Anti-Nuclear antistoff screening med HEp-2 celler

Summary

Indirekte immunfluorescens (IIF) assays har tradisjonelt blitt brukt for påvisning av antinukleære antistoffer (ANA) i humant serum. Tilstedeværelsen av disse antistoffer kan hjelpe til ved diagnostisering av systemiske autoimmune revmatiske sykdommer (SArd). Denne protokollen demonstrerer hvordan du effektivt utføre IIF teknikk for å oppdage nøyaktig disse autoantistoffer.

Abstract

The American College of Rheumatology standpunkt på ANA testing fastsetter bruk av IIF som gullstandarden metode for ANA screening ^en. Selv IIF er en utmerket screening test på ekspert hender, de tekniske vanskeligheter for behandling og lese IIF glir - slik som arbeidskrevende glide behandling, manuell avlesning, behovet for erfarne, trent teknologer og bruk av mørkt rom - å gjøre det IIF metoden vanskelig å få plass i arbeidsflyten av moderne, automatiserte laboratorier.

Den første og avgjørende skritt mot høy kvalitet ANA screening er forsiktig lysbilde behandling. Denne fremgangsmåte er arbeidskrevende, og krever full forståelse av prosessen, så vel som hensyn til detaljer og erfaring.

Bilde lesing er utført av fluoriserende mikros i mørke rom, og er gjort av kvalifiserte teknologer som er kjent med de ulike mønstre, i sammenheng med cellesyklusog morfologi av interfase og delende celler. Forutsatt at IIF er den første linjen screening verktøy for SARD, forstå fremgangsmåten for å riktig utføre denne teknikken er kritisk.

Nylig, har digitale bildebehandlingssystemer blitt utviklet for automatisk avlesning av IIF lysbilder. Disse systemene, som for eksempel NOVA Vis Automated fluorescerende mikroskop, er utviklet for å effektivisere rutine IIF arbeidsflyt. NOVA Vis kjøper og lagrer høyoppløselige digitale bilder av brønnene, og dermed skille image oppkjøpet fra tolkning; Bildene viste en tolket på høyoppløselige dataskjermer. Den lagrer bilder for fremtidig referanse og støtter operatørens tolkning ved å gi fluorescerende lys intensitet data på bildene. Det er også foreløpig kategoriserer resultatene som positive eller negative, og gir mønstergjenkjenning for positive prøver. I sammendraget, eliminerer behovet for mørkerom, og automatiserer og effektiviserer IIF reading / tolkning arbeidsflyt. Viktigst, øker det konsistens mellom lesere og opplesninger. Dessuten, med bruk av strekkode slides, blir transkripsjon feil elimineres ved å gi prøve sporbarhet og positiv pasientidentifikasjon. Dette resulterer i økt pasientdataintegritet og sikkerhet.

Det overordnede målet med denne videoen er å vise IIF prosedyren, inkludert lysbilde behandling, identifisering av felles IIF mønstre, og innføring av nye fremskritt for å forenkle og harmonisere denne teknikken.

Introduction

Betegnelsen antinukleære antistoffer (ANA) beskriver en rekke av auto-antistoffer som reagerer med bestanddeler av cellekjerner, inkludert DNA, proteiner og ribonucleoproteins ^{1, 2.} Hep-2 celle, en innfødt protein array med hundrevis av antigener, gir et ideelt underlag for påvisning av ANA ^en. Påvisning av ANA i humant serum er et viktig verktøy for screening bindevevssykdommer, og IIF er referansemetoden for testing av ^en ANA. Nylig, IIF på HEp-2-celler er blitt erstattet i noen laboratorier med antigen-spesifikke immunanalyser og multipleks-metoder. På grunn av bekymringer over falske negative resultater og mangel på åpenhet for klinikere, American College of Rheumatology dannet en arbeidsgruppe som konkluderte med at IIF bruker HEp-2 celler bør være "gullstandarden" for ANA screening ^en.

På grunn av den subjektive natur ANA screening, er kvaliteten på HEp-2-celler itegral til nøyaktig og trygg rapportering av resultater. Tilstedeværelse av et høyt antall av mitotiske celler, optimal cellemorfologi, tilstrekkelig til konfluens, og ekspresjon av relevante antigener er spesielt viktige. IIF mønstergjenkjenning fungerer som et viktig verktøy for å hjelpe til pasientens diagnose. Forstå betydningen av ulike mønstre gjør at klinikere og laboratoriepersonell til å utføre den aktuelle oppfølging testing for å bekrefte diagnosen. For eksempel kan homogene ANA mønster forekommer i nærvær av anti-dsDNA-eller kromatin-antistoffer, og kan være assosiert med systemisk lupus erythematosus (SLE) ^3. Fra den andre siden, har det nylig blitt beskrevet at den såkalte tette fin flekkete mønster (DFS) som vanligvis ses hos opptil 12% av rutineprøver, for det meste blitt assosiert med anti DFS70 antistoffer. Disse autoantistoffer, da funnet i isolasjon (uten andre sykdomsspesifikke ANA) er ikke assosiert med systemiske autoimmune revmatiske sykdommer <sup> 4-9. Dermed bekreftende testing for anti-DFS70 antistoffer kan bidra til å redusere unødvendig refleks testing, gir store kostnadsbesparelser, og lette pasientens angst.

Gitt at IIF er den første linjen screening metode for å påvise antistoffer, er det viktig at brukeren forstår hvordan valg av reagenser og vev underlag kan påvirke resultatene. Siden IIF teknikken er i seg selv subjektivt, er det viktig at reagensene som benyttes gi den høyeste kvalitet.

Dette målet av denne videoen protokollen er å sette brukeren med de riktige trinnene for å utføre IIF metoden, de vanlige mønstre knyttet til ANA, og å innføre nye fremskritt som kan effektivisere laboratoriet arbeidsflyt og standardisere resultatene.

Protocol

En. Prøveforberedelse og Underlags Selection

1. Fjern reagenser fra emballasjen og la hvert element for å komme til romtemperatur. Forbered reagenser og fortynn pasientsera i henhold til retningen innsatsen. Merk: NOVA Lite lysbilder er strekkode og kan enkelt integreres i automatiserte systemer i forbindelse med Laboratory Information System LIS. Denne prosedyren illustrerer manuell lysbilde behandlingen; høy gjennomstrømning laboratorier, kan imidlertid velge automatisert lysbilde prosessutstyr.

2. Tilsetting av kontroller og prøver

1. Tilsett en dråpe positiv kontroll og en dråpe negativ kontroll til de riktige glide brønner. Pipetter 20 til 25 pl av fortynnede pasientserum til de gjenværende brønnene. Behandle ett lysbilde om gangen.
2. Plasser glideren (r) i en fargingsbeholder med en fuktig papirhåndkle på bunnen. Dekk beholderen og inkuber glideren (e) for 30 min. Merk: Den fuktige forhold vilhindre underlaget tørker ut. Tørking av brønnene kan resultere i kunstig farging. I løpet av denne inkubasjonsperiode blir den anti-nukleære antistoffer i pasientens serum bindes til antigen på cellene som er festet på hver brønn.
3. Etter inkubasjonsperioden, skyll av serum ved hjelp av en svak strøm av vaskebuffer. For å unngå skader på underlaget og hindre at cross-over av prøver mellom brønnene, vinkel glide litt for å unngå å rette strømmen direkte til brønnene. Tapp av overflødig vaskebuffer og plasser lysbilde i en Coplin krukke inneholder vaskebuffer i ca 5 min.

Tre. Tilsetting av Fluorescent konjugat

1. En etter en, fjerner du lysbildene fra vaskebuffer og banke forsiktig for å fjerne overflødig vaskebuffer. Påfør en dråpe av fluorescerende konjugat (FITC-merket anti-humant IgG) på hver brønn. Inkuber lysbilder for 30 min i befuktet container, og sørg for å erstatte flekkerbeholderlokket. Merk: For ANA testing, er bruken av en IgG Fc-konjugatet spesifikt anbefalt. Konjugatet er lysfølsom, og dekselet vil beskytte skinnene mot eksponering for lys i tillegg til å opprettholde den befuktet miljø. I løpet av denne inkubasjonsperiode, blir konjugatet bindes til pasientens anti-nukleære antistoffer som er bundet til celleantigener. Dette konjugat bindingsresultater i nærvær av fluorescens i brønnene.
2. Skyll og vaske lysbildet som beskrevet ovenfor.
3. Plasser et dekkglass på et papirhåndkle og gjelder monteringsmedium i en kontinuerlig linje til nedre kant av dekk.
4. Fjern hvert lysbilde fra vaskebuffer og trykk raset forsiktig for å fjerne overflødig vaskebuffer. Trykk på nedre kant av lysbildet til kanten av dekkglasset.
5. Senk lysbildet på dekkglass på en slik måte at monteringsmedium på dekkglass strømmer til den øvre kant av side uten luftbobledannelse. Merk: Coverslipping, inkludert bruk av den optimale mengden av montering medium, er en teknikk som krever øvelse for å perfeksjonere.

4. Identifikasjon av positive og negative resultater

Manuell tolkning

1. Vis lysbilder med et fluorescerende mikroskop, som ligger i et mørkt rom. Utfør skanning av hele godt med en 20X eller 25X mål å vurdere cellefordeling og ensartethet av fluorescens
2. Bytt til en 40X objektiv for å gjøre den endelige tolkningen om positivitet og mønster.
3. Se på de positive og negative kontroller. Grad positivitet ved hjelp av en reaktivitet karakterskala fra 1 + til 4 +. Merk: Den negative kontrollen vises kanskje ikke helt mørkt, men vil ofte vise lavt nivå spesifikk fluorescens. Den positive kontrollen viser lyse eple grønn fluorescens i kjernen (figur 1).

Automatisert tolkning

Merk: I tilvidere til manuell tolkning, last-og skanne lysbilder ved NOVA Vis Automated fluorescens mikroskop eller andre automatiserte digital bildebehandling instrument; ingen mørkerom er nødvendig. Når du har opprettet et prosjekt ved å velge den aktuelle lysbildet type, kjøper instrumentet og lagrer høyoppløselige digitale bilder av celler i hver brønn. I tillegg, NOVA Vis måler fluorescerende lys intensitet, og kategoriserer resultatene som positive eller negative, og gir mønstergjenkjenning for positive prøver. Bilder blir sett fra brukeren på en datamaskin med høy oppløsning på skjermen, slik at for endelige tolkningen, revisjon og bekreftelse av NOVA Vis resultat. Rapporter kan genereres på bekreftede resultater. Digital mikros skal brukes i forbindelse med en erfaren laboratorietekniker som det er beregnet på å hjelpe til med tolkning av resultater.

Representative Results

Når man skal vurdere cellefarging resultater for HEp-2, fem store atom mønstre er hyppigst rapportert: homogen, flekkete centro, nukleolært, og kjernefysiske prikker. Disse mønstrene er et resultat av autoantistoff binding til spesifikke bestanddeler av kjernen. Selv om ANA-testing er spesifikke for kjernefysiske strukturer, kan cytoplasmatiske mønstre forbundet med autoantistoffer mot cytoplasmatiske strukturer også observeres. I noen tilfeller kan flere autoantistoffer være til stede i en prøve, og bildet kan vises som et blandingsmønster.

Det er andre, mindre hyppig observert, og ofte cellesyklus bestemte mønstre som kan oppdages av IIF-metoden; nylig, har en såkalt tett fin flekkete mønster med spesiell klinisk betydning blitt beskrevet i noen ANA positive sera.

Homogen Mønster

For å identifisere en homogen mønster, skanne godt og identifisere mitotic eller delelinjeceller. Den kondenserte kromatin av mitotiske celler (figur 2, orange pil) oppviser solid, ensartet fluorescens, som ofte er mer markert enn i hvilecelle nuclei.In den homogene mønster, den hvilende celler utstillings uniform, diffus fluorescens av hele kjernen (figur 2, hvite pilen). Dette karakteristiske mønster er ofte et resultat av anti-dsDNA-antistoffer ^10.

Flekkete mønster

I grovspettet mønster, de mitotiske celler viser ingen farging av de kondenserte kromosomale regioner (figur 3, orange pil). De hvilende celler oppviser granulær fluorescens gjennom hele kjernen. Atom speckling kan defineres som grovt eller fint. Den grove speckling mønsteret er ofte et resultat av anti-Sm og anti-RNP ^11..

I den fine flekkete mønster, hviler cellene vise fine eller diffuse speckling hele kjerner, typisk i uniform distribution (Figur 4, hvit pil). Den fine flekkete mønsteret er ofte et resultat av anti-SSAand anti-SSB ^12..

Tett Fin Speckled Mønster

Det er nå anerkjent som den tette fin flekkete mønster (DFS) er vanlig i rutinemessig testing, og så mye som 12% av prøvene er positive for anti-DFS70 autoantistoffer. Men disse autoantistoffer, da funnet isolert, ikke er forbundet med systemiske autoimmune revmatiske sykdommer ^{4. -6.} Disse antistoffene er utbredt hos friske individer og pasienter som bærer sykdommer relatert til SARD ^seks. Bekreftende testing for anti-DFS70 antistoffer kan bidra til å redusere unødvendig refleks testing, gir store kostnadsbesparelser, og lette pasientens angst.

Siden DFS mønsteret er vanskelig å identifisere og ANA positivitet kan føre til angst for både pasienter og leger, er det sterkt anbefalt å utføre en bekreftende test etter identi fying et mønster som tyder på anti-DFS70 antistoffer for å avklare den kliniske betydningen av ANA positivty ^5,6.

I dette mønsteret, mitotiske celler (figur 5, oransje pil) viser positiv flekkete farging av meta kromatin, mens du hviler cellekjerner (figur 5, hvit pil) utstillingen jevnt fordelt fin flekker i hele kjernen.

Centro Mønster

Å identifisere cent mønster, skanne brønnene og identifisere mitotic eller dele celler. I mitotiske celler (figur 6, oransje pil), disse diskrete flekker bli nært forbundet i det som ofte beskrives som en "meta bar". I cent mønster, hvilende celler (figur 6, hvit pil) viser ca 40-60 diskrete flekker fordelt i atomkjerner. Den cent mønsteret er et resultat av anti-CENP A, B, antistoffer C ^13.

trinn "> nucleolar Pattern

Noen nucleolar mønstre er assosiert med diffus cytoplasmisk farging i mitotiske celler (figur 7, orange pil) og negative kromosomale region, mens andre nucleolear mønstre viser positiv farging av det kromosomale regionen. Den nukleolært mønster er forbundet med homogen eller flekkete farging av nucleoli (figur 7, hvite pilen), sammen med svak spettet eller homogen farging av nukleoplasma. Disse mønstrene er assosiert med anti-RNA polymerase III, anti-fibrillarin, anti-Th/To og anti-PM/Scl antistoffer ^14,15.

Nuclear Dot Mønster

Atompunktmønster er forbundet med negativ metafase mitotiske celler (figur 8, orange pil), og med noen få adskilte flekker i hvilecellekjerner (figur 8, hvit pil). Denne karakteristiske mønsteret er ofte et resultat av sp-100, PML, eller P80 Colin autoantistoffer. Disse antistoffene er som assosieres med primær biliær cirrhose og autoimmun hepatitt ^16.

. Figur 1. Negativ kontroll (venstre): Celler vise lav ikke-spesifikk fluorescens, men ingen spesifikk nukleær farging Positiv kontroll (til høyre). Celler viser eplegrønn atom fluorescens.

Figur 2. Homogenous mønster. Mitotiske celler (orangearrow) viser solid fluorescens. Resting cellene vise enda, diffuse flekker (whitearrow).

"Width =" 500 "/>
Figur 3. Grovspettet mønster. Mitotiske celler (oransje pil) viser negativ farging. Hvilende cellene vise en tydelig flekkete flekk (hvit pil).

Figur 4 Fin flekkete mønster. Mitotiske celler (oransje pil). Viser negativ farging. Hvilende cellene vise en tydelig fin flekkete farging (hvit pil).

Figur 5. Tett fin flekkete mønster. Mitotiske celler (oransje pil) viser en fin kornet solid farging. Hvilende cellene vise en veldig fin, diffus flekkete flekken (whitearrow).

Figur 6. Centro mønster. Mitotiske celler (orangearrow) viser uniform, diskrete flekker. Hvile celler (whitearrow) viser 40-60 diskrete flekker per cellekjernen.

Figur 7. Nucleolar mønster. Mitotiske celler (orangearrow) vises som store klynger av kornet farging. Hvile celle nucleishows fluorescens i nucleoli (whitearrow).

Figur 8. Nuclear prikkmønster. Mitotiske celler (orangearrow) vises negativ. Hvilende cellene vise noen discrete flekker i kjernen (whitearrow). I tillegg er nucelar prikkmønster kan sameksistere med farging i cytoplasma forbundet med autoantistoffer mot mitokondrie antigener (rød pil).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NOVA Lite HEp-2 IgG (DAPI conjugate)	INOVA Diagnostics	708102
NOVA View Instrument	INOVA Diagnostics	NV2000
QUANTA Link Workstation	INOVA Diagnostics	LINK010
QUANTA Link Workstation License	INOVA Diagnostics	LINK001
Barcode Scanner	INOVA Diagnostics	LINK019