Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Цитотоксическая Эффективность фотодинамической терапии в клетках остеосаркомы Published: March 18, 2014 doi: 10.3791/51213
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Laboratory for Orthopedic Research, Balgrist University Hospital, Zurich, Switzerland
* These authors contributed equally

Summary

Протокол сообщил здесь позволяет оценка эффективности фотодинамической терапии (PDT) в клеточных линиях и оптимизации настроек PDT перед нанесением терапии на животных моделях.

Abstract

В последние годы наблюдается трудность в нахождении более эффективные терапии против рака с меньшим количеством системных побочных эффектов. Поэтому фотодинамическая терапия является подход роман для более опухоли селективной очистки.

Фотодинамическая терапия (PDT), что делает использование нетоксичного фотосенсибилизатора (PS), который, при активации светом определенной длины волны в присутствии кислорода, генерирует радикалы кислорода, которые вызывают цитотоксический ответ 1. Несмотря на утверждения почти двадцать лет назад FDA, PDT ныне используется только для лечения ограниченное количество типов рака (кожи, мочевого пузыря) и nononcological заболеваний (псориаз, старческий кератоз) 2.

Основное преимущество использования ФДТ является возможность выполнить местное лечение, которое предотвращает системные побочные эффекты. Кроме того, она позволяет лечение опухолей в деликатных участках (например вокруг нервов или кровеносных сосудов). Здесь intraoperatПриложение ив ФДТ рассматривается в остеосаркома (ОС), опухоль кости, целевой первичных спутников опухолевые остались в опухоли окружающие ткани после хирургического удаления опухоли. Лечение направлено на уменьшение количества рецидивов и на снижение риска для (послеоперационном) метастазов.

В настоящем исследовании мы представляем в пробирке процедуры PDT установить оптимальные настройки PDT для эффективного лечения широко используемых клеточных линий ОС, которые используются для воспроизведения заболевания человека в хорошо зарекомендовавших себя intratibial моделей ОС мыши. Поглощение ПС mTHPC был рассмотрен с помощью спектрофотометра и фототоксичность был спровоцирован лазерным светом возбуждения mTHPC на 652 нм, чтобы вызвать гибель клеток оценена с WST-1 анализа и подсчета выживших клеток. Установленные методы позволяют определить оптимальные настройки PDT для будущих исследований на животных моделях. Они легко и быстро инструментом для оценки эффективности PDT в естественных условиях.

Introduction

Сегодняшнее состояние лечения искусства остеосаркомы (ОС), первичная опухоль кости, охватывает комбинацию нео адъювантной химиотерапии и хирургии. Это схема лечения выявлено увеличение выживаемости пациентов с локализованным заболеванием от примерно 20% до использования химиотерапии, чтобы в настоящее время между 60-70% 3, 4. Тем не менее, в последние два десятилетия, общая выживаемость больных ОС с местным заболевания плато 4, 5. Кроме того, 30-40% этих пациентов рецидив в течение 3 лет после постановки диагноза и пациентов с метастазами по-прежнему имеют плохую выживание 20-30% 4, 6, 7. Чтобы улучшить результат этих пациентов, новые терапевтические стратегии должны быть разработаны.

Фотодинамическая терапия (PDT), а роман противоопухолевая терапия, использует свет определенной длины волны для возбуждения PhotosensiТизер (PS), который накапливается в опухолевых клетках после его инъекции в кровоток. Лазерный свет возбуждения генерирует PS кислородных радикалов в присутствии кислорода, которые вызывают цитотоксическую реакцию в опухолевых клеток и гибели клеток. Кроме этого основного механизма, два дополнительных PDT вызвали биологические процессы способствовать уменьшению роста опухоли: PDT вызывает сужение сосудов и образование тромбов в микроциркуляторном опухоли и, следовательно местные гипоксию и аноксию внутри опухоли, что приводит к опухоли миокарда. Наконец, PDT ранены и умирают клетки опухоли вызвать локальный иммунный ответ, довольно уникальную особенность PDT. Это включает в себя систему комплемента и активацию антиген-представляющих дендритных клеток 8. Таким образом, создаются условия для презентации опухолевых антигенов с последующей активацией лимфоидных клеток, что приводит к опухоли специфического иммунитета.

