (2014).More

Etienne, O., Bery, A., Roque, T., Desmaze, C., Boussin, F. D. Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress. J. Vis. Exp. (87), e51209, doi:10.3791/51209 (2014).

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