Summary
这里所报告的协议允许光动力疗法（PDT）中的细胞系和的PDT设置施加治疗在动物模型中之前，优化的效果进行评价。
Abstract
近年来，出现了在寻找更有效的治疗对癌症具有较少的全身性副作用的困难。因此，光动力疗法是一种新的方法对多种肿瘤有选择性的治疗。
光动力疗法（PDT），使一个无毒的光敏剂（PS），其中，经活化的光在氧的存在下的特定波长的光，产生氧自由基，引发细胞毒性反应1的使用。尽管其批准几乎是二十年前由美国FDA，PDT是时下唯一用于治疗癌症类型（皮肤，膀胱）和nononcological疾病（牛皮癣，光化性角化病）2的数量有限。
利用光动力疗法的主要优点是能够执行一个局部治疗，以防止全身性副作用的能力。此外，它可以让肿瘤在细腻的部位治疗（ 如周围神经或血管）。这里，一个intraoperatPDT的IVE应用被认为是在骨肉瘤（OS），肿瘤的骨，针对原发肿瘤的卫星遗留在肿瘤外科手术切除肿瘤后，周围的组织。治疗的目标是减少复发的数量以及减少为（术后）转移的风险。
在本研究中，我们提出在体外 PDT程序以建立有效的治疗方法，用于重现人类疾病中确立intratibial OS的小鼠模型中广泛使用的操作系统的细胞系的最优PDT设置。在PS mTHPC的吸收进行了检查用分光光度计和光毒性被挑起与mTHPC的激光激发在652 nm到诱导细胞死亡评估用WST-1法和存活细胞计数。所建立的技术使我们能够确定最佳PDT设置在动物模型中未来的研究。他们是一个简单而快速的工具，用于PDT的疗效评价
Introduction
骨肉瘤（OS）的艺术处理今天的状态，原发性骨肿瘤，包括为新辅助化疗和手术的组合。这个治疗方案显示增加的患者从使用化疗前约20％的局部疾病的存活率，到目前的60-70％3,4。然而，在过去的二十年中，操作系统患者局部病变的总生存期已趋于稳定4，5。此外，这些患者中30％-40％在确诊后3年内复发和转移性疾病继续有20-30％4一个贫穷的生存，6，7。为了改善这些患者的预后，新的治疗策略需要发展。
光动力疗法（PDT），一个相当新颖的抗癌疗法，采用特定波长光的一个photosensi的激励光敏剂（PS），其中其注射到血液中后积聚在肿瘤细胞。在PS的激光激发产生的氧自由基在氧的存在下，其诱导肿瘤细胞和细胞死亡的细胞毒反应。除了这个主要机制，另外两个PDT诱发的生物学过程有助于减少肿瘤的生长：PDT引起血管收缩和血栓形成的肿瘤微血管，因而局部缺氧及缺氧的肿瘤内，导致肿瘤梗死。最后，PDT受伤和死亡的肿瘤细胞引发局部免疫反应，一个很独特的PDT的功能。这涉及补体系统和抗原的活化呈递树突状细胞8。因此，条件是肿瘤抗原与淋巴样细胞，随后激活的演示文稿中创建，导致肿瘤特异性免疫。
到目前为止，PDT已被用于治疗多种类型的软组织肿瘤和hyperpl亚洲，如光化性角化病，Barrett食管，支气管内肿瘤，膀胱癌，基底细胞癌，和姑息治疗头颈部癌2。治疗是已知的诱导局部，大规模坏死，只有很少的副作用，因此具有选择性地根除肿瘤组织的潜力。尽管有这些优势，PDT的应用程序保持技术上比化疗药物的管理更加严格。为了达到最大的效力，在PS的浓度，光照射时间和总的光能量传递需要被优化。这可以在体内实验来完成，但是，由于相对大量的需要被优化的参数的初步确定体外最佳条件下，它是更有效的。
在下面描述的实验中，我们使用PS 5,10,15,20 -四（间-羟基苯基）叶绿素测试PDT的体外功效奥林简称mTHPC（ 图1A）。 mTHPC是在医药品Foscan，这是目前在临床上对姑息治疗头部和颈部癌症的使用的活性物质。它是最有效的PS中的一个，在低浓度下已经大规模诱导的细胞损伤，并且它被证明是优于其它PS在组织穿透9,10的条款。它的光吸收光谱（ 图1B）示出了两个显着的峰，一个在417 nm和第二在652纳米，这是用于积累PS的组织定位和对PDT诱导，分别。
目前，脂质体制剂用于mTHPC正在开发中。在这里，我们描述的程序来量化这种脂质体制剂的摄取，并且在两个人的OS细胞株进行PDT;低转移性居屋和高转移性143B细胞。一些这里介绍的数据已报告前面11。钍这里描述É方法让我们来研究PDT疗效转移表型的影响。 143B细胞原位注射到免疫缺陷的SCID小鼠的后肢引起intratibial转移性原发性肿瘤，模型密切模仿人类转移性疾病。因此，建议在体外实验中是完全合适的，以评估在体内实验中用于以后的最佳PDT设置。
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Protocol
1。 mTHPC在相应的低的吸收和高转移居屋和143B的OS细胞系的比较
- 制备含有DMEM，含F12，并且在一个比4.5:4.5:1热灭活的胎牛血清的细胞培养基。
注意：在PS mTHPC的脂质体制剂溶解在水中以1.5毫克/毫升mTHPC的最终浓度。 - 板0.2×10 6个居屋和143B细胞/孔在6孔板中（一式三份对各条件），并让细胞贴壁过夜。
注意：该数量必须调节到个体的细胞系。 80-90％A汇合是在实验时最合适。 - 在接下来的一天，孵育细胞mTHPC固定浓度不同的时间段（时间依赖性摄取），或者与在一个固定的时间周期（剂量依赖性摄取）增加mTHPC的浓度。
- 孵育细胞mTHPC具体时间Points或mTHPC的浓度。
注：在本研究中，居屋和143B细胞系孵育0.6微克/毫升mTHPC为0，2.5，5，或10小时，或用0，0.6，2.5和10微克/毫升mTHPC 5小时。所施加的时间周期和剂量可能取决于所使用的细胞株不同而不同。 - 记住，总是在黑暗或暗光条件下工作，防止细胞的直接曝光。
- 将细胞在指定的条件下孵育后，吸出培养基，用PBS洗细胞3次。接着，取下电池用0.5ml胰蛋白酶/ EDTA和计数细胞。
- 脱离后，离心细胞，在400×g离心5分钟，吸出培养基，重悬细胞于PBS中，以200,000细胞/ ml的终密度。
- 移液管将100μl所获得的细胞悬浮液（ 即 20,000个细胞）在96孔板中，并测量这些细胞在荧光分光光度计的荧光。设置S表示mTHPC荧光测量：417 nm处的激发和652 nm处的发射。
- 为了计算每个细胞的内化mTHPC的量，归一化的相对荧光单位（RFU）的细胞数目和细胞的体积，如下所示：
- 从0-4微克/毫升（使用一式三份测量）使用不同浓度的mTHPC在PBS中制备的标准曲线。吸取100微升每种稀释液在96孔板中，并测量使用根据步骤1.6中描述的设置的孔的荧光。
- 通过mTHPC，这给mTHPC的浓度（以μg/ ml）的中井的线性标准曲线的斜率除以RFU（为20,000个细胞获得）。
- 除以10这mTHPC浓度得到mTHPC在一个很好的总量（以μg，相当于100微升细胞悬浮液），并通过20,000个细胞的体积除以该值。
- 计算的公式计算，一个球体的体积：（4/3×π）×3条规则。通过测量20个胰蛋白酶消化细胞的直径，在显微镜下，并除以2这个值取得的半径 r。
- 最后，规范所有的值对那些10小时培养（剂量依赖性摄取）或10微克/毫升mTHPC（随时间变化的吸收），这是设置为100％，处理后得到的HOS细胞。
2。 PS 体外的光毒性的测定
- 种子3000个细胞/孔在96孔板（一式三份对mTHPC的每个浓度使用），并让他们附着过夜。同样准备一个额外的96孔板中，如下所述处理细胞，但随后把它们放在一边的相位衬度成像。
注意：数字必须调整每个单独的细胞系。 50-60％在实验时的汇合是理想的。- 记住要添加单元格对应的暗毒性控制每个mTHPC浓度。该本身是细胞，将在选定的mTHPC浓度的存在或不存在下温育，但不会被点亮。
- 在接下来的一天，孵育细胞取决于细胞系不同mTHPC（0，0.0001，0.001，0.01，0.03，0.075，0.15，0.3，0.6，1.25，2.5，5和10微克/毫升）的浓度和让他们在黑暗中5小时。
- 参见1.3.2节
注意：孵育时间前照明依赖于细胞系和所使用的PS，因此最好是在单独的实验中，测试不同浓度和不同的时间点。
- 参见1.3.2节
- 在温育指定的时间内，用PBS洗细胞两次，并没有mTHPC添加新的新鲜培养基中。
- 照亮细胞用652纳米二极管激光器，具体为mTHPC吸收光谱（ 见图1）。
- 激光设置为21.88毫瓦/厘米2的电源在13.5厘米DISTA的高度考从细胞中，以获得5焦耳/厘米2的能量剂量。照亮细胞为230秒。不亮的暗毒性对照细胞（有，无mTHPC）。
注意：一定要戴眼镜以保护眼睛免受用于PS的激发激光。
- 激光设置为21.88毫瓦/厘米2的电源在13.5厘米DISTA的高度考从细胞中，以获得5焦耳/厘米2的能量剂量。照亮细胞为230秒。不亮的暗毒性对照细胞（有，无mTHPC）。
- 光照后，保持细胞在黑暗中，在37℃24小时。随后，添加水溶性四氮唑（WST-1）试剂（10μl/100微升培养基）。
- 在加入WST-1试剂后三小时，测量96孔板415nm处的各个孔的吸光度。
- 为了计算存活细胞的百分比，设定为无mTHPC处理的细胞为每个条件为100％（ 即照明系统，无mTHPC和nonilluminated，没有mTHPC）中得到的值的平均值。
3。的细胞数量估计由细胞计数
- 种子20,000个细胞/我们LL在24孔板中，并让他们坚持过夜。
- 于室温孵育5小时以mTHPC（0.001，0.003，0.15，0.6和1.25微克/毫升），并如上所述照射它们。
- 收集培养基，一旦用PBS以400×g离心洗细胞，胰蛋白酶消化它们和将它们收集通过离心分离5分钟。
- 离心后，吸出培养基并悬浮细胞于200μl的新鲜培养基。
- 细胞计数在纽鲍尔室。
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Representative Results
与此报告的技术，我们研究mTHPC为基础的PDT在人类OS细胞。首先，mTHPC的时间和剂量依赖性摄取研究在低转移性居屋和在高转移性143B OS细胞系。 mTHPC摄取可以通过测量mTHPC的荧光用荧光分光光度计（ 图2中 ，再现从雷迪等人 11的许可）进行评估。 图2A示出mTHPC的时间依赖性摄取。将细胞悬浮液的荧光强度表示mTHPC的胞内水平。 图2B示出了剂量依赖性mTHPC摄取居屋和143B细胞后5小时培养。在高转移性细胞系143B的吸收往往比在低转移性亲HOS细胞株更高。
黑暗和mTHPC在143B细胞光毒性通过测定细胞Metaboli的评估C活性（用WST-1法），并通过计数5个小时的潜伏期与mTHPC，随后在黑暗中孵育或治疗用激光为230秒，并进一步培养24小时，在黑暗中后剩余的细胞数。
剂量依赖性的暗毒性示于图3（转载自雷迪等人 11的许可）。在图3A中 ，143B细胞用不同mTHPC剂量和相比，未经处理的细胞。观察到细胞数目和代谢活性的剂量依赖性下降。降低细胞活力，以mTHPC浓度等于和低于2.5μg/ ml的高认可。 mTHPC的剂量依赖性的光毒性示于图3B中 。细胞用不同mTHPC剂量和随后的光照（5焦耳/厘米2）。一个相应降低细胞代谢活性（与WST法测定），以及在细胞NU下降MBER进行了观察。所得减少细胞数量施加PDT之后被可视化在图4。
图1。 mTHPC（A）的化学结构和光吸收光谱（B）。数字是由biolitec研究有限公司提供。 请点击这里查看这个数字的放大版本。
图2。 mTHPC由人类OS细胞株居屋和143B的时间和剂量依赖性摄取（A）。居屋（GRE中 y）和143B（黑色）接种在6孔板（0.2×20 6细胞/孔）。过夜培养后，将细胞用0.6微克/毫升mTHPC为0，2.5，5，7.5和10小时（A），或5小时以0，0.6，2.5和10微克/毫升mTHPC（B）的 。荧光强度由激发时测量20,000个细胞的荧光在652 nm处于417 nm处测定。值进行归一化，以计算出的细胞体积和HOS细胞在10小时（A）或孵育10微克/毫升（B）后的mTHPC摄取被设置为100％。值是平均值±三次独立实验的SEM图。从雷迪等 11改编请点击此处查看该图的放大版本。
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图3。黑暗和mTHPC在143B细胞光毒性。细胞过夜治疗前接种和培养。要确定mTHPC剂量依赖性暗毒性，143B细胞中指出mTHPC浓度（A）的存在或不存在孵育5小时在黑暗中。以确定mTHPC剂量依赖性毒性照片，143B细胞与或不mTHPC为5小时，在指定浓度，然后照射5焦耳/厘米2为21.88毫瓦/厘米2，230秒的动力 （B）。用于代谢活性（●），用WST-1法的测量，143B细胞以3000个细胞/孔的密度接种于96孔板中。细胞数（○）从细胞在24孔板中接种20,000细胞/孔进行计数。值是平均值±三次独立实验的SEM图。适应FR奥姆里迪等人 。11 请点击此处查看该图的放大版本。
图4。 143B细胞之前和之后PDT。细胞相衬图像进行播种，放置在协议中所述粘附过夜。以可视化的剂量依赖性，mTHPC介导的光毒性，143B细胞孵育5小时在黑暗中与0，0.6，2.5和10微克/毫升mTHPC（面板AD，分别）。然后将细胞以5焦耳/厘米2的光652的波长为230秒照明系统，并在24小时后拍照。比例尺：100微米排位容易程度点击这里查看此图的放大版本。
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Discussion
为了实现在响应PDT最佳的细胞毒性，关键是要选择合适的激光设置和孵育时间。这里所描述的过程是一致的，高效的，确定的PS吸收和量化PDT诱导的细胞毒性体外 。使用PS mTHPC的特定吸收波长，蜂窝PS摄取可以以直接的方式来确定，并且PS可以被激活，以产生细胞毒性的活性氧物种。
利用这种体外设置中，所有的参数，如聚苯乙烯浓度，药物的光的时间间隔和激光的光强度，可以很容易地调整到PS的特性和所用的细胞系。细胞计数给出了一个直接读出存活的贴壁细胞，这与WST-1法（监测代谢活性）一起提供了一个很好的估计为细胞的存活。然而，该方法只能模拟“第一击”， 即细胞毒性活性氧活化的PS后立即使用。 在体内观察到的随后的血管收缩和免疫系统，需要充分肿瘤根除的激活，只能在动物中进行研究。
图2展示了mTHPC的时间和剂量依赖性摄取在高转移性143B较高的水平比其亲本低转移居屋细胞系。孵育5小时只在高浓度（ 图3）后观察mTHPC在143B OS细胞暗毒性。 143B细胞表现出高灵敏度的PDT，由mTHPC显示和光剂量依赖性光毒性作用。观察到了光毒效应已经在一个mTHPC浓度低至0.075微克/毫升，而0.022±0.006微克/ ml的半数最大致死浓度观察到（ 图3）。
虽然PDT是微创，高效对抗多种肿瘤类型秒，轻微的副作用可应用在患者的技术（ 例如 ，肿胀，红斑）时发生。这表明，在PS不仅采取了由肿瘤细胞中，如下所示，也可由非肿瘤细胞，PDT后引起毒性也是在这些细胞中。 Triesscheijn 等人能够表明肿瘤细胞的增加光敏性相比，人成纤维细胞。与此相反，人微血管内皮细胞呈mTHPC更高的吸收比其他测试的细胞系，从而导致较高的光12。这些发现也与相关PDT相关的抗血管效应，这是经常观察2。
所描述的方法也可以应用于其他的PS。需要调整到PS的特性的温育时间和激光光强度。此外，PDT也可以诱导比OS细胞等，由于只设置是细胞系依赖的，但不是方法本身。随着进一步的开发EAD奏，细胞死亡的机制可以被分析， 例如 。通过参与细胞凋亡，坏死或自噬蛋白免疫印迹分析。还PS的亚细胞定位可以通过激光扫描共聚焦显微镜观察，例如 。
已在体外 ，细胞与PS和PDT诱导的激光光线的，即培养后，已经描述了用于PDT的不同步骤酷似临床情况。患者接受（IV或SC。应用）的PS和鲜明的药物光照时间间隔后，兴趣（ 例如 ，肿瘤组织）的区域用激光照明13。虽然还没有施加在OS中，其潜在的优点是显而易见的; PDT被认为是用于术中治疗肿瘤的卫星，它经常成长为原发肿瘤细胞簇接近原发肿瘤的主要轮缘特别有吸引力的，并可以发起复发当在S错过urgical切除的原发肿瘤。即使是大型骨肿瘤可能与此技术治疗。这已被证明是一种很有前途的研究中的狗14。此外，消除肿瘤细胞无法通过手术切除（ 如多发转移主要在肺中存在的），也可以表示PDT治疗的患者的OS转移性疾病可能的未来应用。
要注意的是，在执行的实验中，应注意所下最小的光曝光进行添加PS到细胞后所有加工步骤，如正常日光还包含必要激活mTHPC的波长是很重要的。同样，在临床前模型体内应用，护理需要采取注射mTHPC后直接光屏蔽动物。它也需要注意的是，WST-1法仅评估肿瘤细胞的代谢活性，这是细胞死亡的间接指标。因此，总细胞数的组合，如这里提出，建议。
总之，所描述的方法（PS-摄取和PDT诱导的细胞毒性）的组合提供了一种快速和成本有效的方法来表征体外将PS的毒性特性。这些体外结果，最佳的光强度和光药间隔的范围可以被估计，这给出了如何PDT可以在体内应用的良好指示。
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Disclosures
作者宣称没有竞争的经济利益或利益冲突。
Acknowledgments
作者要感谢biolitec研究有限公司（德国耶拿）对好心为我们提供了脂质体mTHPC配方，并特别感谢苏珊娜格拉夫和阿诺Wiehe工厂对他们的帮助和技术专长。我们还要感谢凯尔斯丁里迪，谁产生的结果有很大一部分，是coresponsible其出版11。
这项工作是由来自Schweizerischer社团组织Balgrist，苏黎世大学，苏黎世Krebsliga以及从沃尔特湖和约翰娜·沃尔夫基金会，瑞士苏黎世的赠款，并从EuroNanoMed ERA-NET / SNF瑞士拨款补助支持美国国家科学基金会31NM30-一分之十三万一千零四。这项工作也是由HSM的坎顿苏黎世的肌肉骨骼肿瘤（高度专业化医学）计划的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | PAA GmbH, Freiburg, Germany | E15-883 | |
| HAM F12 | PAA GmbH, Freiburg, Germany | E15-817 | |
| Heat-inactivated fetal calf serum | GIBCO, Basel, Switzerland | 10500-064 | |
| mTHPC | biolitec Research GmbH, Jena, Germany | As this liposomal formulation is originating from R&D no catalogue number is available at the moment. Stock: 1.5 mg/ml; provided in a 9:1 mixture of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) and dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG; >99% purity) |
|
| Spectramax Gemini XS plate reader | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ID# 861 | |
| Microscope Zeiss Observer.Z1 | Axio Observer, Axio Vision Release 4.6.3 SP1, Jena Germany | ||
| Ceralas PDT 652 nm Laser | biolitec AG, Jena, Germany | LD652nm2W400u | |
| Water-soluble tetrazolium (WST) reagent | Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Switzerland | 1644807 |
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