Summary
Verwaltung der beiden Analoga von Thymidin, EDU und BrdU, bei schwangeren Mäusen ermöglicht die Analyse des Zellzyklus in neuronalen und Vorläuferzellen im embryonalen Gehirn der Maus. Dieses Verfahren ist nützlich, um die Auswirkungen der genotoxischen Stress, einschließlich ionisierender Strahlung, während der Gehirnentwicklung zu bestimmen.
Abstract
Neuronen der Hirnrinde während der Gehirnentwicklung von verschiedenen Arten von neuralen Stamm-und Vorläuferzellen (NSPC), die einen mehrreihigen Epithel der lateralen Ventrikel des embryonalen Gehirn bilden erzeugt. Genotoxischen Stress, wie ionisierende Strahlung, haben hocheilige Wirkungen auf das sich entwickelnde Gehirn, um die hohe Empfindlichkeit NSPC bezogen. Aufklärung der zellulären und molekularen Mechanismen hängt von der Charakterisierung der DNA-Schadensantwort dieser bestimmten Arten von Zellen, die ein genaues Verfahren erfordert NSPC Progression durch den Zellzyklus in der beschädigten Gewebe zu bestimmen. Hier ist eine Methode, die auf aufeinanderfolgende intraperitoneale Injektionen von EdU und BrdU bei schwangeren Mäusen und weiteren Nachweis dieser zwei Thymidin-Analoga in koronalen Abschnitte des embryonalen Gehirns gezeigt. EdU und BrdU sowohl in DNA replizierender Zellen während der S-Phase eingearbeitet und werden von zwei verschiedenen Techniken (Azid oder detektiertein spezifischer Antikörper bezeichnet), die ihre gleichzeitige Detektion zu erleichtern. EdU und BrdU-Färbung werden dann für jedes NSPC Kern in Abhängigkeit von seinem Abstand von der ventrikulären Marge in einem Standardbereich der dorsalen Telen bestimmt. Damit diese doppelte Markierungstechnik ermöglicht die Unterscheidung Zellen durch den Zellzyklus von denen, die Zellzyklus-Kontrollpunkt, die zu Zellzyklusarrest in Reaktion auf DNA-Schäden aktiviert fortgeschritten.
Ein Beispiel für ein Experiment vorgestellt, in dem EdU wurde vor der Bestrahlung und unmittelbar nach BrdU injiziert und Analysen innerhalb der 4 Stunden nach der Bestrahlung durchgeführt. Dieses Protokoll stellt eine genaue Analyse der DNA-Schadensantwort akuten NSPC der in Abhängigkeit von der Phase des Zellzyklus in der sie bestrahlt wurden. Dieses Verfahren ist leicht umstellbar auf viele andere Systeme, um die Wirkung einer bestimmten Behandlung auf die Zellzyklus-Progression in lebenden Geweben zu bestimmen.
Introduction
Während der embryonalen Entwicklung des Gehirns, werden Projektionsneuronen des zerebralen Kortex in der ventrikulären Zone erzeugt wird, ein mehrreihigen Epithel von verschiedenen Arten von neuralen Stamm-und Vorläuferzellen (NSPC) besteht, die Linien der lateralen Ventrikel. Unter NSPC die radialen Gliazellen (RGC), die als neuronale Stammzellen dienen, unterzogen interkinetic Kernwanderung (INM): sie Mitose führen an der Oberfläche der Herzkammer und der S-Phase an der Grundgrenze des ventrikulären Zone (VZ) 1, 2,3. Sie können entweder symmetrisch teilen, um zwei RGC erzeugen oder asymmetrisch um ein RGC und ein Neuron oder eine Zwischenvorläuferzelle (IPC) 4, 5 zu erzeugen. IPC wandern zu einer darüberliegenden Schicht wuchernden genannt Subventrikularzone (SVZ), wo nach einem letzten symmetrische Teilung sie zwei unreifen Projektionsneuronen 6-8 generieren. Im Gegensatz zu RGC, IPC nicht unterziehen INM (9 Bewertung). Neu erzeugte Neuronen MIGRaß radial entlang der radialen Fasern durch die Zwischenzone (IZ) an ihren Bestimmungsort in der kortikalen Platte (CP) 10, 8 zu erreichen. Das perfekte Timing aller dieser Ereignisse ist von wesentlicher Bedeutung für eine korrekte kortikalen Entwicklung. Zum Beispiel der Wechsel von Proliferation, die Differenzierung von neuronalen Vorläuferpopulationen wird durch die Dauer der G1-Phase 11, 12 gesteuert. Die Verlängerung der G1-Phase korreliert somit mit der Zelldifferenzierung.
