Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Vurdere Cell Cycle Progresjon av Neural Stem og stamceller i mus utvikling av hjernen etter Gentoksisk Stress

doi: 10.3791/51209 Published: May 7, 2014

Summary

Administrasjon av to analoger av tymidin, Edu og BrdU, i drektige mus gjør analyse av cellesyklus progresjon i nevrale og stamceller i den embryonale mus hjernen. Denne fremgangsmåten er nyttig for å bestemme effektene av genotoksiske stress, inkludert ioniserende stråling, ved utvikling av hjernen.

Abstract

Nevroner i hjernebarken er generert under hjernens utvikling fra ulike typer nevrale stamceller og stamceller (NSPC), som danner et pseudostratified epitel fôr sideventriklene av embryonale hjernen. Genotoksiske påkjenninger, slik som ioniserende stråling, har meget skadelig effekt på utviklingen av hjernen er relatert til den høye følsomheten til NSPC. Belysning av de cellulære og molekylære mekanismer som er involvert avhenger av karakteriseringen av DNA-skade responsen av disse spesielle typer av celler, noe som krever en nøyaktig metode for å bestemme NSPC progresjon gjennom cellesyklusen på det skadede vev. Her er det vist en metode basert på suksessive intraperitoneale injeksjoner av Edu og BrdU hos gravide mus og ytterligere påvisning av de to tymidinanaloger i koronale seksjoner av embryonale hjernen. Edu og BrdU begge er innlemmet i DNA av reproduserende celler under S-fasen og blir oppdaget av to forskjellige teknikker (Azide elleret spesifikt antistoff, henholdsvis), som letter deres samtidige påvisning. Edu og BrdU flekker er så bestemt for hver NSPC kjernen i funksjon av sin avstand fra ventrikkel margin i en standard regionen i rygg telencephalon. Således denne dobbeltmerking teknikken tillater å skille celler som utviklet seg gjennom cellesyklusen fra de som har aktivert en cellesyklus kontrollpunkt som fører til cellesyklusarrest i respons til DNA-skade.

Et eksempel på forsøk er presentert, i hvilket Edu ble injisert før bestråling og BrdU umiddelbart etter og analyser utført innen 4 timer etter bestråling. Denne protokollen gir en nøyaktig analyse av den akutte respons på DNA-skade NSPC som funksjon av fasen av cellesyklus ved hvilken de er blitt bestrålt. Denne metoden er lett transposable til mange andre systemer for å bestemme virkningen av en bestemt behandling på cellesyklusprogresjon i levende vev.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Under embryonal utvikling av hjernen, er projeksjon nevroner i hjernebarken generert i ventrikkel sone, en pseudostratified epitel sammensatt av ulike typer nevrale stilk og stamceller (NSPC) som linjer sideventriklene. Blant NSPC de radiale gliaceller (RGC), som fungerer som neurale stamceller, gjennomgår interkinetic atom migrasjon (INM): de utfører mitose ved overflaten av ventrikkel-og S-fasen ved den basale grensen for den ventrikulære sone (VZ) 1, 2,3. De kan dele enten symmetrisk å generere to RGC eller asymmetrisk å generere ett RGC og en nervecelle eller et mellom stamceller (IPC) 4, 5. IPC migrere til en overliggende voksende lag som kalles subventricular sone (SVZ), der etter en siste symmetrisk divisjon genererer de to umodne projeksjon nevroner 6-8. I motsetning til RGC, trenger IPC ikke gjennomgå INM (anmeldt i 9). Nylig genererte nevroner MIGRspiste radialt langs radiale fibrene gjennom mellomliggende sone (IZ) for å nå sin endelige destinasjon i cortical plate (CP) 10, 8. Den perfekte timing av alle disse hendelsene er avgjørende for en korrekt hjernebarken. For eksempel overgangen fra proliferasjon til differensiering av nevrale stamceller populasjoner styres av G1 fase varigheten 11, 12. Forlengelsen av G1 fasen korrelerer altså med celledifferensiering.

Gentoksisk stress, for eksempel ioniserende stråling, alvorlig svekker hjernens utvikling (anmeldt i 13). Vi og andre har vist at NSPC er svært utsatt for stråling-indusert apoptose 14, 15,16. Ioniserende stråling induserer DNA dobbel tråd pauser som er den mest alvorlige skader på prolifererende celler. En viktig del av DNA Damage Response (DDR) i sykkel celler er aktiveringen av cellesyklus sjekkpunkter på G1 / S eller G2 / M overganger eller under Sfase (intra-S sjekkpunkt) 17-21. De blokkere cellesyklusprogresjon for å gi tid for DNA-skade reparasjon eller eliminering av for skadede celler. Følgelig kan celledød, så vel som forsinket cellesyklusprogresjon forandre hjernens utvikling som respons på ioniserende stråling 22-24. Det var derfor interessant å utvikle en metode for å vurdere aktivering av cellesykluskontrollpunkter i NSPC i det bestrålte mus embryonale hjernen.

Progresjonen av cellesyklusen blir rutinemessig fulgt ved hjelp av inkorporering av en analog av tymidin, 5-brom-2'-deoksyuridin (BrdU). BrdU er innlemmet i S-fasen av cellesyklusen, når DNA replikere. Anvendelse av et antistoff mot BrdU lar deretter påvisning av cellene som var i S-fasen i løpet av pulsen av BrdU.

A novel tymidin analog, 5-Ethynyl-2'-deoxyuridin (EDU) blir detektert av en fluoriserende azid. De ulike måter å oppdage Edu og B Rdu ikke kryssreagerer 25, slik at den samtidige deteksjon av begge tymidin-analoger, som er nyttig for studier av cellesyklus-progresjon. Vanligvis celler er første pulserende med Edu og deretter pulserende med BrdU, der tiden mellom begge incorporations varer par timer 25, 26. Tilsetting av BrdU i kulturmedier som inneholder Edu resulterer i fortrinnsvis innlemmelse av BrdU i DNA med utelukkelse av Edu, mens samtidig tillegg av Edu 25 med ekvimolar eller halv ekvimolart BrdU til media resultater i bare BrdU innlemmelse 27. Dette forenkler den doble etiketten protokollen ved å eliminere de vasketrinn som normalt kreves for å fjerne den første etiketten fra kulturmediene før tilsetning av den andre etiketten. Dette er også av spesiell interesse for in vivo-undersøkelse, hvor vasketrinnene er det ikke mulig å bestemme den nøyaktige timing av S-fasen inngang eller utgang av cellepopulasjonen.

t "> Nylig ble en fremgangsmåte for dobbeltpulsmerking i embryonale musehjerne ved hjelp Edu og BrdU 23, 24,22 har blitt utviklet for å analysere cellesyklusprogresjon og INM av NSPC etter in utero bestråling. Videre har det blitt demonstrert at, i løpet S-fasen, museceller replikere første de eukromatin regioner og deretter pericentric heterochromatin 28,29,30. Interessant å pericentric heterochromatin forskjellige kromosomer gruppert i interphasic kjerner danne heterochromatic foci også kjent som chromocenters og lett synlig ved DAPI flekker som lyse foci. Derfor differensial Edu og BrdU stainings av eukromatin og chromocenters hjulpet oss til å analysere mer presist S fase progresjon av NSPC.

Denne metoden tillot demonstrasjonen av den tilsynelatende mangelen på G1 / S sjekkpunkt i NSCP 22-24, noe som er ganske overraskende siden dette punktet er ment å være kritisk for genomstabilitet. Flere experimental design basert på ulike kombinasjoner av Edu og BrdU pulser har blitt brukt til å analysere cellesyklus progresjon i ventral og dorsal telencephalon. Her gis et eksempel på protokoller som tillater undersøkelse av den akutte DNA-skade av NSPC innen de første 4 timer etter in utero bestråling av E14.5 museembryoer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

En. Animal Prosedyrer

Denne protokollen er utformet i samsvar med det europeiske fellesskaps rådsdirektiv av 24 november 1986 (86/609/EØF) og er godkjent av vår institusjonelle komité for dyrevelferd (CETEA-CEA DSV IdF).

  1. Injeksjoner med Edu / BrdU og bestråling av E14.5 gravide mus (Figur 2A).
    1. Forbered en løsning av Edu på 1 mg / ml og BrdU på 5 mg / ml i PBS. Utfør en intra-peritoneal injeksjon (IP) for 100 mL av EDU-løsning ved hjelp av en 25 G nål inn gravide mus. 1,5 timer senere, strålebehandling musene (total kroppsbestråling) ved 0 Gy eller 2 Gy (0,6 Gy / min). Umiddelbart etter, injisere (IP) 200 mL av BrdU løsning ved hjelp av en 25 G nål inn i gravide mus.
  2. Utarbeidelse av koronale skiver av embryonale hjerner.
    1. På en time eller fire timer etter bestråling, avlive de gravide mus med karbondioksid.
    2. Åpne mage Cavity over tre centimeter ved hjelp av saks. Separer de to uterine horn fra resten av livmoren ved seksjonering begge ekstremiteter av hornene. Overfør uterine horn inn i en petriskål inneholdende PBS 0,6% glukose. Åpne livmor horn med pinsett for å isolere embryoer. Fjern amniotic sac av hvert embryo ved hjelp av tang.
    3. Dissekere embryonale hoder med tang og fikse dem ved nedsenkning i 4% paraformaldehyde (PFA, pH = 7,4) O / N ved 4 ° C.
    4. Skyll embryonale hoder i PBS i minst én natt ved 4 ° C. Hoder kan holdes i PBS i flere dager.
    5. Legge hoder i paraffin ved å bruke en vakuum-infiltrering prosessor som angitt i tabell 1.. Hoder innebygging kan også utføres under en kjemisk hette for etanol og xylen bad, og deretter i en 65 ° C ovn i parafin bad.
    6. Forbered 5-mikrometer tykke koronale seksjoner med en mikrotom.
    7. Festes oppå polylysin belagt objektglass. </ Li>
    8. Lysbilder kan holdes ved romtemperatur (RT) i flere måneder.

2. Edu / BrdU Farging

  1. Deparaffinization og antigen avsløring
    1. Deparaffinize parafin-embedded hjerne seksjoner ved nedsenkning av lysbilder i tre bad toluen for 5 min.
    2. Rehydrere i 3 min i to bad av hver oppløsninger av avtagende etanolkonsentrasjon som følgende: etanol 100%, etanol 95%, etanol 70%, og 5 min i H 2 O. Lysbilder kan holdes i avionisert vann for flere hr.
    3. Kok skiver i 10 min i citrat-løsning (10 mM, pH 6), og deretter inkuberes i avionisert vann i 5 min.
  2. Edu farging
    1. Utfør Edu påvisning i henhold til produsentens protokoll. Permeabilize cellene med 0,5% triton X-100 i PBS i 10 min.
    2. Forbered 1X EDU buffer tilsetningsstoff ved å fortynne 10X løsning i avionisert vann. Denne løsningen bør være rykende fersk og brukes på samme day.
    3. Forbered Edu reaksjon cocktail, inkludert Edu Alexa Fluor 488 azid. Det er viktig å legge ingrediensene følgende rekkefølgen listet i tabell 2, på annen måte, vil reaksjonen ikke gå videre optimalt. Bruk EDU reaksjon cocktail innen 15 minutter for fremstillingen.
    4. Fjern permeabilization buffer (trinn 2.1.1), vask deretter to ganger med PBS.
    5. Legg 150 mL av Edu reaksjon cocktail, sette et dekkglass, og inkuberes i 30 minutter i mørke ved RT.
    6. Fjern Edu reaksjon cocktail, vask deretter en gang med PBS.
  3. BrdU flekker
    1. Forbered metningsbuffer med 7,5% geiteserum og 7,5% føtalt bovint serum i PBS. Tilsett 150 pl av metningsbuffer på hjerneskiver, sette et dekkglass, og inkuberes i 1 time ved RT for å blokkere ikke-spesifikk antistoffbinding.
    2. Fjern dekkglass. Legg 150 mL av mus anti-BrdU primær antistoff fortynnes til 1/300 i metning buffer, sette et dekkglass og ruge O /N ved 4 ° C.
    3. Fjern dekkglass, vask deretter tre ganger i PBS.
    4. Tilsett 150 ul av geit-anti-mus-Alexa594 sekundært antistoff fortynnet til 1/400 i metningsbuffer, sette et dekkglass, og inkuberes i 1 time ved RT.
    5. Fjern dekkglass, vask deretter en gang i PBS.
    6. Kjerne farging: Tilsett 150 ul av 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ved 1 pg / ml i PBS, settes et dekkglass og inkuberes i 2 minutter ved RT.
    7. Monter lysbilder i monteringsmedium.

Tre. Analyse

  1. Undersøke hjernen seksjoner under et fluorescens mikroskop med en 20X objektiv eller en konfokalmikroskop og hente bilder i tre kanaler (488 nm, 594 nm og UV) som skiller filer.
  2. Stable bilder med Photoshop programvare.
  3. Analyser hjerneseksjoner i en standard sektor av dorsomedial cerebral vegg. Denne sektoren er 100 mikrometer i sin medial-lateral dimensjon og er delt inn i 18 binger (eller flere) av 10 μm høyde i sin radiale dimensjon ved hjelp av et gitter lagret på bilder (figur 1) som tidligere beskrevet 31.
    1. Juster risten slik som den første hyllen er i ventrikulære overflate, med sin lengdeakse parallell med den ventrikulære grensen. Deretter nummerere merket Edu, BrdU og / eller pyknotic kjerner (tilsvarende apoptotiske kjerner) i hver kasse. Nummer en kjerne som ligger på grensen av to hyller i hyllen som inneholder den større del av, eller i den nedre kasse, når kjernen inntar like store områder innenfor de to hyllene.
  4. Statistisk analyse.

Analyser minst to kortikale skiver per embryo. Gjenta eksperimenter på minst 3 embryoer fra forskjellige kull. Resultater bør gis som gjennomsnitt ± standardfeil for gjennomsnittet (SEM). Statistiske analyser er utført med Graphpad Prism bruker to-veis ANOVA og Bonferroni flere sammenligning posthoc tester.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I eksperimentet beskrevet i figur 2, ble administrert EDU 1,5 time før bestråling og BrdU like etter bestråling. Fire typer av celler ble deretter skilles i de kortikale skiver fremstilt ved en eller fire timer etter bestråling, etter innarbeidelse av enten Edu eller BrdU, begge eller ingen (figurene 2A og 2B). Viktigere, hverken Edu nor BrdU inkorporering endret nivå av strålingsinduserte apoptose (data ikke vist). Videre er de farvemetoder tillater kun påvisning av EDU og BrdU innarbeidet under DNA-replikasjon i S-fase, men ikke har følsomhet til å detektere DNA-syntese som er assosiert med reparasjon selv etter bestråling. Faktisk, i) ingen av Edu nor BrdU farging ble observert i en time etter bestråling (PI) i cellene i det kortikale plate, der ligger postmitotic nevroner i G0 fase og ii) antallet EDU (+) og / eller BrdU (+ ) ble ikke økt i bestrålt forhold til unirradiated hjerner.

Edu (+) BrdU (+) atomkjerner

Edu (+) BrdU (+) atomkjerner tilsvarer NSPC som var i S-fasen før og etter 0 hr PI. De ble dermed bestrålt i S-fasen. Som vist i figurene 3B og 3C deres eukromatin er EDU (+), og kan også være BrdU (+). Deres chromocenters var enten BrdU (+) og BrdU (-). Avhengig av S-fasen er fullført ved tidspunktet for avlivelse Figur 2B viser at ved 1 time PI, ble lokalisert EDU (+) BrdU (+) atomkjerner i S-fase binger (dvs. Deres fordeling og tallene ble ikke påvirket ved bestråling binger 4-10, hvor NSPC er kjent for å utføre fase S 31.. Dette tyder på at strålingsinduserte ikke en fullstendig blokk av DNA-syntese på dette tidspunktet.

Konsekvent med basal til apikale atom migrasjon under G2 fase, ble de fleste Edu (+) BrdU (+) kjerner av NSPC funnet i nærheten av ventrikkelen ved 4 timers PI i ubestrålt brains (Figur 2C). Dette skjedde ikke i 2 Gy bestrålt hjerner der atomkjerner forble i S-fasen binger, mange av dem er apoptose. Til sammen disse dataene viste at NSPC bestrålt i S-fasen aktivert intra-S kontrollposter i forbindelse med forsinket INM og celledød.

Edu (+) BrdU (-) atomkjerner

Edu-(+) BrdU (-)-nuclei svarer til celler som var i S-fasen før, og ikke etter bestråling. Chromocenters av disse kjerner er EDU (+), som indikerer at cellene var i slutten av S-fase når Edu ble injisert i mus (figur 3A). Siden G2 / M faser av NSPC siste to hr i utviklings mus hjernen, Edu (+) BrdU (-) NSPC var i G2 på 0 hr PI. Konsekvent, mest Edu (+) BrdU (-) atomkjerner ble funnet i første bin nær ventrikkelen i unirradiated hjerner på en hr PI. Dette er en konsekvens av INM av NSPC etter S-fasen, hvor mange av dem dannes typisk mitotiske figurer (fig. 2B). På1 hr PI, antall Edu (+) BrdU (-) atomkjerner ble betydelig redusert på ventrikkel overflate og ingen mitotic tallet var påviselig i bestrålte hjerner. Disse dataene viser tydelig at celler bestrålt i G2 aktivert G2 / M sjekkpunkt innen en time PI. Videre er de fleste av EDU (+) BrdU (-) av disse kjerner ble apoptotisk ved 4 timers PI viser at NSPC er meget radiosensitive under G2 (figur 2C).

Edu (-) BrdU (-) atomkjerner

Celler med en Edu (-) BrdU (-) nucleus tilsvarer enten celler i G0 (hovedsakelig umodne nerveceller), eller NSPC som forble i G1 fra Edu innlemmelse til dyreofring (Figur 3E). Sammenligning mellom en time og 4 timer i figur 2C viser interkinetic atom migrasjon gjør at atomkjerner som var nær ventrikkelen i G1 på en time gjennomgikk sin apikale til basal migrasjon på 4 timers, mens atomkjerner som var i S-fasen gikk mot ventricular overflaten.

Som vist i figur 2C mange av disse kjerner ble apoptotisk ved 4 timers PI. Antallet apoptotisk Edu (-) BrdU (-) atomkjerner var maksimal nær ventrikkel overflate og reduksjon i øvre binger. Disse dataene antyder derfor at stråling-indusert apoptose skjedde i NSPC som har blitt bestrålt under tidlig G1 fase og / eller post-mitotic migrerer nevroner. I motsetning til dette ble ingen eller svært få apoptotiske kjerner som finnes i det kortikale plate. Dette er i samsvar med stråling motstand av nerveceller som har nådd sin endelige destinasjon.

Edu (-) BrdU (+) atomkjerner

Edu (-) BrdU (+) atomkjerner tilsvarer celler som trådte S fasen etter bestråling. Vanligvis på en hr PI, viste de en diffus BrdU merking av eukromatin, men ikke fra chromocenters. Således ble de i begynnelsen av S-fasen på den tid (figur 3D). Ved 1 time PI antallet og lokalisasjon innen S phase skuffer av Edu (-) BrdU (+) atomkjerner er lik mellom kontroller og bestrålte hjerner. Således S-fasen i løpet av oppføring av en st hr PI ble ikke påvirket av stråling i mus utvikling av hjernen (figur 2B). Interessant, viser sammenligning av en time og fire timers PI i bestrålte hjerner en nedgang i antall Edu (-) BrdU (+) kjerner og de fleste av disse kjernene var apoptose ved 4 timers PI. Dette tyder på at celler som trådte S fasen etter stråling aktivert intra-S kontrollposter og gjennomgikk apoptose etterpå (figur 2C).

Figur 1
Figur 1. Analyse av Brain delen Koronal delen av cerebral halvkule av E14.5 mus embryoer farget med Dapi. Edu og BrdU flekker samt kjernefysisk morfologi er analysert i en standard sektor av dorsomedial cerebral vegg ved hjelp av et gitter delt i 18 binger (eller mer), som beskrevet i teksten. Målestokk:. 20 mikrometer Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Fig. 2
Figur 2. Cellesyklusprogresjon av bestrålt neural stilk og stamceller (fig. fra Roque et al. Stamceller, 2012). (A) Skjematisk fremstilling av eksperimentell design og DAPI (blå), Edu (grønn), og BrdU (rød) fargingsmønster funnet i koronale kortikale skiver på 1 og 4 timers PI (2 Gy). . Scale bar = 20 mikrometer (B, C) ​​Tall / bin av Edu (+) BrdU (-), Edu (+) BrdU (+), Edu (-) BrdU (+), eller Edu (-) BrdU (- ) atomkjerner med en normal morphology i nonirradiated kontroller (blå) og med en normal (rød) eller apoptose (pyknotic, svart) morfologi i bestrålt (2 Gy) ekser på en time (B) eller 4 timers PI (C). Ingen apoptotiske kjerner ble oppdaget ved en hr PI (B). Statistisk analyse ble utført ved hjelp av Bonferroni post hoc tester. Forkortelser: BrdU, 5-brom-2'-deoxyuridine; DAPI, 4'-6-diamidino-2-phenylindole; Edu, 5-etynyl-2'deoxyuridine; IZ, overgangssone; SVZ, subventricular sone; VZ, ventrikkel sone. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
. Figur 3 Differential Edu og BrdU farging av eukromatin og chromocenters Øvre panel: Z-stackconfocal bilder av Edu (grønn), BrdU (rød) flekker og DNA kontra med DAPI (blå), slik at påvisning av chromocenters som lyse blå brennpunkter. Stainings ble utført på en embryonale hjerne avsnitt samlet på en hr PI i eksperimenter der Edu ble levert 1,5 time før bestråling og BrdU 0 hr PI (bare ubestrålt Kontrollen vises) (Scale bar: 5 mikrometer). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Bottom panelene viser eksempler på de fem forskjellige mønstre av Edu og BrdU flekker oppdaget i koronale hjernen skiver. Flett bilde og enkelt kanaler vises (Scale bar: 2 mikrometer):

A) Nucleus med Edu (+) chromocenters og Edu (+) eller Edu (-) eukromatin. Edu er dermed innlemmet i slutten S fase under replikering av pericentric heterochromatin: cellene var jegn G2 på 0 hr PI.

B) Nucleus med Edu (+) eukromatin og BrdU (+) chomocenters: Edu har blitt innlemmet i tidlig S fase da de fleste av eukromatin er kopiert og BrdU har blitt innlemmet i slutten av S-fasen: Cellene ble i S-fasen på 0 hr PI .

C) Nucleus med Edu (+) BrdU (+) eukromatin og Edu (-) BrdU (-) chromocenters. Edu og BrdU er innarbeidet i den første delen av S-fasen: Cellene var i tidlig S-fasen ved 0 hr PI.

D) Nucleus med BrdU (+) eukromatin og Edu (-) BrdU (-) chromocenter. BrdU er innarbeidet i begynnelsen av S-fasen. Cellene var i sen G1 ved 0 hr PI og angitt S-fasen deretter.

E) Nucleus med Edu (-) BrdU (-) eukromatin og chromocenters. Cellene var i G0 (umodne nerveceller) eller i G1 fasen og har ikke skrevet inn S-fasen i løpet av Edu og BrdU pulser.

Oppløsning Inkubasjon Temperatur Trykk Agitasjon
1 Alkohol 70% 30 min 35 ° C
2 alkohol 95% 15 min 35 ° C
3 alkohol 95% 30 min 35 ° C
4 alkohol 95% 45 min 35 ° C
5 alkohol 100% 15 min 35 ° C
6 alkohol 100% 30 min 35 ° C
7 alkohol 100% 1 hr 35 ° C
8 Toluen 100% 30 min 35 ° C
9 Toluen 100% 45 min 35 ° C
10 Toluen 100% 1 hr 35 ° C
11 Parafin 30 min 58 ° C
12 Parafin 1 hr 58 ° C
13 Parafin 1 hr 58 ° C
14 Parafin 1,5 time 58 ° C

BordEn. Vacuum infiltrasjon prosessor program for parafin innebygging.

Reaksjons komponenter for en lysbilde
1X EDU reaksjon buffer 128,64 mL
CuSO 4 6 mL
Edu Alexa Fluor azide 0,36 mL
1X EDU Reaction buffer additiv 15 mL
Totalt volum 150 mL

Tabell 2. Edu reaksjons cocktails.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Eksperimentell design beskrevet her basert på inkorporering av Edu 1,5 time før bestråling og inkorporering av BrdU umiddelbart etter bestråling tillot demonstrasjonen som NSPCs er i stand til å aktivere S og G2 / M sjekkpunkter, men ikke G1 / S sjekkpunkt i løpet av en st hr etter en gentoksisk stress i fosterets mus hjernen. Vi utførte andre eksperimenter der Edu har blitt injisert på forskjellige tidspunkter etter bestråling og BrdU, bare en time før muse offer, slik at vi kan spesielt sette pris på frekvensen av S-fasen oppføring. Disse eksperimentene har vist at NSPC ikke aktiverer en G1 / S arrest etter en gentoksisk stress i vivo 22,23.

Derfor gjør valget mellom DNA-reparasjon og apoptose ikke forekomme på G1 / S sjekkpunkt heve spørsmålet med hensyn til arten av de mekanismene guarantying genom stabilitet i disse cellene.

Protokollen er enkel og rask. Den annentrinn presentere ingen åpenbare problemer. Denne teknikken er et alternativ til bruk av klor-deoksyuridin (CldU) og jod-deoksyuridin (IDU), som har vist seg å kryssreagere 32.

Et bredt panel av søknader kan vurderes, som protokollen er lett fleksibelt og kan tilpasses flere biologiske spørsmål. Eksempler på endringer foreslått i Roque og samarbeidspartnere 23, Etienne og kollaboratører 22, og i Rousseau og samarbeidspartnere 24. Det kan også kombineres med immunfluorescens deteksjon av flere cellemarkører eller proteiner som er involvert i DNA-skade respons f.eks. Legg merke til at i dette tilfellet kan både BrdU og edu-deteksjon kan utføres med forskjellige fluoroforer som er kommersialisert, å favorisere immun påvisning av andre markører.

Edu-og in vivo-BrdU inkorporering i NSPC kan også brukes i cellesortering ved strømningscytometri for ytterligere biokjemiske analyser. Til slutt, ther fremgangsmåten kan bli utført for å overvåke cellesyklusprogresjon NSPC i forskjellige typer av mutante mus eller etter andre typer genotoksiske påkjenninger (annet enn ioniserende stråling) eller hvilken som helst annen behandling som påvirker cellesyklusprogresjon. Videre kan det lett tilpasses til andre replikerende vev.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Den forskning som fører til disse resultatene har fått støtte fra EU sjuende rammeprogram (FP7/2007-2013) etter tilskuddsavtalen n ° 323267, fra Electricité de France (EDF) og fra l'Agence Nationale de la Recherche - Santé-Environnement et Santé-Travail (ANR-sest, Neurorad).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EdU Life Technologies A10044 1 mg/ml
BrdU Life Technologies B5002 5 mg/ml
IBL 637 CIS BIO International
Tissu Tek VIP Leica
Microtome Leica RM 2125 RT
Triton X-100 Sigma-Aldrich 93443
Click-iT EdU Alexa 488 imaging kit Life Technologies C10083
Anti-BrdU GE Healthcare RPN202 1/300
Goat anti mouse-Alex594 Life Technologies A11001 1/400
Fluoromount SouthernBiotech 0100-01
Polysine slide Thermo scientific J2800AMNZ
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
PBS Life Technologies 20012-068
DAPI Sigma-Aldrich D9542
Microscope BX51 Olympus
Confocal microscope SPE Leica
Prism software Graphpad Version 5.0c
Photoshop software Adobe

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rakic, P. Specification of cerebral cortical areas. Science. 241, 170-176 (1988).
  2. Sauer, F. Mitosis in he neural tube. J Comp Neurol. 377-399 (1935).
  3. Taverna, E., Huttner, W. B. Neural progenitor nuclei IN motion. Neuron. 67, 906-914 (2010).
  4. Committee, B. Embryonic vertebrate central nervous system: revised terminology. Anat Rec. 166, 257-261 (1970).
  5. Bystron, I., Blakemore, C., Rakic, P. Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited. Nature Reviews. Neuroscience. 9, 110-122 (2008).
  6. Miyata, T., et al. Asymmetric production of surface-dividing and non-surface-dividing cortical progenitor cells. Development. 131, 3133-3145 (2004).
  7. Haubensak, W., Attardo, A., Denk, W., Huttner, W. B. Neurons arise in the basal neuroepithelium of the early mammalian telencephalon: a major site of neurogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 3196-3201 (2004).
  8. Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7, 136-144 (2004).
  9. Merot, Y., Retaux, S., Heng, J. I. Molecular mechanisms of projection neuron production and maturation in the developing cerebral cortex. Seminars in Cell & Developmental Biology. 20, 726-734 (2009).
  10. Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex. Trends Neurosci. 27, 392-399 (2004).
  11. Salomoni, P., Calegari, F. Cell cycle control of mammalian neural stem cells: putting a speed limit on G1. Trends Cell Biol. 20, 233-243 (2010).
  12. Calegari, F., Haubensak, W., Haffner, C., Huttner, W. B. Selective lengthening of the cell cycle in the neurogenic subpopulation of neural progenitor cells during mouse brain development. J Neurosci. 25, 6533-6538 (2005).
  13. Andres-Mach, M., Rola, R., Fike, J. R. Radiation effects on neural precursor cells in the dentate gyrus. Cell Tissue Res. 331, 251-262 (2008).
  14. Semont, A., et al. Involvement of p53 and Fas/CD95 in murine neural progenitor cell response to ionizing irradiation. Oncogene. 23, 8497-8508 (2004).
  15. Nowak, E., et al. Radiation-induced H2AX phosphorylation and neural precursor apoptosis in the developing brain of mice. Radiat Res. 165, 155-164 (2006).
  16. Gatz, S. A., et al. Requirement for DNA ligase IV during embryonic neuronal development. J Neurosci. 31, 10088-10100 (2011).
  17. Denekamp, J. Cell kinetics and radiation biology. International Journal of Radiation Biology and Related Studies in Physics, Chemistry, and Medicine. 49, 357-380 (1986).
  18. Hartwell, L. H., Weinert, T. A. Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events. Science. 246, 629-634 (1989).
  19. Weinert, T. A., Hartwell, L. H. Characterization of RAD9 of Saccharomyces cerevisiae and evidence that its function acts posttranslationally in cell cycle arrest after DNA damage. Mol Cell Biol. 10, 6554-6564 (1990).
  20. Tolmach, L. J., Jones, R. W., Busse, P. M. The action of caffeine on X-irradiated HeLa cells. I. Delayed inhibition of DNA synthesis. Radiat Res. 71, 653-665 (1977).
  21. Painter, R. B., Young, B. R. Radiosensitivity in ataxia-telangiectasia: a new explanation. Proc Natl Acad Sci U S A. 77, 7315-7317 (1980).
  22. Etienne, O., Roque, T., Haton, C., Boussin, F. D. Variation of radiation-sensitivity of neural stem and progenitor cell populations within the developing mouse brain. Int J Radiat Biol. 88, 694-702 (2012).
  23. Roque, T., et al. Lack of a p21waf1/cip -dependent G1/S checkpoint in neural stem and progenitor cells after DNA damage in vivo. Stem Cells. 30, 537-547 (2012).
  24. Rousseau, L., et al. In vivo importance of homologous recombination DNA repair for mouse neural stem and progenitor cells. PLoS One. 7, 12 (2012).
  25. Bradford, J. A., Clarke, S. T. Dual-pulse labeling using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) and 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) in flow cytometry. Curr Protoc Cytom. (2011).
  26. Deckbar, D., et al. The limitations of the G1-S checkpoint. Cancer Res. 70, 4412-4421 (2010).
  27. Manual, Click-iT EdU Imaging Kit. http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp10338.pdf (2011).
  28. Weidtkamp-Peters, S., Rahn, H. P., Cardoso, M. C., Hemmerich, P. Replication of centromeric heterochromatin in mouse fibroblasts takes place in early, middle, and late S phase. Histochem Cell Biol. 125, 91-102 (2006).
  29. Wu, R., Terry, A. V., Singh, P. B., Gilbert, D. M. Differential subnuclear localization and replication timing of histone H3 lysine 9 methylation states. Mol Biol Cell. 16, 2872-2881 (2005).
  30. Wu, R., Singh, P. B., Gilbert, D. M. Uncoupling global and fine-tuning replication timing determinants for mouse pericentric heterochromatin. J Cell Biol. 174, 185-194 (2006).
  31. Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness Jr, V. S. The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15, 6046-6057 (1995).
  32. Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. J Vis Exp. (2010).
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Etienne, O., Bery, A., Roque, T., Desmaze, C., Boussin, F. D. Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress. J. Vis. Exp. (87), e51209, doi:10.3791/51209 (2014).More

Etienne, O., Bery, A., Roque, T., Desmaze, C., Boussin, F. D. Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress. J. Vis. Exp. (87), e51209, doi:10.3791/51209 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter