Summary
מבחני immunofluorescent העקיף (IIF) באופן מסורתי המשמשים לזיהוי של נוגדני antinuclear (ANA) בסרום אדם. הנוכחות של נוגדנים אלה יכול לסייע באבחון של מחלות מערכתיות אוטואימוניות שגרוניות (סארטי). פרוטוקול זה מדגים כיצד לבצע ביעילות את טכניקת IIF לזהות במדויק נוגדנים עצמיים אלה.
Abstract
המכללה להצהרת עמדת ראומטולוגיה על בדיקות ANA האמריקנית קובעת את השימוש בIIF כשיטת תקן זהב עבור ANA הקרנת 1. למרות IIF הוא מבחן מיון מצוין בידיים של מומחה, הקשיים הטכניים של עיבוד וקריאת IIF מחליק - כגון עיבוד העבודה אינטנסיבי שקופיות, קריאה ידנית, את הצורך במנוסה, אנשי טכנולוגיה מיומנים ושימוש בחדר חשוך - להפוך את שיטת IIF קשה להתאים את זרימת העבודה של מעבדות מודרניות ואוטומטיות.
הצעד הראשון ומכריע לקראת הקרנת ANA באיכות גבוהה הוא עיבוד שקופיות זהיר. הליך זה הוא עבודה אינטנסיבית, ודורש הבנה מלאה של התהליך, כמו גם תשומת לב לפרטים וניסיון.
קריאת שקופיות מתבצעת על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי בחדרים חשוכים, והוא נעשה על ידי אנשי טכנולוגיה מיומנים שמכירים את הדפוסים השונים, בהקשר של מחזור התאוהמורפולוגיה של שלבי ביניים וחלוקת תאים. ובלבד שIIF הוא כלי מיון הקו הראשונים לסארטי, הבנת הצעדים לביצוע בטכניקה זו בצורה נכונה הוא קריטי.
לאחרונה, מערכות הדמיה דיגיטליות פותחו לקריאה האוטומטית של שקופיות IIF. מערכות אלו, כמו NOVA צפה האוטומטי פלורסנט מיקרוסקופ, נועדו לייעל את זרימת העבודה IIF השגרתית. NOVA צפה רוכש וחנויות תמונות דיגיטליות ברזולוציה גבוהה של הבארות, ובכך מפריד את רכישת תמונה מפרשנות; הם צפו תמונות מתפרשים על צגי מחשב ברזולוציה גבוהה. זה מאחסן את תמונות לשימוש עתידי ותומך בפרשנותו של המפעיל על ידי מתן נתונים עוצמת אור ניאון על התמונות. כמו כן מקדם מסווג תוצאות כחיוביות או שלילי, ומספק זיהוי תבניות עבור דגימות חיוביות. לסיכום, זה מבטל את הצורך בחדר חושך, ולאוטומטי ומייעל את readi IIFng / פרשנות זרימת עבודה. והכי חשוב, הוא מגביר את עקביות בין קוראים וקריאה. יתר על כן, עם השימוש בשקופיות המינימרקטים, שגיאות תעתיק בוטלו על ידי מתן עקיבות מדגם וזיהוי מטופל חיובי. התוצאה היא שלמות מוגברת מטופל נתונים ובטיחות.
המטרה הכללית של הסרטון הזה היא מדגים את הליך IIF, לרבות עיבוד שקופיות, זיהוי של דפוסי IIF משותפים, וכניסתה של התקדמות החדשה כדי לפשט ולהתאים את הטכניקה הזאת.
Introduction
נוגדן antinuclear הטווח (ANA) מתאר מגוון רחב של נוגדנים עצמיים המגיבים עם מרכיבים של גרעין תא כולל DNA, חלבונים וribonucleoproteins 1, 2. תא הפ-2, מערך חלבוני יליד עם מאות אנטיגנים, מספק מצע אידיאלי לצורך זיהוי של 1 ANA. זיהוי של ANA בסרום אנושי הוא כלי חשוב להקרנת מחלות רקמת חיבור, וIIF הוא שיטת ההתייחסות לANA בדיקת 1. לאחרונה, IIF על הפ-2 תאים הוחלף בכמה מעבדות בimmunoassays אנטיגן ספציפי ושיטות זמנית. בשל חשש מתוצאות שליליות כוזבות וחוסר השקיפות לרופאים, הקולג' האמריקאי לראומטולוגיה הקים כוח המשימה שהגיע למסקנה כי IIF באמצעות הפ-2 תאים צריך להיות "תקן זהב" לANA הקרנת 1.
בשל האופי הסובייקטיבי של הקרנת ANA, איכות הפ-2 תאים היא בtegral לדיווח מדויק ובטוח בתוצאות. הנוכחות של מספר גבוה של תאי mitotic, מורפולוגיה אופטימלית תא, confluency מספיק, וביטוי של אנטיגנים רלוונטיים הם חשובים במיוחד. זיהוי תבניות IIF משמש ככלי חשוב כדי לסייע באבחון חולה. הבנת המשמעות של דפוסים שונים מאפשרת לרופאים ואנשי מעבדה לביצוע בדיקות המעקב המתאימות כדי לאשר את האבחנה. לדוגמא, דפוס ANA הומוגנית יכול להתרחש בנוכחות אנטי dsDNA או נוגדני הכרומטין, ועשוי להיות קשור עם זאבת אדמנתית מערכתית (לופוס) 3. מהצד השני, יש לו לאחרונה תואר כי הדפוס שנקרא צפוף הקנס המנומר (DFS), כי הוא נראה לרוב בעד 12% מהדגימות שגרתיות, יש בעיקר מזוהה עם נוגדנים נגד DFS70. נוגדנים עצמיים אלה, כאשר נמצאו בבידוד (ללא ANA ספציפי למחלה אחרת) אינם משויכים מחלות פרקים אוטואימוניות מערכתיות <sup> 4-9. בדיקות ובכך מאשרות לנוגדנים נגד DFS70 יכולות לעזור להפחית את בדיקות רפלקס מיותרות, מציעות חיסכון בעלויות ניכרות, ולהקל על חרדת מטופל.
בהתחשב בכך שIIF הוא המתודולוגיה הקרנת השורה הראשונה כדי לזהות נוגדנים עצמיים, זה הוא בעל חשיבות עליונה שהמשתמש מבין איך הבחירה של חומרים כימיים ומצעי רקמה יכולה להשפיע על תוצאות. מאז טכניקת IIF היא מטבעו סובייקטיבי, חשוב שהחומרים כימיים המשמשים לספק התוצאות באיכות הגבוהות ביותר.
מטרה זו של פרוטוקול וידאו זה היא קראתי למשתמש את הצעדים הנכונים הדרושים כדי לבצע את שיטת IIF, דפוסים הנפוצים הקשורות ANA, ולהציג את הפיתוחים חדשים אשר יכול לייעל את זרימת העבודה במעבדה ולתקנן תוצאות.
Protocol
1. לדוגמא הכנה ותשתית לבחירה
- הסירו ריאגנטים מהאריזה ולאפשר לכל פריט כדי להגיע לטמפרטורת חדר. הכן את חומרים כימיים ולדלל סרה מטופל בהתאם להוספת הכיוון. הערה: שקופיות NOVA לייט המינימרקטים וניתן לשלב בקלות לתוך מערכות אוטומטיות בשיתוף עם LIS מערכת מידע המעבדה. הליך זה מדגים עיבוד שקופיות ידני; מעבדות תפוקה גבוהות, לעומת זאת, יכולות לבחור ציוד לעיבוד שקופיות אוטומטי.
2. תוספת של בקרות ודוגמאות
- לוותר 1 טיפה של בקרה חיובית ו1 טיפה של ביקורת שלילית לבארות שקופיות המתאימות. פיפטה 20-25 μl של סרום מטופל מדולל לבארות הנותרות. לעבד שקופית אחת בכל פעם.