До сих пор, PDT был использован для лечения нескольких типов опухолей мягких тканей и hyperplАзии, таких как светочувствительный кератоз, пищевода Барретта, эндобронхиальных опухолей, рака мочевого пузыря, рака базальных клеток, и паллиативного лечения рака головы и шеи 2. Лечение, как известно, индуцируют некроз, местный крупномасштабное с только небольшими побочными эффектами, и, таким образом, имеет потенциал, чтобы выборочно искоренить опухолевой ткани. Несмотря на эти преимущества, применение ФДТ остается технически более сложным, чем введения химиотерапевтических препаратов. Для достижения максимальной эффективности, концентрацию PS, время воздействия света и общую передачу световой энергии должны быть оптимизированы. Это может быть сделано в естественных экспериментов в, но, из-за относительного большого числа параметров, которые должны быть оптимизированы, он является более эффективным для первоначально определить оптимальные условия в пробирке.

В экспериментах, описанных ниже, мы протестировали эффективность в пробирке ФДТ с использованием PS 5,10,15,20-тетракис (мета-гидроксифенил) CHLОрин, сокращенно mTHPC (рис. 1А). mTHPC является действующим веществом в лекарственного средства Foscan, который в настоящее время используется в клинике для паллиативного лечения рака головы и шеи. Это один из самых мощных ПС, вызывая массовые повреждения клеток уже при низких концентрациях, и было показано, что превосходит другой ПС с точки зрения проникновения в ткани 9, 10. Его поглощения светового спектра (рис. 1В) показаны два выраженные пики, по одному 417 нм и второй на 652 нм, которые используются для тканевой локализации накопления PS и для индукции PDT, соответственно.

В настоящее время, липосомальный формулировка для mTHPC находится в стадии разработки. Здесь мы описываем процедуры количественной оценки поглощение этого липосомного препарата и выполнять PDT в две линии ОС клеток человека; низкую метастатического HOS и высокие метастатические клетки 143b. Некоторые из приведенных данных были сообщалось ранее 11. Чтэ Описанный здесь подход позволяет изучать эффект метастатического фенотипа на PDT эффективности. 143B клетки, ортотопически вводится в задних конечностей иммунодефицитных SCID мышей вызвать intratibial метастазирования первичной опухоли, модель тесно имитируя человеческую болезнь метастазирования. Таким образом, эксперименты, предложенные в пробирке прекрасно подходят для оценки оптимальные настройки PDT быть позже использованы в естественных экспериментов в.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Сравнение поглощения mTHPC в соответствующих Лоу и высокой метастатической поиска предметов и 143B ОС клеточных линий

  1. Подготовить среду для культивирования клеток, содержащей DMEM, ветчина F12 и тепла инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки в соотношении 4.5:4.5:1.
    Примечание: липосомной форме ПС mTHPC растворяли в воде при конечной концентрации 1,5 мг / мл mTHPC.
  2. Пластина 0,2 × 10 6 HOS и 143b клеток / лунку в 6-луночных планшетах (трех повторах для каждого условия), и пусть клетки придерживаться в течение ночи.
    Примечание: число должен быть отрегулирован на отдельные клеточные линии. Сплошности 80-90% является наиболее подходящим в момент эксперимента.
  3. На следующий день, инкубировать клетки с фиксированной концентрации mTHPC в течение различных периодов времени (время зависимое поглощение), либо с увеличением концентраций mTHPC в течение фиксированного периода времени (в зависимости от дозы поглощения).
  4. Инкубируйте клетки с mTHPC для конкретного времени рoints или концентрация mTHPC.
    Примечание: В этом исследовании, как HOS и клеточные линии 143b инкубировали с 0,6 мкг / мл для mTHPC 0, 2,5, 5 или 10 ч, или с 0, 0,6, 2,5 и 10 мкг / мл mTHPC в течение 5 час. Используемые периоды времени и дозировки могут изменяться в зависимости от клеточной линии, которая используется.
  5. Помните всегда работать в темноте или в условиях приглушенного света, чтобы избежать прямого воздействия света клеток.
  6. После инкубации клеток в указанных условиях, аспирации среды и промыть клетки три раза PBS. Затем отделить клетки с 0,5 мл трипсина / ЭДТА и считать клетки.
  7. После отрыва, центрифуге клетки при 400 мкг в течение 5 мин, аспирации среды и ресуспендирования клеток в PBS до конечной концентрации 200000 клеток / мл.
  8. Пипетка 100 мкл полученной суспензии клеток (т.е. 20000 клеток) в 96-луночный планшет и измеряют флуоресценцию этих клеток в флуоресцентном спектрофотометре. Установкас для флуоресцентных измерений mTHPC являются: 417 нм для возбуждения и 652 нм для излучения.
  9. Для того чтобы вычислить количество интернализованной mTHPC на клетку, нормализуют относительно блока флуоресценции (RFU) на количество клеток и клеточного объема следующим образом:
  10. Подготовка стандартную кривую с использованием различных концентраций mTHPC в ФБР от 0-4 мкг / мл (измерений использование трех экземплярах). Вносят по 100 мкл каждого разбавления в 96-луночный планшет и измеряют флуоресценцию в лунках с помощью параметров, описанных в шаге 1.6.
  11. Разделите РФС (полученный на 20000 клеток) по наклону линейного стандартной кривой mTHPC, что дает концентрацию mTHPC (в мкг / мл) в скважине.
  12. Разделите эту концентрацию mTHPC на 10, чтобы получить общее количество mTHPC в одной скважине (в мкг, что составляет 100 мкл клеточной суспензии) и разделить эту величину на объем 20 000 клеток.
  13. Рассчитайте объем с формулой для сферы: (4/3 х π) хR 3. Получение радиус г, измеряя диаметр 20 трипсином клетки под микроскопом, и деления этого значения на 2.
  14. Наконец, нормализовать все значения с результатами, полученными для HOS клеток после 10 ч инкубации (дозозависимое поглощение) или обрабатывали 10 мкг / мл mTHPC (время зависимое поглощение), в котором были установлены на 100%.

2. Измерение фототоксичность PS в пробирке

  1. Seed 3000 клеток / лунку в 96-луночный планшет (трех повторах для каждой концентрации использовали mTHPC) и позволить им следовать в течение ночи. Аналогично подготовить дополнительный пластину 96-а и лечить клетки, как описано ниже, но затем положить их в сторону для контрастного изображения фаз.
    Примечание: количество должно быть отрегулировано для каждого отдельного клеточной линии. Конфлюентности 50-60% во время эксперимента идеально подходит.
    1. Следует помнить, чтобы добавить соответствующее темное контроль токсичности клеток для каждой из концентраций mTHPC.себе являются клетки, которые будут инкубировали в отсутствие или в присутствии выбранных концентраций mTHPC, но не будут гореть.
  2. На следующий день, инкубировать клетки с различными концентрациями mTHPC (0, 0,0001, 0,001, 0,01, 0,03, 0,075, 0,15, 0,3, 0,6, 1,25, 2,5, 5, и 10 мкг / мл) в зависимости от клеточных линий и держать их в темноте в течение 5 часов.
    1. См. раздел 1.3.2
      Примечание: Время инкубации до освещенность зависит от клеточной линии и на ПС, используемого, поэтому желательно, чтобы проверить различные концентрации и различные моменты времени в отдельных экспериментах.
  3. После инкубации в течение указанного периода времени, промыть клетки дважды PBS и добавить новый свежую среду без mTHPC.
  4. Освещать клеток с диодного лазера 652 нм, удельной для спектра поглощения mTHPC (см. Рисунок 1).
    1. Установите лазер для 21,88 мВт / см 2 степени на высоте 13,5 см DistaNCE из клеток, с тем чтобы получить энергетическую дозу 5 Дж / ​​см 2. Освещать клетки для 230 сек. Не осветить темные клетки контроля токсичности (с и без mTHPC).
      Примечание: Всегда носите очки для защиты глаз от лазерного света, используемого для возбуждения PS.
  5. После освещения, сохранить клетки в темноте при 37 º C в течение 24 часов. Впоследствии добавить водорастворимый тетразолия (WST-1) Реагент (10 мкл μl/100 среды).
  6. Через три часа после добавления WST-1 реагентом, измеряют поглощение в отдельные лунки 96-луночного планшета при 415 нм.
  7. Для того чтобы вычислить процент выживших клеток, установить среднее значение величин, полученных для не mTHPC обработанных клетках для каждого условия до 100% (то есть освещение, без mTHPC и nonilluminated, без mTHPC).

3. Оценка сотового телефона на сотовый Подсчет

  1. Семенной 20000 клеток / мыLL в 24-луночный планшет, и пусть они придерживаются в течение ночи.
  2. Инкубируйте клетки в течение 5 ч с mTHPC (0,001, 0,003, 0,15, 0,6, и 1,25 мкг / мл) и освещать их, как описано выше.
  3. Сбор среды, промыть клетки один раз ЗФР, Trypsinize их и собирать их центрифугированием при 400 х г в течение 5 мин.
  4. После центрифугирования аспирации среды и ресуспендирования клеток в 200 мкл свежей среды.
  5. Граф клеток в камере Нойбауэр.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

С здесь сообщенных методов, мы исследовали mTHPC основе PDT в клетках человека OS. Во-первых, время и зависит от дозы поглощение mTHPC была исследована в низком метастатическим поиска предметов и в высокоразвитых метастатических клеточных линий 143B ОС. Поглощение mTHPC может быть оценена путем измерения флуоресценции mTHPC с флуоресцентным спектрофотометром (рис. 2, воспроизведены с разрешения Reidy соавт. 11). Фиг.2А иллюстрирует поглощение mTHPC в зависящей от времени образом. Интенсивность флуоресценции суспензии клеток представляет собой внутриклеточные уровни mTHPC. Фиг.2В иллюстрирует зависимое от дозы поглощение mTHPC в HOS и 143b клеток после 5 ч инкубации. Поглощение в высокой метастатической клеточной линии 143b тенденцию быть выше, чем в нижней родительской линии метастатического HOS клеток.

Темный и фототоксичность mTHPC в 143B клеток оценивали путем определения клеточного Metaboliс активностью (с WST-1 анализе) и путем подсчета количества остаточных клеток после 5 ч инкубации с mTHPC, последующей инкубации в темноте или лечения лазерным светом на 230 сек и дальнейшей инкубации в течение 24 ч в темноте.

Доза зависит темно токсичность показано на рисунке 3 (воспроизводится с разрешения Reidy др.. 11). В фигуре 3А, 143В клетки обрабатывали различными дозами и mTHPC сравнению с необработанными клетками. Наблюдалось дозозависимое снижение числа клеток и метаболической активности. Жизнеспособность Снижение клеток был признан при концентрации mTHPC равного и выше, чем 2,5 мкг / мл. Доза зависит фототоксичность mTHPC, изображенная на рис 3B. Клетки обрабатывали различными дозами mTHPC и с последующим освещения (5 Дж / ​​см 2). Косвенные снижение активности клеточного метаболизма (измерена с WST анализа), а также к уменьшению клеточного NUMBER наблюдалось. В результате уменьшение количества клеток после применения ФДТ визуализируется на рисунке 4.

Рисунок 1
Рисунок 1. Химическая структура mTHPC (а) и спектр поглощения света (B). Цифры были предоставлены Biolitec исследовательского GmbH. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2. Время и доза зависимое поглощение mTHPC по ОС клеточных линий человека HOS и 143B. (А). ХОС (в GRE у) и 143B (в черном) высевали в 6-луночные планшеты (0,2 х 20 6 клеток / лунку). После ночного культивировани клетки инкубировали с 0,6 мкг / мл для mTHPC 0, 2,5, 5, 7,5 и 10 час (а), или в течение 5 часов с 0, 0,6, 2,5 и 10 мкг / мл mTHPC (B) . Интенсивность флуоресценции определяли путем измерения флуоресценции 20000 клеток на 652 нм при возбуждении на 417 нм. Значения были нормализованы к объему расчетной клеток и поглощение mTHPC из HOS клеток на 10 час (А) или после инкубации с 10 мкг / мл (B) был установлен на 100%. Значения представляют собой среднее ± SEM из трех независимых экспериментов. По материалам Reidy др. 11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

les/ftp_upload/51213/51213fig3highres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/51213/51213fig3.jpg "/>
Рисунок 3. Темный и фототоксичность mTHPC в 143B клеток. Клетки высевали и выращивали в течение ночи до начала лечения. Для определения дозы mTHPC зависимой темно токсичность, 143B клетки инкубировали в течение 5 часов в темноте в отсутствие или в присутствии указанных концентраций mTHPC (А). Для определения дозы mTHPC зависит просмотром токсичность, 143b клетки инкубировали с или без mTHPC в течение 5 ч при указанных концентрациях и затем освещается 5 Дж / ​​см 2 с мощностью 21,88 мВт / см 2 в течение 230 сек (B). Для измерения метаболической активности (●) с WST-1 анализа, 143b клетки высевали в 96-луночные планшеты при плотности 3000 клеток / лунку. Количество клеток (○) были подсчитаны из клеток, посеянных на 20000 клеток / лунку в 24-луночных планшетах. Значения представляют собой среднее ± SEM из трех независимых экспериментов. Адаптированный птом Reidy др. 11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4. Фазового контраста изображения 143B клеток до и после ФДТ. Клетки высевали и оставили на ночь придерживаться, как описано в протоколе. Для визуализации от дозы, mTHPC опосредованной света токсичность, 143b клетки инкубировали в течение 5 час в темноте с 0, 0,6, 2,5 и 10 мкг / мл mTHPC (панели AD, соответственно). Затем клетки освещении 5 Дж / ​​см 2 свете 652 длине волны 230 нм для сек и сфотографировали после 24 часов. Шкала бар:. 100 мкм Plпростота нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Для достижения оптимального цитотоксичность в ответ на PDT, очень важно выбрать правильные настройки лазерного света и времени инкубации. Описанных здесь процедуры соответствуют и эффективным для определения поглощения PS и количественно PDT индуцированной цитотоксичности в пробирке. Использование конкретных длин волн поглощения ПС mTHPC, клеточное поглощение PS может быть определена в прямом порядке, и PS может быть активирован для генерации цитотоксических активных форм кислорода.

Используя эту установку в пробирке, все параметры, такие как концентрации ПС, препарат света интервала и интенсивности лазерного света можно легко регулировать с характеристиками ПС и клеточные линии используется. Подсчет клеток дает прямое чтение из выживших, прикрепленных клеток, которые вместе с WST-1 анализа (мониторинга метаболической активности) дает хорошую оценку за выживание клеток. Тем не менее, данный способ может только моделировать "первый хит", то есть клеточной токсичностиактивных форм кислорода сразу же после активации PS. В естественных условиях наблюдается последующее сужение сосудов и активацию иммунной системы, необходимой для полного уничтожения опухоли, могут быть исследованы только у животных.

Рисунок 2 продемонстрировали времени и дозы зависимое поглощение mTHPC на более высокий уровень в высоко метастатической 143B, чем в ее родительской линии метастатического низкой HOS клеток. Темный токсичность mTHPC в 143B ОС клеток наблюдалось после инкубации в течение 5 часов только в высоких концентрациях (рис. 3). 143B клетки проявляют высокую чувствительность к PDT, проявленную mTHPC и свет дозозависимое фототоксических эффект. Фототоксический эффект наблюдался уже при концентрации mTHPC как низко как 0,075 мкг / мл, а половина максимальной летальной концентрации от 0,022 ± 0,006 мкг / мл наблюдалось (фиг. 3).

Хотя PDT минимально инвазивных и эффективным против многих типов опухолейс, незначительные побочные эффекты могут возникнуть при применении технику у пациентов (например,. отек, эритема). Это означает, что PS не только рассмотрен опухолевых клеток, как показано здесь, но и неопухолевой клеток, в результате чего токсичность после ФДТ также в этих клетках. Triesscheijn соавт. Смог показать повышенную светочувствительность опухолевых клеток по сравнению с человеческими фибробластами. В противоположность этому, микрососудистых эндотелиальных клеток человека показали более высокую поглощение mTHPC, чем другие протестированных клеточных линий, которые привели к высокой фоточувствительности 12. Эти данные также коррелируют с PDT связанных анти сосудистых эффектов, которые часто наблюдаются 2.

Описанные способы также могут быть применены для других ПС. Время инкубации и интенсивность лазерного света должны быть адаптированы к характеристикам ПС. Кроме того, PDT также могут быть вызваны в кроме ОС клеток, так как только настройки клеточная линия зависит, но не сам метод. В качестве дополнительной гEAD аутов, механизмы клеточной гибели могут быть проанализированы, например. Вестерн-блот-анализа белки, участвующие в апоптозе, некроза или аутофагии. Кроме того, внутриклеточной локализации ПС могут быть визуализированы, например, с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.

Различные этапы, которые были описаны для ФДТ в пробирке, т.е. инкубации клеток с ПС и индукции ФДТ с лазерным светом, напоминают клиническую ситуацию. Пациенты получают (IV или подкожно. Применяется) PS, и после отдельного интервала наркотиков света, область интересов (например. Опухолевой ткани) освещается лазерным светом 13. Хотя еще не применен в ОС, ее потенциальные преимущества очевидны; PDT считается особенно привлекательным для интраоперационной лечении опухолевых спутников, которые часто растут как кластеры первичной опухоли клеток, близких к основной оправе первичной опухоли и может инициировать повторения когда пропущены во время сurgical резекция первичной опухоли. Даже большие костные опухоли можно лечить с помощью этой техники. Это было показано на перспективный исследования у собак 14. Кроме того, уничтожение опухолевых клеток, которые не могут быть резекции хирургическим путем (например, множественные метастазы в основном происходит в легких), также может представлять собой возможного будущего применения ФДТ у пациентов с метастазами OS.

Важно отметить, что при выполнении экспериментов, следует соблюдать осторожность, что все рабочие этапы выполняются при минимальном воздействии света после добавления PS к клеткам, как нормальный дневной свет также содержит длину волны, необходимой для активации mTHPC. Кроме того, для естественных условиях применения в в доклинических моделях, уход должны быть приняты, чтобы оградить животных от прямого света после введения mTHPC. Необходимо также отметить, что WST-1 анализ только оценивает метаболической активности опухолевых клеток, что является косвенным показателем гибели клеток. Поэтому, Сочетание с общего количества клеток, которые были представлены здесь, рекомендуется.

В заключение, сочетание описанных методов (PS-поглощения и PDT-индуцированной клеточной токсичности) обеспечивает быстрый и экономически эффективную процедуру для характеристики токсичностью ФС в пробирке. С этими результатами в пробирке, диапазон оптимального интенсивности света и интервала наркотиков света можно оценить, что дает хорошее представление о том, как PDT может быть применен в естественных условиях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют каких конкурирующих финансовых интересов или конфликта интересов.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить Biolitec Research GmbH (Йена, Германия) за любезно предоставленные нам с формулировкой липосомальный mTHPC, с особой благодарностью Сусанна Grafe и Арно Wiehe за их помощь и технической экспертизы. Мы также хотели бы поблагодарить Керстин Reidy, который генерируется большая часть результатов и был coresponsible для его опубликования 11.

Эта работа была поддержана грантами от Schweizerischer Verein Balgrist, Цюрихском университете, в Krebsliga Цюрихе, а также за счет гранта от Уолтера Л. и Johanna Wolf Foundation, Цюрих, Швейцария и грантом EuroNanoMed ERA-NET / ОЯТ Швейцарии Национальный научный фонд 31NM30-131004/1. Эта работа также была поддержана HSM (узкоспециализированных Медицина) по программам на костно-мышечной онкологии Кантон Цюрих.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM PAA GmbH, Freiburg, Germany E15-883
HAM F12 PAA GmbH, Freiburg, Germany E15-817
Heat-inactivated fetal calf serum GIBCO, Basel, Switzerland 10500-064
mTHPC biolitec Research GmbH, Jena, Germany As this liposomal formulation is originating from R&D
no catalogue number is available at the moment. Stock: 1.5 mg/ml; provided in a 9:1 mixture of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) and dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG; >99% purity)
Spectramax Gemini XS plate reader Molecular Devices, Sunnyvale, CA ID# 861
Microscope Zeiss Observer.Z1 Axio Observer, Axio Vision Release 4.6.3 SP1, Jena Germany
Ceralas PDT 652 nm Laser biolitec AG, Jena, Germany LD652nm2W400u
Water-soluble tetrazolium (WST) reagent Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Switzerland 1644807

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Juarranz, A., Jaen, P., Sanz-Rodriguez, F., Cuevas, J., Gonzalez, S. Photodynamic therapy of cancer. Basic principles and applications. Clin. Transl. Oncol. 10, 148-154 (2008).
  2. Agostinis, P., et al. Photodynamic therapy of cancer: an update. CA Cancer. 61, 250-281 (2011).
  3. D'Adamo, D. R. Appraising the current role of chemotherapy for the treatment of sarcoma. Semin. Oncol. 38 Suppl 3, 19-29 (2011).
  4. Allison, D. C., et al. A meta-analysis of osteosarcoma outcomes in the modern medical era. Sarcoma. , (2012).
  5. Anninga, J. K., et al. Chemotherapeutic adjuvant treatment for osteosarcoma: where do we stand. Eur. J. Cancer. 47, 2431-2445 (2011).
  6. Bacci, G., et al. Pattern of relapse in patients with osteosarcoma of the extremities treated with neoadjuvant chemotherapy. Eur. J. Cancer. 37, 32-38 (2001).
  7. Briccoli, A., et al. Resection of recurrent pulmonary metastases in patients with osteosarcoma. Cancer. 104, 1721-1725 (2005).
  8. Milla Sanabria, L., et al. Direct and indirect photodynamic therapy effects on the cellular and molecular components of the tumor microenvironment. Biochim. Biophys. Acta. 1835, 36-45 (2013).
  9. Mitra, S., Foster, T. H. Photophysical parameters, photosensitizer retention and tissue optical properties completely account for the higher photodynamic efficacy of meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin vs Photofrin. Photochem. Photobiol. 81, 849-859 (2005).
  10. Ma, L., Moan, J., Berg, K. Evaluation of a new photosensitizer, meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin, for use in photodynamic therapy: a comparison of its photobiological properties with those of two other photosensitizers. Int. J. Cancer. 57, 883-888 (1994).
  11. Reidy, K., Campanile, C., Muff, R., Born, W., Fuchs, B. mTHPC-mediated photodynamic therapy is effective in the metastatic human 143B osteosarcoma cells. Photochem. Photobiol. 88, 721-727 (2012).
  12. Triesscheijn, M., Ruevekamp, M., Aalders, M., Baas, P., Stewart, F. A. Comparative sensitivity of microvascular endothelial cells, fibroblasts and tumor cells after in vitro photodynamic therapy with meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin. Photochem. Photobiol. 80, 236-241 (2004).
  13. Triesscheijn, M., Baas, P., Schellens, J. H., Stewart, F. A. Photodynamic therapy in oncology. Oncologist. 11, 1034-1044 (2006).
  14. Burch, S., et al. Treatment of canine osseous tumors with photodynamic therapy: a pilot study. Clin. Orthop. Relat. Res. 467, 1028-1034 (2009).

Tags

Медицина выпуск 85 фотодинамическая терапия (PDT) 5,10,15,20-тетракис (мета-гидроксифенил) хлорина (mTHPC) фототоксичность темно-токсичность остеосаркома (ОС) фотосенсибилизатором
Цитотоксическая Эффективность фотодинамической терапии в клетках остеосаркомы<em&gt; Экстракорпоральное</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Meier, D., Campanile, C., Botter, S. … More

Meier, D., Campanile, C., Botter, S. M., Born, W., Fuchs, B. Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (85), e51213, doi:10.3791/51213 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter