Summary
מנהל של שני אנלוגים של תימידין, edu וBrdU, בעכברים בהריון מאפשר הניתוח של התקדמות מחזור התא בעצבי ובתאים במוח העכבר העוברי. שיטה זו שימושית כדי לקבוע את ההשפעות של מתח genotoxic, כוללים קרינה מייננת, בהתפתחות המוח.
Abstract
נוירונים בקליפת המוח נוצרים במהלך התפתחות מוח מסוגים שונים של תאי גזע ועצביים (NSPC), המהווים האפיתל המצפה את pseudostratified חדרים לרוחב של המוח העוברי. לחצי genotoxic, כגון קרינה מייננת, יש השפעות מזיקות ביותר על המוח המתפתח הקשורות לרגישות הגבוהה של NSPC. הבהרה של המנגנונים התאיים ומולקולריים המעורבים תלויה באפיון של תגובת הנזק לדנ"א של סוגים מסוימים של תאים אלה, המחייב את השיטה מדויקת כדי לקבוע התקדמות NSPC דרך מחזור התא ברקמה הפגועה. כאן מוצג שיטה המבוססת על זריקות intraperitoneal רצופות של edu וBrdU בעכברים בהריון וגילוי נוסף של שני אנלוגים תימידין אלה בסעיפי העטרה של המוח העוברי. Edu וBrdU שניהם שולבו ב-DNA של תאים משכפלים בשלב S ומזוהים על ידי שתי טכניקות שונות (אזיד אונוגדן ספציפי, בהתאמה), המאפשר זיהוי סימולטני שלהם. Edu ומכתים BrdU לאחר מכן נקבעו לכל גרעין NSPC בפונקציה של המרחק שלה מהשוליים של החדר באזור רמת telencephalon הגבי. לכן טכניקת תיוג כפולה זו מאפשרת להבחין בתאים שהתקדמו דרך מחזור התא מאלו שהפעילו מחסום מחזור תא שמוביל לעצירת מחזור התא בתגובה לנזק לדנ"א.
דוגמא לניסוי שהוצגה, שבי edu הוזרק לפני ההקרנה וBrdU מייד לאחר והניתוחים שבוצע בשעה 4 לאחר הקרנה. פרוטוקול זה מספק ניתוח מדויק של תגובת הנזק לדנ"א החריף של NSPC בתפקודו של השלב של מחזור התא שבו הם נחשפים לקרינה. שיטה זו היא קלות transposable למערכות רבות אחרות על מנת לקבוע את ההשפעה של טיפול מסוים על התקדמות מחזור התא ברקמות חיות.
Introduction
במהלך התפתחות מוח עוברית, תאי עצב השלכה של קליפת המוח נוצרים באזור חדרית, האפיתל pseudostratified המורכב מסוגים שונים של גזע עצבי ובתאים (NSPC) של שהחדרים לרוחב קווים. בין NSPC, תאי גלייה רדיאלי (RGC), המשמשים כתאי גזע עצביים, עוברים הגירה גרעינית interkinetic (INM): הם מבצעים מיטוזה על פני השטח של החדר והשלב-S בגבול הבסיס של אזור חדרית (VZ) 1, 2,3. הם יכולים לחלק בין אם באופן סימטרי ליצירת שני RGC או לא סימטרי כדי ליצור RGC אחד ותא עצב אחד או תא ביניים אב (IPC) 4, 5. IPC להגר לשכבה שמעליה מתרבים הנקראת אזור subventricular (SVZ), שבו לאחר החלוקה סימטרית האחרון הם מייצרים שני נוירונים הקרנה בשלה 6-8. בניגוד לRGC, IPC אינו עובר INM (בדיקה ב 9). נוירונים חדשים שנוצרו migrאכלתי רדיאלית לאורך הסיבים רדיאליים דרך אזור ביניים (י. ז) כדי להגיע ליעד הסופי שלהם בצלחת בקליפת המוח (CP) 10, 8. התזמון המושלם של כל האירועים הללו הוא חיוני להתפתחות קליפת המוח נכונה. למשל מעבר מההפצה לבידול של אוכלוסיות עצביות נשלטת על ידי משך שלב G1 11, 12. ההתארכות של שלב G1 וקושרת וכך עם התמיינות תאים.
