Summary
הפרוטוקול דיווח כאן מאפשר ההערכה של היעילות של טיפול פוטודינמי (PDT) בשורות תאים ואופטימיזציה של הגדרות PDT לפני יישום הטיפול במודלים של בעלי חיים.
Abstract
בשנים האחרונות, חל קושי במציאת טיפולים יעילים יותר נגד סרטן עם תופעות לוואי מערכתיים פחות. לכן הטיפול פוטודינמי הוא גישה חדשנית לטיפול סלקטיבית יותר גידול.
טיפול פוטודינמי (PDT), שעושה שימוש בפוטוסנסיטייזר רעיל (PS), אשר, על הפעלה עם אור באורך גל מסוים בנוכחות חמצן, יוצר רדיקלים שיעוררו תגובה ציטוטוקסיות 1. למרות אישורה לפני כמעט עשרים שנה על ידי ה-FDA, PDT הוא כיום משמש רק לטיפול במספר מצומצם של סוגי הסרטן (עור, שלפוחית השתן) ומחלות nononcological (פסוריאזיס, keratosis actinic) 2.
היתרון העיקרי של השימוש בPDT הוא היכולת לבצע טיפול מקומי, המונע תופעות לוואי מערכתיות. יתר על כן, היא מאפשרת טיפול בגידולים באתרים עדינים (למשל סביב עצבים או כלי דם). הנה, intraoperatיישום ive של PDT נחשב באוסטאוסרקומה (OS), גידול של העצם, כדי למקד את לוויני גידול ראשוניים נשאר מאחור בגידול רקמות לאחר כריתת גידול כירורגית. הטיפול שמטרתו להפחית את מספר הישנויות ולצמצם את הסיכון לגרורות (לאחר ניתוח).
במחקר הנוכחי, אנו מציגים במבחנה נהלי PDT להקים הגדרות PDT אופטימליות לטיפול יעיל של שורות תאים בשימוש נרחב מערכת הפעלה המשמשות לשחזר את המחלה האנושית בעכברי מודל OS intratibial מבוססים היטב. הספיגה של mTHPC נ.ב. נבדקה בספקטרופוטומטר וphototoxicity היה עורר עם עירור אור הלייזר של mTHPC ב652 ננומטר כדי לגרום למוות של תאים הוערך עם assay WST-1 ועל ידי הספירה של תאים ששרדו. הטכניקות הוקמו תאפשר לנו להגדיר את הגדרות PDT אופטימליות למחקרים עתידיים במודלים של בעלי חיים. הם כלי קל ומהיר להערכת היעילות של טיפול פוטודינמי
Introduction
המצב של היום של טיפול האמנות של אוסטאוסרקומה (OS), גידול עצם עיקרי, כולל שילוב של כימותרפיה adjuvant הניאו וניתוח. משטר טיפול זה גילה עלייה בשיעור ההישרדות של חולים עם מחלה מקומית מכ 20% לפני השימוש בכימותרפיה, כדי כיום בין 60-70% 3, 4. עם זאת, בשני העשורים האחרונים, ההישרדות הכוללת של חולים עם מחלת OS מקומית התייצבה 4, 5. יתר על כן, 30-40% מהחולים האלה להשנות תוך 3 שנים לאחר אבחון וחולים עם מחלה גרורתית ימשיכו להיות הישרדות עניות של 20-30% 4, 6, 7. כדי לשפר את התוצאה של חולים אלה, אסטרטגיות טיפוליות חדשות צריכים להיות מפותחות.
