Summary
El protocolo informado aquí permite la evaluación de la eficacia de la terapia fotodinámica (PDT) en líneas de células y la optimización de la configuración de PDT antes de aplicar la terapia en modelos animales.
Abstract
En los últimos años, ha sido la dificultad en la búsqueda de terapias más eficaces contra el cáncer con menos efectos secundarios sistémicos. Por lo tanto la terapia fotodinámica es un nuevo enfoque para el tratamiento selectivo del tumor más.
Terapia fotodinámica (PDT) que hace uso de un fotosensibilizador no tóxico (PS), que, tras la activación con luz de una longitud de onda específica en la presencia de oxígeno, genera radicales de oxígeno que provocan una respuesta citotóxica 1. A pesar de su aprobación hace casi veinte años por la FDA, PDT es hoy en día sólo se utiliza para tratar un número limitado de tipos de cáncer (de piel, de la vejiga) y las enfermedades no oncológico (psoriasis, queratosis actínica) 2.
La principal ventaja de la utilización de la PDT es la capacidad de realizar un tratamiento local, lo que evita efectos secundarios sistémicos. Además, permite el tratamiento de tumores en sitios delicados (por ejemplo, alrededor de los nervios o vasos sanguíneos). Aquí, un intraoperative aplicación de la TFD se considera en el osteosarcoma (OS), un tumor de la médula, para apuntar los satélites de tumor primario queda atrás en el tumor de tejido circundante después de la resección quirúrgica del tumor. El tratamiento tiene como objetivo disminuir el número de recurrencias y a reducir el riesgo de (postoperatoria) la metástasis.
En el presente estudio, se presentan en los procedimientos in vitro PDT para establecer la configuración de PDT óptimas para el tratamiento eficaz de las líneas celulares usadas ampliamente OS que se utilizan para reproducir la enfermedad humana en modelos de ratón OS intratibial bien establecidos. La absorción de la PS mTHPC se examinó con un espectrofotómetro y fototoxicidad se provocaron con la luz láser de excitación de mTHPC a 652 nm para inducir la muerte celular evaluada con un ensayo de WST-1 y por el recuento de células supervivientes. Las técnicas establecidas nos permiten definir los ajustes óptimos PDT para futuros estudios en modelos animales. Son una herramienta fácil y rápida para la evaluación de la eficacia de la terapia fotodinámica
Introduction
Estado actual del tratamiento del arte del osteosarcoma (OS), un tumor óseo primario, abarca una combinación de quimioterapia adyuvante neo y la cirugía. Este régimen de tratamiento reveló un aumento en la tasa de supervivencia de los pacientes con enfermedad localizada de aproximadamente 20% antes del uso de la quimioterapia, a actualmente entre 60-70% 3, 4. Sin embargo, en las últimas dos décadas, la supervivencia global de los pacientes OS con enfermedad local se ha estancado 4, 5. Por otra parte, el 30-40% de los pacientes recae dentro de 3 años después del diagnóstico y los pacientes con enfermedad metastásica siguen teniendo una baja supervivencia de 20-30% 4, 6, 7. Para mejorar el resultado de estos pacientes, las nuevas estrategias terapéuticas deben ser desarrollados.
Terapia fotodinámica (PDT), en lugar de una nueva terapia contra el cáncer, utiliza la luz de una longitud de onda específica para la excitación de un fotosensibleTizer (PS), que se acumula en las células tumorales después de su inyección en el torrente sanguíneo. La luz del láser de excitación de la PS genera radicales de oxígeno en la presencia de oxígeno, que inducen reacción citotóxica en las células tumorales y la muerte celular. Además de este mecanismo primaria, dos adicionales PDT evocados procesos biológicos contribuyen al crecimiento del tumor reducida: PDT causa vasoconstricción y la formación de trombos de la microvasculatura del tumor y, por consiguiente, la hipoxia local y la anoxia el interior del tumor, lo que lleva a un infarto del tumor. Por último, PDT lesiona y mueren las células tumorales activan una respuesta inmune local, una característica muy especial de la TFD. Esto implica el sistema del complemento y la activación de células presentadoras de antígeno dendríticas 8. Por lo tanto, se crean condiciones para la presentación de antígenos tumorales con la posterior activación de las células linfoides, que conduce a la inmunidad específica de tumor.
Hasta ahora, la TFD se ha usado para tratar varios tipos de tumores de tejidos blandos y hyperplasia de, como queratosis actínica, el esófago de Barrett, los tumores endobronquiales, cáncer de vejiga, carcinomas de células basales y el tratamiento paliativo del cáncer de cabeza y cuello 2. El tratamiento se sabe que inducen, la necrosis local a gran escala con sólo pocos efectos secundarios, y por lo tanto tiene el potencial para erradicar selectivamente el tejido tumoral. A pesar de estas ventajas, la aplicación de la TFD sigue siendo técnicamente más exigente que la administración de fármacos quimioterapéuticos. Con el fin de lograr la máxima eficacia, la concentración de PS, el tiempo de exposición a la luz y la transferencia total de energía de la luz necesita ser optimizado. Esto se puede hacer en experimentos in vivo, pero, debido a la gran número relativo de parámetros que necesitan ser optimizados, es más eficiente para determinar inicialmente las condiciones óptimas in vitro.
En los experimentos que se describen a continuación, hemos probado la eficacia in vitro de la TFD con una EP 5,10,15,20-tetrakis (meta-hidroxifenil) chlorin, abreviado mTHPC (Figura 1A). mTHPC es la sustancia activa en el producto medicinal Foscan, que se utiliza actualmente en la clínica para el tratamiento paliativo del cáncer de cabeza y cuello. Es uno de los PS más potente, la inducción de daño celular masiva ya a bajas concentraciones, y se demostró que es superior a otra PS en términos de penetración en el tejido 9, 10. Su espectro de absorción de la luz (Figura 1B) muestra dos picos prominentes, uno a 417 nm y un segundo a 652 nm, que se utilizan para la localización de tejido de acumulación de PS y para PDT de inducción, respectivamente.
En la actualidad, una formulación liposomal de mTHPC está en desarrollo. A continuación, describimos los procedimientos para cuantificar la absorción de esta formulación liposomal, y para llevar a cabo la TFD en dos líneas celulares humanas OS, el bajo HOS metastásico y las células metastásicas 143B altos. Algunos de los datos que aquí se presentan han sido reportados anteriormente 11. Thenfoque E descrito aquí nos permite estudiar el efecto de un fenotipo metastásico en la eficacia de la TFD. 143B células ortotópicamente, inyectados en las extremidades traseras de los ratones SCID inmunodeficientes causan intratibial tumores primarios en metástasis, un modelo que imita estrechamente la enfermedad metástasis humana. Por lo tanto, los experimentos in vitro propuestas son perfectamente adecuados para evaluar los ajustes óptimos PDT que se utilizarán posteriormente en experimentos in vivo.
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Protocol
1. La comparación de la captación de mTHPC en los respectivos baja y altamente metastásico HOS y Líneas Celulares 143B OS
- Preparar el medio de cultivo celular que contenía DMEM, Jamón F12, y suero fetal inactivado por calor ternera en un 4.5:4.5:1 relación.
Nota: La formulación liposomal de la PS mTHPC se disolvió en agua a una concentración final de 1,5 mg / ml mTHPC. - Plate 0,2 x 10 6 células HOS y 143B / pocillo en placas de 6 pocillos (triplica para cada condición) y dejar que las células se adhieran durante la noche.
Nota: el número tiene que ser ajustado a las líneas de células individuales. Una confluencia de 80-90% es el más adecuado en el momento del experimento. - Al día siguiente, incubar las células con una concentración fija de mTHPC para diferentes períodos de tiempo (de absorción dependiente del tiempo), o con concentraciones crecientes de mTHPC durante un período de tiempo fijo (dosis dependiente de la captación).
- Se incuban las células con mTHPC de tiempo específico para points o concentraciones de mTHPC.
Nota: En este estudio, tanto el HOS y líneas de células 143B se incubaron con 0,6 g / ml mTHPC de 0, 2,5, 5, o 10 horas, o con 0, 0,6, 2,5, y 10 g / ml mTHPC durante 5 h. Los períodos de tiempo y las dosis aplicadas pueden variar dependiendo de la línea celular que se utiliza. - Recuerde que debe trabajar siempre en la oscuridad o en condiciones de luz tenue para evitar exposición a la luz directa de las células.
- Después de la incubación de las células en las condiciones indicadas, aspirar el medio y lavar las células tres veces con PBS. A continuación, separar las células con 0,5 ml de tripsina / EDTA y contar las células.
- Después de la separación, centrifugar las células a 400 xg durante 5 min, aspirar el medio y volver a suspender las células en PBS a una densidad final de 200.000 células / ml.
- Pipetear 100 l de la suspensión celular obtenida (es decir, 20.000 células) en una placa de 96 pocillos y medir la fluorescencia de estas células en un espectrofotómetro de fluorescencia. El ajustes para mediciones de fluorescencia mTHPC son: 417 nm para la excitación y 652 nm para la emisión.
- Con el fin de calcular la cantidad de mTHPC internalizada por célula, normalizar la unidad de fluorescencia relativa (RFU) para el número de células y el volumen celular de la siguiente manera:
- Preparar una curva estándar utilizando diferentes concentraciones de mTHPC en PBS de 0-4 g / ml (medidas uso por triplicado). Pipetear 100 l de cada dilución en una placa de 96 pocillos y medir la fluorescencia de los pozos utilizando los ajustes que se describen en el paso 1.6.
- Divida la RFU (obtenido de 20.000 células) por la pendiente de la curva estándar lineal de mTHPC, que muestra la concentración de mTHPC (en g / ml) en el pozo.
- Divida esta concentración mTHPC por 10 para obtener la cantidad total de mTHPC en un pocillo (en microgramos, lo que representa 100 l de suspensión celular) y dividir este valor por el volumen de 20.000 células.
- Calcular el volumen con la fórmula para una esfera: (4/3 x π) xr 3. Obtener el radio r midiendo el diámetro de 20 células tratadas con tripsina bajo un microscopio, y dividiendo este valor por 2.
- Finalmente, normalizar todos los valores a los obtenidos para las células HOS después de 10 horas de incubación (dosis absorción dependiente) o tratados con 10 mg / ml mTHPC (absorción dependiente del tiempo), que se establece en 100%.
2. Medición de la fototoxicidad in vitro de PS
- Seed 3000 células / pocillo en una placa de 96 pocillos (por triplicado para cada concentración de mTHPC utilizados) y dejar que ellos se adhieran noche a la mañana. Del mismo modo preparar una placa de 96 pozos adicionales y tratar las células como se describe a continuación, pero a continuación, poner a un lado para obtener imágenes de contraste de fase.
Nota: el número tiene que ser ajustado para cada línea celular individual. Una confluencia del 50-60% en el momento del experimento es ideal.- Tenga en cuenta que añadir el correspondiente control de toxicidad en la oscuridad de las células de cada una de las concentraciones mTHPC. LaSE son células que se incubaron en ausencia o presencia de concentraciones seleccionadas de mTHPC, pero no se ilumina.
- Al día siguiente, incubar las células con diferentes concentraciones de mTHPC (0, 0,0001, 0,001, 0,01, 0,03, 0,075, 0,15, 0,3, 0,6, 1,25, 2,5, 5, y 10 g / ml) en función de las líneas celulares y mantenerlos en la oscuridad durante 5 horas.
- Consulte la Sección 1.3.2
Nota: El tiempo de incubación antes de la iluminación depende de la línea celular y en la PS se utiliza, por lo tanto, es aconsejable para probar diferentes concentraciones y diferentes puntos de tiempo en experimentos separados.
- Consulte la Sección 1.3.2
- Después de la incubación para el período de tiempo indicado, se lavan las células dos veces con PBS y añadir medio fresco sin mTHPC.
- Iluminar las células con un láser de diodo de 652 nm, específico para el espectro de absorción mTHPC (véase la Figura 1).
- Ajuste el láser para 21.88 mW / cm Potencia de 2 a una altura de 13,5 cm distaNCE de las células, con el fin de obtener una dosis de energía de 5 J / cm 2. Ilumine las células durante 230 seg. No iluminar las células de control de toxicidad oscuros (con y sin mTHPC).
Nota: Siempre use gafas para proteger los ojos de la luz láser que se utiliza para la excitación del PS.
- Ajuste el láser para 21.88 mW / cm Potencia de 2 a una altura de 13,5 cm distaNCE de las células, con el fin de obtener una dosis de energía de 5 J / cm 2. Ilumine las células durante 230 seg. No iluminar las células de control de toxicidad oscuros (con y sin mTHPC).
- Después de la iluminación, mantener las células en la oscuridad a 37 º C durante 24 horas. Posteriormente, se añade agua tetrazolio soluble (WST-1) reactivo (10 μl/100 l de medio).
- Tres horas después de la adición del reactivo WST-1, medir la absorbancia de los pocillos individuales de la placa de 96 pocillos a 415 nm.
- Con el fin de calcular el porcentaje de células supervivientes, establecer la media de los valores obtenidos para las células no tratadas mTHPC para cada condición a 100% (es decir, sistema de iluminación, sin mTHPC y nonilluminated, sin mTHPC).
3. Estimación del número de células por Recuento celular
- Se siembran las células 20000 / nosotrosll en una placa de 24 pocillos y dejar que ellos se adhieran noche a la mañana.
- Se incuban las células durante 5 h con mTHPC (0,001, 0,003, 0,15, 0,6, y 1,25 g / ml) e iluminar ellos como se describe anteriormente.
- Recoger el medio, se lavan las células una vez con PBS, trypsinize ellos y recogerlas por centrifugación a 400 xg durante 5 min.
- Después de la centrifugación, aspirar el medio y volver a suspender las células en 200 l de medio fresco.
- Contar las células en una cámara de Neubauer.
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Representative Results
Con las técnicas aquí reportados, se investigó PDT basada en mTHPC en OS células humanas. En primer lugar, el tiempo y la dosis de absorción depende de mTHPC se investigó en la baja HOS metastásico y en las líneas de células 143B OS altamente metastásicas. mTHPC absorción se puede evaluar mediante la medición de la fluorescencia de mTHPC con un espectrofotómetro de fluorescencia (Figura 2, reproducido con permiso de Reidy et al. 11). Figura 2A ilustra la captación de mTHPC de una manera dependiente del tiempo. La intensidad de fluorescencia de la suspensión de células representa los niveles intracelulares de mTHPC. Figura 2B ilustra la dosis de la absorción de mTHPC dependiente en células HOS y 143B después de 5 horas de incubación. La captación en la alta línea celular metastásico 143B tendió a ser más alta que en la línea celular HOS parental metastásica baja.
Oscuro y fototoxicidad de mTHPC en 143B células se evaluó mediante la determinación del metabólicamente celularla actividad de c (con un ensayo de WST-1) y contando el número de células residuales después de 5 horas de incubación con mTHPC, la posterior incubación en la oscuridad o el tratamiento con luz láser de 230 segundos y una incubación adicional durante 24 horas en la oscuridad.
Dosis toxicidad en la oscuridad dependiente se muestra en la Figura 3 (reproducido con permiso de Reidy et al. 11). En la figura 3A, las células 143B fueron tratados con diferentes dosis mTHPC y se compararon con células no tratadas. Se observó una disminución dependiente de la dosis del número de células y la actividad metabólica. Disminución de la viabilidad celular se reconoció a una concentración mTHPC igual y superior a 2,5 g / ml. Dosis dependiente de fototoxicidad de mTHPC se ilustra en la Figura 3B. Las células fueron tratadas con diferentes dosis mTHPC y con iluminación posterior (5 J / cm 2). Una disminución consecuente en la actividad metabólica celular (medido con el ensayo WST), así como una disminución en Nu celularmbre se observó. La disminución resultante en el número de células después de aplicar PDT se visualiza en la Figura 4.
Figura 1. Estructura química de mTHPC (A) y el espectro de absorción de la luz (B). Las cifras fueron proporcionadas por biolitec Research GmbH. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. El tiempo y la dosis de la absorción dependiente de mTHPC por las líneas celulares OS humanos HOS y 143B. (A). HOS (en gre y) y 143B (en negro) se sembraron en placas de 6 pocillos (0,2 x 20 6 células / pocillo). Después del cultivo durante la noche, las células se incubaron con 0,6 g / ml mTHPC de 0, 2,5, 5, 7,5, y 10 h (A), o durante 5 h con 0, 0,6, 2,5, y 10 g / ml mTHPC (B) . La intensidad de fluorescencia se determinó midiendo la fluorescencia de 20.000 células en 652 nm tras excitación a 417 nm. Los valores se normalizaron con el volumen celda calculada y la absorción mTHPC de células HOS en 10 h (A) o después de la incubación con 10 g / ml (B) se fija en 100%. Los valores son la media ± SEM de tres experimentos independientes. Adaptado de Reidy et al. 11 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 3. Oscuro y fototoxicidad de mTHPC en 143B células. Las células se sembraron y cultivaron durante la noche antes del tratamiento. Para determinar la dosis mTHPC toxicidad en la oscuridad dependiente, células 143B se incubaron durante 5 horas en la oscuridad en la ausencia o presencia de las concentraciones indicadas mTHPC (A). Para determinar la dosis mTHPC toxicidad dependiente de la foto, células 143B se incubaron con o sin mTHPC durante 5 horas a las concentraciones indicadas y luego iluminados con 5 J / cm 2 con una potencia de 21,88 mW / cm 2 para 230 seg (B). Para las mediciones de la actividad metabólica (●) con el ensayo WST-1, células 143B se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 3.000 células / pocillo. El número de células (○) se cuentan a partir de células sembradas a 20.000 células / pocillo en placas de 24 pocillos. Los valores son la media ± SEM de tres experimentos independientes. Fr Adaptadoom Reidy et al 11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Imágenes de contraste de fase de células 143B antes y después de PDT. Las células se sembraron y se dejan adherir durante la noche como se describe en el protocolo. Para visualizar dependiente de la dosis, la toxicidad mediada mTHPC luz, las células 143B se incubaron durante 5 horas en la oscuridad con 0, 0.6, 2.5 y 10 mg / ml mTHPC (paneles AD, respectivamente). Después las células se iluminan con 5 J / cm 2 a la luz de longitud de onda de 652 nm durante 230 segundos, y se fotografiaron después de 24 horas. Barra de escala:. 100 micras PlFacilidad clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Para lograr citotoxicidad óptimo en respuesta a PDT, es fundamental para elegir los ajustes de luz láser adecuados y los tiempos de incubación. Los procedimientos aquí descritos son consistentes y eficientes para determinar la absorción de PS y cuantificar la citotoxicidad inducida por la TFD in vitro. El uso de las longitudes de onda de absorción específica de la PS mTHPC, la absorción de PS celular se puede determinar de una manera directa, y la PS se puede activar para generar especies de oxígeno reactivas citotóxicas.
Utilizando esta configuración in vitro, todos los parámetros tales como la concentración de PS, el intervalo de la luz de drogas y la intensidad de la luz láser se puede ajustar fácilmente a las características de la PS y las líneas celulares utilizadas. El recuento celular da una lectura directa de supervivientes células unidas, que en conjunto con el ensayo WST-1 (seguimiento de la actividad metabólica) da una buena estimación de la supervivencia celular. Sin embargo, el método que se presenta sólo puede modelar el "primer golpe", es decir, la toxicidad de la célulaespecies de oxígeno reactivas de inmediato después de la activación del PS. La in vivo observada tras la vasoconstricción y la activación del sistema inmunológico, es necesario para la erradicación del tumor por completo, sólo puede ser investigado en animales.
La Figura 2 demuestra un tiempo y dosis dependiente de la captación de mTHPC a un nivel superior en la 143B altamente metastásico que en su parental línea celular HOS metastásico bajo. Se observó toxicidad en la oscuridad de mTHPC en células OS 143B después de la incubación durante 5 horas sólo a altas concentraciones (Figura 3). 143B células muestran una alta sensibilidad a la TFD, que se muestra por el mTHPC y dosis de luz efecto fototóxico dependiente. Un efecto fototóxico se observó ya en una concentración mTHPC tan bajo como 0,075 g / ml, y una mitad de la máxima concentración letal de 0,022 ± 0,006 g / ml se observó (Figura 3).
Aunque PDT es mínimamente invasivo y eficaz contra muchos tipos de tumoress, los efectos secundarios menores pueden ocurrir cuando la aplicación de la técnica en pacientes (p. ej. hinchazón, eritema). Esto indica que el PS no sólo se toma por las células tumorales, como se muestra aquí, sino también por las células no tumorales, causando toxicidad después de la TFD también en estas células. Triesscheijn et al. Fue capaz de mostrar una mayor fotosensibilidad de las células tumorales en comparación con los fibroblastos humanos. En contraste, las células endoteliales microvasculares humanas mostraron una mayor captación de mTHPC que las otras líneas celulares de la prueba, lo que condujo a una alta fotosensibilidad 12. Estos hallazgos se correlacionan también con efectos vasculares contra PDT asociadas, que se observan con frecuencia 2.
Los métodos descritos también se pueden aplicar para otro PS. Necesitan tiempo de incubación y la intensidad de la luz láser para adaptarse a las características de la PS. Además, la TFD también puede ser inducida en otra que las células del sistema operativo, ya que sólo los ajustes son la línea celular dependiente pero no el propio método. R Como adicionalouts ead, mecanismos de muerte celular se pueden analizar, por ejemplo. por análisis de transferencia de Western de las proteínas implicadas en la apoptosis, necrosis o la autofagia. También la localización subcelular de PS se puede visualizar por ejemplo, por microscopía confocal de barrido láser.
Los diferentes pasos que se han descrito para PDT in vitro, es decir, la incubación de las células con la PS y la inducción de la TFD con luz láser, se parecen mucho a la situación clínica. Los pacientes reciben (iv o sc. Aplicados) del PS, y después de un intervalo de luz droga distinta, el área de interés (por ejemplo,. Tejido tumoral) se ilumina con luz láser 13. Aunque no se aplica todavía en la SG, sus potenciales ventajas son evidentes; PDT se considera que es particularmente atractivo para el tratamiento intraoperatorio de satélites tumorales, que con frecuencia crecer como grupos de células tumorales primaria junto al borde principal del tumor primario y puede iniciar una recurrencia cuando perdido durante surgical resección del tumor primario. Incluso grandes tumores óseos pueden ser tratados con esta técnica. Esto se ha demostrado por un estudio prometedor en los perros 14. Además, la erradicación de las células tumorales que no se pueden resecar mediante cirugía (por ejemplo, múltiples metástasis que ocurre principalmente en los pulmones), puede también representar una posible aplicación futura de la TFD en pacientes con enfermedad metastásica OS.
Es importante tener en cuenta que, durante la realización de los experimentos, se debe tener cuidado de que todos los pasos de trabajo se realizan bajo una exposición mínima de luz después de la adición de la PS a las células, como la luz del día normal también contiene la longitud de onda necesaria para activar mTHPC. Del mismo modo, para la aplicación in vivo en modelos preclínicos, el cuidado debe ser tomado para proteger a los animales de la luz directa después de inyectar mTHPC. También hay que señalar que el ensayo WST-1 sólo evalúa la actividad metabólica de las células tumorales, que es un indicador indirecto de la muerte celular. Por lo tanto, Una combinación con un recuento total de células, tal como se presenta aquí, se recomienda.
En conclusión, la combinación de los métodos descritos (PS-absorción y toxicidad celular inducida por PDT) ofrece un procedimiento rápido y eficaz y rentable para caracterizar las propiedades de toxicidad de un PS in vitro. Con estos resultados in vitro, el rango de la intensidad de la luz óptima y el intervalo de la luz de drogas puede ser estimado, lo que da una buena indicación de la TFD puede aplicarse in vivo.
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Disclosures
Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia o conflictos de intereses.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a biolitec Research GmbH (Jena, Alemania) por la amabilidad de darnos la formulación liposomal mTHPC, con un agradecimiento especial a Susanna Gräfe y Arno Wiehe por su ayuda y conocimientos técnicos. También nos gustaría dar las gracias a Kerstin Reidy, que genera una gran parte de los resultados y fue corresponsable de su publicación 11.
Este trabajo fue apoyado por becas de la Schweizerischer Verein Balgrist, la Universidad de Zurich, el Krebsliga Zurich, así como por una beca de la Walter L. y Johanna Fundación Wolf, Zurich, Suiza, y una beca de EuroNanoMed ERA-NET / SNF suizo Fundación Nacional para la Ciencia 31NM30-131004/1. Este trabajo también fue apoyado por el programa (de Alta Especialidad de Medicina) para musculoesqueléticos Oncología del Cantón de Zurich HSM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | PAA GmbH, Freiburg, Germany | E15-883 | |
| HAM F12 | PAA GmbH, Freiburg, Germany | E15-817 | |
| Heat-inactivated fetal calf serum | GIBCO, Basel, Switzerland | 10500-064 | |
| mTHPC | biolitec Research GmbH, Jena, Germany | As this liposomal formulation is originating from R&D no catalogue number is available at the moment. Stock: 1.5 mg/ml; provided in a 9:1 mixture of dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) and dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG; >99% purity) |
|
| Spectramax Gemini XS plate reader | Molecular Devices, Sunnyvale, CA | ID# 861 | |
| Microscope Zeiss Observer.Z1 | Axio Observer, Axio Vision Release 4.6.3 SP1, Jena Germany | ||
| Ceralas PDT 652 nm Laser | biolitec AG, Jena, Germany | LD652nm2W400u | |
| Water-soluble tetrazolium (WST) reagent | Roche Diagnostics AG, Rotkreuz, Switzerland | 1644807 |
References
- Juarranz, A., Jaen, P., Sanz-Rodriguez, F., Cuevas, J., Gonzalez, S. Photodynamic therapy of cancer. Basic principles and applications. Clin. Transl. Oncol. 10, 148-154 (2008).
- Agostinis, P., et al. Photodynamic therapy of cancer: an update. CA Cancer. 61, 250-281 (2011).
- D'Adamo, D. R. Appraising the current role of chemotherapy for the treatment of sarcoma. Semin. Oncol. 38 Suppl 3, 19-29 (2011).
- Allison, D. C., et al. A meta-analysis of osteosarcoma outcomes in the modern medical era. Sarcoma. , (2012).
- Anninga, J. K., et al. Chemotherapeutic adjuvant treatment for osteosarcoma: where do we stand. Eur. J. Cancer. 47, 2431-2445 (2011).
- Bacci, G., et al. Pattern of relapse in patients with osteosarcoma of the extremities treated with neoadjuvant chemotherapy. Eur. J. Cancer. 37, 32-38 (2001).
- Briccoli, A., et al. Resection of recurrent pulmonary metastases in patients with osteosarcoma. Cancer. 104, 1721-1725 (2005).
- Milla Sanabria, L., et al. Direct and indirect photodynamic therapy effects on the cellular and molecular components of the tumor microenvironment. Biochim. Biophys. Acta. 1835, 36-45 (2013).
- Mitra, S., Foster, T. H. Photophysical parameters, photosensitizer retention and tissue optical properties completely account for the higher photodynamic efficacy of meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin vs Photofrin. Photochem. Photobiol. 81, 849-859 (2005).
- Ma, L., Moan, J., Berg, K. Evaluation of a new photosensitizer, meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin, for use in photodynamic therapy: a comparison of its photobiological properties with those of two other photosensitizers. Int. J. Cancer. 57, 883-888 (1994).
- Reidy, K., Campanile, C., Muff, R., Born, W., Fuchs, B. mTHPC-mediated photodynamic therapy is effective in the metastatic human 143B osteosarcoma cells. Photochem. Photobiol. 88, 721-727 (2012).
- Triesscheijn, M., Ruevekamp, M., Aalders, M., Baas, P., Stewart, F. A. Comparative sensitivity of microvascular endothelial cells, fibroblasts and tumor cells after in vitro photodynamic therapy with meso-tetra-hydroxyphenyl-chlorin. Photochem. Photobiol. 80, 236-241 (2004).
- Triesscheijn, M., Baas, P., Schellens, J. H., Stewart, F. A. Photodynamic therapy in oncology. Oncologist. 11, 1034-1044 (2006).
- Burch, S., et al. Treatment of canine osseous tumors with photodynamic therapy: a pilot study. Clin. Orthop. Relat. Res. 467, 1028-1034 (2009).