Genotoxische Stress, wie ionisierende Strahlung, stark beeinträchtigen die Entwicklung des Gehirns (in 13 überprüft). Wir und andere haben gezeigt, dass NSPC sind sehr anfällig für strahlungsinduzierte Apoptose 14, 15,16. Ionisierende Strahlung induziert DNA-Doppelstrangbrüche, die am meisten zu schweren Schäden an wuchernden Zellen sind. Eine wesentliche Komponente der DNA-Schadensantwort (DDR) in Rad-Zellen die Aktivierung von Zellzyklus-Checkpoints in der G1 / S oder G2 / M-Übergänge oder während SPhase (intra-S-Checkpoint) 17-21. Sie blockieren die Zellzyklus-Progression, um Zeit für DNA-Schäden zu reparieren oder Beseitigung von beschädigten Zellen zu liefern. Folglich kann Zelltod sowie verzögerte Progression des Zellzyklus die Entwicklung des Gehirns als Reaktion auf ionisierende Strahlung 22-24 verändern. Es war daher interessant, ein Verfahren, um die Aktivierung von Zellzyklus-Checkpoints in NSPC im bestrahlten Maus embryonale Gehirn beurteilen zu entwickeln.
Das Fortschreiten des Zellzyklus wird routinemäßig mit dem Einbau eines Thymidin-Analogon, 5-Bromo-2'-desoxyuridin (BrdU) gefolgt. BrdU während der S-Phase des Zellzyklus, wenn die DNA repliziert aufgenommen. Die Verwendung von einem Antikörper gegen BrdU ermöglicht danach die Detektion von Zellen, in die S-Phase während des Pulses von BrdU waren.
Eine neuartige Thymidin-Analogon, 5-Ethinyl-2'-Desoxyuridin (EDU) von einem fluoreszierenden Azid detektiert. Die verschiedenen Möglichkeiten, um EdU und B zu erkennen RDU nicht kreuzreagieren, 25, die den gleichzeitigen Nachweis beider Thymidin-Analoga, die nützlich für das Studium der Zellzyklusprogression ist. Normalerweise Zellen werden zunächst mit EdU gepulst und dann mit BrdU, wo die Zeit zwischen den beiden Eingemeindungen dauert zwei Stunden 25, 26 gepulst. Zugabe von BrdU in Kulturmedien, die EdU führt vorzugsweise Einbau von BrdU in die DNA unter Ausschluss von Bildung, während gleichzeitiger Zugabe von 25 EdU mit äquimolare oder äquimolare BrdU Hälfte der Medien ergibt nur BrdU-Inkorporation 27. Dies erleichtert die doppelten Markierungsprotokoll durch die Beseitigung der Waschschritte, die normalerweise erforderlich sind, um die erste Markierung aus dem Kulturmedium vor der Zugabe des zweiten Etiketts zu entfernen. Dies ist auch von besonderem Interesse für die in-vivo-Studie, in der die Waschschritte sind nicht möglich, den genauen Zeitpunkt der S-Phase Eintritt oder Austritt von Zellpopulation zu bestimmen.
t "> Kürzlich wurde ein Verfahren zur Zwei-Puls-Markierung in embryonalen Mäusehirn EdU und mit BrdU 23, 24,22 ist entwickelt worden, um die Zellzyklusprogression und INM der NSPC nach Bestrahlung in utero zu analysieren. Außerdem wurde nachgewiesen, dass bei S-Phase, Maus-Zellen replizieren zunächst die Euchromatin Regionen und dann die perizentrischen Heterochromatin 28,29,30. Interessanterweise perizentrischen Heterochromatin von verschiedenen Chromosomen in interphasic Kerne gruppiert, um heterochromatischen Herde auch als Chromozentren bekannt und leicht durch DAPI-Färbung als helle Herde nachweisbar bilden. Daher werden die Differenz EdU und BrdU-Färbungen von Euchromatin und Chromozentren half uns, genauer zu analysieren Fortschreiten der S-Phase NSPC.Diese Methode erlaubt die Demonstration der scheinbaren Mangel an G1 / S Kontrollpunkt in NSCP 22-24, die ganz überraschend ist, da diese Checkpoint soll entscheidend für die Genomstabilität sein. Mehrere experimental Designs basierend auf verschiedenen Kombinationen von Bildung und BrdU-Impulse werden verwendet, um die Zellzyklusprogression in der ventralen und dorsalen Telen analysieren. Hier geben wir ein Beispiel für die Protokolle, die die Untersuchung der akuten DNA-Schäden von NSPC innerhalb der ersten 4 Stunden nach der Bestrahlung in utero E14.5 Mausembryonen.
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Protocol
1. Tierverfahren
Dieses Protokoll wurde in Übereinstimmung mit der Richtlinie Europäischen Gemeinschaften Rates vom 24. November 1986 (86/609/EWG) entwickelt und ist von unseren institutionellen Ausschusses für Tierschutz (Cetea-CEA DSV IdF) genehmigt worden.
- Injektionen mit EdU / BrdU und Bestrahlung von E14.5 schwangeren Mäusen (Abbildung 2A).
- Eine Lösung aus EdU bei 1 mg / ml BrdU und bei 5 mg / ml in PBS. Ausführen einer intraperitonealen (ip) Injektion von 100 ul EdU Lösung unter Verwendung einer 25 G-Nadel in schwangeren Mäusen. 1,5 Stunden später, bestrahlen Mäusen (Ganzkörperbestrahlung) bei 0 Gy oder 2 Gy (0,6 Gy / min). Unmittelbar nach injizieren (IP) 200 ul BrdU-Lösung mit einer 25 G Nadel in den schwangeren Mäusen.
- Vorbereitung der koronalen Scheiben von embryonalen Gehirnen.
- Bei 1 h oder 4 Stunden nach der Bestrahlung, einschläfern die schwangeren Mäusen durch Kohlendioxid.
- Öffnen Sie die Bauch cavity über drei Zentimeter mit einer Schere. Trennen der beiden Uterushörner von dem Rest des Uterus durch Schneiden beider Enden der Hörner. Übertragung der Uterushörner in eine Petrischale mit PBS 0,6% Glucose. Öffnen der Uterushörner mit der Zange, um die Embryonen zu isolieren. Entfernen Sie die Fruchtblase von jedem Embryo mit einer Pinzette.
- Präparieren Sie embryonalen Köpfe mit einer Pinzette und befestigen Sie sie durch Eintauchen in 4% Paraformaldehyd (PFA, pH = 7,4) O / N bei 4 ° C
- Spülen embryonalen Köpfe in PBS für mindestens eine Nacht bei 4 ° C. Heads in PBS für mehrere Tage aufbewahrt werden.
- Einbettung in Paraffin Köpfe unter Verwendung einer Vakuuminfiltrationsprozessor wie in Tabelle 1 angegeben. Köpfe Einbettung kann auch unter einer chemischen Haube für Ethanol und Xylen Bäder in einem 65 ° C Ofen für die Paraffinbäder durchgeführt werden, und dann.
- Bereiten 5 um dicke koronale Schnitte mit einem Mikrotom.
- Montieren Sie auf Polylysin-beschichtete Objektträger. </ Li>
- Folien können bei Raumtemperatur (RT) für mehrere Monate aufbewahrt werden.
2. EdU / BrdU-Färbung
- Entparaffinierung und Antigen-Demaskierung
- Entparaffinieren Paraffin eingebetteten Gehirnschnitte durch Eintauchen der Objektträger in 3 Bäder Toluol für 5 min.
- Rehydrieren für 3 min in 2 Bäder mit jeweils Lösungen von Ethanolkonzentration abnimmt, wie folgend: Ethanol 100%, 95% Ethanol, 70% Ethanol und 5 min in H 2 O. Folien können in entionisiertem Wasser für mehrere Stunden gehalten werden.
- Koche die Scheiben für 10 min in Citrat-Lösung (10 mM, pH 6) und dann in deionisiertem Wasser für 5 min inkubiert.
- EdU Färbung
- Führen EdU Erfassung gemäß dem Protokoll des Herstellers. Durchdringbar Zellen mit 0,5% Triton X-100 in PBS für 10 min.
- Bereiten 1X EdU Puffer-Zusatz durch Verdünnen der 10X-Lösung in VE-Wasser. Diese Lösung sollte frisch hergestellt und am selben da verwendet werden,y.
- Bereiten EdU Reaktion Cocktail, einschließlich EdU Alexa Fluor 488 Azid. Es ist wichtig, die folgenden Bestandteile, die in Tabelle 2 aufgeführten Reihenfolge hinzugefügt, andernfalls wird die Reaktion nicht optimal ablaufen. Verwenden Sie die EdU Reaktion Cocktail innerhalb von 15 Minuten der Vorbereitung.
- Entfernen Sie die Permeabilisierung Puffer (Schritt 2.1.1), dann zweimal mit PBS waschen.
- In 150 ul EdU Reaktion Cocktail, setzen Sie ein Deckglas, und Inkubation für 30 min im Dunkeln bei RT.
- Entfernen Sie die EdU Reaktion Cocktail, dann einmal mit PBS waschen.
- BrdU-Färbung
- Vorbereitung Sättigungspuffer 7,5% Ziegenserum und 7,5% fötales Rinderserum in PBS. In 150 ul Sättigungspuffer auf Gehirnschnitten, setzen Sie ein Deckglas, und Inkubation für 1 h bei RT, um nicht-spezifische Antikörper blockieren verbindlich.
- Entfernen Sie das Deckglas. In 150 ul Maus-Anti-BrdU primären Antikörper bei 1/300 Sättigungspuffer verdünnt, setzen Sie ein Deckglas und Inkubation O /N bei 4 ° C
- Entfernen Sie das Deckglas, dann waschen Sie 3-mal in PBS.
- In 150 ul Ziege-Anti-Maus-Alexa594 sekundären Antikörper bei 1/400, die in Sättigungspuffer verdünnt, setzen Sie ein Deckglas, und Inkubation für 1 h bei RT.
- Entfernen Sie das Deckglas, dann einmal in PBS waschen.
- Kernfärbung: add 150 ul 4 ',6-Diamino-2-phenylindol (DAPI) bei 1 ug / ml in PBS, setzen Sie ein Deckglas und Inkubation für 2 min bei RT.
- Montieren Sie Folien in Montagemedium.
3. Analyse
- Untersuchen Hirnschnitten unter einem Fluoreszenzmikroskop mit einem 20x-Objektiv oder ein konfokales Mikroskop und Bilder zu erhalten in drei Kanäle (488 nm, 594 nm und UV) trennt als Dateien.
- Stapeln Sie Bilder mit Photoshop-Software.
- Analysieren Gehirnschnitte in einem Standard-Sektor der dorsomedial Hirn Wand. Dieser Bereich ist 100 um im medial-lateralen Abmessung und ist in 18 bins (oder mehr) von 10 μ geteiltm Höhe in ihrer radialen Abmessung mit einem Raster von Bildern überlagert (Fig. 1), wie zuvor beschrieben 31.
- Ausrichten des Gitters wie das erste Fach ist an der ventrikulären Oberfläche mit ihrer langen Achse parallel zu der ventrikuläre Grenze. Dann die Nummer des markierten EdU, BrdU-und / oder pyknotische Kerne (entspricht apoptotischen Kerne) in jedem Fach. Anzahl einen Kern an der Grenze der beiden Fächer in den Papierkorb, die seine größeren Teil oder im unteren Behälter enthält, wenn der Zellkern befindet sich gleich Bereiche innerhalb der zwei Behälter entfernt.
- Die statistische Analyse.
Analysieren Sie mindestens zwei kortikalen Scheiben pro Embryo. Wiederholen Experimente an mindestens 3 Embryonen aus verschiedenen Würfen. Ergebnisse sind als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) angegeben werden. Statistische Analysen sind mit Graphpad Prism mit Zwei-Wege-ANOVA und Bonferroni Post-hoc-Mehrfachvergleich Tests durchgeführt.
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Representative Results
In der in Fig. 2 beschriebenen Experiment wurde EdU 1,5 h vor der Bestrahlung verabreicht wird und BrdU nur nach Bestrahlung. Vier Arten von Zellen wurden dann in den kortikalen Scheiben auf 1 oder 4 h nach Bestrahlung zubereitet aus, nach dem Einbau von BrdU oder EdU entweder beide oder keines (2A und 2B). Wichtig ist, dass weder EdU noch BrdU-Einbau verändert die Höhe der Strahlung induzierte Apoptose (Daten nicht gezeigt). Darüber hinaus ermöglichen die Färbemethoden nur der Nachweis von EDU und BrdU während der DNA-Replikation in der S-Phase eingebracht, aber nicht die Empfindlichkeit auf die DNA-Synthese, die mit der Reparatur auch nach Bestrahlung zugeordnet ist detektieren können. Tatsächlich i) weder EdU noch BrdU-Färbung wurde bei 1 h nach Bestrahlung (PI) in Zellen des kortikalen Platte, wohin postmitotischen Neuronen an G0-Phase befindet, und ii) die Anzahl der EDU (+) und / oder BrdU (+ beobachtet ) war nicht in bestrahlten stieg im Vergleich zum unirradiated Gehirne.
EDU (+) BrdU (+)-Kerne
EDU (+) BrdU (+)-Kerne entsprechen NSPC, die vor und nach 0 h PI in der S-Phase waren. Sie wurden also in der S-Phase bestrahlt. Wie in den 3B und 3C gezeigt ist ihre Euchromatin EDU (+) und kann auch BrdU (+) sein. Ihre Chromozenterbildung entweder BrdU (+) oder BrdU (-). Je nach Vollendung der S-Phase zum Zeitpunkt der Opferung Fig. 2B zeigt, daß bei 1 h PI, EDU (+) BrdU (+)-Kerne wurden in der S-Phase Behälter lokalisiert (dh Fächer 4 bis 10, wobei NSPC bekannt, um die S-Phase 31 durchzuführen. Ihre Verteilung und Zahlen wurden durch die Bestrahlung nicht beeinträchtigt. Dies legt nahe, dass die Strahlung nicht einen vollständigen Block der DNA-Synthese zu diesem Zeitpunkt zu induzieren.
Im Einklang mit dem Grund nach apikal Kernwanderung während der G2-Phase wurden die meisten EdU (+) BrdU (+) Kerne NSPC in der Nähe der Herzkammer bei 4 h PI in unbestrahlten brai gefundenns (Abbildung 2C). Dies fand nicht statt in 2 Gy bestrahlt Gehirn, in der Kerne blieb in der S-Phase Tonnen, von denen viele apoptotische. Insgesamt sind dies Daten zeigten, dass NSPC bestrahlt in der S-Phase aktiviert, Intra-S-Checkpoints in Verbindung mit verzögerter INM und Zelltod.
EDU (+) BrdU (-) Kerne
Edu (+) BrdU (-) Kerne entsprechen Zellen, die in der S-Phase vor und nicht nach der Bestrahlung waren. Chromozenterbildung dieser Kerne sind EDU (+) zeigt an, dass Zellen in späten S-Phase, wenn EdU wurde in Mäusen (Fig. 3A) injiziert. Da G2 / M Phasen NSPC letzten 2 Stunden in den Entwicklungs Gehirn der Maus, EDU (+) BrdU (-) NSPC waren in G2 bei 0 h PI. Konsequent meisten EDU (+) BrdU (-)-Kerne wurden in den ersten Behälter in der Nähe des Ventrikels in unbestrahlten Gehirn bei 1 h PI. Dies ist eine Folge des INM NSPC, nach der S-Phase, wobei viele von ihnen gebildeten typischen Mitosen (Abb. 2B). Bei1 Stunde PI, die Zahl der EDU (+) BrdU (-) Kerne wurde deutlich bei der ventrikulären Oberfläche reduziert und keine mitotische Figur war in bestrahlten Gehirn nachweisbar. Diese Daten zeigen deutlich, dass Zellen in G2 bestrahlt aktiviert die G2 / M Kontrollpunkt innerhalb von 1 Stunde PI. Außerdem sind die meisten der EDU (+) BrdU (-) dieser Kerne wurden bei 4 Stunden PI zeigt, daß apoptotische NSPC sind sehr strahlen während G2 (Fig. 2C).
EdU (-) BrdU (-)-Kerne
Zellen mit einem EdU (-) BrdU (-) Kern entsprechen entweder Zellen in G0 (vornehmlich unreifen Neuronen) oder NSPC, die in G1 von EdU Einbeziehung der Tieropfer (3E) geblieben. Vergleich zwischen 1 Stunde und 4 Stunden in 2C zeigt interkinetic Kernwanderung machen, dass Kerne, die bei 1 Stunde in der Nähe der Herzkammer waren in G1 unterzog ihre apikal basale Migration bei 4 Stunden, während Kerne, die in der S-Phase waren, gingen in Richtung der ventricdere Oberfläche.
Wie in 2C gezeigt, viele dieser Kerne wurden bei 4 Stunden PI apoptotisch. Die Zahl der apoptotischen EdU (-) BrdU (-) Kerne maximal war in der Nähe der ventrikulären Oberfläche und verringert im oberen Behälter. Diese Daten deuten daher kam, dass Strahlen-induzierte Apoptose in NSPC, die während der frühen G1-Phase und / oder post-mitotischen Neuronen Migration bestrahlt wurden. Im Gegensatz dazu wurden keine oder nur sehr wenige apoptotische Kerne in der kortikalen Platte gefunden. Dies ist in Übereinstimmung mit der Strahlungsresistenz von Neuronen, die ihren Bestimmungsort erreicht haben.
EDU (-) BrdU (+)-Kerne
EdU (-) BrdU (+) Kerne entsprechen Zellen, die S-Phase nach Bestrahlung eingetragen. Typischerweise bei 1 h PI zeigten sie eine diffuse BrdU-Markierung von Euchromatin, aber nicht von Chromozenterbildung. So waren sie in der frühen S-Phase zu diesem Zeitpunkt (Abbildung 3D). Bei 1 h PI die Anzahl und Lokalisation im S phasE Bins EdU (-) BrdU-(+)-Kerne ist ähnlich zwischen den Kontrollen und bestrahlten Gehirne. So S-Phase Eintritt während der 1. Stunde PI wurde nicht von Strahlung in der Maus entwickelnden Gehirns (2B) betroffen. Interessanterweise Vergleich von 1 Stunde und 4 Stunden PI in bestrahlten Gehirn zeigt einen Rückgang in der Zahl der EdU (-) BrdU-(+)-Kerne und die meisten von diesen Kernen waren apoptotische bei 4 h PI. Dies legt nahe, dass Zellen, die S-Phase nach Bestrahlung aktiviert eingegeben intra-S-Checkpoints und unterzog sich danach Apoptose (Abbildung 2C).
Abbildung 1. Analyse von Hirnschnitt Frontalschnitt des Hirnhemisphäre von E14.5 Mausembryonen mit DAPI. EdU und BrdU-Färbung sowie Kernmorphologie sind in einem Standard-Sektor der dorsomedial cerebra analysiert gebeiztl Wand mit einem Gitter in 18 bins (oder mehr) aufgeteilt, wie im Text beschrieben. Maßstab:. Um 20 Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
2. Zellzyklusprogression von bestrahlten neuralen Stamm-und Vorläuferzellen (Abbildung aus Roque et al., Stammzellen, 2012). (A) Schematische Darstellung des experimentellen Design und DAPI (blau), EDU (grün) und BrdU (rot) Färbungsmuster in kortikalen koronalen Scheiben gefunden bei 1 und 4 Stunden PI (2 Gy). . Maßstabsbalken = 20 um (B, C) Zahlen / bin von Edu (+) BrdU (-), EDU (+) BrdU (+), EDU (-) BrdU (+) oder EdU (-) BrdU (- ) Kerne mit einem normalen morphology in unbestrahlten Kontrollen (blau) und mit einem normalen (rot) oder Apoptose (pyknotische, schwarz) Morphologie in bestrahlten (2 Gy) Kortex bei 1 h (B) oder 4 Stunden PI (C). Keine apoptotischen Kerne wurden bei 1 h PI (B) nachgewiesen. Die statistische Analyse wurde mit Bonferroni Post-hoc-Tests. Abkürzungen: BrdU-, 5-Brom-2'-desoxyuridin; DAPI, 4'-6-Diamidino-2-Phenylindol; EdU, 5-Ethinyl-2'deoxyuridine; IZ, Zwischenzone; SVZ, Subventrikularzone; VZ, ventrikuläre Zone. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
. Abbildung 3 Differenz EdU und BrdU-Färbung von Euchromatin und Chromozentren Oberplatte: Z-Stapelkonfokale Bilder von Edu (grün), BrdU (rot) und DNA-Färbung mit DAPI gegengefärbt (blau), die den Nachweis von Chromozentren so hell blau Herde. Färbungen wurden auf einem 1 Std. bei PI in Experimenten, bei denen EdU wurde 1,5 Stunden geliefert gesammelt embryonalen Hirnschnitt durchgeführt, vor der Bestrahlung und BrdU 0 hr PI (Maßstabsbalken: 5 um) (nur der unbestrahlten Kontrolle gezeigt). Bitte klicken Sie hier, um eine zu sehen Größere Version der Figur.
Bodenplatten zeigen Beispiele für die 5 verschiedene Muster von EdU und BrdU-Färbung in koronalen Hirnschnitten nachgewiesen. Zusammenführen von Bild-und Einzel Kanäle gezeigt (Maßstab: 2 um):
A) Nucleus EdU mit (+) und Chromozentren EdU (+) oder EdU (-) Euchromatin. EdU wurde somit im späten S-Phase während der Replikation der perizentrischen Heterochromatin eingebaut: Die Zellen waren in G2 bei 0 h PI.
B) mit Nucleus EdU (+) Euchromatin und BrdU (+) chomocenters: EdU hat in der frühen S-Phase eingearbeitet worden, als die meisten von Euchromatin repliziert und BrdU wurde im späten S-Phase aufgenommen worden: die Zellen in der S-Phase bei 0 h PI .
C) mit Nucleus EdU (+) BrdU (+) Euchromatin und EdU (-) BrdU (-) Chromozentren. EdU und BrdU im ersten Teil der S-Phase aufgenommen wurden: Die Zellen wurden in der frühen S-Phase bei 0 h PI.
D) Nucleus mit BrdU (+) Euchromatin und EdU (-) BrdU (-) Chromozentrum. BrdU wurde Anfang der S-Phase eingearbeitet. Die Zellen wurden in der späten G1 bei 0 h PI und trat in die S-Phase danach.
E) mit Nucleus EdU (-) BrdU (-) Euchromatin und Chromozentren. Die Zellen wurden in G0 (unreife Neuronen) oder in der G1-Phase und nicht während EdU und BrdU Impulse geben S-Phase.
| Lösung | Inkubation | Temperatur | Druck | Agitation | |
| 1 | Alkohol 70% | 30 min | 35 ° C | auf | auf |
| 2 | Alkohol 95% | 15 min | 35 ° C | auf | auf |
| 3 | Alkohol 95% | 30 min | 35 ° C | auf | auf |
| 4 | Alkohol 95% | 45 min | 35 ° C | auf | auf |
| 5 | Alkohol 100% | 15 min | 35 ° C | auf | auf |
| 6 | Alkohol 100% | 30 min | 35 ° C | auf | auf |
| 7 | Alkohol 100% | 1 Stunde | 35 ° C | auf | auf |
| 8 | Toluol 100% | 30 min | 35 ° C | auf | auf |
| 9 | Toluol 100% | 45 min | 35 ° C | auf | auf |
| 10 | Toluol 100% | 1 Stunde | 35 ° C | auf | auf |
| 11 | Paraffin | 30 min | 58 ° C | auf | auf |
| 12 | Paraffin | 1 Stunde | 58 ° C | auf | auf |
| 13 | Paraffin | 1 Stunde | 58 ° C | auf | auf |
| 14 | Paraffin | 1,5 h | 58 ° C | auf | auf |
Tabelle1. Vakuuminfiltrations Prozessor-Programm für die Paraffineinbettung.
| Reaktionskomponenten für 1 Schlitten | |
| EdU 1X Reaktionspuffer | 128,64 ul |
| CuSO 4 | 6 ul |
| EdU Alexa Fluor Azid | 0,36 ul |
| EdU 1X Reaktionspuffer Additiv | 15 ul |
| Gesamtvolumen | 150 ul |
Tabelle 2. EdU Reaktion Cocktails.
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Discussion
Die hier auf der Grundlage Einbau von EdU 1,5 h beschriebenen Versuchsaufbau vor der Bestrahlung und der Einbau von BrdU unmittelbar nach der Bestrahlung erlaubt die Demonstration, die nach einer NSPC sind in der Lage, S und G2 / M Kontrollpunkte aktivieren, nicht aber die G1 / S Kontrollpunkt während der 1. Stunde genotoxischen Stress in der fetalen Gehirn der Maus. Wir führten weitere Experimente, in denen EdU hat zu verschiedenen Zeiten nach der Bestrahlung und BrdU injiziert worden, nur 1 Stunde vor Mäusen Opfer, so dass wir speziell schätzen die Geschwindigkeit der S-Phase-Eintrag. Diese Experimente haben gezeigt, dass NSPC keine G1 / S Festnahme nach einer genotoxischen Stress in vivo 22,23 aktivieren.
Daher wird die Wahl zwischen der DNA-Reparatur und Apoptose nicht am G1 / S Kontrollpunkt, die Frage nach der Art der Mechanismen guarantying Genomstabilität in diesen Zellen vorkommt.
Das Protokoll ist einfach und schnell. Die verschiedenenSchritte stellen keine offensichtliche Schwierigkeit. Dieses Verfahren ist eine Alternative zu der Verwendung von Chlor-Desoxyuridin (CldU) und Iod-Desoxyuridin (IdU), die kreuzreagieren 32 gezeigt wurden.
Eine breite Platte von Anwendungen in Betracht gezogen werden, da das Protokoll ist leicht flexibel und anpassungsfähig auf mehrere biologische Fragen. Beispiele für Änderungen sind in Roque vorgeschlagen und Mitarbeiter 23, Etienne und Mitarbeiter 22 und in Rousseau und Mitarbeiter 24. Es könnte auch mit Immunfluoreszenz-Nachweis von mehreren Zellmarkern oder Proteine in die DNA-Reparatur beteiligt sind beispielsweise kombiniert werden. Beachten Sie, dass in diesem Fall sowohl BrdU und EdU Erfassungs könnte mit verschiedenen Fluorophoren, die kommerziell durchgeführt werden, um die Immundetektion von anderen Markern zu begünstigen.
EdU und BrdU in vivo-Einbau in NSPC könnte auch in der Zelle verwendet werden, die Sortierung nach Durchflusszytometrie für weitere biochemische Analyse. Schließlich thist Methode könnte durchgeführt, um den Zellzyklus von NSPC überwachen in verschiedenen Arten von mutierten Mäusen oder nach anderen Arten von Belastungen genotoxisch (andere als ionisierende Strahlung) oder einer anderen Behandlung beeinflussen Zellzyklus-Progression. Darüber hinaus könnte es sich leicht auf andere replizieren Gewebe angepasst werden.
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Disclosures
Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Die Forschung, die zu diesen Ergebnissen geführt Mittel von der Europäischen Union Siebten Rahmenprogramms (FP7/2007-2013) unter Finanzhilfevereinbarung Nr. 323267 erhalten, von der Electricité de France (EDF) und von l'Agence Nationale de la Recherche - Santé-Environnement Santé et Travail-(ANR-SEST, Neurorad).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EdU | Life Technologies | A10044 | 1 mg/ml |
| BrdU | Life Technologies | B5002 | 5 mg/ml |
| IBL 637 | CIS BIO International | ||
| Tissu Tek VIP | Leica | ||
| Microtome | Leica | RM 2125 RT | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Click-iT EdU Alexa 488 imaging kit | Life Technologies | C10083 | |
| Anti-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1/300 |
| Goat anti mouse-Alex594 | Life Technologies | A11001 | 1/400 |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Polysine slide | Thermo scientific | J2800AMNZ | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-068 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Microscope BX51 | Olympus | ||
| Confocal microscope SPE | Leica | ||
| Prism software | Graphpad | Version 5.0c | |
| Photoshop software | Adobe |
References
- Rakic, P. Specification of cerebral cortical areas. Science. 241, 170-176 (1988).
- Sauer, F. Mitosis in he neural tube. J Comp Neurol. , 377-399 (1935).
- Taverna, E., Huttner, W. B. Neural progenitor nuclei IN motion. Neuron. 67, 906-914 (2010).
- Committee, B. Embryonic vertebrate central nervous system: revised terminology. Anat Rec. 166, 257-261 (1970).
- Bystron, I., Blakemore, C., Rakic, P. Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited. Nature Reviews. Neuroscience. 9, 110-122 (2008).
- Miyata, T., et al. Asymmetric production of surface-dividing and non-surface-dividing cortical progenitor cells. Development. 131, 3133-3145 (2004).
- Haubensak, W., Attardo, A., Denk, W., Huttner, W. B. Neurons arise in the basal neuroepithelium of the early mammalian telencephalon: a major site of neurogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 3196-3201 (2004).
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7, 136-144 (2004).
- Merot, Y., Retaux, S., Heng, J. I. Molecular mechanisms of projection neuron production and maturation in the developing cerebral cortex. Seminars in Cell & Developmental Biology. 20, 726-734 (2009).
- Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex. Trends Neurosci. 27, 392-399 (2004).
- Salomoni, P., Calegari, F. Cell cycle control of mammalian neural stem cells: putting a speed limit on G1. Trends Cell Biol. 20, 233-243 (2010).
- Calegari, F., Haubensak, W., Haffner, C., Huttner, W. B. Selective lengthening of the cell cycle in the neurogenic subpopulation of neural progenitor cells during mouse brain development. J Neurosci. 25, 6533-6538 (2005).
- Andres-Mach, M., Rola, R., Fike, J. R. Radiation effects on neural precursor cells in the dentate gyrus. Cell Tissue Res. 331, 251-262 (2008).
- Semont, A., et al. Involvement of p53 and Fas/CD95 in murine neural progenitor cell response to ionizing irradiation. Oncogene. 23, 8497-8508 (2004).
- Nowak, E., et al. Radiation-induced H2AX phosphorylation and neural precursor apoptosis in the developing brain of mice. Radiat Res. 165, 155-164 (2006).
- Gatz, S. A., et al. Requirement for DNA ligase IV during embryonic neuronal development. J Neurosci. 31, 10088-10100 (2011).
- Denekamp, J. Cell kinetics and radiation biology. International Journal of Radiation Biology and Related Studies in Physics, Chemistry, and Medicine. 49, 357-380 (1986).
- Hartwell, L. H., Weinert, T. A. Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events. Science. 246, 629-634 (1989).
- Weinert, T. A., Hartwell, L. H. Characterization of RAD9 of Saccharomyces cerevisiae and evidence that its function acts posttranslationally in cell cycle arrest after DNA damage. Mol Cell Biol. 10, 6554-6564 (1990).
- Tolmach, L. J., Jones, R. W., Busse, P. M. The action of caffeine on X-irradiated HeLa cells. I. Delayed inhibition of DNA synthesis. Radiat Res. 71, 653-665 (1977).
- Painter, R. B., Young, B. R. Radiosensitivity in ataxia-telangiectasia: a new explanation. Proc Natl Acad Sci U S A. 77, 7315-7317 (1980).
- Etienne, O., Roque, T., Haton, C., Boussin, F. D. Variation of radiation-sensitivity of neural stem and progenitor cell populations within the developing mouse brain. Int J Radiat Biol. 88, 694-702 (2012).
- Roque, T., et al. Lack of a p21waf1/cip -dependent G1/S checkpoint in neural stem and progenitor cells after DNA damage in vivo. Stem Cells. 30, 537-547 (2012).
- Rousseau, L., et al. In vivo importance of homologous recombination DNA repair for mouse neural stem and progenitor cells. PLoS One. 7, 12 (2012).
- Bradford, J. A., Clarke, S. T. Dual-pulse labeling using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) and 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) in flow cytometry. Curr Protoc Cytom. , (2011).
- Deckbar, D., et al. The limitations of the G1-S checkpoint. Cancer Res. 70, 4412-4421 (2010).
- Manual, Click-iT EdU Imaging Kit. , http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp10338.pdf (2011).
- Weidtkamp-Peters, S., Rahn, H. P., Cardoso, M. C., Hemmerich, P. Replication of centromeric heterochromatin in mouse fibroblasts takes place in early, middle, and late S phase. Histochem Cell Biol. 125, 91-102 (2006).
- Wu, R., Terry, A. V., Singh, P. B., Gilbert, D. M. Differential subnuclear localization and replication timing of histone H3 lysine 9 methylation states. Mol Biol Cell. 16, 2872-2881 (2005).
- Wu, R., Singh, P. B., Gilbert, D. M. Uncoupling global and fine-tuning replication timing determinants for mouse pericentric heterochromatin. J Cell Biol. 174, 185-194 (2006).
- Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness Jr, V. S. The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15, 6046-6057 (1995).
- Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. J Vis Exp. , (2010).