טיפול פוטודינמי (PDT), טיפול נגד סרטן ולא רומן, משתמש באור באורך גל מסוים לעירור של photosensiTizer (PS), אשר מצטבר בתאים הסרטניים לאחר הזרקתה למחזור הדם. אור עירור הלייזר של PS מייצר רדיקלים בנוכחות החמצן, אשר לגרום לתגובה ציטוטוקסיות בתאים סרטניים ומוות של תאים. חוץ ממנגנון עיקרי זה, שני PDT נוסף עורר תהליכים ביולוגיים יתרמו לצמיחת גידול מופחתת: PDT גורם להתכווצות כלי דם והיווצרות קרישי דם על נימי הדם הזעיר וגידול, וכתוצאה מכך היפוקסיה מקומית ואנוקסיה בתוך הגידול, מה שמוביל לאוטם גידול. לבסוף, PDT נפצע ותאים סרטניים מתים לעורר תגובה חיסונית מקומית, תכונה ייחודית למדי של PDT. זה כולל את מערכת המשלימה והפעלה של אנטיגן הצגת תאים דנדריטים 8. לכן, תנאים שנוצרו להצגת אנטיגנים סרטניים עם ההפעלה הבאה של תאי הלימפה, מה שמובילים לחסינות ספציפית גידול.
עד כה, PDT כבר בשימוש לטיפול בסוגים שונים של גידולים ברקמות רכים וhyperplאסיה של, כגון keratosis actinic, ושטו בארט, גידולי Endobronchial, סרטן שלפוחית השתן, קרצינומה של תאים הבזליים, וטיפול פליאטיבי של סרטן הראש והצוואר 2. הטיפול ידוע לגרום נמק בקנה מידה מקומי, גדול עם מעט תופעות לוואי בלבד, ולכן יש לו הפוטנציאל למיגור רקמת גידול באופן סלקטיבי. למרות יתרונות אלה, היישום של PDT נשאר מבחינה טכנית תובעני יותר מהממשל של תרופות כימותרפיות. על מנת להשיג יעילות מרבית, ריכוז PS, זמן חשיפה לאור וסך העברת אנרגיית אור צריך להיות מותאם. ניתן לעשות זאת בניסויי vivo, אבל, בגלל המספר הגדול היחסי של פרמטרים שצריכים להיות מותאמים, הוא יעיל יותר בהתחלה כדי לקבוע תנאים אופטימליים במבחנה.
בניסויים שתוארו להלן, שבדקנו את היעילות במבחנה של PDT באמצעות CHL PS 5,10,15,20-tetrakis (meta-hydroxyphenyl)אורין, מקוצר mTHPC (איור 1 א). mTHPC הוא החומר הפעיל במוצר הרפואי Foscan, אשר משמש כיום במרפאת לטיפול פליאטיבי של סרטן הראש והצוואר. זהו אחד נ.ב. החזק ביותר, גרימת נזק לתאים מסיביים כבר בריכוזים נמוכים, וזה הודגם להיות עדיף על PS האחר במונחים של רקמת חדירה 9, 10. ספקטרום בליעת האור שלו (איור 1) מראה שתי פסגות בולטות, אחד ב417 ננומטר ושני ב652 ננומטר, המשמשות ללוקליזציה רקמות של צבירת PS ולזירוז PDT, בהתאמה.
נכון לעכשיו, ניסוח liposomal לmTHPC הוא בפיתוח. כאן, אנו מתארים את הנהלים לכמת את הספיגה של ניסוח liposomal זה, ולבצע PDT בשתי שורות תאי מערכת הפעלה אנושיות; HOS גרורתי הנמוך ותאי 143B גרורתי גבוהים. חלק מהנתונים שהוצגו כאן כבר דיווחו 11 קודם לכן. הגישת דואר המתוארת כאן מאפשרת לנו לחקור את ההשפעה של פנוטיפ גרורתי ביעילות PDT. 143B תאים, הזריקו orthotopically לגפיים האחורי של עכברי SCID חסרים חיסוניים לגרום לגידולי intratibial גרורות ראשוניים, מודל חיקוי המחלה הגרורה האדם באופן הדוק. לכן, בניסויים במבחנה המוצעים הם בצורה מושלמת מתאימים כדי להעריך את ההגדרות אופטימלי PDT להיות מאוחר יותר נעשה שימוש בניסויי in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. השוואה בין הספיגה של mTHPC בנמוכה ביותר בהתאמה וגרורתי HOS ושורות תאי 143B OS
- להכין מדיום תרבית תאים המכיל DMEM, Ham F12, וסרום חום מומת עוברי עגל ב4.5:4.5:1 יחס.
הערה: ניסוח liposomal של mTHPC נ.ב. היה מומס במים בריכוז סופי של 1.5 מ"ג / מיליליטר mTHPC. - HOS פלייט 0.2 x 10 6 ותאי 143B / גם ב6 צלחות היטב (triplicates עבור כל תנאי) ולתת לתאים לדבוק לילה.
שים לב: המספר צריך להיות מותאם לשורות תאים בודדות. Confluency של 80-90% הוא מתאים ביותר בעת הניסוי. - ביום למחרת, דגירה התאים עם ריכוז קבוע של mTHPC לתקופות זמן שונה (ספיגה תלויה בזמן), או עם עלייה בריכוזים של mTHPC במהלך פרק זמן קבוע (ספיגה תלויה במינון).
- דגירה התאים עם mTHPC עבור p זמן מסויםoints או ריכוזים של mTHPC.
שים לב: במחקר זה, הן את HOS ושורות תאי 143B הודגרו עם 0.6 מיקרוגרם / מיליליטר mTHPC עבור 0, 2.5, 5, או 10 שעה, או עם 0, 0.6, 2.5, ו10 מיקרוגרם / מיליליטר mTHPC במשך 5 שעות. פרקי הזמן שיושמו ומינונים עשויים להשתנות תלוי בשורה של התאים המשמשת. - זכור תמיד לעבוד בחושך או בתנאי תאורה מעומעמים כדי למנוע חשיפה לאור ישירה של התאים.
- לאחר הדגירה של התאים בתנאים מצויינים, לשאוב את המדיום ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS. בשלב הבא, לנתק את התאים עם 0.5 מיליליטר טריפסין / EDTA ולספור את התאים.
- לאחר ניתוק, צנטריפוגה התאים ב XG 400 למשך 5 דקות, לשאוב את המדיום וresuspend תאי PBS לצפיפות סופית של 200,000 תאים / מיליליטר.
- של ההשעיה התא שהושגה פיפטה 100 μl (כלומר 20,000 תאים) בצלחת 96 היטב ולמדוד את הקרינה של תאים אלה בספקטרופוטומטר הקרינה. ההגדרהשל מדידות הקרינה mTHPC הם: 417 ננומטר לעירור ו652 ננומטר לפליטה.
- על מנת לחשב את כמות mTHPC המופנם לכל תא, לנרמל את יחידת הקרינה היחסית (RFU) למספר התא ונפח תא כדלקמן:
- הכן את עקומת סטנדרט באמצעות ריכוזים שונים של mTHPC ב-PBS 0-4 מיקרוגרם / מיליליטר (מדידות בשלושה עותקים לשימוש). פיפטה של דילול כל 100 μl בצלחת 96 היטב ולמדוד את הקרינה של הבארות תוך שימוש בהגדרות שתוארו בשלב 1.6.
- מחלקים את RFU (המתקבל ל20,000 תאים) על ידי שיפוע העקום הסטנדרטי ליניארי של mTHPC, אשר נותן את הריכוז של mTHPC (במיקרוגרם / מיליליטר) בבאר.
- מחלקים ריכוז mTHPC זאת על ידי 10 כדי לקבל את הסכום הכולל של mTHPC בבאר אחת (במיקרוגרם, המייצג את ההשעיה תא 100 μl) ולחלק את הערך הזה בנפח של 20,000 תאים.
- לחשב את הנפח עם הנוסחה לתחום: (4/3 π x) xr 3. השג את הרדיוס r על ידי מדידת הקוטר של 20 תאים trypsinized תחת מיקרוסקופ, וחלוקת ערך זה על ידי 2.
- לבסוף, לנרמל את כל הערכים לאלו שהושגו עבור תאי HOS לאחר 10 שעות של דגירה (ספיגה תלויה במינון) או מטופלים עם 10 מיקרוגרם / מיליליטר mTHPC (ספיגה תלויה בזמן), שנקבעו ל100%.
2. מדידה של phototoxicity של PS במבחנה
- זרעי 3,000 תאים / היטב בצלחת 96 היטב (triplicates עבור כל ריכוז של mTHPC משומש) ולתת להם לדבוק בלילה. כמו כן להכין צלחת 96 היטב נוספת ולטפל בתאים כמתואר בהמשך, אבל אז לשים אותם בצד להדמיה בניגוד שלב.
שים לב: המספר צריך להיות מותאם לכל שורת תא בודדת. Confluency של 50-60% בעת הניסוי הוא אידיאלי.- זכור להוסיף את שליטת הרעילות הכהה המתאימה של תאים לכל אחד מריכוזי mTHPC.se הם תאים שיהיה הודגרו בהעדר או הנוכחות של ריכוזים נבחרים של mTHPC, אבל לא יהיה מואר.
- ביום למחרת, דגירה התאים עם ריכוזים שונים של mTHPC (0, 0.0001, 0.001, 0.01, 0.03, 0.075, 0.15, 0.3, 0.6, 1.25, 2.5, 5, ו10 מיקרוגרם / מיליליטר) בהתאם לשורות התאים ו לשמור אותם בחושך במשך 5 שעות.
- עיין בסעיף 1.3.2
הערה: זמן הדגירה לפני התאורה תלויה בשורת התאים ועל PS בשימוש, ולכן מומלץ לבדוק את הריכוזים שונים ובנקודתי זמן שונות בניסויים נפרדים.
- עיין בסעיף 1.3.2
- לאחר דגירה לתקופה הזמן המצוינת, לשטוף את התאים פעמיים עם PBS ולהוסיף בינוניים טרי חדש ללא mTHPC.
- להאיר את התאים עם לייזר 652 ננומטר דיודה, ספציפי לספקטרום ספיגת mTHPC (ראה איור 1).
- הגדר את הלייזר ל21.88 mW / 2 סנטימטר כוח בגובה של 13.5 dista סנטימטרNCE מהתאים, על מנת לקבל את מנת אנרגיה של 5 J / 2 סנטימטר. להאיר את התאים ל230 שניות. אל להאיר את תאי שליטת רעילות הכהים (עם ובלי mTHPC).
שים לב: תמיד להרכיב משקפיים כדי להגן על העיניים מפני אור הלייזר המשמש לעירור של PS.
- הגדר את הלייזר ל21.88 mW / 2 סנטימטר כוח בגובה של 13.5 dista סנטימטרNCE מהתאים, על מנת לקבל את מנת אנרגיה של 5 J / 2 סנטימטר. להאיר את התאים ל230 שניות. אל להאיר את תאי שליטת רעילות הכהים (עם ובלי mTHPC).
- לאחר הארה, לשמור על התאים בחושך ב37 º C למשך 24 שעות. בהמשך לכך, להוסיף tetrazolium מסיס במים מגיב (WST-1) (10 μl/100 μl של מדיום).
- שלוש שעות לאחר התוספת של המגיב WST-1, למדוד את הספיגה של בארות בודדות של צלחת 96 היטב ב415 ננומטר.
- כדי לחשב את אחוז התאים ששרדו, קבע את הממוצע של הערכים שהתקבלו עבור תאי mTHPC שאינו מטופלים עבור כל תנאי ל100% (המוארים כלומר, ללא mTHPC וnonilluminated, ללא mTHPC).
3. הערכה של מספר סלולרי על ידי ספירת תאים
- תאי זרע 20,000 /ll בצלחת 24 גם ולתת להם לדבוק בלילה.
- דגירה התאים עבור שעה 5 עם mTHPC (0.001, 0.003, 0.15, 0.6, ו1.25 מיקרוגרם / מיליליטר) ולהאיר אותם כפי שתואר לעיל.
- לאסוף את המדיום, לשטוף את תאי פעם עם PBS, trypsinize אותם ולאסוף אותם על ידי צנטריפוגה ב XG 400 למשך 5 דקות.
- לאחר צנטריפוגה, לשאוב את המדיום וresuspend התאים 200 μl של מדיום חדש.
- ספירת התאים בתא נויבאואר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בעזרת הטכניקות כאן דיווחו, אנחנו בדקנו PDT מבוסס mTHPC בתאי מערכת הפעלה אנושיים. ראשית, הספיגה תלויה בזמן ובמינון של mTHPC נחקרה בHOS גרורתי הנמוך ובשורות תאי 143B OS גרורתי מאוד. ספיגת mTHPC יכולה להיות מוערכת על ידי מדידת הקרינה של mTHPC עם ספקטרופוטומטר הקרינה (איור 2, לשכפל באישור מריידי et al. 11). איור 2 א ממחיש את הספיגה של mTHPC באופן תלוי בזמן. עוצמת הקרינה של ההשעיה התא מייצגת את הרמות תאית של mTHPC. איור 2 ממחישה את הספיגה תלויה במינון mTHPC בתאי HOS ו143B לאחר 5 דגירה שעה. הספיגה בשורת התאים גרורתי הגבוהה 143B נטתה להיות גבוה יותר מאשר בקו ההורי גרורתי הנמוך תא HOS.
כהה וphototoxicity של mTHPC ב143B תאים הוערכו על ידי קביעת metaboli התאפעילות ג (עם assay WST-1) ועל ידי ספירת מספר התאים הנותרת לאחר 5 שעות של דגירה עם mTHPC, דגירה לאחר מכן בחושך או טיפול באור הלייזר ל230 שניות ודגירה נוספת ל24 שעות בחושך.
רעילות כהה תלויה מינון מוצגת באיור 3 (לשכפל באישור מריידי et al. 11). באיור 3 א, בתאים שטופלו 143B עם מינוני mTHPC שונים ובהשוואה לתאים שלא טופלו. ירידה תלוית מינון של פעילות מספר התא וחילוף חומרים נצפתה. כדאיות תא ירד הוכרו בריכוז mTHPC שווה וגבוה יותר מאשר 2.5 מיקרוגרם / מיליליטר. phototoxicity התלוי המינון של mTHPC מתואר באיור 3 ב. תאים שטופלו במינונים mTHPC שונים ועם תאורה שלאחר מכן (5 J / 2 סנטימטר). ירידה תוצאתי בפעילות המטבולית של תאים (נמדדה עם assay WST), כמו גם ירידה בנו תאmber נצפה. ירידה וכתוצאה ממספר תאים לאחר החלת PDT היא דמיינו באיור 4.
איור 1. מבנה כימי של mTHPC () וספקטרום בליעת אור (ב '). הנתונים נמסרו על ידי biolitec GmbH המחקר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. ספיגה תלויה בזמן ובמינון של mTHPC ידי שורות תאי מערכת הפעלה האנושיות HOS ו143B. (). HOS (בGRE y) ו143B (בשחור) היו זורעים ב6 צלחות היטב (0.2 x 20 6 תאים / טוב). לאחר culturing בן לילה, התאים הודגרו עם 0.6 מיקרוגרם / מיליליטר mTHPC עבור 0, 2.5, 5, 7.5, ו10 שעה (א), או לשעה 5 עם 0, 0.6, 2.5, ו10 מיקרוגרם / מיליליטר mTHPC (ב ') . עוצמת הקרינה נקבעה על ידי מדידת הקרינה של 20,000 תאים ב652 ננומטר על עירור ב417 ננומטר. ערכים היו מנורמלות המחושב נפח התא וספיגת mTHPC של תאי HOS ב10 שעה (א) או לאחר דגירה עם 10 מיליליטר / מיקרוגרם (ב ') נקבע ל100%. ערכים הם הממוצעים ± SEM של שלושה ניסויים בלתי תלויים. מעובד מתוך ריידי et al. 11 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
"Src =" les/ftp_upload/51213/51213fig3highres.jpg / files/ftp_upload/51213/51213fig3.jpg "/>
איור 3. כהה וphototoxicity של mTHPC ב143B תאים. תאים היו זרע וגדלו בין לילה לפני הטיפול. כדי לקבוע רעילות כהה תלויה מינון mTHPC, תאי 143B הודגרו למשך 5 שעות בחושך בהעדר או הנוכחות של ריכוזי mTHPC הצביעו (א '). כדי לקבוע רעילות תמונה תלויה מינון mTHPC, תאי 143B הודגרו עם או בלי mTHPC למשך 5 שעות בריכוזים שצוינו ולאחר מכן מואר עם 5 J / 2 סנטימטר עם עוצמה של 21.88 mW / 2 סנטימטר ל230 שניות (ב). למדידות של הפעילות המטבולית (●) עם assay WST-1, תאי 143B היו זורעים בצלחות 96, גם בצפיפות של 3,000 תאים / היטב. מספרים סלולריים (○) נספרו מהתאים שנזרעו ב20,000 תאים / גם ב24 גם צלחות. ערכים הם הממוצעים ± SEM של שלושה ניסויים בלתי תלויים. fr המותאםאום ריידי ואח' 11. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. בניגוד שלב תמונות של 143B תאים לפני ואחרי PDT. תאי זרע והשאירו לדבוק לילה כפי שתוארו בפרוטוקול. כדי להמחיש תלוי מינון, mTHPC תיווך רעילות אור, תאי 143B הודגרו למשך 5 שעות בחושך עם 0, 0.6, 2.5, ו10 מיקרוגרם / מיליליטר mTHPC (לוחות לספירה, בהתאמה). התאים אז היו מוארים עם 5 J / 2 סנטימטר אור באורך גל nm 652 ל230 שניות, וצילמו לאחר 24 שעות. בר סולם:. 100 מיקרומטר Plלהקל לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כדי להשיג cytotoxicity האופטימלי בתגובה לPDT, זה הכרחי כדי לבחור את הגדרות לייזר אור הנכונות ובזמני דגירה. הנהלים שתוארו כאן הם עקביים ויעילים כדי לקבוע ספיגת PS ולכמת cytotoxicity PDT מושרה במבחנה. שימוש באורכי גל הקליטה הספציפי של mTHPC PS, ספיגת PS הסלולרית ניתן לקבוע באופן ישיר, וPS יכול להיות מופעל כדי ליצור מיני חמצן תגובתי ציטוטוקסיות.
שימוש בהגדרה זו במבחנה, ניתן להתאים את כל הפרמטרים כגון ריכוז PS, מרווח אור בסמים ובעוצמת אור הלייזר בקלות למאפיינים של PS ושורות התאים בשימוש. ספירת תאים נותנת ישיר קראו מתוך תאים מצורפים ששרדו, אשר יחד עם assay WST-1 (ניטור פעילות המטבולית) נותנת הערכה טובה להישרדות תא. עם זאת, השיטה שהוצגה יכולה רק מודל "הלהיט הראשון", כלומר רעיל לתאמיני חמצן של תגובתי מייד לאחר ההפעלה של PS. In vivo נצפה התכווצות כלי דם שלאחר מכן וההפעלה של מערכת החיסון, הכרחית למיגור גידול מלא, ניתן לחקור רק בבעלי חיים.
איור 2 הפגין ספיגה תלויה בזמן ובמינון של mTHPC לרמה גבוהה יותר ב143B גרורתי מאוד מאשר בקו שלה ההורי הנמוך גרורתי תא HOS. רעילות אפלה של mTHPC בתאי מערכת ההפעלה 143B נצפתה לאחר הדגירה של 5 שעות בלבד בריכוזים גבוהים (איור 3). 143B תאים מראים רגישות גבוהה לPDT, שמוצגת על ידי mTHPC והשפעת phototoxic תלויה מינון אור. השפעת phototoxic נצפתה כבר בריכוז mTHPC נמוך כמו 0.075 מיליליטר מיקרוגרם / וריכוז קטלני מקסימאלי מחצית 0.022 ± 0.006 מיקרוגרם / מיליליטר נצפה (איור 3).
למרות PDT הוא פולשנית ויעיל נגד סוג גידול רביםים, תופעות לוואי קלים יכול להתרחש בעת יישום הטכניקה בחולים (למשל. נפיחות, אודם). זה מצביע על כך נ.ב. לא נלקח רק על ידי תאי גידול, כפי שמוצגים כאן, אלא גם על ידי תאי nontumor, גורמים לרעילות לאחר PDT גם בתאים אלה. Triesscheijn et al. הצליח להראות רגישות מוגברת של תאים סרטניים בהשוואה לfibroblasts אדם. לעומת זאת, תאי אנדותל כלי הדם אדם הראו ספיגה גבוהה יותר של mTHPC מאשר קווים האחרים שנבדקו תא, מה שהוביל לרגישות גבוהה 12. ממצאים אלה תואמים גם עם אפקטי PDT קשורים אנטי כלי דם, אשר לעתים קרובות הם נצפו 2.
השיטות שתוארו יכולות להיות מיושמות גם עבור PS אחר. זמן דגירה ועוצמת אור הלייזר צריכים להיות מותאם למאפיינים של PS. בנוסף, יכול גם להיגרם PDT באחר מאשר תאי מערכת הפעלה, שכן רק ההגדרות הן שורת תאים תלויות אך לא בשיטה עצמה. r כנוסףפסקי EAD, ניתן לנתח מנגנוני מוות של תאים, למשל. על ידי ניתוח הכתם המערבי של חלבונים המעורבים באפופטוזיס, נמק או autophagy. גם לוקליזציה subcellular של PS ניתן דמיינו למשל על ידי מיקרוסקופ לייזר confocal סריקה.
השלבים השונים שתוארו לPDT במבחנה, כלומר דגירה של התאים עם PS והאינדוקציה של PDT עם אור הלייזר, דומים מאוד למצב הקליני. חולים מקבלים (IV או SC. מיושם) PS, ולאחר הפסקה קלה לסמים שונה, לאזור של עניין (למשל. רקמת גידול) מואר באור הלייזר 13. אמנם עדיין לא מיושמים במערכת ההפעלה, היתרונות הפוטנציאליים שלה הם ברורים; PDT נחשב לאטרקטיבי במיוחד לטיפול תוך הניתוחי של לוויני גידול, אשר לעתים קרובות לגדול כצבירי תאי גידול ראשוני קרובים לשפה העיקרית של הגידול הראשוני ועשוי ליזום הישנות כשהחמיץ ביםכריתת urgical של הגידול הראשוני. ניתן לטפל גם בגידולים גרמיים גדולים עם טכניקה זו. זה הוכח במחקר מבטיח בכלבים 14. בנוסף, חיסול של תאים סרטניים שלא ניתן לכרות את הגידול בניתוח (גרורות למשל מרובות בעיקר מתרחשות בתוך הריאות), עשוי גם לייצג את היישום אפשרי בעתיד של PDT בחולים עם מחלה גרורתית של מערכת ההפעלה.
חשוב לציין כי, בעת ביצוע הניסויים, יש להקפיד שכל שלבי העבודה מבוצעים תחת חשיפת אור המינימלית לאחר הוספה נ.ב. לתאים, כמו אור יום רגיל מכיל גם את אורך הגל הדרוש כדי להפעיל mTHPC. כמו כן, עבור ביישום vivo במודלים פרה, טיפול צריך לקחת כדי להגן על בעלי החיים מאור ישיר לאחר הזרקת mTHPC. כמו כן, צריך לציין כי assay WST-1 מעריך את הפעילות המטבולית של תאים סרטניים, המהווה אינדיקטור עקיף של מוות של תאים בלבד. לכן, שילוב עם סך הכל ספירת תאים, כפי שמוצג כאן, הוא מומלץ.
לסיכום, השילוב של השיטות שתוארו (PS-ספיגה ורעיל לתא מושרה PDT) מספק הליך יעיל מהיר ועלות לאפיין תכונות רעילות של PS במבחנה. עם במבחנה התוצאות הללו, בטווח של עוצמת אור האופטימלית ומרווח אור התרופה יכול להיות מוערך, אשר נותן אינדיקציה טובה עד כמה ניתן ליישם PDT in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים או ניגוד עניינים.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לbiolitec המחקר GmbH (Jena, גרמניה) לחביבות לתת לנו ניסוח mTHPC liposomal, עם תודה מיוחדת לסוזנה Grafe וארנו Wiehe לעזרתם ומומחיות טכנית. כמו כן, אנו רוצים להודות לקרסטין ריידי, שנוצר חלק גדול מהתוצאות והיה coresponsible לפרסומו 11.
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מSchweizerischer Verein Balgrist, אוניברסיטת ציריך, ציריך Krebsliga כמו גם על ידי מענק מל 'וולטר וקרן יוהנה וולף, ציריך, שוויץ ומענק מEuroNanoMed ERA-NET / SNF שוויצרי הקרן הלאומית למדע 31NM30-131004/1. עבודה זו נתמכה גם על ידי תכנית (מאוד מיוחדת לרפואה) לשלד ושרירי אונקולוגיה של ציריך Kanton HSM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | PAA GmbH, Freiburg, Germany | E15-883 | |
| HAM F12 | PAA GmbH, Freiburg, Germany | E15-817 | |
| Heat-inactivated fetal calf serum | GIBCO, Basel, Switzerland | 10500-064 | |
| mTHPC | biolitec Research GmbH, Jena, Germany | As this liposomal formulation is originating from R&D no catalogue number is available at the moment. Stock: 1.5 mg/ml; provided in a 9:1 mixture of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) and dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG; >99% purity) |
|
| Spectramax Gemini XS plate reader | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ID# 861 | |
| Microscope Zeiss Observer.Z1 | Axio Observer, Axio Vision Release 4.6.3 SP1, Jena Germany | ||
| Ceralas PDT 652 nm Laser | biolitec AG, Jena, Germany | LD652nm2W400u | |
| Water-soluble tetrazolium (WST) reagent | Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Switzerland | 1644807 |
References
- Juarranz, A., Jaen, P., Sanz-Rodriguez, F., Cuevas, J., Gonzalez, S. Photodynamic therapy of cancer. Basic principles and applications. Clin. Transl. Oncol. 10, 148-154 (2008).
- Agostinis, P., et al. Photodynamic therapy of cancer: an update. CA Cancer. 61, 250-281 (2011).
- D'Adamo, D. R. Appraising the current role of chemotherapy for the treatment of sarcoma. Semin. Oncol. 38 Suppl 3, 19-29 (2011).
- Allison, D. C., et al. A meta-analysis of osteosarcoma outcomes in the modern medical era. Sarcoma. , (2012).
- Anninga, J. K., et al. Chemotherapeutic adjuvant treatment for osteosarcoma: where do we stand. Eur. J. Cancer. 47, 2431-2445 (2011).
- Bacci, G., et al. Pattern of relapse in patients with osteosarcoma of the extremities treated with neoadjuvant chemotherapy. Eur. J. Cancer. 37, 32-38 (2001).
- Briccoli, A., et al. Resection of recurrent pulmonary metastases in patients with osteosarcoma. Cancer. 104, 1721-1725 (2005).
- Milla Sanabria, L., et al. Direct and indirect photodynamic therapy effects on the cellular and molecular components of the tumor microenvironment. Biochim. Biophys. Acta. 1835, 36-45 (2013).
- Mitra, S., Foster, T. H. Photophysical parameters, photosensitizer retention and tissue optical properties completely account for the higher photodynamic efficacy of meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin vs Photofrin. Photochem. Photobiol. 81, 849-859 (2005).
- Ma, L., Moan, J., Berg, K. Evaluation of a new photosensitizer, meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin, for use in photodynamic therapy: a comparison of its photobiological properties with those of two other photosensitizers. Int. J. Cancer. 57, 883-888 (1994).
- Reidy, K., Campanile, C., Muff, R., Born, W., Fuchs, B. mTHPC-mediated photodynamic therapy is effective in the metastatic human 143B osteosarcoma cells. Photochem. Photobiol. 88, 721-727 (2012).
- Triesscheijn, M., Ruevekamp, M., Aalders, M., Baas, P., Stewart, F. A. Comparative sensitivity of microvascular endothelial cells, fibroblasts and tumor cells after in vitro photodynamic therapy with meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin. Photochem. Photobiol. 80, 236-241 (2004).
- Triesscheijn, M., Baas, P., Schellens, J. H., Stewart, F. A. Photodynamic therapy in oncology. Oncologist. 11, 1034-1044 (2006).
- Burch, S., et al. Treatment of canine osseous tumors with photodynamic therapy: a pilot study. Clin. Orthop. Relat. Res. 467, 1028-1034 (2009).
