Summary
A administração de dois análogos de timidina, EdU e BrdU, em ratinhas grávidas permite a análise da progressão do ciclo celular em células progenitoras neurais e no cérebro do rato embrionário. Este método é útil para determinar os efeitos do stress genotóxico, incluindo a radiação ionizante, durante o desenvolvimento do cérebro.
Abstract
Os neurónios do córtex cerebral são gerados durante o desenvolvimento do cérebro a partir de diferentes tipos de células estaminais e progenitoras neurais (NSPC), que formam um epitélio pseudo alinhando os ventrículos laterais do cérebro embrionário. Estresses genotóxicos, como a radiação ionizante, têm efeitos altamente deletérios sobre o cérebro em desenvolvimento relacionado com a alta sensibilidade do NSPC. A elucidação dos mecanismos celulares e moleculares envolvidas depende da caracterização da resposta a danos no ADN destes tipos particulares de células, o que requer um método preciso para determinar a progressão NSPC longo do ciclo celular no tecido danificado. Aqui é mostrado um método baseado em sucessivas injeções intraperitoneais Edu e BrdU em camundongos grávidas e ainda a detecção destes dois análogos da timidina em cortes coronais do cérebro embrionário. EdU BrdU e ambos são incorporados no ADN das células em replicação durante a fase S e são detectados através de duas técnicas diferentes (ou azidaum anticorpo específico, respectivamente), que facilitam a sua detecção simultânea. EdU e coloração BrdU são então determinados para cada núcleo NSPC em função da sua distância a partir da margem do ventrículo numa região padrão do telencéfalo dorsal. Assim, esta técnica de marcação dupla permite distinguir células que progrediu ao longo do ciclo celular das que ter activado um checkpoint do ciclo celular, levando à paragem do ciclo celular em resposta ao dano do DNA.
Um exemplo de experimento é apresentado, no qual EdU foi injetado antes da irradiação e BrdU imediatamente após e análises realizadas no âmbito da 4 h após a irradiação. Este protocolo apresenta uma análise precisa da resposta de dano de DNA aguda de NSPC em função da fase do ciclo celular em que eles foram irradiadas. Este método é facilmente transponível para muitos outros sistemas, a fim de determinar os efeitos de um tratamento específico sobre a progressão do ciclo celular em tecidos vivos.
Introduction
Durante o desenvolvimento do cérebro embrionário, de neurónios de projecção do córtex cerebral são gerados na zona ventricular, um epitélio pseudo composto de diferentes tipos de estaminais neuronais e células progenitoras (NSPC) que reveste os ventrículos laterais. Entre NSPC, as células gliais radiais (RGC), que servem como células estaminais neurais, sofrer migração nuclear interkinetic (INM): eles realizam a mitose na superfície do ventrículo e da fase S no limite basal da zona ventricular (VZ) 1, 2,3. Eles podem dividir ou simetricamente para gerar dois RGC ou assimetricamente para gerar um RGC e um neurônio ou uma célula intermediária progenitor (IPC) 4, 5. IPC migrar para uma camada sobrejacente proliferando chamada zona subventricular (SVZ), onde depois de uma última divisão simétrica geram dois neurônios de projeção imaturos 6-8. Ao contrário do RGC, o IPC não sofrem INM (revisado em 9). Neurônios recém-gerados Migrcomeu radialmente ao longo das fibras radiais através da zona intermediária (IZ) para chegar ao seu destino final na placa cortical (CP) 10, 8. O timing perfeito de todos estes eventos é essencial para um desenvolvimento cortical correta. Por exemplo, o interruptor de proliferação a diferenciação de populações progenitoras neurais é controlada pela duração da fase G1 11, 12. O prolongamento da fase G1 assim correlaciona com a diferenciação celular.
Estresse genotóxico, como radiação ionizante, o desenvolvimento do cérebro severamente prejudicar (revisado em 13). Nós e outros autores mostraram que NSPC são altamente propensos a apoptose induzida por radiação 14, 15,16. As radiações ionizantes induzir rupturas dos filamentos de DNA duplo que são os danos mais graves para células em proliferação. Um componente essencial da resposta a danos do DNA (DDR) em células de ciclismo é a ativação de pontos de controle do ciclo celular nas transições G1 / S ou G2 / M ou durante Sfase (intra-S checkpoint) 17-21. Eles bloqueiam a progressão do ciclo celular para dar tempo para a reparação de danos ao DNA ou eliminação de células muito danificadas. Consequentemente, a morte celular, bem como a progressão do ciclo celular retardada pode alterar o desenvolvimento do cérebro em resposta à exposição a radiação ionizante 22-24. Era, portanto, interessante para desenvolver um método para avaliar a activação de checkpoints do ciclo celular em NSPC no cérebro do rato embrionário irradiado.
A progressão do ciclo celular é normalmente seguido usando a incorporação de um análogo da timidina, 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU). BrdU é incorporado durante a fase S do ciclo celular, quando o ADN está a replicar. A utilização de um anticorpo contra BrdU permite posteriormente a detecção de células que estavam na fase S durante o pulso de BrdU.
Um análogo da timidina romance, 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) é detectada por um azida fluorescente. As diferentes maneiras de detectar EdU e B RDU não reagem de forma cruzada 25, permitindo a detecção simultânea de ambos os análogos de timidina, a qual é útil para o estudo da progressão do ciclo celular. Normalmente, as células são pulsadas com EdU primeiro e, em seguida, pulsadas com BrdU, em que o tempo entre as duas incorporações dura duas horas 25, 26. A adição de BrdU em meios de cultura contendo EdU resulta preferencialmente incorporação de BrdU no ADN com a exclusão de EdU, enquanto que a adição simultânea de EdU 25 com BrdU equimolar ou equimolar metade para os meios de comunicação provoca apenas a incorporação de BrdU 27. Isto simplifica o protocolo de marcação dupla, eliminando as etapas de lavagem que são normalmente necessários para a remoção da etiqueta a partir do primeiro meio de cultura antes da adição da segunda etiqueta. Este também é de um interesse especial para o estudo in vivo, em que os passos de lavagem não são possíveis, para determinar o momento preciso da entrada na fase S ou saída da população de células.
t "> Recentemente, um método de rotulagem de duplo pulso em cérebro embrionário do rato usando EdU e BrdU 23, 24,22 foi desenvolvido para analisar a progressão do ciclo celular e INM de NSPC no útero após a irradiação. Além disso, tem sido demonstrado que, durante fase S, células de camundongo replicar primeiro as regiões eucromatina e, em seguida, a heterocromatina pericêntrica 28,29,30. Curiosamente, heterochromatin pericêntrica de diferentes cromossomos agrupados em núcleos interphasic para formar focos heterocromática também conhecido como chromocenters e facilmente detectável pela coloração DAPI como focos brilhante. Portanto, os diferenciais Edu e BrdU colorações de eucromatina e chromocenters nos ajudou a analisar com mais precisão a progressão da fase S de NSPC.Este método permitiu a demonstração da aparente falta de G1 / S checkpoint em NSCP 22-24, o que é bastante surpreendente, pois o ponto de verificação é suposto ser crítico para a estabilidade do genoma. Vários experimental desenhos com base em várias combinações de edu e BrdU pulsos foram utilizados para analisar a progressão do ciclo celular, no telencéfalo ventral e dorsal. Aqui, damos um exemplo de protocolos para permitir o estudo do dano ao DNA aguda da NSPC no primeiro 4 horas após a irradiação em utero de embriões E14.5 do mouse.
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Protocol
1. Procedimentos com animais
Este protocolo foi desenvolvido em conformidade com as directivas da Comunidade Europeia do Conselho de 24 de novembro de 1986 (86/609/CEE) e foi aprovado pelo nosso comitê institucional sobre bem-estar animal (CETEA-CEA DSV IDF).
- Injeções com edu / BrdU e irradiação de E14.5 camundongos grávidas (Figura 2A).
- Prepara-se uma solução de EdU a 1 mg / ml e de BrdU em 5 mg / ml em PBS. Realizar uma injecção intra-peritoneal (IP) de 100 ul de solução de edu utilizando uma agulha de 25 G em ratas grávidas. 1,5 h mais tarde, os ratinhos irradiar (irradiação total do corpo), a 0 Gy, ou 2 Gy (0,6 Gy / min). Imediatamente depois, injectar (IP) de 200 ul de solução de BrdU utilizando uma agulha G 25, nas ratas grávidas.
- Preparação de cortes coronais de cérebros embrionárias.
- Em 1 hora ou 4 horas após a irradiação, eutanásia os ratos grávidas por dióxido de carbono.
- Abra a cavi abdominalty mais de três centímetros por meio de tesoura. Separa-se os dois cornos uterinos do resto do útero por corte de ambas as extremidades os chifres. Transferir os cornos uterinos em uma placa de Petri contendo PBS 0,6% de glucose. Abra os cornos uterinos com a pinça, a fim de isolar os embriões. Retire o saco amniótico de cada embrião usando uma pinça.
- Dissecar cabeças embrionários com fórceps e corrigi-los por imersão em 4% de paraformaldeído (PFA, pH = 7,4) O / N a 4 ° C.
- Lavar cabeças embrionárias em PBS durante pelo menos uma noite a 4 ° C. Cabeças pode ser mantido em PBS, durante vários dias.
- Incorporar cabeças em parafina usando um processador de infiltração de vácuo, tal como indicado na Tabela 1. Cabeças incorporação também pode ser realizada sob um capuz químico para etanol e um banho de xilema e depois num forno de 65 ° C para os banhos de parafina.
- Prepare 5 mícrons cortes coronais de espessura com um micrótomo.
- Montar em lâminas de microscópio revestidas com polilisina. </ Li>
- Slides pode ser mantido à temperatura ambiente (RT) durante vários meses.
2. Edu / BrdU Coloração
- Desparafinização e antígeno desmascaramento
- Retire a parafina as seções do cérebro em parafina por imersão das lâminas em 3 banhos de tolueno por 5 min.
- Re-hidratar durante 3 min em dois banhos de cada soluções de concentrações decrescentes de etanol, como se segue: 100% de etanol, etanol a 95%, etanol a 70%, e 5 min em H 2 O. As lâminas podem ser mantidos em água desionizada durante vários horas.
- Ferver as fatias durante 10 min em solução de citrato (10 mM, pH 6), e em seguida, incuba-se água desionizada, durante 5 min.
- Coloração EdU
- Realizar a detecção EdU de acordo com o protocolo do fabricante. Permeabilizar as células com 0,5% de triton X-100 em PBS durante 10 min.
- Prepare aditivo tampão 1X EdU diluindo a solução 10X em água desionizada. Esta solução deve ser preparado e usado no mesmo day.
- Prepare EdU cocktail reação, incluindo EdU Alexa Fluor 488 azida. É importante adicionar os ingredientes seguintes pela ordem indicada na Tabela 2, de outro modo, a reacção não prosseguirá optimamente. Use o cocktail reação EdU dentro de 15 minutos de preparação.
- Remover o tampão de permeabilização (passo 2.1.1), em seguida, lavar duas vezes com PBS.
- Adicionar 150 mL de EdU cocktail reação, colocar uma lamela e incubar por 30 min no escuro à temperatura ambiente.
- Remover o cocktail reacção EdU, em seguida, lavar uma vez com PBS.
- Coloração BrdU
- Preparar tampão de saturação com 7,5% de soro de cabra e 7,5% de soro fetal bovino em PBS. Adicionar 150 ul de tampão de saturação em fatias de cérebro, colocar uma lamela, e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente para bloquear o anticorpo não-específico de ligação.
- Retirar as lamelas. Adicionar 150 mL de rato anti-BrdU anticorpo primário diluído em 1/300 em tampão de saturação, colocar uma lamela e incubar O /N a 4 ° C.
- Retirar as lamelas, em seguida, lava-se 3 vezes em PBS.
- Adicionar 150 ul de anticorpo de cabra anti-ratinho-Alexa594 anticorpo secundário diluído a 1/400 no tampão de saturação, colocar uma lamela, e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente.
- Retirar as lamelas, em seguida, lavar uma vez com PBS.
- A coloração nuclear: adicionar 150 uL de 4 ',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) em 1 ug / ml em PBS, colocar uma lamela e incubar durante 2 minutos à temperatura ambiente.
- Monte slides em meio de montagem.
3. Análise
- Examine seções do cérebro com um microscópio de fluorescência com um objetivo 20X ou um microscópio confocal e adquirir imagens em três canais (488 nm, 594 nm e UV), como separa arquivos.
- Empilhe as imagens com o software Photoshop.
- Analisar seções do cérebro em um setor padrão da parede cerebral dorsomedial. Esse sector é de 100 um, na sua dimensão médio-lateral e está dividido em 18 bandejas (ou mais) de 10 μm de altura na sua dimensão radial utilizando uma grelha sobreposta imagens (Figura 1) como previamente descrito 31.
- Alinhar a grade, como o primeiro compartimento está na superfície ventricular, com o seu eixo longo paralelo ao arco ventricular. Então o número da UDE rotulados, BrdU e / ou núcleos picnóticos (correspondendo a núcleos apoptóticos) em cada bin. Numero um núcleo localizado no limite de dois compartimentos do compartimento que contém a sua maior parte, ou no compartimento inferior, quando o núcleo ocupa áreas iguais dentro dos dois compartimentos.
- A análise estatística.
Analisar, pelo menos, duas fatias corticais por embrião. Repetir experiências em, pelo menos, 3 a partir de embriões de ninhadas diferentes. Os resultados devem ser dadas como erro médio ± padrão da média (SEM). As análises estatísticas são realizadas com Graphpad Prism usando ANOVA de duas vias e vários testes de comparação posthoc Bonferroni.
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Representative Results
Na experiência descrita na Figura 2, EdU foi administrado 1,5 horas antes da irradiação e BrdU logo após a irradiação. Quatro tipos de células foram então distinguidos nas fatias corticais preparadas a 1 ou 4 horas após a irradiação, de acordo com a incorporação de BrdU quer EdU ou, ambos ou nenhum (Figuras 2A e 2B). Importante, nem EdU nem a incorporação de BrdU alterou o nível de apoptose induzida por radiação (dados não mostrados). Além disso, os métodos de coloração de apenas permitir a detecção de EDU e BrdU incorporada durante a replicação do ADN em fase S, mas não tem a sensibilidade para detectar a síntese de DNA, que está associado com a reparação, mesmo após irradiação. Com efeito, i) nem EdU nem coloração BrdU foi observada em 1 hr pós irradiação (PI) em células da placa cortical, onde estão localizados os neurónios pós-mitóticos na fase G0 e ii) o número de EdU (+) e / ou de BrdU (+ ) não aumentou em comparação com irradiado unirradiated cérebros.
Edu (+) BrdU (+) núcleos
Edu (+) BrdU (+) núcleos correspondem a NSPC que estavam em fase S antes e depois 0 hr PI. Eles foram então irradiados em fase S. Como mostrado nas figuras 3B e 3C sua eucromatina é EdU (+) e podem ser também de BrdU (+). Seus chromocenters eram ou BrdU (+) ou de BrdU (-). Dependendo conclusão da fase S na altura do sacrifício Figura 2B mostra que a 1 h PI, EdU (+) BrdU (+) núcleos estavam localizados nas caixas de fase S (isto é, bandejas de 4 a 10, em que NSPC são conhecidos para realizar a fase S 31. sua distribuição e os números não foram afectadas por irradiação. Isto sugere que a radiação não induziu um bloqueio completo da síntese de ADN neste momento.
Consistentemente com o basal a migração nuclear apical durante a fase G2, a maioria Edu (+) BrdU (+) núcleos de NSPC foram encontrados perto do ventrículo em 4 horas PI em brai não irradiadons (Figura 2C). Isso não ocorreu em 2 Gy irradiado cérebros em que núcleos permaneceram no S caixas de fase, muitos deles sendo apoptose. No total, esses dados mostram que NSPC irradiados na fase S ativado intra-S checkpoints em associação com INM atraso e morte celular.
Edu (+) BrdU (-) núcleos
EdU (+) BrdU (-) núcleos correspondem a células que estavam na fase S antes e não depois da irradiação. Chromocenters destes núcleos são EdU (+), o que indica que as células estavam em fase S tardia quando EdU foi injectado em ratinhos (Figura 3A). Desde G2 / M fases de NSPC passado 2 horas no cérebro em desenvolvimento mouse, Edu (+) BrdU (-) NSPC estavam em G2 em 0 hr PI. Consistentemente, mais EdU (+) BrdU (-) núcleos foram encontrados no primeiro compartimento próximo do ventrículo em cérebros não irradiadas em 1 hora PI. Esta é uma consequência do INM de NSPC, após a fase S, onde muitos deles formados figuras típicas de mitose (Figura 2B). EmPI 1 hora, o número de EdU (+) BrdU (-) núcleos foi significativamente reduzida na superfície do ventrículo e não figura mitótico foi detectável no cérebro irradiados. Estes dados mostram claramente que as células irradiadas em G2 activado a G2 / M posto dentro de 1 hora PI. Além disso, a maioria dos EdU (+) BrdU (-) destes núcleos foram apoptótica em 4 horas PI demonstrando que NSPC são altamente radiossensíveis durante G2 (Figura 2C).
Edu (-) BrdU (-) núcleos
Células com uma edu (-) BrdU (-) correspondem ao núcleo tanto células em G0 (neurônios principalmente imaturos), ou NSPC que permaneceu no G1 a partir EdU incorporação ao sacrifício de animais (Figura 3E). Comparação entre 1 hora e 4 horas na Figura 2C mostra a migração nuclear interkinetic fazendo que os núcleos que estavam perto do ventrículo no G1 a 1 hr realizou a apical à migração basal em 4 horas, enquanto que os núcleos que estavam em fase S foi em direção ao ventricsuperfície ular.
Conforme mostrado na Figura 2C muitos destes núcleos foram apoptótica em 4 horas PI. O número de apoptose Edu (-) BrdU (-) núcleos foi máxima perto da superfície ventricular e diminui em caixas superiores. Estes dados sugerem, portanto, que a apoptose induzida por radiação ocorreu em NSPC que foram irradiadas durante a fase G1 precoce e / ou pós-mitótico migrando neurônios. Por outro lado, nenhuma ou poucas células apoptóticas foram encontradas na placa cortical. Isto está de acordo com a resistência à radiação de neurônios que chegaram ao seu destino final.
Edu (-) BrdU (+) núcleos
EdU (-) BrdU (+) correspondem aos núcleos de células que entraram na fase S após a irradiação. Tipicamente, a PI 1 hora, eles mostraram uma marcação BrdU difusa de eucromatina, mas não de chromocenters. Assim, eles estavam na fase S precoce em que o tempo (Figura 3D). Em 1 hr PI o número e localização dentro S PHAse caixas de Edu (-) BrdU (+) núcleo é semelhante entre os controles e cérebros irradiados. Assim, a entrada S-fase durante o PI hr 1 º não foi afetada pela radiação no cérebro do rato em desenvolvimento (Figura 2B). Interessantemente, a comparação entre 1 hora e 4 horas PI em cérebros irradiados mostra um declínio no número de EdU (-) BrdU (+) dos núcleos e a maior parte destes núcleos foram apoptótica em 4 horas PI. Isto sugere que as células que entraram na fase S após radiação activado intra-S pontos de verificação e, posteriormente, submetidos a apoptose (Figura 2C).
Figura 1. Análise da seção do cérebro Secção coronal do hemisfério cerebral de embriões E14.5 rato corado com Dapi. EdU e coloração BrdU, bem como a morfologia nuclear são analisados em um setor padrão do cerebra dorsomediall de parede utilizando uma grelha dividido em 18 bandejas (ou mais) como descrito no texto. Barra de escala:. 20 mM Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Progressão do ciclo celular Figura 2. Dos irradiado neural-tronco e células progenitoras (figura de Roque et al., Células-tronco, de 2012). (A) Diagrama esquemático do delineamento experimental e DAPI (azul), Edu (verde), e BrdU (vermelho) padrões de coloração encontrados em fatias corticais coronais em 1 e 4 horas PI (2 Gy). . Escala bar = 20 mM (B, C) Números / bin de Edu (+) BrdU (-), Edu (+) BrdU (+), Edu (-) BrdU (+), ou Edu (-) BrdU (- núcleos) com um mo normaisrphology em controlos não irradiados (azuis) e com um (preto picnótica,) morfologia em irradiado (2 Gy) normal (vermelho) ou apoptótica córtices em 1 hora (B) ou 4 horas PI (C). Sem núcleos apoptóticos foram detectados a um PI horas (B). A análise estatística foi realizada utilizando testes post hoc de Bonferroni. Abreviaturas: BrdU, 5-bromo-2'-desoxiuridina; DAPI, 4'-6-diamidino-2-fenilindol; Edu, 5-etinil-2'desoxiuridina; IZ, zona intermediária; ZSV, zona subventricular; VZ, zona ventricular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
. Figura 3 EDU Diferencial e BrdU coloração de eucromatina e chromocenters superior do painel: Z-stackimagens confocal de Edu (verde), BrdU (vermelho) coloração e DNA contrastado com DAPI (azul), permitindo a detecção de focos chromocenters como azul brilhante. Foram realizadas marcações em uma seção do cérebro embrionário coletadas em 1 hr PI em experimentos onde EdU foi entregue 1,5 hr antes da irradiação e BrdU 0 hr PI (apenas o controle não irradiado é mostrado) (bar Escala: 5 mm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Painéis inferiores mostram exemplos dos cinco padrões diferentes de EdU e coloração BrdU detectado em fatias de cérebro coronais. Mesclar imagem e canais individuais são mostradas (Barra de escala: 2 mm):
A) Núcleo com Edu (+) chromocenters e Edu (+) ou Edu (-) euchromatin. EdU tem sido assim incorporada em fase S tardia durante a replicação de heterocromatina pericêntrica: as células foram in G2 em 0 hr PI.
B) Núcleo com Edu (+) eucromatina e BrdU (+) chomocenters: EdU foi incorporada na fase S inicial, quando a maioria dos euchromatin é replicado e BrdU foi incorporada na fase S tardia: as células estavam em fase S em 0 hr PI .
C) Núcleo com Edu (+) BrdU (+) eucromatina e Edu (-) BrdU (-) chromocenters. EdU e BrdU foram incorporadas na primeira parte da fase S: As células foram em fase S precoce a 0 hr PI.
D) Núcleo com BrdU (+) eucromatina e Edu (-) BrdU (-) cromocentro. BrdU foi incorporado no início da fase S. As células foram, no final de G1 em 0 hr PI e entrou fase S depois.
E) Núcleo com o Edu (-) BrdU (-) eucromatina e chromocenters. As células foram em G0 (neurônios imaturos) ou em fase G1 e não entrar na fase S durante Edu e BrdU pulsos.
| Solução | Incubação | Temperatura | Pressão | Agitação | |
| 1 | Álcool 70% | 30 min | 35 ° C | em | em |
| 2 | álcool 95% | 15 min | 35 ° C | em | em |
| 3 | álcool 95% | 30 min | 35 ° C | em | em |
| 4 | álcool 95% | 45 min | 35 ° C | em | em |
| 5 | álcool 100% | 15 min | 35 ° C | em | em |
| 6 | álcool 100% | 30 min | 35 ° C | em | em |
| 7 | álcool 100% | 1 hr | 35 ° C | em | em |
| 8 | Tolueno 100% | 30 min | 35 ° C | em | em |
| 9 | Tolueno 100% | 45 min | 35 ° C | em | em |
| 10 | Tolueno 100% | 1 hr | 35 ° C | em | em |
| 11 | Parafina | 30 min | 58 ° C | em | em |
| 12 | Parafina | 1 hr | 58 ° C | em | em |
| 13 | Parafina | 1 hr | 58 ° C | em | em |
| 14 | Parafina | 1,5 hr | 58 ° C | em | em |
MesaPrograma de processador de 1. Vácuo infiltração para inclusão em parafina.
| Componentes de reação para 1 slide | |
| 1X tampão de reação EdU | 128,64 mL |
| CuSO4 | 6 mL |
| EdU Alexa Fluor azida | 0,36 mL |
| 1X EdU aditivo tampão Reacção | 15 ul |
| O volume total | 150 ul |
Tabela 2. Cocktails reação Edu.
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Discussion
O delineamento experimental descrito aqui com base na incorporação de EdU 1,5 hr antes da irradiação e incorporação de BrdU imediatamente após a irradiação permitiu a demonstração de que NSPCs são capazes de ativar S e G2 / M, mas não a ponto de verificação G1 / S durante a 1 ª hora após a estresse genotóxico no cérebro fetal mouse. Realizamos outros experimentos em que EdU foi injetado em diferentes momentos após a irradiação e BrdU, apenas 1 hora antes de ratos sacrifícios, permitindo-nos apreciar especificamente a taxa de entrada de fase S. Estas experiências demonstraram que NSPC não ativar uma parada G1 / S, após um estresse genotóxico in vivo 22,23.
Por conseguinte, a escolha entre a reparação de ADN e apoptose não ocorre na barreira G1 / S levantando a questão sobre a natureza dos mecanismos também garantiu a estabilidade do genoma dessas células.
O protocolo é simples e rápido. A diferenteetapas apresentar nenhuma dificuldade óbvia. Esta técnica é uma alternativa para a utilização de cloro-desoxiuridina (CldU) e iodo-desoxiuridina (IDU) que foram mostrados para reagir de forma cruzada 32.
Um amplo painel de aplicativos pode ser considerado, como o protocolo é facilmente flexível e adaptável a várias questões biológicas. Exemplos de mudanças são propostas em Roque e colaboradores 23, Etienne e colaboradores 22, e em Rousseau e colaboradores 24. Poderia ser também combinado com a detecção de imunofluorescência de vários marcadores de células ou proteínas envolvidas na resposta de danos ao DNA, por exemplo. Note-se, que, neste caso, tanto a detecção de BrdU e EdU pode ser realizada com diferentes fluoróforos que são comercializados, para favorecer a detecção imunológica de outros marcadores.
EdU e BrdU in vivo em incorporação em NSPC também pode ser utilizado em células de triagem de citometria de fluxo para posterior análise bioquímica. Finalmente, thé o método pode ser realizado para monitorar a progressão do ciclo celular de NSPC em diferentes tipos de ratinhos mutantes ou depois de outros tipos de stress genotóxico (excepto radiação ionizante), ou qualquer outro tratamento que afectam a progressão do ciclo celular. Além disso, pode ser facilmente adaptada para outros tecidos replicantes.
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Disclosures
Os autores não têm qualquer conflito de interesses.
Acknowledgments
A investigação conducente a estes resultados foi financiada pelo Sétimo Programa-Quadro da União Europeia (FP7/2007-2013), sob contrato de subvenção n ° 323267, da Electricité de France (EDF) e de l'Agence Nationale de la Recherche - Santé-Environnement et Santé-Travail (ANR-SEST, Neurorad).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EdU | Life Technologies | A10044 | 1 mg/ml |
| BrdU | Life Technologies | B5002 | 5 mg/ml |
| IBL 637 | CIS BIO International | ||
| Tissu Tek VIP | Leica | ||
| Microtome | Leica | RM 2125 RT | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Click-iT EdU Alexa 488 imaging kit | Life Technologies | C10083 | |
| Anti-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1/300 |
| Goat anti mouse-Alex594 | Life Technologies | A11001 | 1/400 |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Polysine slide | Thermo scientific | J2800AMNZ | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-068 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Microscope BX51 | Olympus | ||
| Confocal microscope SPE | Leica | ||
| Prism software | Graphpad | Version 5.0c | |
| Photoshop software | Adobe |
References
- Rakic, P. Specification of cerebral cortical areas. Science. 241, 170-176 (1988).
- Sauer, F. Mitosis in he neural tube. J Comp Neurol. , 377-399 (1935).
- Taverna, E., Huttner, W. B. Neural progenitor nuclei IN motion. Neuron. 67, 906-914 (2010).
- Committee, B. Embryonic vertebrate central nervous system: revised terminology. Anat Rec. 166, 257-261 (1970).
- Bystron, I., Blakemore, C., Rakic, P. Development of the human cerebral cortex: Boulder Committee revisited. Nature Reviews. Neuroscience. 9, 110-122 (2008).
- Miyata, T., et al. Asymmetric production of surface-dividing and non-surface-dividing cortical progenitor cells. Development. 131, 3133-3145 (2004).
- Haubensak, W., Attardo, A., Denk, W., Huttner, W. B. Neurons arise in the basal neuroepithelium of the early mammalian telencephalon: a major site of neurogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 3196-3201 (2004).
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7, 136-144 (2004).
- Merot, Y., Retaux, S., Heng, J. I. Molecular mechanisms of projection neuron production and maturation in the developing cerebral cortex. Seminars in Cell & Developmental Biology. 20, 726-734 (2009).
- Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex. Trends Neurosci. 27, 392-399 (2004).
- Salomoni, P., Calegari, F. Cell cycle control of mammalian neural stem cells: putting a speed limit on G1. Trends Cell Biol. 20, 233-243 (2010).
- Calegari, F., Haubensak, W., Haffner, C., Huttner, W. B. Selective lengthening of the cell cycle in the neurogenic subpopulation of neural progenitor cells during mouse brain development. J Neurosci. 25, 6533-6538 (2005).
- Andres-Mach, M., Rola, R., Fike, J. R. Radiation effects on neural precursor cells in the dentate gyrus. Cell Tissue Res. 331, 251-262 (2008).
- Semont, A., et al. Involvement of p53 and Fas/CD95 in murine neural progenitor cell response to ionizing irradiation. Oncogene. 23, 8497-8508 (2004).
- Nowak, E., et al. Radiation-induced H2AX phosphorylation and neural precursor apoptosis in the developing brain of mice. Radiat Res. 165, 155-164 (2006).
- Gatz, S. A., et al. Requirement for DNA ligase IV during embryonic neuronal development. J Neurosci. 31, 10088-10100 (2011).
- Denekamp, J. Cell kinetics and radiation biology. International Journal of Radiation Biology and Related Studies in Physics, Chemistry, and Medicine. 49, 357-380 (1986).
- Hartwell, L. H., Weinert, T. A. Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events. Science. 246, 629-634 (1989).
- Weinert, T. A., Hartwell, L. H. Characterization of RAD9 of Saccharomyces cerevisiae and evidence that its function acts posttranslationally in cell cycle arrest after DNA damage. Mol Cell Biol. 10, 6554-6564 (1990).
- Tolmach, L. J., Jones, R. W., Busse, P. M. The action of caffeine on X-irradiated HeLa cells. I. Delayed inhibition of DNA synthesis. Radiat Res. 71, 653-665 (1977).
- Painter, R. B., Young, B. R. Radiosensitivity in ataxia-telangiectasia: a new explanation. Proc Natl Acad Sci U S A. 77, 7315-7317 (1980).
- Etienne, O., Roque, T., Haton, C., Boussin, F. D. Variation of radiation-sensitivity of neural stem and progenitor cell populations within the developing mouse brain. Int J Radiat Biol. 88, 694-702 (2012).
- Roque, T., et al. Lack of a p21waf1/cip -dependent G1/S checkpoint in neural stem and progenitor cells after DNA damage in vivo. Stem Cells. 30, 537-547 (2012).
- Rousseau, L., et al. In vivo importance of homologous recombination DNA repair for mouse neural stem and progenitor cells. PLoS One. 7, 12 (2012).
- Bradford, J. A., Clarke, S. T. Dual-pulse labeling using 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) and 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) in flow cytometry. Curr Protoc Cytom. , (2011).
- Deckbar, D., et al. The limitations of the G1-S checkpoint. Cancer Res. 70, 4412-4421 (2010).
- Manual, Click-iT EdU Imaging Kit. , http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp10338.pdf (2011).
- Weidtkamp-Peters, S., Rahn, H. P., Cardoso, M. C., Hemmerich, P. Replication of centromeric heterochromatin in mouse fibroblasts takes place in early, middle, and late S phase. Histochem Cell Biol. 125, 91-102 (2006).
- Wu, R., Terry, A. V., Singh, P. B., Gilbert, D. M. Differential subnuclear localization and replication timing of histone H3 lysine 9 methylation states. Mol Biol Cell. 16, 2872-2881 (2005).
- Wu, R., Singh, P. B., Gilbert, D. M. Uncoupling global and fine-tuning replication timing determinants for mouse pericentric heterochromatin. J Cell Biol. 174, 185-194 (2006).
- Takahashi, T., Nowakowski, R. S., Caviness Jr, V. S. The cell cycle of the pseudostratified ventricular epithelium of the embryonic murine cerebral wall. J Neurosci. 15, 6046-6057 (1995).
- Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. J Vis Exp. , (2010).
