Summary
Indirecte immunofluorescentie (IIF) assays traditioneel gebruikt voor de detectie van antinucleaire antilichamen (ANA) in menselijk serum. De aanwezigheid van deze antilichamen kunnen helpen bij de diagnose van systemische auto reumatische aandoeningen (SARD). Dit protocol laat zien hoe effectief uit te voeren de IIF techniek om deze autoantilichamen nauwkeurig te detecteren.
Abstract
De American College of Rheumatology positie verklaring over ANA testen, wordt het gebruik van IIF als de gouden standaard methode voor het ANA screening 1. Hoewel IIF is een uitstekende screeningstest in deskundige handen, de technische problemen van de verwerking en het lezen IIF dia's - zoals de arbeidsintensieve verwerking glijbaan, handleiding lezen, de behoefte aan ervaren, opgeleide technologen en het gebruik van donkere kamer - maken het IIF methode moeilijk in te passen in de workflow van de moderne, geautomatiseerde laboratoria.
De eerste en cruciale stap op weg naar een hoge kwaliteit ANA screening is voorzichtig glijbaan verwerking. Deze procedure is arbeidsintensief en volledig begrip van de werkwijze en aandacht voor details en ervaring vereist.
Dia lezing wordt uitgevoerd door fluorescentie microscopie in donkere kamers, en wordt gedaan door opgeleide technologen die vertrouwd zijn met de verschillende patronen, in het kader van de celcyclusen de morfologie van interfase en delende cellen. Mits IIF is de eerste lijn screening tool voor SARD, het begrijpen van de stappen om deze techniek correct uit te voeren is van cruciaal belang.
Recent zijn digitale beeldvormingssystemen ontwikkeld voor het automatisch lezen van IIF dia. Deze systemen, zoals het NOVA View Automated fluorescentiemicroscoop, zijn ontworpen om de routine IIF stroomlijnen. NOVA Bekijk verwerft en slaat digitale beelden van de putten hoge resolutie, waardoor beeldaanwinst scheiden van interpretatie; beelden worden bekeken een geïnterpreteerde op hoge resolutie beeldschermen. Het slaat beelden voor toekomstige referentie en ondersteunt de interpretatie van de exploitant door middel van fluorescerende lichtintensiteit gegevens op de afbeeldingen. Ook voorlopig categoriseert resultaten als positief of negatief, en biedt patroonherkenning voor positieve monsters. Samengevat, het elimineert de behoefte aan donkere kamer, en automatiseert en stroomlijnt het IIF reading / interpretatie workflow. Belangrijker nog, het verhoogt de consistentie tussen lezers en lezingen. Bovendien, met het gebruik van barcodes glijbanen, transcriptie fouten worden voorkomen door te bepalen monster traceerbaarheid en positieve patiënt identificatie. Dit resulteert in een verhoogde patiëntgegevens integriteit en veiligheid.
Het algemene doel van deze video is om de IIF-procedure aan te tonen, waaronder dia verwerking, de identificatie van gemeenschappelijke IIF patronen, en de introductie van nieuwe ontwikkelingen te vereenvoudigen en harmoniseren van deze techniek.
Introduction
Het antinucleaire antilichaam term (ANA) beschrijft verschillende auto-antilichamen die reageren met bestanddelen van celkernen waaronder DNA, eiwitten en ribonucleoproteins 1, 2. De HEp-2 cellen, een natief eiwit array met honderden antigenen, een ideale substraat voor de detectie van ANA 1. De detectie van ANA in menselijk serum is een belangrijk onderzoekshulpmiddel voor bindweefselziekten en IIF is de referentiemethode ANA test 1. Onlangs heeft IIF op HEp-2-cellen vervangen in sommige laboratoria antigeenspecifieke multiplex immunoassays en werkwijzen. Als gevolg van bezorgdheid over vals negatieve resultaten en het gebrek aan transparantie aan werkers, de American College of Rheumatology vormden een Task Force concludeerde dat IIF gebruik HEp-2-cellen de "gouden standaard" voor ANA screening 1 zou moeten zijn.
Door de subjectieve aard van ANA screening, de kwaliteit van HEp-2-cellen inTEGRAL om nauwkeurige en vol vertrouwen rapportage van de resultaten. De aanwezigheid van een groot aantal mitotische cellen optimaal celmorfologie voldoende confluentie en expressie van relevante antigenen zijn bijzonder belangrijk. IIF patroonherkenning fungeert als een belangrijk instrument om te helpen bij de patiënt de diagnose. Inzicht in de betekenis van de verschillende patronen kan de artsen en laboratoriumpersoneel om de passende follow-up testen uit te voeren om de diagnose te bevestigen. Zo kunnen homogeen ANA patroon voorkomen in de aanwezigheid van anti-dsDNA antilichamen of chromatine, en kan gepaard gaan met systemische lupus erythematosus (SLE) 3. Van de andere kant, is onlangs beschreven dat de zogenaamde dichte fijn gespikkelde patroon (DFS), die vaak wordt gezien in maximaal 12% van de routine monsters, is meestal in verband gebracht met anti-DFS70 antilichamen. Deze auto-antilichamen, indien in isolatie (zonder andere ziektespecifieke ANA) zijn niet geassocieerd met systemische auto reumatische aandoeningen <sup> 4-9. Daarbij bevestigend onderzoek naar anti-DFS70 antilichamen kunnen helpen onnodige reflex tests te beperken, bieden aanzienlijke kostenbesparingen en gemak patiënt angst.
Gezien het feit dat IIF is de eerste lijn screening methodologie om autoantilichamen sporen, is het van het grootste belang dat de gebruiker begrijpt hoe de selectie van reagentia en weefsel substraten resultaten kunnen beïnvloeden. Aangezien de IIF techniek subjectief, is het belangrijk dat de gebruikte reagentia bieden de hoogste kwaliteit.
Dit doel van deze video-protocol is om de gebruiker vertrouwd te maken met de juiste stappen die nodig zijn om de IIF-methode, de gemeenschappelijke patronen geassocieerd met ANA voeren, en om nieuwe ontwikkelingen waarvoor het laboratorium workflow kunnen stroomlijnen en de resultaten te standaardiseren introduceren.
Protocol
1. Monstervoorbereiding en de gekozen ondergrond
- Verwijder reagentia uit de verpakking en laat elk item om op kamertemperatuur te komen. Bereid reagentia en verdun patiëntensera volgens de richting insert. Opmerking: NOVA Lite slides barcode en kan gemakkelijk in combinatie met het Laboratorium Informatie Systeem LIS worden geïntegreerd in geautomatiseerde systemen. Deze procedure illustreert handleiding dia verwerking; hoge doorvoer laboratoria evenwel kiezen voor geautomatiseerde dia apparatuur.
2. Toevoeging van controles en-monsters
- Breng 1 druppel positieve controle en 1 druppel negatieve controle aan de juiste putjes dia. Pipetteer 20-25 gl verdunde patiëntenserum de resterende putjes. Verwerk een dia per keer.
- Plaats de schuif (s) in een kleuring container met een vochtige papieren handdoek op de bodem. Bedek de houder en incubeer de schuif (s) gedurende 30 minuten. Opmerking: De vochtige omstandigheden zalvoorkomen dat de ondergrond uitdroogt. Drogen van de putten kan leiden tot kunstmatig kleuring. Tijdens deze incubatietijd wordt de antinucleaire antilichamen in het serum van de patiënt binden aan antigenen van de cellen die zich binden aan elk putje.
- Na de incubatieperiode, spoelen het serum met behulp van een zachte stroom van wasbuffer. Om te voorkomen dat schade aan de ondergrond en het voorkomen van cross-over van de monsters tussen de putten, de hoek van de glijbaan iets om te voorkomen dat de leiding van de stroom direct op de putten. Tik overtollige wasbuffer en plaats de dia in een Coplin pot met wasbuffer gedurende ongeveer 5 minuten.
3. Toevoeging van TL-conjugaat
- Een voor een, verwijdert u de dia's van de wasbuffer en tik zachtjes om het overtollige wasbuffer verwijderen. Breng 1 druppel fluorescente conjugaat (FITC gemerkt anti-humaan IgG) op elk putje. Incubeer de glaasjes gedurende 30 min in de bevochtigde container, en zorg ervoor dat de vlekken te vervangencontainer deksel. Opmerking: ANA test is het gebruik van een IgG Fc specifiek conjugaat aanbevolen. Het conjugaat is lichtgevoelig en het deksel zal de dia tegen blootstelling aan licht naast het handhaven van de bevochtigde omgeving. Tijdens deze incubatieperiode wordt het conjugaat binden aan anti-nucleaire antilichamen van de patiënt die zijn gebonden aan de cel antigenen. Dit conjugaat binding resulteert in de aanwezigheid van fluorescentie in de putjes.
- Spoel en was de dia zoals hierboven beschreven.
- Plaats een dekglaasje op keukenpapier en fixeermiddel toepassing in een continue lijn met de onderkant van het dekglaasje.
- Verwijder elke dia uit de wasbuffer en tik op de schuif zachtjes om het overtollige wasbuffer verwijderen. Raak de onderrand van de schuif naar de rand van het dekglaasje.
- Sluit voorzichtig de schuif op het dekglaasje zodanig dat het fixeermiddel op het dekglaasje stroomt naar de bovenrand van de schuif zonder vorming luchtbel. Opmerking: Coverslipping, inclusief het gebruik van de optimale hoeveelheid van de montage medium, is een techniek die praktijk neemt om te perfectioneren.
4. Identificatie van positieve en negatieve resultaten
Handmatig Interpretatie
- Bekijk dia's met een fluorescentiemicroscoop, gelegen in een donkere kamer. Voer scannen van het gehele goed met een 20X en 25X objectief celverdeling en uniformiteit van fluorescentie beoordelen
- Schakel over naar een 40x doelstelling om de uiteindelijke interpretatie met betrekking tot positiviteit en patroon te maken.
- Kijk naar de positieve en negatieve controles. Grade positiviteit met een reactiviteit beoordelingsschaal van 1 + tot 4 +. Opmerking: De negatieve controle mogelijk niet helemaal donker, maar zal vertonen vaak een laag niveau niet-specifieke fluorescentie. De positieve controle zal helder appel groene fluorescentie in de kern (figuur 1) weer te geven.
Automatische interpretatie
Opmerking: In additiop handmatige interpretatie, belasting en scan dia's door NOVA Bekijk Automated fluorescentiemicroscoop of andere geautomatiseerde digitale imaging-instrument; geen donkere kamer nodig. Na het aanmaken van een project door het selecteren van het juiste type glijbaan, het instrument verwerft en slaat digitale beelden van cellen van hoge resolutie in elk putje. Daarnaast meet NOVA Bekijk fluorescerend licht-intensiteit, en categoriseert de resultaten als positief of negatief, en biedt patroonherkenning voor positieve monsters. De beelden worden bekeken door de exploitant op een hoge resolutie computer monitor, waardoor uiteindelijke interpretatie, revisie en bevestiging van NOVA View resultaat. Rapporten kunnen worden gegenereerd op bevestigd resultaten. Digitale microscopie moet in combinatie met een ervaren laborant worden gebruikt zoals het is bedoeld om te helpen bij de interpretatie van de resultaten.
Representative Results
Bij het evalueren van celkleuring resultaten voor HEp-2, vijf grote nucleaire patronen zijn meest gemelde: homogeen, gespikkeld, centromeer, nucleolar, en nucleaire stippen. Deze patronen zijn het gevolg van auto-antilichaam binden aan specifieke bestanddelen van de kern. Hoewel ANA test specifiek nucleaire structuren kunnen cytoplasmatische patronen geassocieerd met autoantilichamen tegen cytoplasmatische structuren worden waargenomen. In sommige gevallen kunnen verschillende auto-antilichamen aanwezig in een monster, en kan het beeld als gemengd patroon.
Er zijn andere, minder vaak waargenomen en vaak celcyclus specifieke patronen die kunnen worden gedetecteerd door de IIF werkwijze; meest recent is een zogenaamde dichte fijn gespikkelde patroon met speciale klinische betekenis is beschreven in een aantal ANA positieve sera.
Homogene Patroon
Om een homogeen patroon te identificeren, scan de put en identificeren mitotische of scheidingslijnencellen. De gecondenseerde chromatine van de mitotische cellen (Figuur 2, oranje pijl) vertoont solide, uniforme fluorescentie die vaak meer uitgesproken dan in de rustende cel nuclei.In het homogeen patroon, de rustende cellen vertonen uniform, diffuse fluorescentie van de gehele kern (Figuur 2, witte pijl). Deze karakteristiek patroon is vaak het resultaat van anti-dsDNA-antilichamen 10.
Gespikkelde Patroon
In de grove gespikkeld patroon, de mitotische cellen vertonen geen kleuring van het gecondenseerde chromosomale regio's (figuur 3, oranje pijl). De rustende cellen vertonen korrelvormige fluorescentie gedurende de gehele kern. De nucleaire spikkels kan worden gedefinieerd als grof of fijn. De grove spikkels patroon is vaak het resultaat van anti-Sm en anti-RNP 11.
In het fijn gespikkelde patroon, de rustende cellen vertonen boete of diffuse speckling de gehele kernen, meestal in uniform ditkering (Figuur 4, witte pijl). De fijne gespikkelde patroon is vaak het resultaat van anti-SSAand anti-SSB 12.
Dichte Fine gespikkelde Patroon
Het wordt nu erkend dat de dichte fijne gespikkelde patroon (DFS) is gemeenschappelijk in routine testen, en maar liefst 12% van de monsters positief zijn voor anti-DFS70 autoantilichamen. Echter, deze auto-antilichamen, wanneer gevonden op zichzelf niet geassocieerd met systemische auto reumatische aandoeningen 4 -6. Deze antilichamen zijn overwegend in gezonde individuen en patiënten dragen ziekten die niets met SARD 6. Bevestigend onderzoek naar anti-DFS70 antilichamen kunnen helpen onnodige reflex tests te beperken, bieden een aanzienlijke kostenbesparing en gemak patiënt angst.
Sinds de DFS patroon is moeilijk te identificeren en ANA positiviteit kan leiden tot angst voor zowel patiënten als artsen, is het sterk aanbevolen om een bevestigende test uit te voeren na identificatie fying een patroon suggestief van anti-DFS70 antilichamen tegen de klinische betekenis van ANA verduidelijken positivty 5,6.
In dit patroon, mitotische cellen (Figuur 5, oranje pijl) laten positieve gespikkelde kleuring van de metafase chromatine, terwijl rust celkernen (Figuur 5, witte pijl) vertonen uniform verdeeld fijne spikkels in de hele kern.
Centromeer Patroon
Om de centromeer patroon te identificeren, scan de putten en identificeren mitotische of delende cellen. In mitotische cellen (Figuur 6, oranje pijl), die discrete spikkels worden nauw betrokken bij wat vaak omschreven als een "metafase bar". In de centromeer patroon, rustende cellen (Figuur 6, witte pijl) laten ongeveer 40-60 discrete spikkels verspreid over de kernen. Het centromeer patroon is het resultaat van anti-CENP A, B, C antilichamen 13.
stap "> Hergroepering van nucleoli PatroonSommige nucleolair patronen worden geassocieerd met diffuse cytoplasmatische kleuring in mitotische cellen (figuur 7, oranje pijl) en negatieve chromosomaal gebied, terwijl andere nucleolear patronen tonen positieve kleuring van het chromosomale gebied. De nucleolair patroon wordt geassocieerd met homogene of gespikkeld kleuring van de nucleoli (figuur 7, witte pijl), samen met zwakke gespikkelde of homogene kleuring van het nucleoplasma. Deze patronen worden geassocieerd met anti-RNA polymerase III, anti-fibrillarin, anti-Th/To en anti-PM/Scl antilichamen 14,15.
Nucleaire Dot Pattern
De nucleaire puntpatroon geassocieerd met negatieve metafase mitotische cellen (Figuur 8, oranje pijl) en met weinig discrete spikkels in rustpositie celkernen (Figuur 8, witte pijl). Deze karakteristiek patroon is vaak het gevolg van SP-100, PML of p80 Colin autoantilichamen. Deze antilichamen zijn samenhingen met primaire biliaire cirrose en auto-immune hepatitis 16.
. Figuur 1 Negatieve controle (links): Cellen tonen lage niveau niet-specifieke fluorescentie, maar geen specifieke kernkleuring Positieve controle (rechts):. Cellen geven appelgroen nucleaire fluorescentie.
Figuur 2. Homogene patroon. Mitotische cellen (orangearrow) Solide fluorescentie. Rustende cellen vertonen zelfs, diffuse kleuring (whitearrow).
"Width =" 500 "/>
Figuur 3. Grof gespikkeld patroon. Mitotische cellen (oranje pijl) geven negatieve kleuring. Rustende cellen vertonen een duidelijke gespikkelde vlek (witte pijl).
Figuur 4. Fine gespikkelde patroon. Mitotische cellen (oranje pijl) geven negatieve kleuring. Rustende cellen vertonen een duidelijke fijn gespikkelde kleuring (witte pijl).
Figuur 5. Dichte fijn gespikkelde patroon. Mitotische cellen (oranje pijl) laten een fijne korrelige vaste stof kleuring. Rustende cellen vertonen een zeer fijne, diffuse gespikkelde vlek (whitearrow).
Figuur 6. Centromeer patroon. Mitotische cellen (orangearrow) toon uniform, discrete spikkels. Rustende cellen (whitearrow) toont 40-60 discrete spikkels per celkern.
Figuur 7. Hergroepering van nucleoli patroon. Mitotische cellen (orangearrow) verschijnen als grote clusters van granulaire kleuring. Rusten cel nucleishows fluorescentie in de nucleoli (whitearrow).
Figuur 8. Nuclear stippenpatroon. Mitotische cellen (orangearrow) lijken negatief. Rustende cellen vertonen een paar discrete spikkels in de kern (whitearrow). Daarnaast is de Nucelar dot patroon kan samengaan met cytoplasmakleuring geassocieerd met auto-antilichamen tegen mitochondriale antigenen (rode pijl).
Disclosures
De auteurs Gabriella Lakos, Cassandra Bryant, Carol Buchner, en Anna Eslami zijn medewerkers van INOVA Diagnostics.
Acknowledgments
Wij danken Cassandra Bryant voor het uitvoeren van de IIF experiment en Carol Buchner voor haar deskundige technische beoordeling.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NOVA Lite HEp-2 IgG (DAPI conjugate) | INOVA Diagnostics | 708102 | |
| NOVA View Instrument | INOVA Diagnostics | NV2000 | |
| QUANTA Link Workstation | INOVA Diagnostics | LINK010 | |
| QUANTA Link Workstation License | INOVA Diagnostics | LINK001 | |
| Barcode Scanner | INOVA Diagnostics | LINK019 |
References
- Meroni, P. L., Schur, P. H. ANA screening: an old test with new recommendations. Ann Rheum Dis. 69 (8), 1420-1422 (2010).
- Tan, E. M. Autoantibodies to nuclear antigens (ANA): Their immunobiology and medicine. Advances in immunology. 33, 167-240 (1982).
- Sack, U., et al. Autoantibody detection using indirect immunofluorescence on HEp-2 cells. Ann NY Acad Sci. 1173, 166-173 (2009).
- Watanabe, A., et al. Anti-DFS70 antibodies in 597 healthy hospital workers. Arthritis Rheum. 50 (3), 892-900 (2004).
- Mahler, M., et al. Importance of the dense fine speckled pattern on HEp-2 cells and anti-DFS70 antibodies for the diagnosis of systemic autoimmune diseases. Autoimmun Revi. 11 (9), 642-645 (2012).
- Mahler, M., Fritzler, M. J. The clinical significance of the dense fine speckled immunofluorescence pattern on HEp-2 cells for the diagnosis of systemic autoimmune diseases. Clin Dev Immunol. , (2012).
- Miyara, M., et al. Clinical phenotypes of patients with anti-DFS70/LEDGF antibodies in a routine ANA referral cohort. Clin Dev Immunol. , (2013).
- Mariz, H., et al. Pattern on the antinuclear antibody-HEp-2 test is a critical parameter for discriminating antinuclear antibody positive healthy individuals and patients with autoimmune rheumatic diseases. Arthritis Rheum. 63 (1), 191-200 (2011).
- Muro, Y., et al. High concomitance of disease marker autoantibodies in anti-DFS70/LEDGF autoantibody-positive patients with autoimmune rheumatic disease. Lupus. 17 (3), 171-176 (2008).
- Agmon-Levin, N., et al. International recommendations for the assessment of autoantibodies to cellular antigens referred to as anti-nuclear antibodies. Ann Rheum Dis. 73 (1), 17-23 (2014).
- Craft, J., et al. The U2 small nuclear ribonucleoprotein particle as an autoantigen. J Clin Invest. 81 (6), 1716-1724 (1998).
- Salomonsson, S., et al. A serologic marker for fetal risk of congenital heart block. Arthritis Rheum. 46 (5), 1233-1241 (2002).
- Miyawaki, S., et al. Clinical and serological heterogeneity in patients with anticentromere antibodies. J Rheumatology. 32 (8), 1488-1494 (2005).
- Raijamkers, R., et al. PM-Scl-75 is the main autoantigen in patients with the polymyositis/scleroderma overlap syndrome. Arthritis Rheum. 50 (2), 565-569 (2004).
- Yang, J. M., et al. Human scleroderma sera contain autoantibodies to protein components specific to the UC small nucleolar RNP complex. Arthritis Rheum. 48 (1), 210-217 (2003).
- Granito, A., et al. Antinuclear antibodies as ancillary markers in primary biliary cirrhosis. Expert Rev Mol Diagn. 12 (1), 65-74 (2012).