- מניחים את השקף (ים) במכל מכתים עם מגבת נייר לחה בתחתית. כסה את המכל ודגירת השקופיות (ות) עבור 30 דקות. הערה: תנאי הלחות יהיולמנוע את המצע מהתייבשות. ייבוש של הבארות עלול לגרום להכתמת artifactual. במהלך תקופת דגירה זה, הנוגדנים נגד הגרעין בסרום של המטופל יהיו לאגד אנטיגנים של התאים המתוקנות על גבי היטב כל אחד.
- לאחר תקופת הדגירה, לשטוף את הסרום באמצעות זרם עדין של חיץ לשטוף. על מנת להימנע מפגיעה במצע ולמנוע מעל צולב של דגימות בין בארות, זווית השקופית מעט כדי להימנע מלכוון את הזרם ישירות על הבארות. הקש את חיץ לשטוף עודף ובמקום להחליק לתוך צנצנת המכילה Coplin לשטוף חיץ למשך כ 5 דקות.
3. תוספת של פלורסנט המצומד
- אחד אחד, להסיר את השקופיות מלשטוף חיץ ולטפוח בעדינות כדי להסיר את החיץ לשטוף העודף. החל 1 טיפה של המצומד פלורסנט (שכותרתו FITC IgG אנטי אנושי) על גבי כל טוב. דגירה השקופיות במשך 30 דקות במכל humidified, ולהיות בטוח שיחליף את הצביעהכיסוי מיכל. הערה: לבדיקת ANA, השימוש בהמצומד ספציפי IgG Fc מומלץ. המצומד הוא רגיש לאור, והכיסוי יגן על השקופיות מחשיפה לאור, בנוסף לשמירה על סביבת humidified. במהלך תקופה זו דגירה, המצומד יהיה לאגד נוגדנים אנטי הגרעיניים של החולה שחייבים אנטיגנים התא. המצומד זה מחייב תוצאות בנוכחות הקרינה בבארות.
- יש לשטוף ולשטוף את השקופיות כפי שתואר לעיל.
- מניחים coverslip על מגבת נייר ולהחיל הרכבה בינונית בקו רציף לקצה התחתון של coverslip.
- הסר כל שקופית מלשטוף חיץ ולנצל את השקופית בעדינות כדי להסיר את החיץ לשטוף העודף. נוגע בקצה התחתון של השקופית לקצה coverslip.
- בעדינות להוריד את השקופיות על coverslip בצורה כזאת, כי המדיום גובר על coverslip זורם לקצה העליון של השקופית ללא היווצרות בועות אוויר. הערה: Coverslipping, כולל שימוש בכמות האופטימלית של הרכבה בינונית, הוא טכניקה שדורשת תרגול כדי מושלמות.
4. זיהוי של תוצאות חיוביות ושליליות
פרשנות ידנית
- צפה בשקופיות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי, הממוקם בחדר חשוך. לבצע סריקה של כל היטב עם מטרת 20X או 25X להעריך חלוקת תא ואחידות של הקרינה
- לעבור לאובייקטיבי 40X כדי להפוך את הפרשנות הסופית לגבי חיוביות ודפוס.
- תסתכל על הבקרות החיוביות ושליליות. חיוביות כיתה באמצעות סולם דירוג תגובתיות מ1 + עד 4 +. הערה: הבקרה השלילית עשויה שלא להופיע חשוכה לגמרי, אבל לעתים קרובות להציג הקרינה ספציפיות ברמה הנמוכה. הביקורת החיובית תציג פלואורסצנטי ירוק תפוח בהיר בגרעין (איור 1).
פרשנות אוטומטית
הערה: בadditiעל פרשנות ידנית, עומס ושקופיות סריקה על ידי NOVA צפה האוטומטי הקרינה מיקרוסקופ או מכשיר הדמיה אחר אוטומטי דיגיטלי; אין חדר חושך הוא הכרחי. לאחר יצירת פרויקט על ידי בחירת סוג השקופיות המתאימה, המכשיר רוכש וחנויות תמונות דיגיטליות ברזולוציה גבוהה של תאים בכל טוב. בנוסף, NOVA צפה מודד את עוצמת אור ניאון, ומסווג את תוצאות כחיוביות או שלילי, ומספק זיהוי תבניות עבור דגימות חיוביות. תמונות שנצפו על ידי המפעיל על צג מחשב ברזולוציה גבוהה, המאפשרות פרשנות סופית, תיקון ואישור של NOVA צפה בתוצאה. דוחות ניתן להפיק בתוצאות אישרו. מיקרוסקופ דיגיטלי יש להשתמש בשילוב עם טכנאי מעבדה מנוסה כפי שהוא נועד לסייע בפרשנות של תוצאות.
Representative Results
בעת הערכת תוצאות מכתים התא להפ-2, חמישה דפוסים גרעיניים עיקריים הם נפוץ ביותר שדווחו: הומוגנית, מנומר, centromere, nucleolar, ונקודות גרעיניות. דפוסים אלה הם התוצאה של הנוגדן מחייב למרכיבים ספציפיים של הגרעין. למרות בדיקות ANA היא ספציפיות למבנים גרעיניים, דפוסי cytoplasmic קשורים עם נוגדנים עצמיים כנגד מבני cytoplasmic יכולים גם להיות שנצפו. במקרים מסוימים, כמה נוגדנים עצמיים עשויים להיות נוכחים במדגם, והתמונה עשויה להופיע כדפוס מעורב.
יש אחרים, פחות נצפה לעתים קרובות, ולעתים קרובות דפוסים ספציפיים מחזור התא שיכול להיות מזוהה על ידי שיטת IIF; לאחרונה, דפוס שנקרא צפוף קנס מנומר עם משמעות קלינית מיוחדת שתואר בחלק סרה חיובית ANA.
תבנית אחידה
לזהות דפוס הומוגנית, לסרוק היטב ולזהות mitotic או מפרידתאים. הכרומטין המרוכז של תאי mitotic (איור 2, חץ כתום) מפגין הקרינה מוצקה, אחידה אשר לעתים קרובות בולטת יותר מאשר בתא מנוחת nuclei.In הדפוס הומוגנית, אחיד תערוכת תאי מנוחה, הקרינה מפוזרת של כל הגרעין (איור 2, חץ לבן). דפוס אופייני זה הוא לעתים קרובות התוצאה של נוגדנים נגד dsDNA 10.
תבנית מנומרת
בדפוס המנומר הגס, תאי mitotic להראות שום צביעה של אזורי כרומוזומים תמצית (איור 3, חץ כתום). תאי המנוחה תערוכת הקרינה גרעינית בכל רחבי הגרעין. שנקר הגרעיני יכול להיות מוגדר כגס או עדין. הדפוס שנקר גס הוא לעתים קרובות התוצאה של אנטי-SM ו11 אנטי RNP.
בדפוס המנומר בסדר, תאי המנוחה להראות שנקרו קנס או מפוזר לאורך כל הגרעינים, בדרך כלל בד האחידistribution (איור 4, חץ לבן). הדפוס המנומר הקנס הוא לעתים קרובות התוצאה של אנטי SSAand אנטי SSB 12.
תבנית פיין המנומרת צפופה
עכשיו זה הכיר בכך שהדפוס המנומר בסדר הצפוף (DFS) הוא נפוץ בבדיקה שגרתית, וככל 12% מהדגימות חיוביים לנוגדנים עצמיים נגד DFS70. עם זאת, נוגדנים עצמיים אלה, כאשר נמצאו בבידוד, אינם קשורים עם מחלות פרקים אוטואימוניות מערכתיות 4 -6. נוגדנים אלה הם נפוצים אצל אנשים וחולי נושאי מחלות שאינן קשורות לסארטי 6 בריאים. בדיקות מאשרות לנוגדנים נגד DFS70 יכולות לעזור להפחית את בדיקות רפלקס מיותרות, מציעות חיסכון בעלויות ניכרות, ולהקל על חרדת מטופל.
