Summary
La administración de dos análogos de timidina, edu y BrdU, en ratones embarazada permite el análisis de la progresión del ciclo celular en células progenitoras neurales y en el cerebro de ratón embrionario. Este método es útil para determinar los efectos del estrés genotóxico, incluyendo la radiación ionizante, durante el desarrollo del cerebro.
Abstract
Las neuronas de la corteza cerebral se generan durante el desarrollo cerebral de diferentes tipos de células madre y progenitoras neuronales (CPSN), que forman un epitelio pseudoestratificado que reviste los ventrículos laterales del cerebro embrionario. Tensiones genotóxicos, como la radiación ionizante, tienen efectos muy nocivos sobre el desarrollo del cerebro relacionada con la alta sensibilidad de NSPC. La elucidación de los mecanismos celulares y moleculares implicados depende de la caracterización de la respuesta al daño de ADN de estos tipos particulares de células, que requiere un método preciso para determinar CPSN progresión a través del ciclo celular en el tejido dañado. Aquí se muestra un método basado en sucesivas inyecciones intraperitoneales de Edu y BrdU en ratones embarazadas y aún más la detección de estos dos análogos de la timidina en secciones coronales del cerebro embrionario. Edu y BrdU se incorporan tanto en el ADN de las células de replicación durante la fase S y se detectan mediante dos técnicas diferentes (o azidaun anticuerpo específico, respectivamente), lo que facilita su detección simultánea. Edu y tinción de BrdU se determinan entonces para cada núcleo CPSN en función de su distancia desde el margen ventricular en una región estándar del telencéfalo dorsal. Por lo tanto esta técnica de doble etiquetado permite distinguir las células que progresaron a través del ciclo celular de los que han activado un punto de control del ciclo celular que conduce a la detención del ciclo celular en respuesta al daño del ADN.
Un ejemplo de experimento se presenta, en el que se inyectó EdU antes de la irradiación y BrdU inmediatamente después y análisis realizados en el 4 horas después de la irradiación. Este protocolo proporciona un análisis preciso de la respuesta al daño de ADN aguda de CPSN en función de la fase del ciclo celular en la que se han irradiado. Este método es fácilmente extrapolable a muchos otros sistemas con el fin de determinar el impacto de un tratamiento particular en la progresión del ciclo celular en los tejidos vivos.
Introduction
Durante el desarrollo embrionario del cerebro, las neuronas de proyección de la corteza cerebral se generan en la zona ventricular, un epitelio pseudoestratificado compuesto de diferentes tipos de células madre neurales y células progenitoras (CPSN) que recubre los ventrículos laterales. Entre CPSN, las células gliales radiales (RGC), que sirven como células madre neurales, se someten a la migración nuclear interkinetic (INM): que realizan la mitosis en la superficie del ventrículo y la fase S en el límite basal de la zona ventricular (VZ) 1, 2,3. Ellos pueden dividir de forma simétrica para generar dos RGC o asimétricamente para generar una RGC y una neurona o una célula progenitora intermedia (IPC) 4, 5. IPC migrar a una capa superpuesta que proliferan llamada zona subventricular (SVZ), donde después de una última división simétrica generan dos neuronas de proyección inmaduros 6-8. Contrariamente a la RGC, IPC no sufren INM (revisado en 9). Neuronas recién generadas MIGRcomió radialmente a lo largo de las fibras radiales a través de la zona intermedia (IZ) para llegar a su destino final en la placa cortical (CP) 10, 8. La sincronización perfecta de todos estos eventos es esencial para un desarrollo cortical correcta. Por ejemplo, el interruptor de la proliferación a la diferenciación de las poblaciones progenitoras neuronales se controla por la duración de la fase G1 11, 12. El alargamiento de la fase G1 se correlaciona tanto con la diferenciación celular.
Estrés genotóxico, como la radiación ionizante, el desarrollo del cerebro dañar seriamente (revisado en 13). Nosotros y otros han demostrado que NSPC son muy propensas a la apoptosis inducida por la radiación-14, 15,16. Las radiaciones ionizantes inducen ADN de doble filamento se rompe que son el daño más severo a las células proliferantes. Un componente esencial de la respuesta al daño del ADN (DDR) en el ciclo de las células es la activación de los puntos de control del ciclo celular en la transición G1 / S o G2 / M transición o durante Sfase (intra-S de control) 17-21. Ellos bloquean la progresión del ciclo celular para proporcionar tiempo para la reparación del daño en el ADN o eliminación de células demasiado dañados. En consecuencia, la muerte celular, así como la progresión del ciclo celular retardada pueden alterar el desarrollo del cerebro en respuesta a la exposición a radiaciones ionizantes 22-24. Por lo tanto, era interesante desarrollar un método para evaluar la activación de puntos de control del ciclo celular en CPSN en el cerebro de ratón embrionario irradiado.
La progresión del ciclo celular es seguida de forma rutinaria utilizando la incorporación de un análogo de timidina, 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU). BrdU se incorpora durante la fase S del ciclo celular, cuando el ADN se replica. El uso de un anticuerpo contra BrdU a partir de entonces permite la detección de células que se encontraban en la fase S durante el pulso de BrdU.
Un nuevo análogo de timidina, 5-etinil-2'-desoxiuridina (edu) se detecta por una azida fluorescente. Las diferentes maneras de detectar Edu y B RDU no reacciona de forma cruzada 25, lo que permite la detección simultánea de ambos análogos de timidina, que es útil para el estudio de la progresión del ciclo celular. Por lo general, las células se pulsaron con primera edu y pulsaron entonces con BrdU, en el que el tiempo entre las dos incorporaciones dura par de horas 25, 26. La adición de BrdU en medio de cultivo que contiene EdU preferentemente resulta en la incorporación de BrdU en el ADN con la exclusión de edu, mientras que la adición simultánea de EdU 25 con BrdU equimolar o medio equimolar a los resultados de los medios de comunicación en sólo incorporación de BrdU 27. Esto simplifica el protocolo de doble etiquetado mediante la eliminación de los pasos de lavado que normalmente se requieren para eliminar la primera etiqueta del medio de cultivo antes de la adición de la segunda etiqueta. Esto también es de especial interés para el estudio in vivo, donde los pasos de lavado no son posibles, para determinar el momento preciso de la entrada en la fase S o la salida de la población celular.
t "> Recientemente, un método de etiquetado de doble pulso en el cerebro embrionario de ratón usando edu y BrdU 23, 24,22 se ha desarrollado para analizar la progresión del ciclo celular y el INM de CPSN después de la irradiación en el útero. Además, se ha demostrado que, durante fase S, células de ratón se replica en primer lugar las regiones de eucromatina y heterocromatina entonces el pericéntrica 28,29,30. Curiosamente, la heterocromatina pericéntrica de diferentes cromosomas agrupados en núcleos interfásicos para formar focos de heterocromatina también conocido como chromocenters y fácilmente detectable por tinción con DAPI como focos brillantes. Por lo tanto, los diferenciales Edu y BrdU tinciones de eucromatina y chromocenters nos ayudaron a analizar con mayor precisión la progresión de la fase S de NSPC.Este método permite la demostración de la aparente falta de G1 / S de control en NSCP 22-24, que es bastante sorprendente, ya que este punto de control se supone que es crítico para la estabilidad del genoma. Varios experimental diseños basados en diversas combinaciones de edu y BrdU pulsos se han utilizado para analizar la progresión del ciclo celular en el telencéfalo ventral y dorsal. Aquí, le damos un ejemplo de protocolos que permiten el estudio del daño en el ADN aguda de NSPC dentro de las primeras 4 horas después de la irradiación en el útero de embriones E14.5 ratón.
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Protocol
1. Los procedimientos con animales
Este protocolo ha sido diseñado de acuerdo con la Directiva del Consejo Europeo de Comunidades de 24 de Noviembre de 1986 (86/609/CEE) y ha sido aprobado por nuestro comité institucional sobre bienestar animal (CETEA-CEA DSV IDF).
- Las inyecciones con edu / BrdU y la irradiación de E14.5 ratones preñados (Figura 2A).
- Preparar una solución de EdU a 1 mg / ml y de BrdU a 5 mg / ml en PBS. Realice una inyección intraperitoneal (IP) de 100 l de solución de EdU utilizando una aguja de 25 G en ratones embarazadas. 1.5 h más tarde, irradiar los ratones (irradiación corporal total) a 0 Gy o 2 Gy (0,6 Gy / min). Inmediatamente después, se inyectan (IP) 200 l de solución de BrdU utilizando una aguja de calibre 25 en los ratones embarazadas.
- Preparación de cortes coronales de cerebro embrionarias.
- En 1 hora o 4 horas después de la irradiación, la eutanasia a los ratones preñados por el dióxido de carbono.
- Abra la cavi abdominalty más de tres centímetros con unas tijeras. Separar los dos cuernos uterinos del resto del útero mediante el seccionamiento de ambas extremidades de los cuernos. La transferencia de los cuernos uterinos en una placa de Petri que contenía PBS 0,6% de glucosa. Abra los cuernos uterinos con los fórceps con el fin de aislar los embriones. Retire la bolsa de líquido amniótico de cada embrión con unas pinzas.
- Diseccionar cabezas de embriones con unas pinzas y fijarlos por inmersión en paraformaldehído al 4% (PFA, pH = 7,4) O / N a 4 ° C.
- Enjuague cabezas de embriones en PBS durante al menos una noche a 4 ° C. Jefes se pueden mantener en PBS durante varios días.
- Cabezas Insertar en parafina usando un procesador de infiltración al vacío como se indica en la Tabla 1. Jefes de incrustación también se puede realizar bajo una campana química para el etanol y baños de xilol, y luego en un horno de 65 ° C para los baños de parafina.
- Preparar 5-m de espesor secciones coronales con un microtomo.
- Montar en portaobjetos de microscopio recubiertos con polilisina. </ Li>
- Las diapositivas se pueden mantener a temperatura ambiente (TA) durante varios meses.
2. Edu / BrdU tinción
- Desparafinización y antígeno desenmascarar
- Desparafinar las secciones del cerebro embebidos en parafina por inmersión de los portaobjetos en 3 baños de tolueno durante 5 min.
- Se rehidrata durante 3 min en 2 baños de cada uno soluciones de la disminución de la concentración de etanol de la siguiente manera: etanol al 100%, etanol al 95%, etanol al 70%, y 5 min en H 2 O. Las diapositivas se pueden mantener en agua desionizada durante varias horas.
- Hervir las rodajas durante 10 min en solución de citrato (10 mM, pH 6), y luego incubar en agua desionizada durante 5 min.
- Tinción EdU
- Realizar la detección de EdU de acuerdo con el protocolo del fabricante. Permeabilizar las células con 0,5% de Triton X-100 en PBS durante 10 min.
- Preparar aditivo tampón 1X EdU diluyendo la solución 10 veces en agua desionizada. Esta solución debe ser recién hecho y utilizado en el mismo daY.
- Preparar EdU cóctel de reacción, incluyendo EdU Alexa Fluor 488 azida. Es importante añadir los ingredientes siguiendo el orden indicado en la Tabla 2, de otro modo, la reacción no se procederá de manera óptima. Utilice el cóctel reacción EdU en los 15 minutos de preparación.
- Retire la permeabilización de amortiguación (paso 2.1.1), luego se lava dos veces con PBS.
- Añadir 150 l de EdU cóctel de reacción, poner un cubreobjetos, y se incuba durante 30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente.
- Retire el cóctel reacción Edu, luego lavar una vez con PBS.
- Tinción BrdU
- Preparar tampón de saturación con 7,5% de suero de cabra y suero bovino fetal al 7,5% en PBS. Añadir 150 l de tampón de saturación en rodajas de cerebro, colocar un cubreobjetos, y se incuba durante 1 hora a TA para bloquear anticuerpo inespecífico vinculante.
- Quite el cubreobjetos. Añadir 150 l de ratón anti-BrdU anticuerpo primario diluido a 1/300 en tampón de saturación, se puso un cubreobjetos y se incuban O /N a 4 ° C.
- Quite el cubreobjetos, luego lavar 3 veces en PBS.
- Añadir 150 l de anticuerpo de cabra anti-ratón-Alexa594 anticuerpo secundario diluido a 1/400 en tampón de saturación, poner un cubreobjetos, y se incuba durante 1 hora a TA.
- Quite el cubreobjetos, luego lavar una vez con PBS.
- Tinción nuclear: añadir 150 l de 4 ',6-diamino-2-fenilindol (DAPI) a 1 g / ml en PBS, se puso un cubreobjetos y se incuba durante 2 minutos a temperatura ambiente.
- Montar las diapositivas en medio de montaje.
3. Análisis
- Examine las secciones del cerebro bajo un microscopio de fluorescencia con un objetivo 20X o un microscopio confocal y adquirir imágenes en tres canales (488 nm, 594 nm y UV) como separa archivos.
- Pila de imágenes con el software Photoshop.
- Analizar las secciones del cerebro en un sector estándar de la pared cerebral dorsomedial. Este sector es de 100 micras en su dimensión medial-lateral y está dividida en 18 contenedores (o más) de 10 μm de altura en su dimensión radial usando una cuadrícula superpuesta sobre imágenes (Figura 1) como se ha descrito previamente 31.
- Alinear la red, tales como el primer bin está en la superficie ventricular, con su eje largo paralelo a la frontera del ventrículo. Luego el número de la etiqueta EdU, BrdU y / o núcleos picnóticos (correspondiente a los núcleos apoptóticos) en cada bin. Número A núcleo situado en el límite de dos contenedores en el depósito que contiene su mayor parte, o en la papelera inferior, cuando el núcleo ocupa áreas iguales dentro de los dos contenedores.
- El análisis estadístico.
Analizar al menos dos rebanadas corticales por embrión. Repita los experimentos en al menos 3 embriones de diferentes camadas. Los resultados deben ser dados como media ± error estándar de la media (SEM). Los análisis estadísticos se realizaron con Graphpad Prism usando ANOVA de dos vías y múltiples pruebas posthoc comparación Bonferroni.
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Representative Results
En el experimento descrito en la Figura 2, EdU se administró 1,5 horas antes de la irradiación y de BrdU sólo después de la irradiación. Cuatro tipos de células se distinguen en las rodajas corticales preparadas en 1 o 4 horas después de la irradiación, de acuerdo a la incorporación de cualquiera de EdU o BrdU, ambos o ninguno (Figuras 2A y 2B). Es importante destacar que, ni EdU ni la incorporación de BrdU cambiar el nivel de la apoptosis inducida por la radiación (datos no mostrados). Por otra parte, los métodos de tinción sólo permiten la detección de EDU y BrdU incorporado durante la replicación del ADN en fase S, pero no tienen la sensibilidad para detectar la síntesis de ADN que está asociado con la reparación incluso después de la irradiación. En efecto, i) ni EdU ni tinción BrdU se observó a 1 h después de la irradiación (PI) en las células de la placa cortical, donde se encuentran las neuronas postmitóticas en fase G0 y ii) el número de Edu (+) y / o BrdU (+ ) no fue mayor en comparación con irradiado unirradiated cerebros.
Edu (+) BrdU (+) núcleos
Edu (+) BrdU (+) núcleos corresponden a NSPC que se encontraban en la fase S, antes y después de 0 hr PI. Así fueron irradiados en la fase S. Como se muestra en las figuras 3B y 3C su eucromatina es edu (+) y puede ser también de BrdU (+). Sus cromocentros eran o bien de BrdU (+) o de BrdU (-). Dependiendo de la finalización de la fase S en el momento del sacrificio Figura 2B muestra que en 1 hr PI, edu (+) de BrdU (+) núcleos fueron localizados en los contenedores de fase S (es decir contenedores de 4 a 10, donde se sabe que CPSN para llevar a cabo la fase S 31. Su distribución y números no se vieron afectadas por la irradiación. Esto sugiere que la radiación no indujo un bloqueo completo de la síntesis de ADN en este momento.
En consonancia con la basal a la migración nuclear apical durante la fase G2, la mayoría de Edu (+) BrdU (+) núcleos de NSPC fueron encontrados cerca del ventrículo a 4 hr PI en brai no irradiadons (Figura 2C). Esto no ocurrió en 2 Gy irradiado cerebros en la que los núcleos permanecían en contenedores fase S, muchos de los cuales son de apoptosis. En conjunto estos datos mostró que CPSN irradiado en la fase S activa intra-S puntos de control en asociación con el retraso en el INM y la muerte celular.
Edu (+) BrdU (-) núcleos
Edu (+) BrdU (-) núcleos corresponden a las células que se encontraban en la fase S antes y no después de la irradiación. Chromocenters de estos núcleos son edu (+), lo que indica que las células estaban en fase S tardía cuando EdU se inyectó en los ratones (Figura 3A). Desde las fases G2 / M del NSPC pasado 2 horas en el cerebro de ratón en desarrollo, Edu (+) BrdU (-) NSPC estaban en G2 a 0 hr PI. Consecuentemente, la mayoría de Edu (+) BrdU (-) núcleos se encuentra en la primera bandeja cerca del ventrículo en los cerebros no irradiados en 1 hr PI. Esto es una consecuencia del INM de NSPC, después de la fase S, en donde muchos de ellos formaron figuras mitóticas típicas (Figura 2B). En1 hr PI, el número de edu (+) de BrdU (-) núcleos se redujo significativamente en la superficie ventricular y ninguna figura mitótica fue detectable en los cerebros irradiados. Estos datos muestran claramente que las células irradiadas en G2 activan el G2 / M de control dentro de 1 hr PI. Además, la mayoría de EdU BrdU (+) (-) de estos núcleos fueron apoptóticas en 4 horas PI demostrando que CPSN son altamente sensibles a la radiación durante la fase G2 (Figura 2C).
Edu (-) BrdU (-) núcleos
Las células con una EDU (-) BrdU (-) núcleo corresponden a cualquiera de las células en G0 (neuronas inmaduras, principalmente), o NSPC que permaneció en el G1 de la incorporación EdU para el sacrificio de animales (Figura 3E). Comparación entre 1 hora y 4 horas en la figura 2C muestra la migración nuclear interkinetic haciendo que los núcleos que se encontraban cerca del ventrículo en G1 en 1 hr se haya producido la apical a la migración basal a las 4 horas, mientras que los núcleos que se encontraban en la fase S se fueron hacia el Ventricsuperficie ular.
Como se muestra en la Figura 2C muchos de estos núcleos fueron apoptóticas en 4 horas PI. El número de apoptótica edu (-) de BrdU (-) núcleos fue máxima cerca de la superficie ventricular y disminuye en los contenedores superiores. Estos datos sugieren, por tanto, ocurrió que la apoptosis inducida por radiación en NSPC que han sido irradiados durante la fase G1 temprana y / o post-mitótico neuronas migran. Por el contrario, ninguno o muy pocos núcleos apoptóticos se encontraron en la placa cortical. Esto está de acuerdo con la resistencia a la radiación de las neuronas que han alcanzado su destino final.
Edu (-) BrdU (+) núcleos
Edu (-) BrdU (+) núcleos corresponden a células que entraron en la fase S después de la irradiación. Típicamente en 1 hr PI, que mostraron un marcaje con BrdU difusa de eucromatina, pero no de cromocentros. Así que estaban en fase S temprana en ese momento (Figura 3D). A 1 hr PI el número y la localización dentro de S PHAe contenedores de Edu (-) BrdU (+) núcleos es similar entre los controles y los cerebros irradiados. Así, la entrada de la fase S durante el hr PI 1 º no se vio afectada por la radiación en el cerebro de ratón en desarrollo (Figura 2B). Curiosamente, la comparación de 1 hora y 4 horas PI en los cerebros irradiados muestra una disminución en el número de edu (-) de BrdU (+) núcleos y la mayoría de estos núcleos fueron apoptóticas en 4 horas PI. Esto sugiere que las células que entraron en la fase S después de la radiación activa intra-S los puntos de control y se les realizó la apoptosis después (Figura 2 C).
Figura 1. Análisis de la sección del cerebro Sección coronal del hemisferio cerebral de embriones de ratón E14.5 teñidas con DAPI. EdU y tinción BrdU, así como la morfología nuclear se analizan en un sector estándar del cerebra dorsomedialL pared utilizando una cuadrícula dividida en 18 contenedores (o más) como se describe en el texto. Barra de escala:. 20 m Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. La progresión del ciclo celular de los nervios irradiados tallo y células progenitoras (figura de Roque et al., Células madre, 2012). (A) Representación esquemática del diseño experimental y DAPI (azul), Edu (verde) y BrdU (rojo) los patrones de coloración que se encuentran en rebanadas corticales coronal en 1 y 4 hr PI (2 Gy). . Barra de escala = 20 m (B, C) Números / bin de Edu (+) BrdU (-), Edu (+) BrdU (+), Edu (-) BrdU (+) o Edu (-) BrdU (- ) núcleos con un mo normalesrphology en los controles no irradiados (azul) y con un normal (rojo) o apoptosis morfología (pyknotic, negro) en irradiado (2 Gy) cortezas en 1 hr (B) o 4 hr PI (C). No hay núcleos apoptóticos se detectaron en 1 hr PI (B). Análisis estadístico se realizó mediante pruebas de Bonferroni post hoc. Abreviaturas: BrdU, 5-bromo-2'-desoxiuridina; DAPI, 4'-6-diamino-2-fenilindol; Edu, 5-etinil-2'deoxyuridine; IZ, zona intermedia; SVZ, zona subventricular; VZ, zona ventricular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
. Figura 3 EdU diferencial y tinción BrdU de eucromatina y chromocenters superior del panel: Z-stackconfocal de imágenes de Edu (verde), BrdU (rojo) y la tinción de ADN counterstained con DAPI (azul), que permite la detección de chromocenters como focos de color azul brillante. Las tinciones se realizaron en una sección del cerebro de embriones recogidos en 1 hr PI en experimentos donde EdU fue entregado 1,5 horas antes de la irradiación y BrdU 0 hr PI (sólo el control no irradiado se muestra) (barra de escala: 5 m). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Los paneles inferiores muestran ejemplos de los 5 modelos diferentes de Edu y tinción BrdU detectado en rodajas de cerebro coronales. Combinar la imagen y los canales individuales se muestran (barra de escala: 2 m):
A) Núcleo con Edu (+) chromocenters y Edu (+) o Edu (-) eucromatina. EdU hubiere sido incorporado en la fase S tardía durante la replicación de la heterocromatina pericéntrica: las células fueron in G2 a 0 hr PI.
B) Núcleo con Edu (+) eucromatina y BrdU (+) chomocenters: EDU se ha incorporado en la fase S temprana, cuando la mayor parte de la eucromatina se replica y BrdU se ha incorporado en la fase S tardía: las células estaban en fase S a 0 hr PI .
C) Núcleo con Edu (+) BrdU (+) eucromatina y Edu (-) BrdU (-) chromocenters. Edu y BrdU se han incorporado en la primera parte de la fase S: Las células estaban en fase S temprana a 0 horas PI.
D) Núcleo con BrdU (+) eucromatina y Edu (-) BrdU (-) chromocenter. BrdU se ha incorporado en el comienzo de la fase S. Las células fueron a finales de G1 a 0 hr PI y entraron en la fase S a partir de entonces.
E) Núcleo con Edu (-) BrdU (-) eucromatina y chromocenters. Las células se encontraban en G0 (neuronas inmaduras) o en fase G1 y no entraron en la fase S durante Edu y BrdU pulsos.
| Solución | Incubación | Temperatura | Presión | Agitación | |
| 1 | El alcohol 70% | 30 min | 35 ° C | en | en |
| 2 | de alcohol 95% | 15 min | 35 ° C | en | en |
| 3 | de alcohol 95% | 30 min | 35 ° C | en | en |
| 4 | de alcohol 95% | 45 min | 35 ° C | en | en |
| 5 | el alcohol 100% | 15 min | 35 ° C | en | en |
| 6 | el alcohol 100% | 30 min | 35 ° C | en | en |
| 7 | el alcohol 100% | 1 hr | 35 ° C | en | en |
| 8 | Tolueno 100% | 30 min | 35 ° C | en | en |
| 9 | Tolueno 100% | 45 min | 35 ° C | en | en |
| 10 | Tolueno 100% | 1 hr | 35 ° C | en | en |
| 11 | Parafina | 30 min | 58 ° C | en | en |
| 12 | Parafina | 1 hr | 58 ° C | en | en |
| 13 | Parafina | 1 hr | 58 ° C | en | en |
| 14 | Parafina | 1.5 hr | 58 ° C | en | en |
Tabla1. Programa de procesador de infiltración de vacío para la inclusión en parafina.
| Componentes de reacción para 1 diapositiva | |
| Tampón de reacción 1X EdU | 128,64 l |
| CuSO4 | 6 l |
| EdU Alexa Fluor azida | 0,36 l |
| 1X tampón de reacción EdU aditivo | 15 l |
| Volumen total | 150 l |
Tabla 2. Cocktails de reacción edu.
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Discussion
El diseño experimental descrito aquí basado en la incorporación de EdU 1,5 horas antes de la irradiación y la incorporación de BrdU inmediatamente después de la irradiación permitió la demostración de que NSPCs son capaces de activar S y puntos de control G2 / M pero no el punto de control G1 / S durante la 1 ª hora después de un estrés genotóxico en el cerebro del ratón fetal. Se realizaron otros experimentos en los que se ha inyectado EdU en diferentes momentos después de la irradiación y BrdU, a sólo 1 hora antes de ratones sacrificios, que nos permite apreciar en concreto la velocidad de entrada en la fase S. Estos experimentos han demostrado que CPSN no activar una detención en G1 / S después de un estrés genotóxico in vivo 22,23.
Por lo tanto, la elección entre la reparación del ADN y la apoptosis no se produce en el punto de control G1 / S que plantea la cuestión de la naturaleza de los mecanismos garantizando la estabilidad del genoma en estas células.
El protocolo es fácil y rápido. La diferentepasos no presentan dificultades evidentes. Esta técnica es una alternativa a la utilización de cloro-desoxiuridina (CldU) y yodo-desoxiuridina (IDU), que se ha demostrado que reaccionan de forma cruzada 32.
Un amplio panel de aplicaciones puede ser considerado, como el protocolo es fácilmente flexible y adaptable a varias cuestiones biológicas. Se proponen ejemplos de cambios en Roque y colaboradores 23, Etienne y colaboradores 22, y en Rousseau y colaboradores 24. Se podría también combinarse con la detección de inmunofluorescencia de varios marcadores de células o proteínas implicadas en la respuesta al daño del ADN, por ejemplo. Tenga en cuenta, que en este caso, tanto de BrdU y la detección EdU se podrían realizar con diferentes fluoróforos que se comercializan, para favorecer la detección inmune de otros marcadores.
Edu y BrdU en la incorporación in vivo en CPSN también podrían utilizarse en la clasificación celular por citometría de flujo para el análisis adicional bioquímico. Por último, thes el método podría llevarse a cabo para controlar la progresión del ciclo celular de CPSN en diferentes tipos de ratones mutantes o después de otros tipos de estrés genotóxicos (distinta de una radiación ionizante) o cualquier otro tratamiento que afecta a la progresión del ciclo celular. Por otra parte se podría adaptar fácilmente a otros tejidos replicantes.
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Disclosures
Los autores no tienen ningún conflicto de intereses.
Acknowledgments
La investigación que lleva a estos resultados ha recibido financiación de la Unión Europea del Séptimo Programa Marco (FP7/2007-2013) en virtud de acuerdo de subvención n ° 323267, de Electricité de France (EDF) y de l'Agence Nationale de la Recherche - Santé-Environnement et Santé-Travail (ANR-SEST, Neurorad).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EdU | Life Technologies | A10044 | 1 mg/ml |
| BrdU | Life Technologies | B5002 | 5 mg/ml |
| IBL 637 | CIS BIO International | ||
| Tissu Tek VIP | Leica | ||
| Microtome | Leica | RM 2125 RT | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Click-iT EdU Alexa 488 imaging kit | Life Technologies | C10083 | |
| Anti-BrdU | GE Healthcare | RPN202 | 1/300 |
| Goat anti mouse-Alex594 | Life Technologies | A11001 | 1/400 |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Polysine slide | Thermo scientific | J2800AMNZ | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-068 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Microscope BX51 | Olympus | ||
| Confocal microscope SPE | Leica | ||
| Prism software | Graphpad | Version 5.0c | |
| Photoshop software | Adobe |
References
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