Anti-nukleär antikropp Screening med hjälp av HEp-2-celler

Summary

Indirekt immunofluorescens (IIF)-analyser har traditionellt använts för påvisande av antinukleära antikroppar (ANA) i humanserum. Förekomsten av dessa antikroppar kan vara till hjälp vid diagnos av systemiska autoimmuna reumatiska sjukdomar (SARD). Detta protokoll visar hur effektivt att utföra IIF teknik för att exakt upptäcka dessa autoantikroppar.

Abstract

American College of Rheumatology ställningstagande på ANA testning föreskriver användning av IIF som guldmyntfoten metod för ANA screening ^1. Även IIF är en utmärkt screeningtest i expert händer, de tekniska svårigheterna med bearbetning och läsa IIF slides - såsom arbetskrävande glid bearbetning, manuell avläsning, behovet av erfarna, utbildade tekniker och användning av mörka rummet - gör IIF-metoden svårt att passa in i arbetsflödet av moderna, automatiserade laboratorier.

Den första och avgörande steg mot högkvalitativa ANA screening är noggrann glidbehandling. Detta förfarande är arbetsintensiv, och kräver fullständig förståelse för processen, såväl som uppmärksamhet på detaljer och erfarenhet.

Skjut läsning utförs av fluorescensmikroskopi i mörka rum, och görs av utbildad tekniker som känner till de olika mönster, i samband med cellcykelnoch morfologi interfas och delande celler. Förutsatt att IIF är den första raden screeningmetod för SARD, förstå stegen för att korrekt utföra denna teknik är avgörande.

Nyligen har digitala bildsystem utvecklats för automatisk avläsning av IIF diabilder. Dessa system, som NOVA Visa Automated Fluorescerande mikroskop, är utformade för att effektivisera rutin IIF arbetsflöde. NOVA Visa förvärvar och lagrar högupplösta digitala bilder av brunnarna och därmed separera bild förvärv från tolkning; Bilderna visade en tolkas på högupplösta datorskärmar. Den lagrar bilder för framtida referens och stödjer operatörens tolkning genom att ge fluorescerande ljusintensitet uppgifter om bilderna. Det också preliminärt kategoriserar resultat som positivt eller negativt, och ger mönsterigenkänning för positiva prov. Sammanfattningsvis eliminerar behovet av mörkrummet, och automatiserar och effektiviserar IIF reading / tolkning arbetsflöde. Viktigast av allt, det ökar överensstämmelsen mellan läsare och avläsningar. Dessutom, med hjälp av streckkodade bilder, är felskrivningar elimineras genom att prov spårbarhet och positiva patientidentifiering. Detta resulterar i ökad patientintegritet och säkerhetsuppgifter.

Det övergripande målet med den här videon är att visa på IIF förfarande, där även bild bearbetning, identifiera gemensamma IIF mönster, och införandet av nya framsteg för att förenkla och harmonisera denna teknik.

Introduction

Termen antinukleär antikropp (ANA) och beskriver en mångfald autoantikroppar som reagerar med beståndsdelar i cellkärnan, inklusive DNA, proteiner och ribonukleoproteiner ^{1, 2.} HEp-2-cell, ett nativt protein array med hundratals antigener ger ett idealiskt substrat för detektion av ANA ^1. Upptäckten av ANA i humant serum är en viktig screeningmetod för bindvävssjukdomar, och IIF är referensmetod för ANA testning ^1. Nyligen, IIF på HEp-2 celler har ersatts i vissa laboratorier med antigenspecifika immun och multiplex metoder. På grund av oro för falskt negativa resultat och bristen på öppenhet för kliniker, American College of Rheumatology bildat en arbetsgrupp som fram till att IIF använder HEp-2-celler bör vara den "gyllene standarden" för ANA screening ^1.

På grund av den subjektiva naturen av ANA screening, är kvaliteten på HEp-2-celler itegral till korrekt och säker rapportering av resultat. Förekomsten av ett stort antal mitotiska celler optimal cellmorfologi, tillräcklig konfluens, och uttryck av relevanta antigener som är särskilt viktiga. IIF mönsterigenkänning är ett viktigt verktyg för att bistå i patientens diagnos. Att förstå betydelsen av olika mönster gör det möjligt för läkare och laboratoriepersonal att utföra lämplig uppföljning tester för att bekräfta diagnosen. Till exempel kan homogent ANA mönster inträffa i närvaro av anti-dsDNA eller kromatin-antikroppar, och kan vara associerade med systemisk lupus erythematosus (SLE) ^3. Från andra sidan har det nyligen beskrivits att den så kallade täta finfläckig mönster (DFS) som ofta ses i upp till 12% av rutinprover, främst har förknippats med anti DFS70 antikroppar. Dessa autoantikroppar, då fann för sig (utan andra sjukdomsspecifika ANA) är inte förknippade med systemiska autoimmuna reumatiska sjukdomar <sup> 4-9. Därmed bekräftande tester för anti-DFS70 antikroppar kan bidra till att minska onödig reflex test, ger avsevärda kostnadsbesparingar, och lindra patientens ångest.

Med tanke på att IIF är den första raden screeningmetod för att detektera autoantikroppar, är det av största vikt att användaren förstår hur valet av reagens och vävnads substrat kan påverka resultaten. Eftersom IIF teknik är inneboende subjektivt, är det viktigt att de reagens som används ger de högsta kvalitet.

Målet med denna video protokoll är att bekanta användaren med rätt steg som behövs för att utföra IIF-metoden, de gemensamma mönster i samband med ANA, och att införa nya framsteg som kan effektivisera laboratoriearbetsflödet och standardisera resultat.

Protocol

1. Provberedning och substrat Selection

1. Ta bort reagenser från förpackningar och låta varje objekt för att komma till rumstemperatur. Förbered reagenser och späda patientsera enligt riktningen insatsen. OBS: NOVA Lite diabilder är barcoded och kan enkelt integreras i automatiserade system i samband med laboratorieinformationssystem LIS. Denna procedur illustrerar manuell slide behandling; hög kapacitet laboratorier kan dock välja automatisk bildprocessutrustning.

2. Tillägg av kontroller och prover

1. Dispensera 1 droppe av den positiva kontrollen och 1 droppe negativ kontroll till lämpliga glid brunnar. Pipettera 20-25 pl utspätt patientserum till de återstående brunnarna. Bearbeta en bild i taget.
2. Placera objektglaset (s) i en färgning behållare med en fuktig pappershandduk på botten. Täck behållaren och inkubera objektglaset (n) i 30 min. Anm: De fuktiga förhållanden kommerförhindra att substratet torkar ut. Torkning av brunnarna kan resultera i artefaktuella färgning. Under denna inkubationsperiod, kommer anti-nukleära antikroppar i patientens serum binder till antigener av de celler som är bundna till varje brunn.
3. Efter inkubationsperioden, skölj av serumet med användning av en svag ström av tvättbuffert. För att undvika skador på underlaget och förhindra cross-over av prover mellan brunnar, vinkel bilden en aning för att undvika att rikta strömmen direkt på brunnarna. Knacka bort tvättbuffert och placera objektglas i ett Coplin-kärl innehållande tvättbuffert under ca 5 min.

3. Tillsats av fluorescerande konjugat

1. En efter en, ta bort bilderna från tvättbufferten och knacka försiktigt för att avlägsna överskottet tvättbufferten. Applicera en droppe av fluorescerande konjugat (FITC-märkt anti-humant IgG) till varje brunn. Inkubera objektglasen i 30 minuter i fuktig behållare, och se till att byta ut färgningbehållarens lock. Obs! ANA testning, är användningen av en IgG-Fc specifikt konjugat rekommenderas. Konjugatet är ljuskänslig, och locket skyddar bilderna från ljus förutom att bibehålla den fuktig miljö. Under denna inkubationsperiod, kommer konjugatet att binda till patientens anti-nukleära antikroppar, som har bundit till antigenerna cell. Detta konjugat bindande resultat i närvaro av fluorescens i brunnarna.
2. Skölj och tvätta sliden som beskrivits ovan.
3. Placera på ett täckglas på en pappershandduk och tillämpa monteringsmedium i en kontinuerlig linje till den nedre kanten av täckglas.
4. Ta bort varje bild från tvättbufferten och peka på skjut försiktigt för att ta bort överskottet tvättbufferten. Tryck på den nedre kanten av bilden till kanten av täckglaset.
5. Sänk försiktigt ned objektglaset på täckglaset så att monteringsmedium på täckflöden till den övre kanten av bilden utan luftbubbelbildning. Notera: Coverslipping, bland annat med hjälp av optimala mängden monteringsmedium, är en teknik som kräver övning för att fullända.

4. Identifiering av positiva och negativa resultat

Manuell Tolkning

1. Visa bilder med en fluorescerande mikroskop, som ligger i ett mörkt rum. Utför scanning av hela bra med en 20X eller 25X mål att bedöma distributionen och likformighet av fluorescens cell
2. Byt till en 40X mål att göra den slutliga tolkningen om positivitet och mönster.
3. Titta på de positiva och negativa kontrollerna. Grade positivitet med hjälp av en reaktivitet betygsskala från 1 + till 4 +. Obs: Den negativa kontrollen kanske inte visas helt mörkt, men kommer ofta visa låg nivå ospecifik fluorescens. Den positiva kontrollen visar ljust äppelgrön fluorescens i kärnan (fig. 1).

Automatisk tolkning

Obs: I additiom till manuell tolkning, belastning och skanna diabilder från NOVA Visa Automatiserad fluorescens mikroskop eller annan automatiserad digital bildbehandling instrument; ingen mörkrum är nödvändig. När du har skapat ett projekt genom att välja lämpligt bildtypen, förvärvar instrumentet och lagrar högupplösta digitala bilder av celler i varje brunn. Dessutom NOVA Visa mäter fluorescerande ljusintensitet, och kategoriserar resultatet som positivt eller negativt, och ger mönsterigenkänning för positiva prov. Bilderna ses av operatören på en högupplöst datorskärm, vilket möjliggör slutgiltiga tolkningen, revidering och bekräftelse av NOVA Visa resultat. Rapporter kan genereras på bekräftade resultat. Digital mikroskopi bör användas tillsammans med en erfaren laboratorietekniker som den är avsedd som hjälp vid tolkning av resultat.

Representative Results

Vid bedömningen av cellfärgningsresultat för Hep-2, fem stora kärnvapen mönster är vanligast rapporterade: homogen, fläckig, centromer nucleolar och nukleära prickar. Dessa mönster är resultatet av autoantikroppen att binda till specifika beståndsdelar i kärnan. Även ANA testning är specifika för kärnstrukturer, kan cytoplasmiska mönster i samband med autoantikroppar mot cytoplasmiska strukturer också observeras. I vissa fall kan flera autoantikroppar vara närvarande i ett prov, och bilden kan visas som en blandad bild.

Det finns andra, mindre frekvent, och ofta cellcykelspecifika mönster som kan upptäckas av IIF-metoden; senast, har en så kallad tät finfläckig mönster med särskild klinisk betydelse har beskrivits i vissa ANA positiva sera.

Homogen Mönster

För att identifiera ett homogent mönster, skanna väl och identifiera mitotiska eller skiljeceller. Den kondense kromatin i de mitotiska cellerna (Figur 2, orange pil) uppvisar fast, jämn fluorescens, som ofta är mer uttalad än i vilande cellen nuclei.In den homogena mönstret, den vilande celler uppvisar enhetlig, diffus fluorescens av hela kärnan (Figur 2, vit pil). Denna karakteristiskt mönster är ofta resultatet av anti-dsDNA-antikroppar ^10.

Fläckigt mönster

I grova fläckigt mönster de mitotiska cellerna inte visar någon färgning av de kondenserade kromosomala regioner (figur 3, orange pil). De vilande celler uppvisar granulat fluorescens i hela kärnan. Kärnkraftsfläck kan definieras som grovt eller fint. Den Grov fläckmönster är ofta resultatet av anti-Sm och anti-RNP ^11.

I finfläckig mönster, de vilande celler visar fina eller diffus fläck hela kärnorna, vanligen i uniform distribution (Figur 4, vit pil). Den fina spräckliga mönstret är ofta resultatet av anti-SSAand anti-SSB ^12.

Tät finfläckig Mönster

Det är nu känt att den täta fina spräckliga mönster (DFS) är vanlig i rutintestning, och så mycket som 12% av proverna är positiva för anti-DFS70 autoantikroppar. Dessa autoantikroppar, när de finns i isolering, inte är förknippade med systemiska autoimmuna reumatiska sjukdomar ^{4 -6.} Dessa antikroppar är vanliga hos friska individer och patienter som bär sjukdomar som saknar samband med SARD ^6. Bekräftande tester för anti-DFS70 antikroppar kan bidra till att minska onödig reflex test, ger avsevärda kostnadsbesparingar, och lindra patientens ångest.

Eftersom DFS mönstret är svårt att identifiera och ANA positivitet kan orsaka ångest för både patienter och läkare, är det starkt rekommenderat att utföra ett bekräftande test efter identi fiera ett mönster som tyder på anti DFS70 antikroppar för att klargöra den kliniska betydelsen av ANA positivty ^5,6.

I detta mönster, mitotiska celler (Figur 5, orange pil) visar positiv fläckig färgning av metafas kromatin, medan vila cellkärnor (Figur 5, vit pil) uppvisar jämnt fördelade fina fläckar i hela kärnan.

Centromeren Mönster

För att identifiera centromer mönstret, skanna brunnarna och identifiera mitotiska eller delande celler. I mitotiska celler (Figur 6, orange pil), dessa åtskilda fläckar blir nära samband i det som ofta beskrivs som en "metafas bar". I centromeren mönstret, vilande celler (Figur 6, vit pil) visar ca 40-60 åtskiljda fläckar fördelade över kärnorna. Centromeren mönstret är resultatet av anti-CENP A, B, antikroppar C ^13.

steg "> Nukleolär Mönster

Vissa nukleolära mönster är associerad med diffus cytoplasmisk färgning i mitotiska celler (Figur 7, orange pil) och negativa kromosomala regionen, medan andra nucleolear mönster visar positiv färgning av den kromosomala regionen. Det nukleolära mönstret associerat med homogen eller fläckig färgning av nukleolerna (fig 7, vit pil), tillsammans med svag spräckligt eller homogen färgning av nukleoplasman. Dessa mönster är förknippade med anti-RNA-polymeras III, anti-fibrillarin, anti-Th/To och anti-PM/Scl antikroppar ^14,15.

Kärnbildpunktmönster

Kärnpunktmönster är förknippad med negativa metafasmitotiska celler (Figur 8, orange pil) och med några diskreta fläckar i vilande cellkärnor (Figur 8, vit pil). Denna karakteristiskt mönster är ofta ett resultat av sp-100, PML, eller P80 Colin autoantikroppar. Dessa antikroppar är som matiskt med primär biliär cirros och autoimmun hepatit ^16.

. Figur 1 Negativ kontroll (vänster): Celler visar låg nivå icke-specifik fluorescens, men ingen specifik nukleär färgning Positiv kontroll (höger):. Celler visar äppelgrön nukleär fluorescens.

Figur 2. Homogen mönster. Mitotiska celler (orangearrow) visar fast fluorescens. Vilande celler visar även, diffus färgning (whitearrow).

"Width =" 500 "/>
Figur 3. Grov fläckigt mönster. Mitotiska celler (orange pil) visar negativ färgning. Vilande celler visar en tydlig spräcklig fläck (vit pil).

Figur 4. Fina spräckliga mönster. Mitotiska celler (orange pil) visar negativ färgning. Vilande celler visar en tydlig finfläckig färgning (vit pil).

Figur 5. Tät finfläckig mönster. Mitotiska celler (orange pil) visar ett finkornigt fast färgning. Vilande celler visar en mycket fin, diffus spräcklig fläck (whitearrow).

Figur 6. Centromer mönster. Mitotiska celler (orangearrow) show uniform, åtskiljda fläckar. Vilande celler (whitearrow) visar 40-60 åtskiljda fläckar per cellkärna.

Figur 7. Nukleolär mönster. Mitotiska celler (orangearrow) visas som stora kluster av granulär färgning. Vilande cell nucleishows fluorescens i nukleolerna (whitearrow).

Figur 8. Kärnprickmönster. Mitotiska celler (orangearrow) verkar negativt. Vilande celler visar några discrEte fläckar i kärnan (whitearrow). Dessutom kan nucelar prickmönster samexistera med cytoplasmatisk färgning i samband med autoantikroppar mot mitokondriella antigener (röd pil).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NOVA Lite HEp-2 IgG (DAPI conjugate)	INOVA Diagnostics	708102
NOVA View Instrument	INOVA Diagnostics	NV2000
QUANTA Link Workstation	INOVA Diagnostics	LINK010
QUANTA Link Workstation License	INOVA Diagnostics	LINK001
Barcode Scanner	INOVA Diagnostics	LINK019