מאז דפוס DFS קשה לזהות וחיוביות ANA יכולה לגרום לחרדה לחולים ורופאים כאחד, מומלץ מאוד לבצע בדיקה מאשרות לאחר על זהות fying דפוס רמיזות של נוגדנים נגד DFS70 להבהיר את המשמעות הקלינית של ANA positivty 5,6.
בדפוס זה, תאי mitotic (איור 5, חץ כתום) מראים כתמים מנומרים חיוביים של הכרומטין metaphase, בזמן המנוחה גרעין תא (איור 5, חץ לבן) תערוכת כתמים עדינים מפוזרים באופן אחיד בכל הגרעין.
תבנית centromere
כדי לזהות את דפוס centromere, לסרוק את הבארות ולזהות mitotic או תאים מתחלקים. בתאי mitotic (איור 6, חץ כתום), הכתמים בדידים אלה הופכים קשורים באופן הדוק במה שלעתים קרובות מתואר כ" בר metaphase ". בדפוס centromere, תאים נחים (איור 6, חץ לבן) מראים כ 40-60 כתמים בדידים מופצים ברחבי הגרעינים. דפוס centromere הוא התוצאה של אנטי CENP A, B, C נוגדנים 13.
"> תבנית nucleolar צעדכמה דפוסי nucleolar קשורים לצביעה מפוזרת cytoplasmic בתאי mitotic (איור 7, חץ כתום) ואזור כרומוזומליות שלילי, ואילו דפוסי nucleolear אחרים מציגים מכתים חיובי של האזור בכרומוזומים. דפוס nucleolar קשור לצביעה אחידה או מנומרת של nucleoli (איור 7, חץ לבן), יחד עם מנומר חלש או צביעה הומוגנית של nucleoplasm. דפוסים אלו קשורים עם אנטי RNA פולימראז III, אנטי fibrillarin, anti-Th/To וanti-PM/Scl נוגדני 14,15.
תבנית הגרעינית דוט
דפוס הנקודה הגרעינית קשור לתאי mitotic metaphase שליליים (איור 8, חץ כתום) ועם כמה כתמים בדידים בגרעין תא מנוחה (איור 8, חץ לבן). דפוס אופייני זה הוא לעתים קרובות התוצאה של SP-100, PML, או נוגדנים עצמיים קולין P80. נוגדנים אלה הם כמו sociated עם שחמת מרה ראשית והפטיטיס אוטואימונית 16.
. איור 1 בקרה שלילית (משמאל): תאים להציג נמוכה ברמת הקרינה שאינה ספציפית, אבל לא מכתים גרעיני ספציפי שליטה חיובית (מימין):. תאים להציג הקרינה גרעינית ירוקה תפוח.
איור 2. דפוס הומוגנית. תאי mitotic (orangearrow) מראה הקרינה מוצקה. תאי מנוחה להראות אפילו, מכתים מפוזר (whitearrow).
"= רוחב" 500 "/>
איור 3. מנומר גס תבנית. תאי mitotic (חץ כתום) להראות מכתים שלילי. תאי מנוחה מראים כתם ברור מנומר (חץ לבן).
איור 4. דפוס פיין מנומר. תאי mitotic (חץ כתום) להראות מכתים שלילי. תאי מנוחה להראות מכתים מובחן בסדר מנומר (חץ לבן).
איור 5. דפוס צפוף קנס מנומר. תאי mitotic (חץ כתום) להראות מכתים מוצק גרגירים עדין. תאי מנוחה מראים כתם יפה מאוד, מפוזר מנומר (whitearrow).
ogether.within-page = "תמיד"> 
אחיד איור 6. דפוס centromere. תאי mitotic (orangearrow) מופע, כתמים בדידים. נח תאים (whitearrow) מראה 40-60 כתמים לגרעין תא נפרדים.
איור 7. דפוס nucleolar. תאי mitotic (orangearrow) מופיע צבירים גדולים כמו של מכתים פרטני. הקרינה נחה תא nucleishows בnucleoli (whitearrow).
איור 8. דפוס נקודות גרעיניות. תאי mitotic (orangearrow) יופיע שלילי. תאי מנוחה להראות כמה discrכתמי ete בגרעין (whitearrow). בנוסף, בדפוס נקודות nucelar יכולים לדור בכפיפה אחת עם מכתים cytoplasmic קשור עם נוגדנים עצמיים לאנטיגנים של המיטוכונדריה (חץ אדום).
Disclosures
המחברים גבריאלה Lakos, קסנדרה ראיינט, קרול בוכנר, ואנה אסלאמי הם עובדים של אבחון INOVA.
Acknowledgments
אנו מודים לקסנדרה בראיינט לביצוע ניסוי IIF וקרול בוכנר לבדיקת המומחה הטכנית שלה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NOVA Lite HEp-2 IgG (DAPI conjugate) | INOVA Diagnostics | 708102 | |
| NOVA View Instrument | INOVA Diagnostics | NV2000 | |
| QUANTA Link Workstation | INOVA Diagnostics | LINK010 | |
| QUANTA Link Workstation License | INOVA Diagnostics | LINK001 | |
| Barcode Scanner | INOVA Diagnostics | LINK019 |
References
- Meroni, P. L., Schur, P. H. ANA screening: an old test with new recommendations. Ann Rheum Dis. 69 (8), 1420-1422 (2010).
- Tan, E. M. Autoantibodies to nuclear antigens (ANA): Their immunobiology and medicine. Advances in immunology. 33, 167-240 (1982).
- Sack, U., et al. Autoantibody detection using indirect immunofluorescence on HEp-2 cells. Ann NY Acad Sci. 1173, 166-173 (2009).
- Watanabe, A., et al. Anti-DFS70 antibodies in 597 healthy hospital workers. Arthritis Rheum. 50 (3), 892-900 (2004).
- Mahler, M., et al. Importance of the dense fine speckled pattern on HEp-2 cells and anti-DFS70 antibodies for the diagnosis of systemic autoimmune diseases. Autoimmun Revi. 11 (9), 642-645 (2012).
- Mahler, M., Fritzler, M. J. The clinical significance of the dense fine speckled immunofluorescence pattern on HEp-2 cells for the diagnosis of systemic autoimmune diseases. Clin Dev Immunol. , (2012).
- Miyara, M., et al. Clinical phenotypes of patients with anti-DFS70/LEDGF antibodies in a routine ANA referral cohort. Clin Dev Immunol. , (2013).
- Mariz, H., et al. Pattern on the antinuclear antibody-HEp-2 test is a critical parameter for discriminating antinuclear antibody positive healthy individuals and patients with autoimmune rheumatic diseases. Arthritis Rheum. 63 (1), 191-200 (2011).
- Muro, Y., et al. High concomitance of disease marker autoantibodies in anti-DFS70/LEDGF autoantibody-positive patients with autoimmune rheumatic disease. Lupus. 17 (3), 171-176 (2008).
- Agmon-Levin, N., et al. International recommendations for the assessment of autoantibodies to cellular antigens referred to as anti-nuclear antibodies. Ann Rheum Dis. 73 (1), 17-23 (2014).
- Craft, J., et al. The U2 small nuclear ribonucleoprotein particle as an autoantigen. J Clin Invest. 81 (6), 1716-1724 (1998).
- Salomonsson, S., et al. A serologic marker for fetal risk of congenital heart block. Arthritis Rheum. 46 (5), 1233-1241 (2002).
- Miyawaki, S., et al. Clinical and serological heterogeneity in patients with anticentromere antibodies. J Rheumatology. 32 (8), 1488-1494 (2005).
- Raijamkers, R., et al. PM-Scl-75 is the main autoantigen in patients with the polymyositis/scleroderma overlap syndrome. Arthritis Rheum. 50 (2), 565-569 (2004).
- Yang, J. M., et al. Human scleroderma sera contain autoantibodies to protein components specific to the UC small nucleolar RNP complex. Arthritis Rheum. 48 (1), 210-217 (2003).
- Granito, A., et al. Antinuclear antibodies as ancillary markers in primary biliary cirrhosis. Expert Rev Mol Diagn. 12 (1), 65-74 (2012).
