Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

السامة للخلايا فعالية العلاج الضوئي في خلايا عظمية Published: March 18, 2014 doi: 10.3791/51213
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Laboratory for Orthopedic Research, Balgrist University Hospital, Zurich, Switzerland
* These authors contributed equally

Summary

بروتوكول ذكرت هنا يسمح تقييم فعالية العلاج الضوئي (PDT) في خطوط الخلايا وتعظيم الاستفادة من إعدادات PDT قبل تطبيق العلاج في النماذج الحيوانية.

Abstract

في السنوات الأخيرة، كان هناك صعوبة في إيجاد علاجات أكثر فعالية ضد السرطان مع أقل آثار جانبية جهازية. بالتالي العلاج الضوئي هو نهج جديدة لعلاج أكثر انتقائية الورم.

العلاج الضوئي (PDT) أن يجعل من استخدام الضيائي غير سام (PS)، والتي، على تفعيل مع ضوء طول موجة محددة في وجود الأكسجين، وتولد الجذور الأكسجين التي تثير استجابة السامة للخلايا 1. على الرغم من موافقتها منذ ما يقرب من عشرين عاما من قبل ادارة الاغذية والعقاقير، وتستخدم في الوقت الحاضر PDT فقط لعلاج عدد محدود من أنواع السرطان (الجلد والمثانة) وأمراض nononcological (الصدفية، تقران سافع) 2.

والميزة الرئيسية لاستخدام PDT هو القدرة على إجراء المعالجة المحلية، والذي يمنع الآثار الجانبية الجهازية. وعلاوة على ذلك، فإنه يسمح علاج الأورام في مواقع حساسة (مثلا حول الأعصاب أو الأوعية الدموية). هنا، وهو intraoperatويعتبر تطبيق إيف من PDT في عظمية (OS)، ورم العظام، لاستهداف أقمار الورم الرئيسي خلفها الورم في الأنسجة المحيطة بعد استئصال الورم الجراحية. يهدف العلاج إلى تقليل عدد تكرار وإلى الحد من المخاطر ل(بعد عملية) ورم خبيث.

في هذه الدراسة، فإننا نقدم في المختبر إجراءات PDT لإنشاء إعدادات PDT الأمثل لعلاج فعال من خطوط الخلايا المستخدمة على نطاق واسع OS التي تستخدم لإنتاج الأمراض التي تصيب البشر في نماذج الماوس OS intratibial راسخة. تم فحص امتصاص للPS mTHPC مع وأثار طيفي والضيائية مع ضوء الليزر الإثارة من mTHPC في 652 نانومتر للحث على موت الخلايا المقررة مع WST-1 فحص وفرز الخلايا على قيد الحياة. تقنيات إنشاء تمكننا من تحديد إعدادات PDT الأمثل للدراسات المستقبلية في النماذج الحيوانية. فهي أداة سهلة وسريعة لتقييم فعالية PDT في الجسم الحي.

Introduction

الدولة اليوم من العلاج فن عظمية (OS)، ورم العظام الأولية، ويشمل مجموعة من المحافظين الجدد العلاج الكيميائي المواد المساعدة والجراحة. وكشف هذا نظام المعالجة زيادة في معدل بقاء المرضى الذين يعانون من مرض المترجمة من حوالي 20٪ قبل استخدام العلاج الكيميائي، لحاليا بين 60-70٪ 3، 4. ومع ذلك، في العقدين الأخيرين، فقد استقر على البقاء الإجمالي من المرضى يعانون من مرض OS المحلية 4، 5. علاوة على ذلك، 30-40٪ من هؤلاء المرضى الانتكاس في غضون 3 سنوات بعد التشخيص والاستمرار المرضى الذين يعانون من المرض المنتشر أن يكون لها بقاء الفقراء من 20-30٪ 4، 6، 7. لتحسين نتائج هؤلاء المرضى، والحاجة إلى تطوير استراتيجيات علاجية جديدة.

العلاج الضوئي (PDT)، والعلاج المضادة للسرطان الرواية بدلا من ذلك، يستخدم ضوء طول موجة محددة لالإثارة من photosensitizer (PS)، التي تتراكم في الخلايا السرطانية بعد الحقن لها في مجرى الدم. ضوء الليزر الإثارة من PS يولد الجذور الأكسجين في وجود الأكسجين، مما يحفز رد فعل السامة للخلايا في الخلايا السرطانية وموت الخلايا. إلى جانب هذه الآلية الأولية، أثار إضافيتين PDT تسهم العمليات البيولوجية لانخفاض نمو الورم: PDT يسبب تضيق الأوعية وتكوين خثرة من الأوعية الدموية الدقيقة الورم، ونقص الأكسجة بالتالي المحلية ونقص الأكسجين داخل الورم، مما يؤدي إلى احتشاء الورم. أخيرا، أصيب PDT ويموتون الخلايا السرطانية يؤدي الى استجابة مناعية المحلية، وهي ميزة فريدة من نوعها بدلا من PDT. هذا ينطوي على نظام مكمل وتفعيل مستضد تقديم الخلايا الجذعية 8. وبالتالي، يتم تهيئة الظروف لعرض مستضدات الأورام مع تفعيل لاحقة من الخلايا اللمفاوية، مما يؤدي إلى الحصانة محددة الورم.

حتى الآن، وقد استخدم لعلاج PDT عدة أنواع من أورام الأنسجة الرخوة وhyperplفي آسيا، مثل تقران سافع والمريء باريت، وأورام داخل القصبة، وسرطان المثانة، وسرطان الخلايا القاعدية، والمعالجة الملطفة لسرطان الرأس والرقبة 2. ومن المعروف أن العلاج للحث المحلية، على نطاق واسع نخر مع الآثار الجانبية قليلا فقط، وبالتالي لديه القدرة على القضاء بشكل انتقائي الأنسجة السرطانية. على الرغم من هذه المزايا، وتطبيق PDT لا تزال من الناحية الفنية أكثر تطلبا من إدارة المخدرات العلاج الكيميائي. من أجل تحقيق فعالية قصوى، وتركيز PS، وقت التعرض للضوء ومجموع نقل الطاقة الضوئية في حاجة إلى أن يكون الأمثل. ويمكن أن يتم ذلك في في التجارب المجراة، ولكن، نظرا لوجود عدد كبير من المعلمات النسبية التي تحتاج إلى أن يكون الأمثل، وهو أكثر فعالية لتحديد الظروف المثلى في البداية في المختبر.

في التجارب المذكورة أدناه، ونحن اختبار فعالية في المختبر من PDT باستخدام PS-5،10،15،20 tetrakis (الفوقية hydroxyphenyl) شيليأورين، يختصر mTHPC (الشكل 1A). mTHPC هو المادة الفعالة في المنتج الطبية Foscan، والذي يستخدم حاليا في العيادة لتلقي العلاج الملطفة لسرطان الرأس والرقبة. وهي واحدة من أقوى PS، الأمر الذي أدى تلف الخلايا الضخمة بالفعل في تركيزات منخفضة، وقد تبين أن تكون متفوقة على غيرها PS من حيث اختراق الأنسجة 9، 10. في امتصاص الضوء الطيف (الشكل 1B) يبين اثنين من قمم بارزة، واحد في 417 نانومتر، والثانية في 652 نانومتر، والتي تستخدم لتوطين الأنسجة تراكم PS وPDT الحث على التوالي.

حاليا، صياغة الليبوسومال لmTHPC هي قيد التطوير. هنا، نحن تصف إجراءات لقياس الإقبال على هذه الصيغة الليبوسومال، وأداء PDT في اثنين من خطوط الخلايا OS الإنسان، وملتحقا النقيلي منخفضة والخلايا 143B النقيلي عالية. وقد تم الإبلاغ عن بعض البيانات المقدمة هنا في وقت سابق 11. النهج ه الموصوفة هنا تمكننا من دراسة تأثير النمط الظاهري المنتشر على PDT فعالية. 143B الخلايا، وحقن orthotopically في الأطراف الخلفية من المناعة الفئران SCID ناقصة يسبب الأورام الأولية المتفاقمة intratibial، نموذج محاكاة عن كثب مرض نقيلي الإنسان. وبالتالي، فإن التجارب في المختبر المقترحة هي مناسبة تماما لتقييم إعدادات PDT الأمثل لاستخدامها في وقت لاحق في التجارب المجراة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. مقارنة بين امتصاص من mTHPC في أدنى المعنية ودرجة عالية من النقيلي وملتحقا 143B OS خطوط الخليوي

  1. إعداد خلية ثقافة المتوسط ​​تحتوي على DMEM، هام F12، والحرارة المعطل مصل العجل الجنين في نسبة 4.5:4.5:1.
    ملاحظة: تم حل صياغة الليبوسومال من PS mTHPC في الماء عند تركيز النهائي من 1.5 ملغ / مل mTHPC.
  2. لوحة 0.2 × 10 6 خلايا وملتحقا 143B / جيد في 6 لوحات جيدة (يثلث لكل حالة)، والسماح للخلايا الالتزام بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: عدد لابد من تعديلها لخطوط الخلايا الفردية. A confluency من 80-90٪ هو أنسب وقت التجربة.
  3. في اليوم التالي، واحتضان الخلايا مع تركيز ثابت من mTHPC لفترات زمنية مختلفة (الوقت امتصاص التابعة)، أو مع زيادة تركيزات mTHPC خلال فترة زمنية محددة (جرعة امتصاص التابعة).
  4. احتضان الخلايا مع mTHPC لفترة محددة عoints أو تركيزات mTHPC.
    ملاحظة: في هذه الدراسة، وحضنت كل من ملتحقا وخطوط الخلايا 143B مع 0.6 ميكروغرام / مل mTHPC ل0، 2.5، 5، أو 10 ساعة، أو مع 0، 0.6، 2.5، و 10 ميكروغرام / مل mTHPC لمدة 5 ساعة. قد تختلف الفترات الزمنية المطبقة وجرعات اعتمادا على خط الخلية التي يتم استخدامها.
  5. تذكر أن يعمل دائما في الظلام أو في ظروف الإضاءة خافتة لمنع التعرض للضوء المباشر للخلايا.
  6. بعد حضانة الخلايا في الظروف المشار إليها، نضح المتوسطة وغسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. المقبل، فصل الخلايا مع 0.5 مل التربسين / EDTA وعدد الخلايا.
  7. بعد انفصال، الطرد المركزي الخلايا في 400 x ج لمدة 5 دقائق، نضح المتوسطة وresuspend الخلايا في برنامج تلفزيوني لكثافة النهائي من 200،000 خلية / مل.
  8. ماصة 100 ميكرولتر من تعليق الخلية التي تم الحصول عليها (أي 20،000 الخلايا) في لوحة 96 جيدا وقياس مضان من هذه الخلايا في معمل مضان. الإعدادق لقياسات مضان mTHPC هي: 417 نانومتر للإثارة و 652 نانومتر للالانبعاثات.
  9. من أجل حساب كمية mTHPC المنضوية لكل خلية، وتطبيع وحدة مضان النسبي (RFU) لعدد الخلايا وحجم الخلايا كما يلي:
  10. إعداد منحنى قياسي باستخدام تركيزات مختلفة من mTHPC في برنامج تلفزيوني 0-4 ميكروغرام / مل (القياسات استخدام ثلاث نسخ). ماصة 100 ميكرولتر من كل تخفيف في لوحة 96 جيدا وقياس مضان من الآبار باستخدام الإعدادات الموضحة في الخطوة 1.6.
  11. تقسيم RFU (التي تم الحصول عليها للخلايا 20،000) من قبل المنحدر من منحنى القياسية الخطية من mTHPC، والتي تعطي تركيز mTHPC (في ميكروغرام / مل) في البئر.
  12. تقسيم هذا التركيز mTHPC بنسبة 10 إلى الحصول على المبلغ الإجمالي للmTHPC في بئر واحدة (في ميكروغرام، وهو ما يمثل 100 ميكرولتر من تعليق خلية) وتقسم هذه القيمة عن طريق حجم 20،000 الخلايا.
  13. حساب حجم مع صيغة لمجال: (4/3 س π) ×ص 3. الحصول على نصف قطرها ص عن طريق قياس قطرها 20 trypsinized الخلايا تحت المجهر، وتقسيم هذه القيمة بنسبة 2.
  14. أخيرا، وتطبيع كل القيم لتلك التي حصلت للخلايا ملتحقا بعد 10 ساعة من الحضانة (جرعة امتصاص التابعة) أو تعامل مع 10 ميكروغرام / مل mTHPC (الوقت امتصاص التابعة)، والتي تم تعيينها إلى 100٪.

2. قياس الضيائية من PS في المختبر

  1. البذور 3،000 خلية / جيدا في لوحة 96 جيدا (يثلث لكل تركيز mTHPC المستخدمة) والسماح لهم الانضمام بين عشية وضحاها. وبالمثل إعداد إضافية وحة 96 جيدا وعلاج الخلايا كما هو موضح أدناه، ولكن ثم وضعها جانبا للتصوير النقيض المرحلة.
    ملاحظة: عدد لابد من تعديلها لكل خط الخلية الفردية. A confluency من 50-60٪ في وقت التجربة هو المثل الاعلى.
    1. نضع في اعتبارنا أن تضيف المقابلة سيطرة الظلام سمية للخلايا لكل من تركيزات mTHPC. الحد ذاتها هي الخلايا التي سيتم المحتضنة في غياب أو وجود تركيزات مختارة من mTHPC، ولكن لن تكون مضيئة.
  2. في اليوم التالي، واحتضان الخلايا مع تركيزات مختلفة من mTHPC (0، 0.0001، 0.001، 0.01، 0.03، 0.075، 0.15، 0.3، 0.6، 1.25، 2.5، 5، و 10 ميكروغرام / مل) اعتمادا على خطوط الخلايا و الاحتفاظ بها في الظلام لمدة ساعة 5.
    1. الرجوع إلى القسم 1.3.2
      ملاحظة: قبل فترة حضانة تعتمد الإضاءة على خط الخلية وعلى PS المستخدمة، وبالتالي فإنه من المستحسن لاختبار تركيزات مختلفة ونقاط زمنية مختلفة في تجارب منفصلة.
  3. بعد الحضانة للفترة الزمنية المشار إليها، وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني وإضافة جديدة متوسطة جديدة دون mTHPC.
  4. إلقاء الضوء على الخلايا مع ليزر ديود 652 نانومتر، محددة لامتصاص الطيف mTHPC (انظر الشكل 1).
    1. ضبط الليزر ل21.88 ميغاواط / سم 2 قوة على ارتفاع 13.5 سم distaالامتحانات التنافسية الوطنية من الخلايا، من أجل الحصول على جرعة من الطاقة من 5 J / سم 2. إلقاء الضوء على الخلايا ل230 ثانية. لا تضيء الخلايا السيطرة سمية الظلام (مع وبدون mTHPC).
      ملاحظة: دائما ارتداء النظارات لحماية العينين من ضوء الليزر المستخدمة في الإثارة من PS.
  5. بعد الإضاءة، والحفاظ على الخلايا في الظلام في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. في وقت لاحق، إضافة الماء نتروبلو القابلة للذوبان (WST-1) كاشف (10 μl/100 ميكرولتر من متوسطة).
  6. بعد ثلاث ساعات من إضافة كاشف WST-1، وقياس الامتصاصية من الآبار الفردية من لوحة 96 جيدا في 415 نانومتر.
  7. من أجل حساب نسبة الخلايا على قيد الحياة، تعيين متوسط ​​القيم التي تم الحصول عليها للخلايا غير المعالجة mTHPC لكل حالة إلى 100٪ (أي مضيئة، دون mTHPC وnonilluminated، دون mTHPC).

3. تقدير عدد الخلايا التي كتبها العد الخليوي

  1. البذور 20،000 خلية / نحنليرة لبنانية في 24 لوحة جيدا والسماح لهم الانضمام بين عشية وضحاها.
  2. احتضان الخلايا لمدة 5 ساعة مع mTHPC (0.001، 0.003، 0.15، 0.6، و 1.25 ميكروغرام / مل)، وتضيء لهم كما هو موضح أعلاه.
  3. جمع المتوسطة، وغسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، يعرض للتريبسين لهم وجمعها بواسطة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق.
  4. بعد الطرد المركزي، ونضح المتوسطة و resuspend الخلايا في 200 ميكرولتر من متوسطة جديدة.
  5. عد الخلايا في غرفة نويباور.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

مع تقنيات ذكرت هنا، ونحن التحقيق PDT مقرها mTHPC في خلايا OS الإنسان. أولا، تم التحقيق في الوقت وامتصاص الجرعة تعتمد على mTHPC في ملتحقا النقيلي منخفضة والمنتشر في غاية خطوط الخلايا 143B OS. يمكن تقييم mTHPC امتصاص عن طريق قياس مضان من mTHPC مع معمل مضان (الشكل 2، مستنسخة بإذن من ريدي وآخرون 11). ويوضح الشكل 2A امتصاص mTHPC بطريقة تعتمد الوقت. كثافة مضان لتعليق الخلية يمثل مستويات الخلايا من mTHPC. يوضح الشكل 2B الجرعة تعتمد امتصاص mTHPC في الخلايا ملتحقا و143B بعد 5 ساعة الحضانة. تميل امتصاص في خط الخلية النقيلي عالية 143B أن تكون أعلى مما كانت عليه في منخفض النقيلي الوالدين خط الخلية ملتحقا.

تم تقييم الظلام والضيائية من mTHPC في 143B الخلايا عن طريق تحديد الخلية metaboliج النشاط (مع WST-1 مقايسة) وعن طريق حساب عدد الخلايا المتبقية بعد 5 ساعة من الحضانة مع mTHPC، الحضانة اللاحقة في الظلام أو المعاملة مع ضوء الليزر عن 230 ثانية ومزيد من الحضانة لمدة 24 ساعة في الظلام.

ويرد جرعة سمية الظلام تعتمد في الشكل 3 (مستنسخة بإذن من ريدي وآخرون 11). في الشكل 3A، تم علاج الخلايا 143B مع جرعات mTHPC مختلفة ومقارنة مع الخلايا غير المعالجة. ولوحظ وجود انخفاض تعتمد على الجرعة من عدد الخلايا والأيض النشاط. واعترف بقاء الخلية انخفضت في تركيز mTHPC متساوية وأعلى من 2.5 ميكروغرام / مل. ويتضح من جرعة الضيائية تعتمد mTHPC في الشكل 3B. تم علاج الخلايا مع جرعات مختلفة mTHPC ومع إضاءة لاحقة (5 J / سم 2). انخفاض تبعية في النشاط الأيضي الخلية (قياس مع مقايسة WST)، وكذلك انخفاض في نو الخليةولوحظ mber. هو تصور الانخفاض الناتج في عدد الخلايا بعد تطبيق PDT في الشكل 4.

الشكل 1
الشكل 1. التركيب الكيميائي للmTHPC (A) والطيف امتصاص الضوء (B). وقدمت الأرقام من قبل biolitec البحوث GmbH المزيد. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. الوقت وامتصاص الجرعة تعتمد على mTHPC من خطوط الخلايا البشرية OS ملتحقا و143B. (A). ملتحقا (في اليونان ذ) و143B (باللون الأسود) والمصنف في 6 لوحات جيدة (0.2 × 20 6 خلايا / جيد). بعد زراعة بين عشية وضحاها، وحضنت الخلايا مع 0.6 ميكروغرام / مل mTHPC ل0، 2.5، 5، 7.5، و 10 ساعة (A)، أو لمدة 5 ساعة مع 0، 0.6، 2.5، و 10 ميكروغرام / مل mTHPC (B) . وتم تحديد كثافة مضان من خلال قياس مضان من 20،000 الخلايا في 652 نانومتر على الإثارة في 417 نانومتر. كانت القيم تطبيع حجم الخلية المحسوب وامتصاص mTHPC الخلايا ملتحقا في 10 ساعة (A) أو بعد الحضانة مع 10 ميكروغرام / مل (B) تم تعيين إلى 100٪. القيم هي يعني ± SEM من ثلاث تجارب مستقلة. مقتبس من ريدي وآخرون 11 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

les/ftp_upload/51213/51213fig3highres.jpg "سرك =" / files/ftp_upload/51213/51213fig3.jpg "/>
الرقم 3. الظلام والضيائية من mTHPC في 143B الخلايا. خلايا المصنف ونمت بين عشية وضحاها قبل العلاج. لتحديد الجرعة السمية mTHPC الظلام تعتمد، وحضنت الخلايا 143B لمدة 5 ساعة في الظلام في غياب أو وجود تركيزات mTHPC أشارت (A). لتحديد الجرعة السمية mTHPC الصورة تعتمد، وحضنت الخلايا 143B مع أو بدون mTHPC لمدة 5 ساعة بتركيزات أشارت ثم مضيئة مع 5 J / سم 2 مع قوة من 21.88 ميغاواط / سم 2 ل230 ثانية (B). لقياس النشاط الأيضي (●) مع مقايسة WST-1، وكانت المصنفة الخلايا 143B في لوحات 96 بشكل جيد في مناطق ذات كثافة من 3،000 خلية / جيدا. احصي أعداد الخلايا (○) من الخلايا المصنفة في 20،000 خلية / جيد في 24 لوحات جيدة. القيم هي يعني ± SEM من ثلاث تجارب مستقلة. الاب تكييفهاام ريدي وآخرون 11 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الشكل 4. كانت الصور الطوري من 143B الخلايا قبل وبعد PDT. خلايا المصنف وترك بين عشية وضحاها على الالتزام كما هو موضح في البروتوكول. لتصور الجرعة تعتمد، mTHPC بوساطة سمية خفيفة، وحضنت الخلايا 143B لمدة 5 ساعة في الظلام مع 0، 0.6، 2.5، و 10 ميكروغرام / مل mTHPC (لوحات م، على التوالي). الخلايا ثم تم مضيئة مع 5 J / سم 2 ضوء 652 نانومتر الطول الموجي لل230 ثانية، وتصويرها بعد 24 ساعة. شريط مقياس: 100 ميكرون ررتخفيف بعض انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لتحقيق السمسة الأمثل ردا على PDT، لا بد من اختيار الحق وإعدادات ضوء الليزر ومرات الحضانة. الإجراءات الموصوفة هنا هي متسقة وفعالة لتحديد امتصاص PS وقياس السمية الخلوية PDT يتسبب في المختبر. باستخدام موجات الامتصاص النوعي للPS mTHPC، يمكن تحديد امتصاص PS الخلوية بطريقة مباشرة، ويمكن تفعيل PS لتوليد أنواع الأكسجين التفاعلية السامة للخلايا.

باستخدام هذا الإعداد في المختبر، وجميع المعلمات مثل تركيز PS، فاصل الضوء المخدرات وشدة ضوء الليزر يمكن تعديلها بسهولة لخصائص PS وخطوط الخلايا المستخدمة. عدد خلايا يعطي قراءة مباشرة من الباقين على قيد الحياة الخلايا المرفقة، التي جنبا إلى جنب مع مقايسة WST-1 (مراقبة النشاط الأيضي) يعطي تقدير جيد لبقاء الخلية. ومع ذلك، يمكن طريقة عرض نموذج فقط "الضربة الأولى"، أي سمية الخليةأنواع الاكسجين التفاعلية من مباشرة بعد تفعيل PS. في الجسم الحي لاحظ تضيق الأوعية اللاحقة وتفعيل الجهاز المناعي، واللازمة لاستئصال الورم بالكامل، لا يمكن إلا أن يتم التحقيق في الحيوانات.

أظهر الرقم 2 من الوقت وامتصاص الجرعة تعتمد على mTHPC إلى مستوى أعلى في 143B المنتشر في غاية من انخفاض النقيلي خط الأبوية في الخلايا ملتحقا. ولوحظ سمية المظلم من mTHPC في الخلايا OS 143B بعد الحضانة لمدة 5 ساعة فقط بتركيزات عالية (الشكل 3). تظهر الخلايا 143B حساسية عالية لPDT، كما هو موضح من قبل mTHPC وجرعة ضوء تأثير الضوئية التابعة. ولوحظ وجود تأثير الضوئية بالفعل في تركيز mTHPC منخفضة تصل إلى 0.075 ميكروغرام / مل، ولوحظ نصف التركيز المميت القصوى من 0.022 ± 0.006 ميكروغرام / مل (الشكل 3).

على الرغم من أن PDT هو الحد الأدنى الغازية وفعالة ضد العديد من نوع الورمق، يمكن أن يحدث آثار جانبية طفيفة عند تطبيق هذه التقنية في المرضى (على سبيل المثال. تورم، احمرار). هذا يشير إلى أن PS لا يؤخذ إلا من قبل الخلايا السرطانية، كما هو موضح هنا، ولكن أيضا من قبل خلايا nontumor، مما تسبب سمية بعد PDT أيضا في هذه الخلايا. كان Triesscheijn وآخرون. قادرة على إظهار حساسية للضوء زيادة الخلايا السرطانية مقارنة مع الخلايا الليفية الإنسان. في المقابل، أظهرت الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان امتصاص أعلى من mTHPC من غيرها من خطوط الخلايا اختبار، مما أدى إلى حساسية عالية 12. ترتبط هذه النتائج أيضا مع PDT المرتبطة آثار الأوعية الدموية المضادة، والتي كثيرا ما لوحظ 2.

ويمكن أيضا أن الأساليب المذكورة أن تطبق لغيرها PS. فترة حضانة والليزر شدة الضوء يجب أن يتم تكييفها وفقا لخصائص PS. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا PDT أن يتسبب في غيرها من الخلايا OS، منذ فقط الإعدادات خط الخلية تعتمد ولكن ليس الأسلوب نفسه. ص كما إضافيةعموميات الهيئة، وآليات موت الخلايا يمكن تحليلها، على سبيل المثال. من خلال تحليل البقعة الغربية من البروتينات المشاركة في موت الخلايا المبرمج، نخر أو الالتهام الذاتي. أيضا توطين التحت خلوية من PS يمكن تصور مثل المسح الضوئي ليزر متحد البؤر بواسطة المجهر.

الخطوات المختلفة التي تم وصفها لPDT في المختبر، أي الحضانة من الخلايا التي تحتوي على PS وتحريض PDT مع ضوء الليزر، تشبه الحالة السريرية. استقبال المرضى (في الوريد أو الشوري. تطبيقها) على PS، وبعد فترة ضوء المخدرات متميزة، يضيء مجال الاهتمام (على سبيل المثال. نسيج الورم) مع ضوء الليزر 13. على الرغم من عدم تطبيقها بعد في نظام التشغيل، ومزاياه المحتملة واضحة، ويعتبر PDT أن تكون جذابة بشكل خاص لعلاج الورم أثناء العملية من الأقمار الصناعية، التي تنمو في كثير من الأحيان كما كتل الخلايا السرطانية الأولية على مقربة من حافة الرئيسي من الورم الرئيسي وربما الشروع في تكرار عندما أضاع خلال قاستئصال urgical من الورم الرئيسي. يمكن علاج أورام عظمية كبيرة حتى مع هذه التقنية. وقد تبين ذلك من خلال دراسة واعدة في الكلاب 14. بالإضافة إلى ذلك، القضاء على الخلايا السرطانية التي لا يمكن مقطوعة عن طريق الجراحة (مثل الانبثاث متعددة التي تحدث غالبا في الرئتين)، قد تمثل أيضا تطبيقها في المستقبل من الممكن PDT في المرضى الذين يعانون من المرض المنتشر OS.

من المهم أن نلاحظ أنه أثناء تنفيذ التجارب، وينبغي الحرص على أن تعمل جميع الخطوات يتم تنفيذها في إطار الحد الأدنى من التعرض للضوء بعد إضافة PS إلى الخلايا، وضوء النهار الطبيعي يحتوي أيضا على الطول الموجي اللازمة لتفعيل mTHPC. وبالمثل، في الجسم الحي في تطبيق نماذج ما قبل السريرية، واحتياجات الرعاية التي ينبغي اتخاذها لحماية الحيوانات من الضوء المباشر بعد حقن mTHPC. فإنه يحتاج أيضا إلى الإشارة إلى أن مقايسة WST-1 فقط بتقييم النشاط الأيضي للخلايا السرطانية، وهو مؤشر غير مباشر للموت الخلية. ول، وهو مزيج مع عدد خلايا الكلي، كما وردت هنا، فمن المستحسن.

في الختام، مزيج من الأساليب المذكورة (PS-امتصاص وسمية الخلايا التي يسببها PDT) يوفر إجراء فعال سريع والتكلفة اللازمين لتوصيف خصائص سمية على PS في المختبر. مع هذه النتائج في المختبر، ومجموعة من شدة الضوء الأمثل والفاصل الضوء المخدرات يمكن تقدير، مما يعطي مؤشرا جيدا لكيفية PDT يمكن تطبيقها في الجسم الحي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب تعلن أي مصالح أو تضارب المصالح المالية المتنافسة.

Acknowledgments

فإن الكتاب أود أن أشكر biolitec بحوث محدودة (جينا، ألمانيا) لتتكرم تزويدنا صياغة الليبوسومال mTHPC، مع شكر خاص لسوزانا GRAFE وأرنو Wiehe لمساعدتهم والخبرة التقنية. نحن أيضا نود أن نشكر كيرستين ريدي، الذي ولدت على جزء كبير من النتائج وكان coresponsible لنشره 11.

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من Schweizerischer VEREIN Balgrist، جامعة زيوريخ، وزيوريخ Krebsliga فضلا عن منحة من والتر L. ومؤسسة جوانا وولف، زيوريخ، سويسرا ومنحة من EuroNanoMed ERA-NET / الجبهة الوطنية الصومالية السويسرية المؤسسة الوطنية للعلوم 31NM30-131004/1. وأيد هذا العمل أيضا من قبل HSM برنامج (الطب متخصصة للغاية) لعلم الأورام العضلية الهيكلية من Kanton زيوريخ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM PAA GmbH, Freiburg, Germany E15-883
HAM F12 PAA GmbH, Freiburg, Germany E15-817
Heat-inactivated fetal calf serum GIBCO, Basel, Switzerland 10500-064
mTHPC biolitec Research GmbH, Jena, Germany As this liposomal formulation is originating from R&D
no catalogue number is available at the moment. Stock: 1.5 mg/ml; provided in a 9:1 mixture of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) and dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG; >99% purity)
Spectramax Gemini XS plate reader Molecular Devices, Sunnyvale, CA ID# 861
Microscope Zeiss Observer.Z1 Axio Observer, Axio Vision Release 4.6.3 SP1, Jena Germany
Ceralas PDT 652 nm Laser biolitec AG, Jena, Germany LD652nm2W400u
Water-soluble tetrazolium (WST) reagent Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Switzerland 1644807

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Juarranz, A., Jaen, P., Sanz-Rodriguez, F., Cuevas, J., Gonzalez, S. Photodynamic therapy of cancer. Basic principles and applications. Clin. Transl. Oncol. 10, 148-154 (2008).
  2. Agostinis, P., et al. Photodynamic therapy of cancer: an update. CA Cancer. 61, 250-281 (2011).
  3. D'Adamo, D. R. Appraising the current role of chemotherapy for the treatment of sarcoma. Semin. Oncol. 38 Suppl 3, 19-29 (2011).
  4. Allison, D. C., et al. A meta-analysis of osteosarcoma outcomes in the modern medical era. Sarcoma. , (2012).
  5. Anninga, J. K., et al. Chemotherapeutic adjuvant treatment for osteosarcoma: where do we stand. Eur. J. Cancer. 47, 2431-2445 (2011).
  6. Bacci, G., et al. Pattern of relapse in patients with osteosarcoma of the extremities treated with neoadjuvant chemotherapy. Eur. J. Cancer. 37, 32-38 (2001).
  7. Briccoli, A., et al. Resection of recurrent pulmonary metastases in patients with osteosarcoma. Cancer. 104, 1721-1725 (2005).
  8. Milla Sanabria, L., et al. Direct and indirect photodynamic therapy effects on the cellular and molecular components of the tumor microenvironment. Biochim. Biophys. Acta. 1835, 36-45 (2013).
  9. Mitra, S., Foster, T. H. Photophysical parameters, photosensitizer retention and tissue optical properties completely account for the higher photodynamic efficacy of meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin vs Photofrin. Photochem. Photobiol. 81, 849-859 (2005).
  10. Ma, L., Moan, J., Berg, K. Evaluation of a new photosensitizer, meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin, for use in photodynamic therapy: a comparison of its photobiological properties with those of two other photosensitizers. Int. J. Cancer. 57, 883-888 (1994).
  11. Reidy, K., Campanile, C., Muff, R., Born, W., Fuchs, B. mTHPC-mediated photodynamic therapy is effective in the metastatic human 143B osteosarcoma cells. Photochem. Photobiol. 88, 721-727 (2012).
  12. Triesscheijn, M., Ruevekamp, M., Aalders, M., Baas, P., Stewart, F. A. Comparative sensitivity of microvascular endothelial cells, fibroblasts and tumor cells after in vitro photodynamic therapy with meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin. Photochem. Photobiol. 80, 236-241 (2004).
  13. Triesscheijn, M., Baas, P., Schellens, J. H., Stewart, F. A. Photodynamic therapy in oncology. Oncologist. 11, 1034-1044 (2006).
  14. Burch, S., et al. Treatment of canine osseous tumors with photodynamic therapy: a pilot study. Clin. Orthop. Relat. Res. 467, 1028-1034 (2009).

Tags

الطب، العدد 85، العلاج الضوئي (PDT)، 5،10،15،20-tetrakis (الفوقية hydroxyphenyl) chlorin (mTHPC)، الضيائية، والظلام سمية، عظمية (OS)، الضيائي
السامة للخلايا فعالية العلاج الضوئي في خلايا عظمية<em&gt; في المختبر</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Meier, D., Campanile, C., Botter, S. … More

Meier, D., Campanile, C., Botter, S. M., Born, W., Fuchs, B. Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (85), e51213, doi:10.3791/51213 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter