Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Cytotoksiske Effekt av fotodynamisk terapi i Osteosarkom celler Published: March 18, 2014 doi: 10.3791/51213
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Laboratory for Orthopedic Research, Balgrist University Hospital, Zurich, Switzerland
* These authors contributed equally

Summary

Protokollen rapportert her tillater evaluering av effekten av fotodynamisk terapi (PDT) i cellelinjer, og optimalisering av PDT-innstillingene før påføring av terapi i dyremodeller.

Abstract

I de senere årene har det vært vansker med å finne mer effektive behandlingsformer mot kreft med færre systemiske bivirkninger. Derfor Fotodynamisk terapi er en ny tilnærming for en mer svulst selektiv behandling.

Fotodynamisk terapi (PDT), som gjør bruk av en ikke-toksisk fotosensibiliserende (PS), som ved aktivering med lys av en bestemt bølgelengde i nærvær av oksygen, genererer oksygenradikaler som frembringer et cytotoksisk respons 1.. Til tross for sin godkjenning nesten tjue år siden av FDA, er PDT i dag kun brukes til å behandle et begrenset antall krefttyper (hud, blære) og nononcological sykdommer (psoriasis, aktinisk keratose) 2.

Den store fordelen med bruk av PDT er muligheten for å utføre en lokal behandling, som hindrer systemiske bivirkninger. Dessuten blir det behandling av svulster på ømfintlige områder (f.eks rundt nerver eller blodårer). Her, en intraoperative anvendelse av PDT regnes i osteosarkom (OS), en svulst i beinet, for å målrette primære tumor satellitter etterlatt i tumor omkringliggende vev etter kirurgisk reseksjon. Behandlingen tar sikte på å redusere antallet tilbakefall og for å redusere risikoen for (postoperativt) metastasering.

I den foreliggende undersøkelse viser vi in vitro PDT prosedyrer for å etablere de optimale PDT innstillinger for effektiv behandling av hyppig benyttede OS-cellelinjene som anvendes for å reprodusere det menneskelige sykdommer i veletablerte intratibial OS musemodeller. Opptaket av PS mTHPC ble undersøkt med et spektrofotometer og fototoksisitet ble provosert med laserlys eksitasjon av mTHPC på 652 nm å indusere celledød vurderes med WST-1-analysen og ved opptelling av overlevende celler. De etablerte teknikker gjør oss i stand til å definere optimale PDT innstillingene for fremtidige studier i dyremodeller. De er en enkel og rask verktøy for evaluering av effekten av PDT in vivo.

Introduction

Dagens toppmoderne behandling av osteosarkom (OS), en primær bein svulst, omfatter en kombinasjon av neo adjuvant kjemoterapi og kirurgi. Denne behandlingsregime avslørte en økning i overlevelse av pasienter med lokalisert sykdom fra omtrent 20% før bruk av kjemoterapi, for å nå mellom 60 til 70% 3, 4. Men i de siste to tiårene, har total overlevelse av OS pasienter med lokal sykdom plateaued fire, fem. Videre, 30-40% av disse pasientene tilbakefall innen 3 år etter diagnose og pasienter med metastatisk sykdom fortsette å ha en dårlig overlevelse på 20-30% 4, 6, 7. For å forbedre utfallet av disse pasientene, nye terapeutiske strategier må utvikles.

Fotodynamisk terapi (PDT), et ganske ny anticancerterapi, benytter lys med en bestemt bølgelengde for eksitering av en photosensiTizer (PS), som akkumuleres i svulstceller etter dets injeksjon i blodstrømmen. Laserlys magnetisering av PS genererer oksygenradikaler i nærvær av oksygen, noe som induserer cytotoksisk reaksjon i tumorceller og celledød. I tillegg til denne primære mekanisme, ytterligere to PDT fremkalt biologiske prosesser bidrar til redusert tumorvekst: PDT forårsaker vasokonstriksjon og trombedannelse av svulsten microvasculature og følgelig lokal hypoksi og anoksi inne i tumoren, noe som fører til tumorinfarkt. Til slutt, PDT skadet og døende kreftceller utløse en lokal immunrespons, en ganske unik funksjon av PDT. Dette innebærer komplementsystemet og aktivering av antigen-presenterende dendrittceller 8.. Således er betingelsene opprettes for presentasjon av tumorantigener med påfølgende aktivering av lymfoide celler, som fører til tumorspesifikk immunitet.

Så langt har PDT blitt brukt til å behandle flere typer bløtvev svulster og hyperplAsias, slik som aktinisk keratose, Barretts øsofagus, Endobronkiale svulster, blærekreft, basalcellekreft, og palliativ behandling av hode og nakke kreft to. Denne behandling er kjent for å indusere lokal, storskala nekrose med bare lite bivirkninger, og har således potensiale for selektivt å utrydde tumorvevet. Til tross for disse fordelene, er anvendelsen av PDT teknisk mer krevende enn administrering av kjemoterapeutiske medikamenter. For å oppnå maksimal effekt, PS-konsentrasjon, lyseksponering tiden og den totale lysenergi overføring må optimaliseres. Dette kan gjøres i in vivo forsøk, men, på grunn av det relativt store antall parametere som må bli optimalisert, er det mer effektivt å først bestemme optimale betingelser in vitro.

I forsøkene som er beskrevet nedenfor, har vi testet in vitro effekt av PDT med PS 5,10,15,20-tetrakis-(meta-hydroksyfenyl)-CHLOrin, forkortet mTHPC (figur 1A). mTHPC er virkestoffet i legemiddelet Foscan, som i dag brukes i klinikken for palliativ behandling av hode og nakke kreft. Det er en av de mest potente PS, indusere massiv celleskade allerede ved lave konsentrasjoner, og det ble vist å være overlegen i forhold til andre PS i form av vevspenetrasjon 9, 10. Den lette absorpsjonsspektrum (figur 1 B) viser to fremtredende topper, en ved 417 nm og en andre ved 652 nm, som brukes for vev lokalisering av samler PS og for PDT induksjon, henholdsvis.

Foreløpig en liposomal formulering for mTHPC er under utvikling. Her beskriver vi fremgangsmåter for å kvantifisere binding av denne liposomal formulering, og for å utføre PDT i to humane OS-cellelinjer, og den lave metastatisk HOS og den høye 143b metastatiske celler. Noen av de data som presenteres her har blitt rapportert tidligere 11. The tilnærming beskrevet her gjør oss i stand til å studere effekten av en metastatisk fenotype på PDT effekt. 143b celler, orthotopically injiseres i baklemmene av immunmangel SCID mus forårsake intratibial metastasizing primære svulster, en modell tett etterligne menneskelige metastasizing sykdom. Således er foreslått in vitro eksperimenter er perfekt egnet for å vurdere de optimale PDT innstillinger som skal senere brukt i in vivo eksperimenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Sammenligning av opptak av mTHPC i de respektive lav og svært metastatisk HOS og 143B OS Cell Lines