מתח genotoxic, כגון קרינה מייננת, התפתחות המוח יפגע קשות (שנסקרה ב13). אנחנו ואחרים הראו כי NSPC נוטה מאוד לאפופטוזיס מושרה קרינה 14, 15,16. קרינה מייננת לגרום להפסקות גדיל הדנ"א כפולות שהניזק החמור ביותר לתאים מתרבים. מרכיב חיוני אחד תגובת נזק לדנ"א (DDR) בתאי רכיבה על אופניים הוא ההפעלה של מחסומי מחזור תא ב/ מעברי M-G1 / S או G2 או במהלך Sשלב (מחסום התוך S) 17-21. הם חוסמים את התקדמות מחזור התא כדי לספק זמן לתיקון נזק לדנ"א או חיסול של תאים פגועים מדי. כתוצאה מכך, מוות של תאים, כמו גם התקדמות מחזור התא מעוכבת עשוי לשנות את התפתחות מוח בתגובה לחשיפה לקרינה מייננת 22-24. זה היה כך מעניין לפתח שיטה להעריך את הפעלת מחסומי מחזור התא בNSPC במוח העוברי של העכברים המוקרן.
ההתקדמות של מחזור התא באופן שיגרתי ואחרי שימוש בשילוב של אנלוגי תימידין, 5-Bromo-2'-deoxyuridine (BrdU). BrdU משולב בשלב S של מחזור התא, כאשר ה-DNA הוא שכפול. השימוש בנוגדנים נגד BrdU מאפשר לאחר מכן זיהוי של תאים שהיו בשלב S במהלך הדופק של BrdU.
אנלוגי תימידין רומן, 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (edu) הוא זוהה על ידי אזיד ניאון. הדרכים השונות כדי לזהות edu ו-B RDU לא חוצה להגיב 25, המאפשר זיהוי בו זמני של שני אנלוגים תימידין, וזה שימושי לחקר התקדמות מחזור התא. בדרך כלל תאים פעמו ראשונה עם edu ולאחר מכן פעמו עם BrdU, שבו הזמן בין שתי ההתאגדות נמשך כמה שעות 25, 26. תוספת של BrdU בתקשורת והתרבות המכילה edu תוצאות במעדיפות שילוב של BrdU לתוך DNA עם ההרחקה של EDU, בעוד בנוסף בו זמנית של edu 25 עם BrdU equimolar או חצי equimolar לתוצאות התקשורת בשילוב BrdU רק 27. זה מפשט את פרוטוקול התיוג הכפול על ידי ביטול הצעדים לשטוף, כי הם בדרך כלל נדרשו להסיר את התווית הראשונה מהתקשורת והתרבות לפני תוספת של התווית השנייה. זה גם הוא של עניין מיוחד עבור in vivo מחקר, שבו צעדי הכביסה אינם אפשריים, כדי לקבוע את העיתוי המדויק של כניסת שלב S או יציאה של אוכלוסיית תאים.
t "> לאחרונה, שיטה של תיוג כפול דופק במוח עכבר העוברי באמצעות edu ו23 BrdU, 24,22 פותחה כדי לנתח את התקדמות מחזור התא וINM של NSPC לאחר הקרנה ברחם. יתר על כן זה כבר הוכיח כי, במהלך שלב S, תאי עכבר לשכפל ראשון אזורי euchromatin ולאחר מכן heterochromatin pericentric 28,29,30. מעניין, heterochromatin pericentric של כרומוזומים שונים התקבצו בגרעיני interphasic כדי ליצור מוקדי heterochromatic הידוע גם בchromocenters ובקלות לזיהוי על ידי מכתים DAPI כמוקדים בהירים. לכן, stainings edu וBrdU ההפרש של euchromatin וchromocenters עזר לנו לנתח באופן מדויק יותר את התקדמות שלב S של NSPC.שיטה זו אפשרה להפגנה של חוסר לכאורה של מחסום G1 / S בNSCP 22-24, וזה די מפתיע שכן מחסום זה אמור להיות קריטי ליציבות הגנום. כמה expעיצובי erimental מבוססים על שילובים שונים של קטניות edu וBrdU שימשו כדי לנתח את התקדמות מחזור התא בtelencephalon הגחון ועל הגב. הנה, אנחנו נותנים דוגמא של פרוטוקולים המאפשרים המחקר של הנזקים אקוטי DNA של NSPC בתוך 4 שעות הראשונות שלאחר הקרנה ברחם של עוברי עכברי E14.5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. נהלי בעלי החיים
פרוטוקול זה תוכנן בהתאם להוראת מועצת הקהילות האירופית של 24 נובמבר 1986 (86/609/EEC) ואושר על ידי ועדה המוסדית שלנו על רווחת בעלי חיים (CETEA-CEA DSV צה"ל).
- זריקות עם edu / BrdU והקרנה של עכברות הרות E14.5 (איור 2 א).
- הכן פתרון של edu ב1 מ"ג / מיליליטר וBrdU ב5 מ"ג / מיליליטר PBS. לבצע הזרקה תוך הצפק (IP) של פתרון edu 100 μl באמצעות מחט 25 G לעכברים בהריון. 1.5 שעות מאוחר יותר, להקרין את העכברים (הכוללת הקרנת גוף) בשעה 0 Gy או 2 Gy (0.6 Gy / min). מייד לאחר מכן, להזריק (IP) 200 μl של פתרון BrdU באמצעות מחט 25 G לעכברים בהריון.
- הכנת פרוסות העטרה של מוח העוברי.
- בשעה 1 או 4 שעות לאחר הקרנה, להרדים את העכברים בהריון על ידי פחמן דו חמצני.
- פתח את קאווי הבטןty בשלושה סנטימטרים בעזרת מספריים. להפריד בין שתי קרנות רחם משאר הרחם על ידי חתך שני הגפיים של הקרניים. העבר את קרן הרחם לתוך צלחת פטרי המכילה גלוקוז 0.6% PBS. פתח את קרנות רחם עם המלקחיים כדי לבודד את העוברים. הסר את השק השפיר של כל עובר באמצעות מלקחיים.
- לנתח ראשים עובריים עם מלקחיים ולתקן אותם על ידי טבילה בparaformaldehyde 4% (PFA, pH = 7.4) O / N ב 4 ° C.
- יש לשטוף את הראש עוברי ב-PBS ללילה אחד לפחות ב 4 ° C. יכולים להיות כל הזמן בראשים PBS במשך כמה ימים.
- ראשים להטביע בפרפין באמצעות מעבד חדירת ואקום כפי שמצוין בטבלה 1. יכולים גם להתבצע ראשי ההטבעה מתחת למכסת מנוע כימית לאתנול ואמבטיות xylen, ולאחר מכן בתנור 65 מעלות צלזיוס למשך אמבטיות פרפין.
- הכן את סעיפי העטרה עבים 5-מיקרומטר עם microtome.
- הר על גבי שקופיות מיקרוסקופ מצופה polylysine. </ Li>
- יכולות להישמר שקופיות בטמפרטורת חדר (RT) במשך מספר חודשים.
2. Edu / BrdU מכתים
- הסרת מסכות Deparaffinization ואנטיגן
- Deparaffinize החלקים במוח פרפין, מוטבע על ידי טבילה של שקופיות ב3 אמבטיות של טולואן למשך 5 דקות.
- רעננותם במשך 3 דקות ב2 אמבטיות של כל פתרונות של הפחתת ריכוז אתנול כבא: 100% אתנול, 95% אתנול, 70% אתנול, ו 5 דקות בH 2 O. יכולות להיות כל הזמן במגלשות מים deionized במשך כמה שעות.
- מרתיחים את הפרוסות ל10 דקות בתמיסת ציטרט (10 מ"מ, pH 6), ולאחר מכן לדגור במי deionized במשך 5 דקות.
- מכתים edu
- לבצע זיהוי edu על פי הפרוטוקול של היצרן. Permeabilize תאים עם 0.5% X-100 טריטון ב PBS עבור 10min.
- הכן את תוסף חיץ 1X edu על ידי דילול פתרון 10X במי deionized. פתרון זה צריך להיעשות טרי והשתמש באותו day.
- הכן קוקטייל תגובת edu, כוללים אזיד edu אלקסה פלואוריד 488. חשוב להוסיף את המרכיבים הבאים לפי הסדר הרשום בטבלה 2, אחרת, התגובה לא תמשיך בצורה אופטימלית. השתמש בקוקטייל תגובת edu בתוך 15 דקות של הכנה.
- הסר את חיץ permeabilization (צעד 2.1.1), ולאחר מכן לשטוף פעמיים עם PBS.
- הוסף 150 μl של קוקטייל תגובת edu, לשים coverslip, ודגירת 30 דקות בחושך ב RT.
- הסר את קוקטייל תגובת edu, ולאחר מכן לשטוף פעם עם PBS.
- מכתים BrdU
- הכן את חיץ הרוויה עם 7.5% נסיוב עזים ו7.5% בסרום שור עוברי ב-PBS. הוסף 150 μl של חיץ הרוויה על פרוסות מוח, לשים את coverslip, ודגירה עבור שעה 1 ב RT לחסום נוגדן שאינו ספציפי מחייב.
- הסר את coverslip. הוסף 150 μl של נוגדן ראשוני עכבר אנטי BrdU המדולל ב1/300 במאגר רוויה, לשים coverslip ודגירת O /N ב 4 ° C.
- הסר את coverslip, ולאחר מכן לשטוף 3 פעמים ב-PBS.
- הוסף 150 μl של נוגדנים משני אנטי עכבר Alexa594 העז מדוללים ב1/400 במאגר רוויה, לשים coverslip, ודגירה עבור שעה 1 ב RT.
- הסר את coverslip, ולאחר מכן לשטוף פעם אחת ב-PBS.
- מכתים גרעיני: להוסיף 150 μl של 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) בשעה 1 מיקרוגרם / מיליליטר PBS, לשים coverslip ו דגירה למשך 2 דקות ב RT.
- הר שקופיות בהרכבה בינונית.
3. ניתוח
- בחן את החלקים במוח תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מטרת 20X או מיקרוסקופ confocal ולרכוש תמונות בשלושה ערוצים (488 ננומטר, 594 ננומטר ו-UV) כמפריד בין קבצים.
- מחסנית תמונות עם תוכנת Photoshop.
- נתח את החלקים במוח במגזר סטנדרטי של קיר מוחין dorsomedial. מגזר זה הוא 100 מיקרומטר בממד המדיאלי לרוחב והוא מחולק ל18 פחים (או יותר) של 10 μמ 'גובה בממד הרדיאלי שלה באמצעות רשת superposed על תמונות (איור 1) כפי שתואר לעיל ביום 31.
- יישר את הרשת כגון הסל הראשון הוא על פני החדר, עם מקביל לציר הארוך שלה לגבול של החדר. לאחר מכן למספר את edu שכותרתו, BrdU ו / או גרעיני pyknotic (המקביל ל גרעינים אפופטוטיים) בכל סל. מספר גרעין ממוקם על הגבול של שני פחים לפח המכיל חלק שלה גדול יותר, או בסל נמוך יותר, כאשר הגרעין תופס שטחים שווים תוך הפחים.
- ניתוח סטטיסטי.
לנתח לפחות שתי פרוסות בקליפת המוח לעובר. חזור על ניסויים בלפחות 3 עוברים מהמלטות שונות. יש לתת תוצאות כשגיאה ממוצעת ± התקן של הממוצע (SEM). ניתוחים סטטיסטיים שנערכו עם GraphPad פריזמה באמצעות ANOVA דו כיוונית ובדיקות posthoc השוואה מרובות Bonferroni.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בניסוי המתואר באיור 2, edu היה מנוהל 1.5 שעות לפני ההקרנה וBrdU רק לאחר הקרנה. ארבעה סוגים של תאים ולאחר מכן היו להבחין בפרוסות בקליפת המוח שהוכנו ב1 או 4 שעות שלאחר הקרנה, על פי השילוב של שני edu או BrdU, אף שניהם או (2 א ודמויות 2B). חשוב לציין, לא edu ולא שילוב BrdU שינה את הרמה של אפופטוזיס מושרה קרינה (מידע לא מוצג). יתר על כן, שיטות הצביעה מאפשרות רק את הגילוי של EDU וBrdU שולב במהלך שכפול הדנ"א בשלב-S אבל אין לי הרגישות לזיהוי סינתזה של DNA, המשויכת לתיקון גם לאחר הקרנה. ואכן, אני) לא edu ולא מכתים BrdU נצפה בהודעת שעה הקרנת 1 (PI) בתאים של הצלחת בקליפת המוח, שבו נמצאים תאי עצב postmitotic בשלב G0 וii) מספר EDU (+) ו / או BrdU (+ ) לא עלה במוקרן בהשוואה לunirradiated מוח.
גרעיני EDU (+) BrdU (+)
גרעיני BrdU EDU (+) (+) מתאימות לNSPC שהיו בשלב S לפני ואחרי 0 PI שעה. הם היו מוקרנים ובכך בשלב S. כפי שניתן לראות ב3B דמויות ו3C euchromatin הוא EDU (+) ועשוי להיות גם BrdU (+). chromocenters היו או BrdU (+) או BrdU (-). בהתאם להשלמת שלב S בזמן הקרבת איור 2 מראה כי בPI 1 שעות, גרעיני EDU (+) BrdU (+) היו נקודתיים בפחי שלב S (כלומר פחים 4-10, שם NSPC ידועים לבצע שלב S ביום 31. ההפצה והמספרים שלהם לא הושפעו על ידי הקרנה. הדבר מצביע על כך שהקרינה לא לגרום לחסימה של סינתזת דנ"א מלאה בשלב זה.
באופן עקבי עם הבסיס להגירה גרעינית הפסגה בשלב G2, רוב הגרעינים (+) BrdU (+) edu של NSPC נמצאו ליד החדר ב 4 PI שעות בbrai unirradiatedNS (איור 2 ג). זה לא קרה ב2 Gy מוקרן מוחות שבו גרעינים נשארו בפחי שלב S, שרבים מהם הוא אפופטוטיים. הנתונים אלה הראו כי בסך הכל NSPC מוקרן בשלב S יופעל מחסומי התוך S בשיתוף עם INM המושהה ומוות של תאים.
BrdU EDU (+) (-) גרעינים
BrdU EDU (+) (-) גרעינים מתאימות לתאים שהיו בשלב S לפני ולא אחרי ההקרנה. Chromocenters של גרעינים אלה הם EDU (+), מצביע על כך שתאים היו בשלב-S מאוחר כאשר edu שהוזרק בעכברים (איור 3 א). מאז שלבי G2 / M של NSPC האחרון שעה 2 במוח העכבר מתפתח, edu (+) BrdU (-) NSPC היו בG2 ב 0 PI שעה. באופן עקבי, BrdU ביותר EDU (+) (-) גרעינים נמצאו בסל הראשון ליד החדר במוחה unirradiated בPI 1 שעות. זוהי תוצאה של INM של NSPC, לאחר שלב S, שבו רבים מהם יצרו דמויות המיטוטי טיפוסיות (איור 2). בPI 1 שעות, מספר EDU (+) BrdU (-) גרעינים הופחתו באופן משמעותי על פני החדר ולא דמות המיטוטי הייתה להבחין במוחם מוקרן. נתונים אלו מראים בבירור כי תאים מוקרנים ב G2 הופעלו G2 / M המחסום בתוך PI 1 שעות. יתר על כן, רוב edu BrdU (+) (-) של גרעינים אלה היו אפופטוטיים ב4 PI שעות הוכחת כי NSPC הוא radiosensitive מאוד במהלך G2 (איור 2 ג).
Edu (-) BrdU (-) גרעינים
תאים עם EDU (-) BrdU (-) גרעין מתאימות לשני תאים בG0 (נוירונים בעיקר בשלה), או NSPC שנותר בG1 מהתאגדות edu להקרבת בעלי חיים (איור 3E). השוואה בין 1 שעות ו 4 שעות באיור 2C מצביעה על הגירה גרעינית interkinetic עושה שגרעינים שהיו קרובים לחדר בG1 בשעה 1 עברו קודקודם להגירה בסיס ב 4 שעות, ואילו גרעינים שהיו בשלב S הלכו לכיוון ventricמשטח תואר בלבד.
כפי שמוצג באיור 2 ג רבים של גרעינים אלה היו אפופטוטיים ב4 PI שעה. מספר edu אפופטוטיים (-) BrdU (-) גרעינים היו מקסימאלי בקרבת פני השטח של החדר ויורד בסלים העליונים. נתונים אלה מראים, אפוא, כי אפופטוזיס מושרה הקרינה הזאת התרחש בNSPC שכבר מוקרן בתחילת שלב G1 ו / או הודעה המיטוטי-נודדים תאי עצב. לעומת זאת, אף אחד או מעט מאוד גרעינים אפופטוטיים נמצאו בצלחת בקליפת המוח. זה בהתאם להתנגדות הקרינה של נוירונים שהגיעו ליעדן הסופי.
גרעיני BrdU (+) - EDU ()
Edu (-) גרעיני BrdU (+) מתאימות לתאים שנכנסו לשלב S לאחר הקרנה. בדרך כלל בPI 1 שעות, הם הראו תיוג BrdU מפוזר של euchromatin, אבל לא של chromocenters. כך הם היו בשלב S המוקדם בזמן ש( איור 3D). בPI 1 שעות המספר והלוקליזציה בתוך phas Sפחי דואר של EDU (-) גרעיני BrdU (+) דומים בין בקרות ומוח מוקרן. לכן כניסת S-שלב במהלך PI 1 שעות st לא הושפעה מקרינה במוח המתפתח של העכבר (איור 2). מעניין לציין, כי השוואה של 1 שעות ו 4 PI שעות במוח מוקרן מצביעה על ירידה במספרם של EDU (-) גרעיני BrdU (+) ורוב הגרעינים אלה היו אפופטוטיים ב4 PI שעה. הדבר מצביע על כך תאים שנכנסו לשלב S לאחר הקרינה הופעלו מחסומי התוך S ועברו אפופטוזיס לאחריו (איור 2 ג).
איור 1. ניתוח של סעיף עטרת סעיף המוח של האונה המוח של עוברי עכברי E14.5 מגואלות DAPI. Edu ומכתים BrdU כמו גם מורפולוגיה גרעינית מנותחות במגזר סטנדרטי של cerebra dorsomedialקיר l באמצעות רשת המחולקת ל18 פחים (או יותר) כפי שמתואר בטקסט. בר סולם:. 20 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. התקדמות מחזור התא של מוקרן גזע עצבי ותאים ובתאים (איור מRoque et al., תאי גזע, 2012). (א) תרשים סכמטי של עיצוב ניסיוני וDAPI (הכחול), edu (ירוק), וBrdU (אדום) מכתים דפוסים שנמצאו בקליפת מוח פרוסות העטרה בPI 1 ו 4 שעות (2 Gy). . קנה מידה בר = 20 מיקרומטר (B, C) מספרים / bin של EDU (+) BrdU (-), BrdU EDU (+) (+), edu (-) BrdU (+), או EDU (-) BrdU (- גרעינים) עם מו נורמליrphology בבקרת nonirradiated (הכחול) ועם נורמלי (אדום) או אפופטוטיים מורפולוגיה (pyknotic, שחורה) במוקרן (2 Gy) הקורטקס בשעה 1 (ב) או PI 4 שעות (C). אין גרעינים אפופטוטיים התגלו בPI 1 שעות (ב '). ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות post hoc בדיקות Bonferroni. קיצורים: BrdU, 5-bromo-2'-deoxyuridine; DAPI, 4'-6-diamidino-2-phenylindole; Edu, 5-ethynyl-2'deoxyuridine; א.ת., אזור ביניים; SVZ, אזור subventricular; VZ, אזור חדרית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
. איור 3 דיפרנציאל edu ומכתים BrdU של euchromatin וchromocenters פנל עליון: Z-מחסניתתמונות confocal של EDU (ירוק), BrdU (אדום) מכתים ו-DNA counterstained עם DAPI (כחול) המאפשרים זיהוי של chromocenters כמוקדים כחולים בהירים. Stainings בוצעו על סעיף מוח עוברי שנאסף בPI 1 שעות בניסויים שבם edu נמסר 1.5 שעות לפני PI 0 שעות ההקרנה וBrdU (שליטת unirradiated רק מוצגת) (סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר). אנא לחץ כאן לצפייה גרסה גדולה יותר של דמות זו.
פנלים תחתון מראים דוגמאות של 5 דפוסים של edu ומכתים BrdU זוהה בפרוסות מוח העטרה שונים. מיזוג תמונה וערוצים בודדים מוצגים (סרגל קנה מידה: 2 מיקרומטר):
() גרעין עם EDU (+) chromocenters וEDU (+) או EDU - euchromatin). Edu כבר שולב ובכך בשלב מאוחר במהלך השכפול של heterochromatin pericentric: התאים היו i G2 n ב 0 PI שעה.
B) גרעין עם edu euchromatin (+) וBrdU + chomocenters (): edu כבר שולב בשלב S המוקדם, כאשר רוב euchromatin משוכפל וBrdU כבר שולב בשלב מאוחר: התאים היו בשלב S ב 0 PI שעות .
euchromatin C) גרעין עם EDU (+) BrdU (+) וEDU (-) BrdU (-) chromocenters. Edu וBrdU כבר שולבו בחלק הראשון של שלב S: התאים היו בשלב S המוקדם ב 0 PI שעה.
euchromatin D) גרעין עם BrdU (+) וEDU (-) BrdU (-) chromocenter. BrdU כבר שולב בתחילתו של שלב S. התאים היו בG1 מאוחר ב0 PI שעה ונכנסו לשלב S לאחר מכן.
E) גרעין עם EDU (-) BrdU (- euchromatin) וchromocenters. התאים היו בG0 (נוירונים לא בשלה) או בשלב G1 ולא נכנסו לשלב S במהלך פולסים edu וBrdU.
| פתרון | דגירה | טמפרטורה | לחץ | תסיסה | |
| 1 | אלכוהול 70% | 30 דקות | 35 ° C | על | על |
| 2 | אלכוהול 95% | 15 דקות | 35 ° C | על | על |
| 3 | אלכוהול 95% | 30 דקות | 35 ° C | על | על |
| 4 | אלכוהול 95% | 45 דקות | 35 ° C | על | על |
| 5 | אלכוהול 100% | 15 דקות | 35 ° C | על | על |
| 6 | אלכוהול 100% | 30 דקות | 35 ° C | על | על |
| 7 | אלכוהול 100% | 1 שעות | 35 ° C | על | על |
| 8 | טולואן 100% | 30 דקות | 35 ° C | על | על |
| 9 | טולואן 100% | 45 דקות | 35 ° C | על | על |
| 10 | טולואן 100% | 1 שעות | 35 ° C | על | על |
| 11 | פרפין | 30 דקות | 58 ° C | על | על |
| 12 | פרפין | 1 שעות | 58 ° C | על | על |
| 13 | פרפין | 1 שעות | 58 ° C | על | על |
| 14 | פרפין | 1.5 שעות | 58 ° C | על | על |
שולחן1. תכנית מעבד חדירת אבק להטבעת פרפין.
| מרכיבי תגובה לשקופית 1 | |
| תגובת חיץ 1X edu | 128.64 μl |
| 4 CuSO | 6 μl |
| אזיד edu אלקסה פלואוריד | 0.36 μl |
| תוסף חיץ תגובת 1X edu | 15 μl |
| נפח כולל | 150 μl |
טבלה 2. קוקטיילים תגובת edu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תכנון הניסוי המתואר כאן מבוסס על שילוב של שעה edu 1.5 לפני הקרנה ושילוב של BrdU מייד לאחר ההקרנה אפשרה להפגנה שNSPCs מסוגל להפעיל S ומחסומי G2 / M אבל לא את מחסום G1 / S בשעת 1 st אחרי מתח genotoxic במוח העכבר העוברי. אנחנו ביצענו ניסויים אחרים בהם edu כבר הזריק בזמנים שונים לאחר ההקרנה וBrdU, רק 1 שעות לפני קורבנות עכברים, ומאפשרים לנו להעריך את שיעור כניסת שלב S במיוחד. ניסויים אלה הראו כי NSPC לא יפעיל מעצר G1 / S אחרי מתח genotoxic in vivo 22,23.
לכן, הבחירה בין תיקון DNA ואפופטוזיס אינה מתרחשת במחסום G1 / S להעלות את השאלה על טיבו של המנגנונים guarantying יציבות הגנום בתאים אלה.
הפרוטוקול הוא קל ומהיר. שונהצעדים כרוכים בשום קושי מובן מאליו. טכניקה זו היא חלופה לשימוש בכלורו-deoxyuridine (CldU) וiodo-deoxyuridine (IDU) אשר הוכח לצלב מגיב-32.
פנל רחב של יישומים עשוי להיחשב, כפרוטוקול בקלות גמיש להתאמה לכמה שאלות ביולוגיות. דוגמאות לשינויים שהוצעו ברוקה ומשתפי פעולה 23, אטיין ומשתפי פעולה 22, וברוסו ומשתפי פעולה 24. זה יכול להיות משולב גם עם זיהוי immunofluorescence של מספר סמני תא או חלבונים מעורבים בתגובה נזק לדנ"א למשל. שימו לב, כי במקרה זה, שני BrdU וזיהוי edu יכולים להתבצע עם fluorophores שונה שהם ממוסחרים, לטובת זיהוי חיסונית של סמנים אחרים.
Edu וBrdU בשילוב vivo בNSPC יכולים לשמש גם במיון תא על ידי cytometry זרימה לאנליזה ביוכימית נוספת. לבסוף, ההוא שיטה יכולה להתבצע כדי לפקח על התקדמות מחזור התא של NSPC בסוגים שונים של עכברים שעברו מוטציה או אחרי סוגים אחרים של לחצי genotoxic (מלבד קרינה מייננת) או כל טיפול אחר המשפיע על התקדמות מחזור התא. יתר על כן זה יכול להתאים בקלות לרקמות משכפלות אחרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש הסופרים שאין ניגוד העניינים.
Acknowledgments
המחקר שהוביל לתוצאות הללו קיבל מימון מתכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופי (FP7/2007-2013) תחת הסכם מענק N ° 323,267, מחברת חשמל הצרפתי (EDF) ומl' Agence Nationale de la משוכלל ונדיר - סנטה-Environnement et סנטה-Travail (ANR-SEST, Neurorad).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EdU | Life Technologies | A10044 | 1 mg/ml |
| BrdU | Life Technologies | B5002 | 5 mg/ml |
| IBL 637 | CIS BIO International | ||
| Tissu Tek VIP | Leica | ||
| Microtome | Leica | RM 2125 RT | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Click-iT EdU Alexa 488 imaging kit | Life Technologies | C10083 | |
| Anti-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1/300 |
| Goat anti mouse-Alex594 | Life Technologies | A11001 | 1/400 |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Polysine slide | Thermo scientific | J2800AMNZ | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-068 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Microscope BX51 | Olympus | ||
| Confocal microscope SPE | Leica | ||
| Prism software | Graphpad | Version 5.0c | |
| Photoshop software | Adobe |
References
- Rakic, P. Specification of cerebral cortical areas. Science. 241, 170-176 (1988).
- Sauer, F. Mitosis in he neural tube. J Comp Neurol. , 377-399 (1935).
- Taverna, E., Huttner, W. B. Neural progenitor nuclei IN motion. Neuron. 67, 906-914 (2010).
- Committee, B. Embryonic vertebrate central nervous system: revised terminology. Anat Rec. 166, 257-261 (1970).
- Bystron, I., Blakemore, C., Rakic, P. Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited. Nature Reviews. Neuroscience. 9, 110-122 (2008).
- Miyata, T., et al. Asymmetric production of surface-dividing and non-surface-dividing cortical progenitor cells. Development. 131, 3133-3145 (2004).
- Haubensak, W., Attardo, A., Denk, W., Huttner, W. B. Neurons arise in the basal neuroepithelium of the early mammalian telencephalon: a major site of neurogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 3196-3201 (2004).
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7, 136-144 (2004).
- Merot, Y., Retaux, S., Heng, J. I. Molecular mechanisms of projection neuron production and maturation in the developing cerebral cortex. Seminars in Cell & Developmental Biology. 20, 726-734 (2009).
- Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex. Trends Neurosci. 27, 392-399 (2004).
- Salomoni, P., Calegari, F. Cell cycle control of mammalian neural stem cells: putting a speed limit on G1. Trends Cell Biol. 20, 233-243 (2010).
- Calegari, F., Haubensak, W., Haffner, C., Huttner, W. B. Selective lengthening of the cell cycle in the neurogenic subpopulation of neural progenitor cells during mouse brain development. J Neurosci. 25, 6533-6538 (2005).
- Andres-Mach, M., Rola, R., Fike, J. R. Radiation effects on neural precursor cells in the dentate gyrus. Cell Tissue Res. 331, 251-262 (2008).
- Semont, A., et al. Involvement of p53 and Fas/CD95 in murine neural progenitor cell response to ionizing irradiation. Oncogene. 23, 8497-8508 (2004).
- Nowak, E., et al. Radiation-induced H2AX phosphorylation and neural precursor apoptosis in the developing brain of mice. Radiat Res. 165, 155-164 (2006).
- Gatz, S. A., et al. Requirement for DNA ligase IV during embryonic neuronal development. J Neurosci. 31, 10088-10100 (2011).
- Denekamp, J. Cell kinetics and radiation biology. International Journal of Radiation Biology and Related Studies in Physics, Chemistry, and Medicine. 49, 357-380 (1986).
- Hartwell, L. H., Weinert, T. A. Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events. Science. 246, 629-634 (1989).
- Weinert, T. A., Hartwell, L. H. Characterization of RAD9 of Saccharomyces cerevisiae and evidence that its function acts posttranslationally in cell cycle arrest after DNA damage. Mol Cell Biol. 10, 6554-6564 (1990).
- Tolmach, L. J., Jones, R. W., Busse, P. M. The action of caffeine on X-irradiated HeLa cells. I. Delayed inhibition of DNA synthesis. Radiat Res. 71, 653-665 (1977).
- Painter, R. B., Young, B. R. Radiosensitivity in ataxia-telangiectasia: a new explanation. Proc Natl Acad Sci U S A. 77, 7315-7317 (1980).
- Etienne, O., Roque, T., Haton, C., Boussin, F. D. Variation of radiation-sensitivity of neural stem and progenitor cell populations within the developing mouse brain. Int J Radiat Biol. 88, 694-702 (2012).
- Roque, T., et al. Lack of a p21waf1/cip -dependent G1/S checkpoint in neural stem and progenitor cells after DNA damage in vivo. Stem Cells. 30, 537-547 (2012).
- Rousseau, L., et al. In vivo importance of homologous recombination DNA repair for mouse neural stem and progenitor cells. PLoS One. 7, 12 (2012).
- Bradford, J. A., Clarke, S. T. Dual-pulse labeling using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) and 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) in flow cytometry. Curr Protoc Cytom. , (2011).
- Deckbar, D., et al. The limitations of the G1-S checkpoint. Cancer Res. 70, 4412-4421 (2010).
- Manual, Click-iT EdU Imaging Kit. , http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp10338.pdf (2011).
- Weidtkamp-Peters, S., Rahn, H. P., Cardoso, M. C., Hemmerich, P. Replication of centromeric heterochromatin in mouse fibroblasts takes place in early, middle, and late S phase. Histochem Cell Biol. 125, 91-102 (2006).
- Wu, R., Terry, A. V., Singh, P. B., Gilbert, D. M. Differential subnuclear localization and replication timing of histone H3 lysine 9 methylation states. Mol Biol Cell. 16, 2872-2881 (2005).
- Wu, R., Singh, P. B., Gilbert, D. M. Uncoupling global and fine-tuning replication timing determinants for mouse pericentric heterochromatin. J Cell Biol. 174, 185-194 (2006).
- Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness Jr, V. S. The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15, 6046-6057 (1995).
- Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. J Vis Exp. , (2010).