  1. Forbered cellekulturmedium inneholdende DMEM, Ham F12, og varme-inaktivert føtalt kalveserum, i et forhold 4.5:4.5:1.
    Merk: liposomal formulering av PS mTHPC ble oppløst i vann ved en endelig konsentrasjon på 1,5 mg / ml mTHPC.
  2. Plate 0,2 x 10 6 HOS og 143B celler / brønn i 6-brønn plater (triplicates for hver tilstand) og la cellene holder seg over natten.
    Merk: antallet må justeres til enkelte cellelinjer. En konfluens over 80-90% er mest egnet ved tidspunktet for forsøket.
  3. På den følgende dag, inkuberes cellene med en fastlagt konsentrasjon av mTHPC for forskjellige tidsperioder (tidsavhengig opptak) eller med økende konsentrasjoner av mTHPC under en fast tidsperiode (doseavhengig opptak).
  4. Inkuber cellene med mTHPC for bestemt tid points eller konsentrasjoner av mTHPC.
    Merk: I denne studien ble både HOS og 143B cellelinjer inkubert med 0,6 mikrogram / ml mTHPC for 0, 2,5, 5, eller 10 timer, eller med 0, 0,6, 2,5, og 10 mikrogram / ml mTHPC for 5 hr. De anvendte tidsperioder og doseringer kan variere avhengig av den cellelinjen som benyttes.
  5. Husk å alltid jobbe i mørket eller i nedtonet lysforhold for å unngå direkte eksponering lys av cellene.
  6. Etter inkubering av cellene ved de angitte betingelsene, aspirere mediet, og cellene vaskes tre ganger med PBS. Deretter løsner cellene med 0,5 ml trypsin / EDTA og telle cellene.
  7. Etter løsgjøring, sentrifuger cellene ved 400 x g i 5 min, aspirere mediet og resuspender cellene i PBS til en endelig tetthet på 200.000 celler / ml.
  8. Pipetter 100 pl av den oppnådde cellesuspensjonen (dvs. 20,000 celler) i en 96-brønns plate og måler fluorescensen av disse cellene i et fluorescens-spektrofotometer. Innstillingens for mTHPC fluorescens målinger er: 417 nm for eksitasjon og 652 nm for utslipp.
  9. For å beregne mengden av internalisert mTHPC per celle, normalisere den relative fluorescens-enhet (RFU) for det cellenummer og cellevolum som følger:
  10. Forbered en standardkurve ved hjelp av ulike konsentrasjoner av mTHPC i PBS 0-4 mikrogram / ml (bruk tredoble målinger). Pipetter 100 ul av hver fortynning i en 96-brønns plate og måle fluorescensen av brønnene ved hjelp av innstillingene som beskrevet under trinn 1.6.
  11. Fordel RFU (erholdt etter 20 000 celler) av skråningen av den lineære standardkurven for mTHPC, som gir konsentrasjonen av mTHPC (i ug / ml) i brønnen.
  12. Fordel denne mTHPC konsentrasjon ved 10 for å få den totale mengden av mTHPC i en brønn (i ug, som representerer 100 ul av cellesuspensjonen), og dele denne verdi av volumet av 20 000 celler.
  13. Beregn volum med formelen for en kule: (4/3 x π) xr tre. Skaff radien r ved å måle diameteren på 20 trypsinisert celler under et mikroskop, og dividere denne verdi med 2.
  14. Til slutt, normalisere alle verdiene til de som ble oppnådd for HOS-celler etter 10 timers inkubasjon (doseavhengig opptak) eller behandlet med 10 ug / ml mTHPC (tidsavhengig opptak), som ble satt til 100%.

2. Måling av Fototoksisitet av PS In Vitro

  1. Seed 3000 celler / brønn i en 96-brønns plate (triplicates for hver konsentrasjon av mTHPC brukes), og la dem følge over natten. På samme måte fremstille en ytterligere 96-brønns plate og behandle cellene, som beskrevet nedenfor, men deretter sette dem til side for fasekontrastavbildning.
    Merk: antallet må justeres for hver enkelt cellelinje. En konfluens på 50-60% ved tidspunktet for forsøket er ideelt.
    1. Husk å legge den tilsvarende mørk toksisitet kontroll av celler for hver av de mTHPC konsentrasjoner. Dense er celler som vil bli inkubert i fravær eller nærvær av utvalgte konsentrasjoner av mTHPC, men vil ikke bli belyst.
  2. På den følgende dag, inkuberes cellene med forskjellige konsentrasjoner av mTHPC (0, 0,0001, 0,001, 0,01, 0,03, 0,075, 0,15, 0,3, 0,6, 1,25, 2,5, 5 og 10 pg / ml) avhengig av cellelinjer og holde dem i mørke i 5 timer.
    1. Se avsnitt 1.3.2
      Merk: inkubasjonstid før belysningen er avhengig av cellelinjen, og på den PS anvendes, det er derfor tilrådelig å teste forskjellige konsentrasjoner og forskjellige tidspunkt i separate eksperimenter.
  3. Etter inkubasjon i den indikerte tidsperiode, vaskes cellene to ganger med PBS og legge nytt friskt medium uten mTHPC.
  4. Lyse av cellene med en 652 nm laser diode, som er spesifikke for mTHPC absorpsjonsspektrum (se Fig. 1).
    1. Sett laser til 21.88 mW / cm 2 makt i en høyde på 13,5 cm distance fra cellene, for å oppnå en energi-dose på 5 J / cm 2. Belyse cellene for 230 sek. Ikke belyse de mørke toksisitet kontrollceller (med og uten mTHPC).
      Merk: Bruk alltid briller for å beskytte øynene mot laserlys brukes til magnetisering av PS.
  5. Etter belysning, holde cellene i mørket ved 37 ° C i 24 timer. Deretter legger vannløselig tetrazolium (WST-1) reagens (10 μl/100 ul av medium).
  6. Tre timer etter tilsetningen av WST-1-reagens, å måle absorbansen av individuelle brønner i 96-brønns plate ved 415 nm.
  7. For å beregne hvor stor andel av overlevende celler, satt gjennomsnittet av verdiene oppnådd for ikke mTHPC behandlet celler for hver tilstand til 100% (dvs. opplyst, uten mTHPC og nonilluminated, uten mTHPC).

Tre. Estimering av Cell Number Cell Counting

  1. Seed 20000 celler / vill i en 24-brønns plate og la dem følge over natten.
  2. Inkuber cellene i 5 timer med mTHPC (0.001, 0.003, 0.15, 0.6 og 1.25 pg / ml) og belyse dem som beskrevet ovenfor.
  3. Samle medium, vaskes cellene en gang med PBS, trypsinize dem og samle dem ved sentrifugering ved 400 x g i 5 min.
  4. Etter sentrifugering aspirere mediet og resuspender cellene i 200 pl friskt medium.
  5. Telle celler i en Neubauer kammer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Med de her rapportert teknikker, undersøkte vi mTHPC-baserte PDT i menneskelige OS celler. Først ble den tid og doseavhengig opptak av mTHPC undersøkt i den lave metastatisk HOS og i de høyt metastatisk 143B OS-cellelinjer. mTHPC opptak kan vurderes ved å måle fluorescensen av mTHPC med et fluorescens spektrofotometer (figur 2, reproduseres med tillatelse fra Reidy et al. 11). Figur 2A illustrerer opptak av mTHPC på en tidsavhengig måte. Fluorescens-intensiteten av cellesuspensjonen representerer de intracellulære nivåer av mTHPC. Figur 2B illustrerer den doseavhengige mTHPC uptake in HOS og 143b celler etter 5 timers inkubering. Opptaket i høy metastatisk cellelinje 143B tenderte til å være høyere enn den lave metastatisk HOS foreldrecellelinje.

Mørk og fototoksisitet av mTHPC i 143b celler ble undersøkt ved å bestemme celle metabolic-aktivitet (med en WST-1-analysen), og ved telling av antallet av gjenværende celler etter 5 timers inkubering med mTHPC, følgende inkubering i mørket eller behandling med laserlys ved 230 sek og ytterligere inkubasjon i 24 timer i mørket.

Doseavhengig mørk toksisitet er vist i figur 3 (gjengitt med tillatelse fra Reidy et al. 11). I figur 3A, ble det 143b celler ble behandlet med forskjellige doser mTHPC og sammenlignet med ubehandlede celler. En doseavhengig reduksjon av celletallet og metabolsk aktivitet ble observert. Redusert celle levedyktighet ble anerkjent på en mTHPC konsentrasjon og høyere enn 2,5 mg / ml. Dose avhengig fototoksisitet av mTHPC er illustrert i figur 3B. Celler ble behandlet med forskjellige doser mTHPC og med etterfølgende belysning (5 J / cm 2). En følge reduksjon i celle metabolsk aktivitet (målt med WST-analyse), så vel som en nedgang i celle number ble observert. Den resulterende reduksjon av celleantallet etter at PDT blir visualisert i figur 4..

Figur 1
Figur 1. Kjemisk struktur av mTHPC (A) og lysabsorpsjon spektrum (B). Tall ble levert av BIOLITEC Forskning GmbH. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Fig. 2
Figur 2. Tid og doseavhengig opptak av mTHPC av de menneskelige OS cellelinjer HOS og 143b. (A). HOS (i gre y) og 143B (i sort) ble sådd i 6-brønns plater (0,2 x 20 6 celler / brønn). Etter dyrkning over natten ble cellene inkubert med 0,6 ug / ml mTHPC for 0, 2.5, 5, 7.5, og 10 t (B), eller i 5 timer med 0, 0,6, 2,5 og 10 pg / ml mTHPC (B) . Fluorescensintensitet ble bestemt ved å måle fluorescensen av 20000 celler på 652 nm ved eksitasjon ved 417 nm. Verdier ble normalisert til den beregnede cellevolumet og den mTHPC opptak av HOS-celler ved 10 timer (A) eller etter inkubering med 10 mikrogram / ​​ml (B) ble satt til 100%. Verdier er gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter. Tilpasset fra Reidy et al. 11 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

les/ftp_upload/51213/51213fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51213/51213fig3.jpg "/>
Figur 3. Mørk og fototoksisitet av mTHPC i 143b celler. Celler ble sådd og dyrket over natten før behandling. For å bestemme mTHPC doseavhengig mørk toksisitet ble 143b celler inkubert i 5 timer i mørke i fravær eller nærvær av angitte mTHPC konsentrasjoner (A). For å bestemme mTHPC doseavhengig fototoksisitet, 143b ble cellene inkubert med eller uten mTHPC i 5 timer ved indikerte konsentrasjoner og deretter belyst med 5 J / cm 2 med en kraft av 21,88 mW / cm 2 til 230 sek (B). For målinger av metabolsk aktivitet (●) med WST-1-analyse ble 143b celler utsådd i 96-brønns plater ved en densitet på 3000 celler / brønn. Cell tallene (○) ble talt fra celler seeded på 20.000 celler / brønn i 24-brønners plater. Verdier er gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter. Tilpasset frOM Reidy et al 11. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Bilder fasekontrast av 143B-celler før og etter PDT. Ble cellene sådd og venstre for å overholde over natten som beskrevet i protokollen. For å visualisere doseavhengig, mTHPC mediert lyse toksisitet ble 143b celler inkubert i 5 timer i mørke med 0, 0,6, 2,5 og 10 pg / ml mTHPC (panelene AD, henholdsvis). Cellene ble deretter belyst med 5 J / cm 2 lys av 652 nm bølgelengde på 230 sek, og fotografert etter 24 timer. Målestokk:. 100 mikrometer Plletthet klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For å oppnå optimal cytotoksisitet i respons til PDT, er det viktig å velge de riktige laser lysinnstillinger og inkubasjonstidene. De her beskrevne prosedyrer er konsekvent og effektivt å bestemme PS opptak og å kvantifisere PDT indusert cytotoksisitet in vitro. Ved hjelp av de spesielle bølgelengder av absorpsjons-PS mTHPC, kan den cellulære PS opptak bestemmes på en direkte måte, og PS kan aktiveres for å generere cytotoksiske reaktive oksygenarter.

Ved hjelp av denne in vitro oppsett, kan alle parametere som PS konsentrasjon, narkotika lys intervall og laserlys intensitet enkelt justeres til egenskapene til PS og cellelinjer som brukes. Legemer gir en direkte lest ut av overlevende celler festet, som sammen med WST-1-assay (overvåking metabolsk aktivitet) gir et godt estimat for celleoverlevelse. Imidlertid kan det presenteres metoden kun modellere "første hit", dvs. cellen toksisitetav reaktive oksygenarter umiddelbart etter aktivering av PS. Den in vivo observert følgende vasokonstriksjon og aktivering av immunsystemet, som er nødvendig for fullstendig tumor utrydding, kan bare bli undersøkt i dyr.

Figur 2 vist en tid og doseavhengig opptak av mTHPC til et høyere nivå i den svært metastatisk 143B enn i dets paren lavt metastatisk HOS cellelinje. Mørk toksisitet av mTHPC in 143b OS-cellene ble observert etter inkubasjon i 5 timer kun ved høye konsentrasjoner (figur 3). 143b cellene vise en høy følsomhet for PDT, vist av mTHPC og lys doseavhengige fototoksisk effekt. En fototoksiske effekt ble observert allerede på et mTHPC konsentrasjon så lav som 0,075 mikrogram / ​​ml, og en halv maksimal letal konsentrasjon på 0,022 ± 0,006 ug / ml ble det observert (figur 3).

Selv PDT er minimal invasiv og effektiv mot mange tumortypes, kan mindre bivirkninger oppstå ved bruk av teknikken i pasienter (f.eks. hevelse, erytem). Dette indikerer at PS er ikke bare opptas av tumorceller, som vist her, men også ved nontumor celler, forårsaker toksisitet etter PDT også i disse cellene. Triesscheijn et al. Var i stand til å vise en økt lysfølsomhet av tumorceller sammenlignet med humane fibroblaster. I kontrast, humane mikrovaskulære endotelceller viste et høyere opptak av mTHPC enn de andre testede cellelinjer, noe som førte til en høy lysfølsomhet 12.. Disse funnene også korrelerer med PDT tilhørende anti vaskulære effekter, som er hyppig observert to.

De beskrevne metoder kan også benyttes for andre PS. Inkubasjonstid og laser lysintensitet må være tilpasset egenskapene til PS. I tillegg kan PDT også bli indusert på andre måter enn OS-cellene, siden bare innstillingene er cellelinje avhengig av, men ikke selve metoden. Som ekstra rEAD outs, kan celledød mekanismer analyseres, f.eks. av Western Blot analyse av proteiner involvert i apoptose, nekrose eller autofagi. Også den subcellulære lokalisering av PS kan visualiseres f.eks ved konfokal laser scanning mikroskopi.

De forskjellige trinn som er blitt beskrevet for PDT in vitro, dvs. inkubering av cellene med PS og induksjon av PDT med laserlys, ligner den kliniske situasjon. Pasientene mottar (iv eller sc. Brukt) PS, og etter en distinkt narkotika lys intervall, området av interesse (f.eks. Svulstvev) er belyst med laserlys 13. Selv om det ennå ikke er anvendt i OS, dets potensielle fordeler er åpenbare; PDT er ansett å være spesielt attraktiv for intraoperativ behandling av tumor satellitter, som ofte vokser som primær tumorcelleklynger nær hoved kant av den primære tumor og kan igangsette en gjentakelse når savnet under surgical reseksjon av den primære tumor. Selv store benaktige tumorer kan behandles med denne teknikken. Dette har blitt vist ved en lovende studie på hunder 14. I tillegg utryddelse av tumorceller som ikke kan resected etter kirurgi (for eksempel flere metastaser for det meste forekommer i lungene), kan også representere en mulig fremtidig bruk av PDT hos pasienter med metastatisk sykdom OS.

Det er viktig å bemerke at, ved utføring av forsøkene, bør man sørge for at alle arbeidstrinnene utføres under eksponering minimal lys etter tilsetting av PS i de celler, som normalt dagslys inneholder også bølgelengden nødvendig for å aktivere mTHPC. Likeledes, for in vivo søknad i prekliniske modeller, trenger omsorg for å bli tatt for å skjerme dyrene fra direkte lys etter injisering mTHPC. Det må også bemerkes at WST-1-analysen kun vurderer den metabolske aktiviteten til tumor-celler, som er en indirekte indikasjon på celledød. Derfor, En blanding med et totalt celletall, som er presentert her, er anbefalt.

Konklusjonen er at kombinasjonen av de beskrevne metoder (PS-opptak og PDT-indusert celletoksisitet) gir en rask og kostnadseffektiv fremgangsmåte for å karakterisere toksisitet egenskapene til en PS in vitro. Med disse in vitro-resultater, kan omfanget av den optimale lysintensitet og stoffet lys intervall beregnes, noe som gir en god indikasjon på hvor PDT kan bli anvendt in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser eller interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å takke BIOLITEC Forskning GmbH (Jena, Tyskland) for vennlig å gi oss med liposomal mTHPC formulering, med spesiell takk til Susanna Grafe og Arno Wiehe for deres hjelp og teknisk ekspertise. Vi vil også gjerne takke Kerstin Reidy, som genererte en stor del av resultatene og var coresponsible for revidering 11.

Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Schweizerischer Verein Balgrist, University of Zurich, den Krebsliga Zürich samt av en bevilgning fra Walter L. og Johanna Wolf Foundation, Zürich, Sveits og et stipend fra EuroNanoMed ERA-NET / SNF Swiss National Science Foundation 31NM30-131004/1. Dette arbeidet ble også støttet av HSM (høyspesialisert medisin) program for Muskel Oncology Kanton Zürich.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM PAA GmbH, Freiburg, Germany E15-883
HAM F12 PAA GmbH, Freiburg, Germany E15-817
Heat-inactivated fetal calf serum GIBCO, Basel, Switzerland 10500-064
mTHPC biolitec Research GmbH, Jena, Germany As this liposomal formulation is originating from R&D
no catalogue number is available at the moment. Stock: 1.5 mg/ml; provided in a 9:1 mixture of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) and dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG; >99% purity)
Spectramax Gemini XS plate reader Molecular Devices, Sunnyvale, CA ID# 861
Microscope Zeiss Observer.Z1 Axio Observer, Axio Vision Release 4.6.3 SP1, Jena Germany
Ceralas PDT 652 nm Laser biolitec AG, Jena, Germany LD652nm2W400u
Water-soluble tetrazolium (WST) reagent Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Switzerland 1644807

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Juarranz, A., Jaen, P., Sanz-Rodriguez, F., Cuevas, J., Gonzalez, S. Photodynamic therapy of cancer. Basic principles and applications. Clin. Transl. Oncol. 10, 148-154 (2008).
  2. Agostinis, P., et al. Photodynamic therapy of cancer: an update. CA Cancer. 61, 250-281 (2011).
  3. D'Adamo, D. R. Appraising the current role of chemotherapy for the treatment of sarcoma. Semin. Oncol. 38 Suppl 3, 19-29 (2011).
  4. Allison, D. C., et al. A meta-analysis of osteosarcoma outcomes in the modern medical era. Sarcoma. , (2012).
  5. Anninga, J. K., et al. Chemotherapeutic adjuvant treatment for osteosarcoma: where do we stand. Eur. J. Cancer. 47, 2431-2445 (2011).
  6. Bacci, G., et al. Pattern of relapse in patients with osteosarcoma of the extremities treated with neoadjuvant chemotherapy. Eur. J. Cancer. 37, 32-38 (2001).
  7. Briccoli, A., et al. Resection of recurrent pulmonary metastases in patients with osteosarcoma. Cancer. 104, 1721-1725 (2005).
  8. Milla Sanabria, L., et al. Direct and indirect photodynamic therapy effects on the cellular and molecular components of the tumor microenvironment. Biochim. Biophys. Acta. 1835, 36-45 (2013).
  9. Mitra, S., Foster, T. H. Photophysical parameters, photosensitizer retention and tissue optical properties completely account for the higher photodynamic efficacy of meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin vs Photofrin. Photochem. Photobiol. 81, 849-859 (2005).
  10. Ma, L., Moan, J., Berg, K. Evaluation of a new photosensitizer, meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin, for use in photodynamic therapy: a comparison of its photobiological properties with those of two other photosensitizers. Int. J. Cancer. 57, 883-888 (1994).
  11. Reidy, K., Campanile, C., Muff, R., Born, W., Fuchs, B. mTHPC-mediated photodynamic therapy is effective in the metastatic human 143B osteosarcoma cells. Photochem. Photobiol. 88, 721-727 (2012).
  12. Triesscheijn, M., Ruevekamp, M., Aalders, M., Baas, P., Stewart, F. A. Comparative sensitivity of microvascular endothelial cells, fibroblasts and tumor cells after in vitro photodynamic therapy with meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin. Photochem. Photobiol. 80, 236-241 (2004).
  13. Triesscheijn, M., Baas, P., Schellens, J. H., Stewart, F. A. Photodynamic therapy in oncology. Oncologist. 11, 1034-1044 (2006).
  14. Burch, S., et al. Treatment of canine osseous tumors with photodynamic therapy: a pilot study. Clin. Orthop. Relat. Res. 467, 1028-1034 (2009).

Tags

Medisin fotodynamisk terapi (PDT) 5,10,15,20-tetrakis (meta-hydroxyphenyl) chlorin (mTHPC) fototoksisitet mørk-toksisitet osteosarkom (OS) photosensitizer
Cytotoksiske Effekt av fotodynamisk terapi i Osteosarkom celler<em&gt; In Vitro</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Meier, D., Campanile, C., Botter, S. … More

Meier, D., Campanile, C., Botter, S. M., Born, W., Fuchs, B. Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (85), e51213, doi:10.3791/51213 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter