Summary
Utero-ट्यूबल भ्रूण स्थानांतरण गर्भाशय स्थानांतरण प्रदर्शन करते हैं तो हो सकता है कि भ्रूण बहिर्वाह को रोकने के लिए एक बाधा के रूप में utero-ट्यूबल जंक्शन का उपयोग करता है. Vasectomized पुरुषों भ्रूण स्थानांतरण के लिए pseudopregnant प्राप्तकर्ताओं प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं. दोनों तकनीकों पर चर्चा कर रहे हैं.
Abstract
एक किराए की महिला को preimplantation भ्रूण का स्थानांतरण epigenetic परिवर्तन के प्रभावों को बाद में भ्रूण के विकास और वयस्क स्वास्थ्य पर preimplantation विकास के दौरान उत्पन्न अध्ययन करने के लिए आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों या के उत्पादन के लिए एक आवश्यक कदम है. एक प्रभावी और लगातार भ्रूण स्थानांतरण तकनीक का उपयोग आनुवंशिक रूप से संशोधित पशुओं की पीढ़ी को बढ़ाने के लिए और आरोपण दरों और अवधि तक जीवित रहने पर अलग उपचार के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है. ब्लास्टोसिस्ट चरण में भ्रूण आम तौर पर भ्रूण में गड़बड़ी पिपेट पेश करने गर्भाशय की दीवार में एक छिद्र प्रदर्शन, गर्भाशय हस्तांतरण से स्थानांतरित कर रहे हैं. पिपेट वापस ले लिया गया है के बाद गर्भाशय में प्रदर्शन छिद्र बंद नहीं करता है, और कारण गर्भाशय का सकारात्मक दबाव के उदर गुहा को भ्रूण सकते हैं बहिर्वाह. पंचर भी, आरोपण impairs कि एक नकसीर उत्पादन ब्लॉक हस्तांतरण विंदुक और भ्रूण डी प्रभावित कर सकते हैं कर सकते हैंZona बिना भ्रूण स्थानांतरित कर रहे हैं, खासकर जब evelopment,. नतीजतन, इस तकनीक अक्सर बहुत चर और समग्र कम भ्रूण जीवित रहने की दरों में यह परिणाम है. इन नकारात्मक प्रभाव से बचना, utero-ट्यूबल भ्रूण स्थानांतरण भ्रूण बहिर्वाह बाधा उत्पन्न करती है कि एक प्राकृतिक बाधा के रूप में utero-ट्यूबल जंक्शन का लाभ लेने के लिए और गर्भाशय की दीवार का पंचर से बचें. Vasectomized पुरुषों pseudopregnant प्राप्तकर्ताओं प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं. पुरुष नसबंदी प्रदर्शन करने के लिए एक तकनीक utero-ट्यूबल भ्रूण स्थानांतरण करने के लिए एक पूरक के रूप में वर्णन किया गया है.
Introduction
भ्रूण स्थानांतरण शायद माउस मॉडल में प्रदर्शन सबसे अक्सर शल्य प्रक्रिया है. इस तकनीक इन विट्रो हेरफेर तकनीकों के अधीन भ्रूण से संतानों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है और इसलिए, pronuclear इंजेक्शन, lentiviral पारगमन, या कल्पना गठन के द्वारा आनुवंशिक रूप से संशोधित मॉडल के विकास के लिए एक आवश्यक कदम का गठन किया. इसके अलावा, तकनीक preimplantation विकास के दौरान होने वाली विविध अपमान की विकासात्मक प्रभाव के अध्ययन की अनुमति देता है. कृत्रिम प्रजनन तकनीक 1 या विभिन्न पदार्थों या मेटाबोलाइट्स 2 के असामान्य सांद्रता के लिए जोखिम का उपयोग आरोपण या गर्भनाल विफलताओं और संतानों में दीर्घकालिक प्रभाव में जिसके परिणामस्वरूप भ्रूण के विकास को प्रभावित कर सकता है. एक विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य भ्रूण स्थानांतरण तकनीक एक सुसंगत आदमी में आरोपण और भ्रूण के विकास पर प्रयोगात्मक उपचार के संभावित नकारात्मक प्रभाव का परीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण हैएनईआर.
Murine preimplantation भ्रूण 0.5 दिनों के बाद coitum की एम्पुली (डीपीसी) pseudopregnant प्राप्तकर्ता (डिंबवाहिनी हस्तांतरण) 3,4 या 2.5 डीपीसी pseudopregnant प्राप्तकर्ता के गर्भाशय में (गर्भाशय हस्तांतरण) 5,6 के माध्यम से डिंबवाहिनी में या तो एक प्राप्तकर्ता महिला को हस्तांतरित किया जा सकता है उनके विकास के चरण पर निर्भर करता है. इस तरह के भ्रूण या प्रेरित pluripotent स्टेम सेल का इंजेक्शन द्वारा काइमेरिक चूहों उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया उन लोगों के रूप में ब्लास्टोसिस्ट चरण में भ्रूण,, आमतौर पर गर्भाशय हस्तांतरण से स्थानांतरित कर रहे हैं. ब्लास्टोसिस्ट्स भी एक 0.5 डीपीसी प्राप्तकर्ता के डिंबवाहिनी को हस्तांतरित किया जा सकता है, लेकिन भ्रूण आरोपण से पहले जगह लेता अपमान से उबरने के लिए 2 दिन diapause आए और है, क्योंकि यह विकास disruptors के लिए एक कम शारीरिक परीक्षण का गठन किया. गर्भाशय स्थानांतरण गर्भाशय लुमेन में एक भ्रूण में गड़बड़ी पिपेट का उपयोग की अनुमति देता है कि एक छेद उत्पन्न करने के क्रम में एक संकीर्ण सुई के साथ गर्भाशय की दीवार puncturing शामिल है. एकlthough इस तकनीक का अच्छा परिणाम निकल सकते हैं, अवधि के लिए अस्तित्व (यानी एक पिल्ला करने के लिए है कि विकास का तबादला भ्रूण का प्रतिशत) अक्सर कम और 7,8 अप्रत्याशित है.
गर्भाशय की दीवार का पंचर कुछ हानिकारक दुष्प्रभाव जरूरत पर जोर देता. सबसे पहले, myometrium एक अत्यधिक vascularized ऊतक है और इसके पंचर अक्सर एक छोटे से नकसीर में यह परिणाम है. रक्त भ्रूण हस्तांतरण विंदुक ब्लॉक या भ्रूण की मौत और / या आरोपण विफलता के कारण गर्भाशय लुमेन आक्रमण कर सकते हैं. रक्त कोशिकाओं और मलबे blastomeres को संलग्न कर सकते हैं के रूप में Zona बिना भ्रूण स्थानांतरित कर रहे हैं जब यह विशेष रूप से प्रासंगिक है. भ्रूण का तबादला कर दिया गया है के बाद दूसरा, प्रदर्शन किया उद्घाटन सील नहीं करता है, तो वे छिद्र के माध्यम से वापस प्रवाह कर सकते हैं और एक बहुत बड़ी मात्रा गर्भाशय में पेश किया गया है जब उदर गुहा को निष्कासित कर दिया जाएगा. वर्णित utero-ट्यूबल भ्रूण स्थानांतरण के साथ साथ embr देने के लिए utero-ट्यूबल जंक्शन का लाभ लेनेगर्भाशय की दीवार puncturing और जिससे इसके प्रतिकूल परिणाम 9 से बचने की आवश्यकता के बिना गर्भाशय में Yos.
भ्रूण स्थानांतरण के लिए इस्तेमाल किया pseudopregnant प्राप्तकर्ता महिलाओं vasectomized पुरुषों 8 के साथ प्राकृतिक सहवास से प्राप्त कर रहे हैं. एक बाँझ पुरुष द्वारा उत्पादित लाभदायक स्राव तबादला भ्रूण के लिए ग्रहणशील बनने के लिए गर्भाशय के लिए आवश्यक हैं. एक प्राप्तकर्ता को प्राप्त करने के लिए, उम्र के 6 महीने के लिए 8 सप्ताह की 2 महिलाओं की एक अधिकतम दोपहर में एक vasectomized पुरुष के साथ रखा जाता है. अगली सुबह, महिलाओं के एक योनि संभोग प्लग, पुरुष लाभदायक तरल पदार्थ से coagulated प्रोटीन की एक पेड़ों का झुरमुट की उपस्थिति के लिए जाँच कर रहे हैं. संभोग आमतौर पर आधी रात के दौरान होता है के रूप में, योनि प्लग का पता लगाने के दिन 0.5 डीपीसी माना जाता है. Vasectomized पुरुषों कुछ विक्रेताओं से खरीदा जा सकता है, यहाँ बताया शल्य प्रक्रिया अपेक्षाकृत आसान है और भ्रूण स्थानांतरण के लिए आवश्यक से किसी भी अतिरिक्त उपकरणों की आवश्यकता नहीं है.
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Protocol
सभी पशु प्रयोगों यूएसडीए पशु की देखभाल और उपयोग के निर्देशों के अनुसार Beltsville एरिया पशु की देखभाल और उपयोग Comittees (BAACUC 11-015) द्वारा अनुमोदित किया गया.
1. संज्ञाहरण और analgesia (सर्जिकल प्रक्रियाओं दोनों के लिए आम)
- माउस वजन और 27 जी सुइयों के साथ दो 1 मिलीलीटर सीरिंज में निम्नलिखित anesthetics और एनाल्जेसिक लोड:
- Ketamine (0.1 मिलीग्राम / छ: 0.01 मिलीग्राम / एक 10 मिलीग्राम / एमएल समाधान के ग्राम) और xylazine (0.01 मिलीग्राम / छ: एक 2 मिलीग्राम / एमएल समाधान की 0.005 मिलीग्राम / छ).
- Buprenorphine (0.1 माइक्रोग्राम / छ: एक 0.01 मिलीग्राम / एमएल समाधान के 0.01 मिलीलीटर).
- अंगूठे और तर्जनी के साथ संभव के रूप में जबड़े के करीब के रूप में अपनी गर्दन के कूड़ा उठा और थोड़ा और अंगूठी उंगलियों के बीच पूंछ पकड़ से माउस स्थिर.
- Intraperitoneally Ketamine-Xylazine मिश्रण इंजेक्षन. आंतरिक अंगों puncturing से बचने के लिए, साथ माउस पकड़थोड़ा अपने कूल्हों के स्तर के नीचे अपने सिर (चित्रा 1 ए)
- अंगूठे और तर्जनी (चित्रा 1 बी) के बीच गर्दन पकड़ के कूड़ा में Buprenorphine subcutaneously इंजेक्षन.
- एक गर्म मंच पर पिंजरे (स्वच्छ और किसी भी दूसरे जानवर के बिना) में माउस छोड़ें.
- बेहोश होने के बाद, (पैर के अंगूठे चुटकी द्वारा जाँच) रियर पैर पलटा के अभाव के लिए जाँच करें. आंख का सूखापन से बचने के लिए और नेत्रच्छद पलटा (चित्रा 1C) के अभाव के लिए जाँच करने के लिए नेत्र मरहम लागू करें.
- इस प्रोटोकॉल में नीचे वर्णित प्रक्रियाओं का प्रदर्शन करने के लिए पर्याप्त 30 मिनट की एक न्यूनतम के लिए एक शल्य चिकित्सा संज्ञाहरण विमान, प्रदान करता है (प्रोटोकॉल 2 और 3). अब समय की आवश्यकता है, 1.1.1 में वर्णित खुराक का आधा साथ ketamine + xylazine की एक अतिरिक्त इंजेक्शन 30 मिनट के बाद लागू किया जा सकता है. एक तेजी से और अनियमित एक को सांस लेने पैटर्न में बदलाव लो इंगित करता हैउचित संज्ञाहरण विमान के एसएस.
2. शुक्रवाहिकोच्छेदन
- एक सिद्ध संभोग प्रदर्शन के साथ एक पुरुष का प्रयोग करें.
- , सर्जिकल उपकरणों जीवाणुरहित सर्जरी प्रदर्शन किया जाएगा, जहां सतहों को साफ और 70% इथेनॉल के साथ उन्हें मिटा.
- पहले से सजगता के नुकसान के लिए जाँच, (प्रोटोकॉल 1) विस्तृत रूप में संज्ञाहरण प्रदर्शन करना.
- निकालने के लिए, एक गर्म मंच पर माउस प्लेस दो काल्पनिक आड़ा लाइनों के बीच उदर क्षेत्र से बिजली कतरनी के साथ फर 0.5 सेमी और लिंग के ऊपर 2.5 सेमी (2A चित्रा) रखा.
- 10% povidone आयोडीन और 70% इथेनॉल के साथ अनुक्रमिक पोंछते द्वारा मुंडा क्षेत्र sanitize.
- मुंडा क्षेत्र को प्रकाश में लाने के लिए एक छेद के साथ एक बाँझ तौलिया के साथ सर्जन और कवर की दिशा में अपनी पूंछ के साथ लापरवाह स्थिति में माउस रखें. शल्य चिकित्सा क्षेत्र रोशन.
- एक 10-15 मिमी अनुदैर्ध्य त्वचा incisio प्रदर्शन करनाn के बारे में 1 सेमी लिंग ऊपर पेट, की औसत दर्जे लाइन में. दाँतेदार संदंश ड्रेसिंग और फिर (आंकड़े 2A और 2 बी) कैंची से काट के साथ त्वचा पकड़ो.
- Linea अल्बा में एक 5-10 मिमी अनुदैर्ध्य चीरा प्रदर्शन करना. दाँतेदार संदंश microdissecting के साथ मांसपेशियों को पकड़ो और कैंची (चित्रा -2) साथ काटा.
- दाँतेदार संदंश विदारक सूक्ष्म साथ एक पक्ष के वृषण वसा पैड ले लो और वृषण बेनकाब करने के लिए यह पुल, वीएएस deferens और अधिवृषण. वीएएस deferens वृषण को औसत दर्जे का है और यह पसंद वृषण दीवार से जुड़ी नहीं एक स्पष्ट रूप से पहचाने मुक्त ट्यूब (है एक रक्त वाहिका एक तरफ (चित्रा 2 डी) के साथ चलने के साथ अधिवृषण).
- वे लाल बारी जब तक एक सूक्ष्म विदारक दाँतेदार संदंश, लौ ड्रेसिंग संदंश के साथ वीएएस deferens होल्डिंग (चित्रा 2 ई (चित्रा 2 एफ) एक बार में दो अंक में वीएएस deferens कटौती और दाग़ना करने के लिए उन्हें इस्तेमाल करते हैं. कटौती के बारे में 5 मिमी के एक हिस्से को हटा दें और दो स्पष्ट रूप से अलग cauterized समाप्त होता है (चित्रा 2 जी) छोड़ देना चाहिए.
- वापस उदर गुहा को अंडकोष, अधिवृषण और वीएएस deferens ले जाएँ.
- अन्य अंडकोष में चरण 9 से आगे बढ़ें.
- 5/0 absorbable सिवनी (चित्रा 2H) के साथ किए गए एक या दो क्षैतिज गद्दा टांके के साथ मांसपेशियों सीवन.
- एक या दो घाव कतरनी (चित्रा 2I) के साथ त्वचा सीवन.
- , Vasectomised पुरुष (कान की अंगूठी, अंगुली टैटू ...) पहचानें यह एक गर्म मंच पर रखा पिंजरे कदम है और यह संज्ञाहरण से ठीक है जब तक निरीक्षण (प्रति सजग और sternal अवलंबन बनाए रखने). गर्म नमकीन घोल का 0.5-1 एमएल चमड़े के नीचे इंजेक्शन फिर से बेहतर बनाता हैcovery. , पुरुष नसबंदी स्थानांतरण के दौरान होने वाली संभव घटनाओं रिकॉर्ड पीने के पानी के लिए एंटीबायोटिक जोड़ने.
- घाव क्लिप 10 दिनों एक घाव क्लिपर पदच्युत या दांत संदंश की एक जोड़ी के साथ पुरुष नसबंदी के बाद हटाया जा सकता है. vasectomized पुरुष सर्जरी के बाद 2 सप्ताह दोस्त के लिए तैयार हो जाएगा.
- प्राप्तकर्ताओं प्राप्त करने के लिए यह प्रयोग करने से पहले उपजाऊ महिलाओं के साथ संभोग से vasectomized पुरुष के बांझपन का परीक्षण करें.
3. Utero-ट्यूबल भ्रूण स्थानांतरण
- माउस morulae या ब्लास्टोसिस्ट्स 2.5 डीपीसी पर एक pseudopregnant प्राप्तकर्ता महिला को इस तकनीक से स्थानांतरित किया जा सकता.
- भ्रूण में गड़बड़ी कांच विंदुक तैयार:
- पिपेट धारक हानिकारक से बचने के क्रम में कांच capillaries के सुझावों को पोलिश.
- थोड़ा घूर्णन, जबकि ठीक एक लौ के साथ हीटिंग द्वारा गिलास केशिका का मध्य भाग नरमsynchronously दोनों हाथों से केशिका. केशिका अनुभाग मुलायम और प्रकाश (लाल रंग) निंदनीय हो जाता है, लौ से जल्दी से इसे वापस लेने और 130-150 मीटर तक इसकी बाहरी व्यास संकीर्ण करने के लिए दोनों सिरों खींच.
- कांच शांत और फिर धीरे से एक हीरा सूत्री पेंसिल, घर्षण पत्थर या नाखून फाइल के साथ संकीर्ण भाग स्कोरिंग और दोनों पक्षों से खींच कर यह कटौती करने के लिए रुको. ब्रेक के साफ और सीधा होना चाहिए
- एक 100-130 माइक्रोन एपर्चर छोड़ रहा है, बहुत जल्दी ज्वलंत द्वारा टिप पोलिश. Pipettes बाद में उपयोग के लिए भंडारित किया जा सकता है.
- गर्म भ्रूण हेरफेर मीडिया (CZBH या M2, चर्चा देखें).
- , सर्जिकल उपकरणों जीवाणुरहित सर्जरी प्रदर्शन किया जाएगा, जहां सतहों को साफ और 70% इथेनॉल के साथ उन्हें मिटा.
- पहले से सजगता के नुकसान के लिए जाँच, (प्रोटोकॉल 1) विस्तृत रूप में संज्ञाहरण प्रदर्शन करना.
- टी रखते हुएवह एक गर्म मंच पर माउस, घुटनों और बाहर पसलियों (आंकड़े 3 ए और 3 बी) के बीच पृष्ठीय क्षेत्र से बिजली कतरनी के साथ फर हटा दें.
- 10% povidone आयोडीन और 70% इथेनॉल के साथ अनुक्रमिक पोंछते द्वारा मुंडा क्षेत्र sanitize.
- Prewarmed भ्रूण हेरफेर मीडिया को इनक्यूबेटर से भ्रूण ले जाएँ.
- Stereomicroscope के तहत एक गर्म चरण के लिए प्राप्तकर्ता ले जाएँ और (अपने सिर सही या सर्जन के बाईं ओर करने के लिए तलाश के साथ) सर्जन को laterally प्रवण स्थिति में डाल दिया है.
- मुंडा क्षेत्र को प्रकाश में लाने के लिए एक छेद के साथ एक बाँझ तौलिया के साथ क्षेत्र को कवर और शल्य चिकित्सा के क्षेत्र रोशन.
- पिछले पसली और कमर और पीठ और पेट (आंकड़े 3A एक के बीच लाइन के पृष्ठीय ⅓ के बीच लाइन के कपाल ⅓ पर स्थित एक जगह में त्वचा में एक 1 सेमी आड़ा (ऊर्ध्वाधर) चीरा प्रदर्शनएन डी -3 बी). दाँतेदार संदंश ड्रेसिंग के साथ त्वचा पकड़ो और कैंची (चित्रा -3 सी) के साथ काटा.
- त्वचा में कटौती की गई है, अंडाशय (लाल / नारंगी) या अंडाशय (सफेद) आसपास वसा पैड शरीर दीवार के माध्यम से देखे जा सकते हैं. चीरा किसी भी बड़ी रक्त वाहिका में कटौती नहीं करता है, जहां एक जगह में अंडाशय या वसा पैड पर शरीर दीवार में एक 0.3-0.5 सेमी आड़ा (ऊर्ध्वाधर) चीरा प्रदर्शन करना. सूक्ष्म विदारक दाँतेदार संदंश के साथ मांसपेशियों को पकड़ो और कैंची (चित्रा 3 डी) के साथ काटा.
- उसके सिर सर्जन की ओर का सामना करना पड़ है करने के लिए माउस ले जाएँ.
- भ्रूण में गड़बड़ी पिपेट (चित्रा 3E) लोड:
- CZBH मीडिया व्यापक हिस्से के बारे में 5 मिमी तक हेरफेर पिपेट की संकीर्ण भाग के माध्यम से कैशिकता से चढ़ना करने की अनुमति दें.
- एक छोटे हवाई बुलबुले (0.2-0.5 मिमी) को ले लो.
- में भ्रूण (5-10) परिचयमीडिया की एक न्यूनतम राशि (2-4 मिमी).
- एक अन्य छोटे हवाई बुलबुले (0.2-0.5 मिमी) और मीडिया की एक छोटी राशि (0.5-1 एमएम) को ले लो.
- मुंह वातशोषक धारक को या कदम 3.17 के लिए तैयार हाथ से संचालित डिवाइस, से जुड़ी कांच विंदुक छोड़ दें.
- सूक्ष्म विदारक दाँतेदार संदंश के साथ अंडाशय आसपास वसा पैड ले लो और अंडाशय, डिंबवाहिनी, और उदर गुहा के बाहर ऊपरी गर्भाशय के एक छोटे से हिस्से (आंकड़े 3F और 3 जी) का पर्दाफाश करने के लिए माउस सिर की ओर खींच.
- डिंबवाहिनी के लिए कदम और (डिंबवाहिनी गर्भाशय से मिलता है, जहां IE) utero-ट्यूबल जंक्शन बेनकाब करने के लिए सूक्ष्म विदारक दाँतेदार संदंश के साथ वसा पैड हड़पने, इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार है, मुंह में वातशोषक मुँह टुकड़ा धारण.
- सुलभ utero-ट्यूबल जंक्शन ध्यान में रखते हुए, (सही सौंप दिया हो) अपने बाएँ हाथ से मामूली घुमावदार सूक्ष्म विच्छेदन संदंश लेने के लिए और बस से नीचे उन्हें जगहउस हिस्से को ऊपर 2 मिमी के बारे में डिंबवाहिनी हथियाने utero-ट्यूबल जंक्शन.
- मामूली घुमावदार सूक्ष्म विच्छेदन संदंश के साथ utero-ट्यूबल जंक्शन होल्डिंग, एक 27 जी सुई (चित्रा 3H) के साथ संदंश के करीब डिंबवाहिनी अनुभाग पंचर.
- Utero-ट्यूबल जंक्शन के माध्यम से गर्भाशय को सुई और अग्रिम के साथ प्रदर्शन मुंह में भ्रूण हेरफेर पिपेट डालें (3I और 3J आंकड़े). पिपेट utero-ट्यूबल जंक्शन (चित्रा 3K) पारित हो जाने के बाद इसे आसानी से स्लाइड. मलबे से एंडोमेट्रियल क्षति (कोई 3 से अधिक मिमी) और पिपेट अवरुद्ध रोकने के गर्भाशय में बहुत दूर तक प्रगति नहीं है.
- धीरे (चित्रा 3L) बह द्वारा गर्भाशय में भ्रूण रिलीज. दोनों हवाई बुलबुले गर्भाशय के माध्यम से गुजरना होगा. पहली बुलबुला ऊपर मीडिया के कुछयह भी गर्भाशय में जारी की है, लेकिन यह आरोपण में बाधा हो सकती है, और अधिक हवा शुरू करने से बचने की जा सकती है.
- भ्रूण गर्भाशय में जारी किया गया है बस के बाद पिपेट निकालें.
- डिंबवाहिनी ले जाएँ और वसा पैड हथियाने से वापस उदर गुहा को अंडाशय.
- 5/0 absorbable सिवनी (चित्रा 3 एम) के साथ एक क्षैतिज गद्दा सिलाई के साथ मांसपेशियों सीवन.
- एक घाव क्लिपर (चित्रा 3N) के साथ त्वचा सीवन.
- यदि जरूरी हुआ तो दूसरी तरफ चरण 10 से आगे बढ़ें.
- , प्राप्तकर्ता (कान की अंगूठी, अंगुली टैटू ...) पहचानें (एक गर्म मंच पर रख दिया गया) अपने पिंजरे के लिए यह कदम है और यह संज्ञाहरण से ठीक है जब तक निरीक्षण (प्रति सजग और sternal अवलंबन बनाए रखने).
- भ्रूण स्थानांतरण के दौरान होने वाली संभव घटनाओं व्याख्या और पीने के पानी के लिए एंटीबायोटिक जोड़ने. गर्म साली की एक 0.5-1 एमएल चमड़े के नीचे इंजेक्शनपूर्वोत्तर के समाधान वसूली में सुधार.
- घाव क्लिप 10 दिनों एक घाव क्लिपर पदच्युत या संदंश (चित्रा 3O) के दो जोड़े के साथ भ्रूण स्थानांतरण के बाद हटाया जा सकता है. प्राप्तकर्ता गर्भावस्था का आकलन और पिल्ले की संख्या का अनुमान लगाने के लिए उस दिन पर तौला जा सकता है. 15 दिनों भ्रूण स्थानांतरण के बाद प्राप्तकर्ता को पोटा सामग्री प्रदान करें.
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Representative Results
Utero-ट्यूबल भ्रूण स्थानांतरण गर्भाशय भ्रूण स्थानांतरण 2,9,10 के लिए संबंधित जटिलताओं के कुछ से बचने के गर्भाशय में भ्रूण स्थानांतरण करने के लिए एक मतलब प्रदान करता है. 1 टेबल में हम हम वर्णित प्रोटोकॉल के बाद CD1 प्राप्तकर्ताओं को जोड़तोड़ के विभिन्न प्रकार के अधीन CD1 ब्लास्टोसिस्ट्स स्थानांतरित प्राप्त किया है कुछ प्रतिनिधि परिणाम दिखाते हैं. अवधि (एक पिल्ला में जिसके परिणामस्वरूप भ्रूण का%) या (lentivirus उजागर करने के मामले में) E15 के लिए अस्तित्व के लिए अस्तित्व युग्मनज चरण (IVC) से इन विट्रो में बस सुसंस्कृत भ्रूण, कैमेरिक पिल्ले उत्पन्न करने के लिए iPSC इंजेक्शन के अधीन भ्रूण के बीच समान है और उनके Zona हटा दिया था और भ्रूण स्थानांतरण से पहले 7 घंटे के लिए lentivirus से अवगत कराया गया है कि भ्रूण. इसलिए, utero-ट्यूबल भ्रूण स्थानांतरण विशेष रूप से इस तरह के Zona pellucida कमी लोगों के रूप में जटिल और lentivirus के साथ incubated भ्रूण स्थानांतरित करने के लिए एक विश्वसनीय तकनीक है.
चित्रा 1. Ketamine-Xylazine. बी) नेत्र मरहम की Buprenorphine. सी) आवेदन के चमड़े के नीचे इंजेक्शन के anesthetics और दर्दनाशक दवाओं के इंजेक्शन. ए) intraperitoneal इंजेक्शन.
चित्रा 2. . एक लाल "X" के साथ दिखाया गया नसबंदी प्रोटोकॉल) चीरा बिंदु () के बारे में 1 सेमी लिंग के ऊपर रखा जाता है;.. लिंग ऊपर 0.5-2.5 सेमी (काली लाइनें) बी) त्वचा चीरा सी) स्नायु चीरा से फर हटा दें. डी) वीएएस deferens (काला तीर) और परीक्षण(*). ई) एक बार में दो अंक में वीएएस deferens का दाग़ना. एफ) दाग़ना के लिए संदंश की ज्वलंत है. जी) वीएएस deferens स्पष्ट रूप से दो cauterized सिरों में अलग कर दिया. एच) स्नायु सिवनी. मैं) त्वचा सीवन. यहां क्लिक करें बड़ी छवि को देखने के लिए.
चित्रा 3. Utero-ट्यूबल भ्रूण ट्रांसफर प्रोटोकॉल ए, बी) पृष्ठीय और एक लाल "X" के साथ दिखाया गया चीरा बिंदु के पार्श्व दृश्य ();. पिछले पसली और कमर के बीच काली लाइनें (ए, बी) और पीठ और पेट के बीच में (बी) एक गाइड. सी) त्वचा चीरा के रूप में सेवा करते हैं.
| उपचार | तबादलों की संख्या | तबादला भ्रूण | वितरित पिल्ले | टी के लिए जीवन रक्षाएर्म (%) |
| IVC | 11 | 110 | 82 | 74.5 |
| iPSC इंजेक्शन | 3 | 50 | 35 | 70.0 |
| Lentivirus | 6 | 60 | 44 | 73.3 |
तालिका 1. प्रतिनिधि परिणाम utero-ट्यूबल भ्रूण स्थानांतरण निम्नलिखित चालाकी भ्रूण के तीन अलग अलग समूहों में परिवर्तित करने के बाद प्राप्त की. 1) भ्रूण सुसंस्कृत इन विट्रो (IVC) युग्मनज चरण से ब्लास्टोसिस्ट चरण के लिए, 2) 10 करारनामों के साथ इंजेक्शन विवो उत्पादित ब्लास्टोसिस्ट्स मेंई iPSC काइमेरिक चूहों उत्पन्न करने के लिए, 3) में विवो उनके Zona हटा दिया था और GFP व्यक्त एक lentivirus के साथ 7 घंटे के लिए incubated रहे थे कि ब्लास्टोसिस्ट्स का उत्पादन किया. डाटा हमल आगे प्रगति करने की अनुमति नहीं किया गया था के रूप में वे, 10 दिनों भ्रूण स्थानांतरण के बाद व्यवहार्य भ्रूण की संख्या का प्रतिनिधित्व करते हैं जहां lentivirus उजागर समूह, के लिए छोड़कर हस्तांतरित भ्रूण की संख्या से बाहर का जन्म पिल्ले की संख्या का प्रतिनिधित्व करते हैं.
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Discussion
पुरुष नसबंदी प्रमुख कठिनाइयों को शामिल नहीं करता है कि एक अपेक्षाकृत सीधे आगे सर्जिकल तकनीक है. Povidone आयोडीन और इथेनॉल के साथ sanitizing जब यह पेरिटोनियम में जलन पैदा कर सकता है के रूप में (इथेनॉल) के साथ पिछले धोने, povidone आयोडीन को हटा सुनिश्चित करें. वीएएस deferens के लिए उपयोग भी अंडकोश की थैली या पेट 8 में एक आड़ा चीरा प्रदर्शन से हासिल किया जा सकता है. अंडकोषीय चीरा कारण जरूरत अपेक्षाकृत छोटा चीरा और थोड़ा बेहतर पश्चात व्यवहार करने के लिए 11 पेट चीरा आड़ा करने की सिफारिश की गई है. यह दो बार एक ही वीएएस deferens cauterizing और एक कार्यात्मक वीएएस deferens छोड़ने से नौसिखिए सर्जन को रोकने, दोनों अंडकोष से वासा deferentia के लिए एक आसान और साफ पहुँच प्रदान करता है तथापि, क्योंकि हम अंडकोषीय अधिक पेट चीरा पसंद करते हैं. दोनों पेट तकनीकों के बीच, हम transver अधिक Linea अल्बा में अनुदैर्ध्य चीरा पक्षसाल यह उदर हर्निया के विकास से परहेज है, किसी भी पेट पेशी फाइबर में कटौती नहीं करता है. हालांकि, पुरुष नसबंदी और utero-ट्यूबल भ्रूण स्थानांतरण प्रोटोकॉल दोनों उपलब्ध उपकरणों के लिए या शोधकर्ता की व्यक्तिगत पसंद के लिए अनुकूलित किया जा सकता. उदाहरण के लिए, एक ग्लास मनका अजीवाणु वीएएस deferens दाग़ना करने के लिए इस्तेमाल संदंश गर्म करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. किसी भी मामले में, यह एक सड़न रोकनेवाला तकनीक का पालन करने के लिए पशु कल्याण को अधिकतम करने के क्रम में उचित संज्ञाहरण और analgesia प्रदान करने के लिए, और स्थानीय नियमों का पालन करने के लिए आवश्यक है.
संशोधनों के लिए अतिसंवेदनशील एक और पहलू संज्ञाहरण प्रोटोकॉल है. Inhalational संज्ञाहरण (isoflurane) उपलब्ध है, तो यह एक बहुत ही स्थिर संज्ञाहरण विमान और तेजी से वसूली प्रदान करता है, जैसा कि हम, बजाय Parenteral (इंजेक्शन) संज्ञाहरण के अपने प्रयोग के लिए प्रोत्साहित करते हैं. हालांकि, यह inhalational संज्ञाहरण अभी एडमिनिस्ट्रेशन या होना चाहिए जो अंतर और बाद operatory दर्द के लिए एक एनाल्जेसिक के उपयोग की आवश्यकता है कि राज्य के लिए महत्वपूर्ण हैpremedication के रूप में सर्जरी से पहले stered. Buprenorphine माउस 12 में लंबे समय तक analgesia प्रदान कि एक opioid है. Parenteral संज्ञाहरण भी इस तरह के पुरुष नसबंदी और भ्रूण स्थानांतरण के रूप में कम प्रक्रियाओं के लिए एक अच्छा संवेदनाहारी विमान प्रदान करता है. Ketamine-Xylazine माउस सर्जरी 13 के लिए एक बहुत ही विश्वसनीय संयोजन है और हम buprenorphine साथ premedication के साथ संयोजन के रूप में इस संयोजन का उपयोग कर किसी भी संवेदनाहारी जटिलताओं कभी नहीं देखा है. अन्य Parenteral संयोजनों 12 इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन हम (tribromoethanol) Avertin मादक मिश्रण के उपयोग को हतोत्साहित, केवल एक खुराक प्रशासन जा सकता है और कई लेख ऐसे स्थानीय जलन, गरीब पीड़ानाश, आन्त्रावरोध रूप में इसके उपयोग के साथ जुड़े विविध जटिलताओं को सूचित किया है , उदर गुहा, subperitoneal मांसपेशी फाइबर और पेट अंगों की सतह के गल जाना, और यहां तक कि मृत्यु दर 14-18 में रेशेदार adhesions.
भ्रूण स्थानांतरण दोनों भ्रूण का अच्छा प्रबंधन की आवश्यकता है एकडी प्राप्तकर्ता. स्तनधारी भ्रूण स्थानांतरण के लिए एक सामान्य नियम के रूप में, भ्रूण के विकास के चरण में अधिक प्राप्तकर्ता के pseudopregnancy मंच से उन्नत नहीं, बल्कि विपरीत हो सकता है. दूसरे शब्दों में, भ्रूण मां के लिए इंतजार कर सकते हैं, लेकिन मां भ्रूण के लिए इंतजार नहीं कर सकते, तो इस तकनीक morulae या ब्लास्टोसिस्ट्स स्थानांतरित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन पहले नहीं चरणों. Utero-ट्यूबल भ्रूण स्थानांतरण दो दिनों utero-ट्यूबल जंक्शन डिंबवाहिनी से भ्रूण की प्राकृतिक पारगमन की अनुमति के लिए खुला है, जब शाम रात तक दोपहर (2.5 डीपीसी) से योनि प्लग का पता लगाने (3 डीपीसी), के बाद किया जा सकता है गर्भाशय सींग के लिए. तबादला भ्रूण पहले से ही जोड़ - तोड़ के कुछ प्रकार से पीड़ित हो सकता है, विचार है कि भ्रूण से निपटने के लिए किसी भी आगे के नुकसान को कम करना चाहिए. माउस भ्रूण हेरफेर के लिए एक उत्कृष्ट गाइड नेगी एट अल में पाया जा सकता है. 8 में नियमित रूप में एक शारीरिक पीएच पकड़ जो दो सबसे अधिक इस्तेमाल माउस भ्रूण हेरफेर मीडिया,निःशुल्क, CZBH 19 और M2 20 हैं. विवो उत्पादित माउस भ्रूण में लंबी अवधि के 21 के लिए ठंडे तापमान या असामान्य पीएच के लिए जोखिम को दूर कर सकते हैं, जोड़ - तोड़ मीडिया prewarmed किया जाना चाहिए. मीडिया एक संस्कृति डिश में prewarmed है तो मीडिया की परासारिता वजह से पानी के वाष्पीकरण को बढ़ाने के लिए और है कि ठंड हेरफेर मीडिया से हानिकारक हो सकता है, के रूप में, लंबी अवधि (40 से अधिक मिनट) के लिए वार्मिंग से बचने. इसी तरह, भ्रूण हेरफेर पिपेट अंदर बिताए समय की वजह से पिपेट में मौजूद छोटे मात्रा को कम किया जाना चाहिए.
एक उचित भ्रूण में गड़बड़ी पिपेट का उपयोग प्रोटोकॉल की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है. हेरफेर pipettes एक पतली कांच की दीवार के साथ कांच capillaries से बनाया जा सकता है. अक्सर बड़े जानवर भ्रूण को संभालने के लिए इस्तेमाल किया पाश्चर pipettes, भी नियोजित किया जा सकता है, लेकिन कारण टिप के लिए हैंडल से अपनी कम दूरी के लिए, कांच capillaries से किए गए हेरफेर pipettes अधिक comf हैंपैंतरेबाज़ी करने ortable. खींच की लौ और गति के लिए जोखिम दीवार मोटाई और पिपेट का भीतरी व्यास का निर्धारण. कुछ अभ्यास, चालक और माइक्रो फोर्ज भी इस्तेमाल किया जा सकता है के बाद जोड़ - तोड़ pipettes आसानी से हाथ से किया जा सकता है. यह कई इष्टतम हेरफेर pipettes उत्पादन में समय का निवेश करने के लिए महत्वपूर्ण है. जोड़ - तोड़ पिपेट एपर्चर एक निर्बाध प्रवाह की अनुमति के लिए एक भ्रूण से अधिक व्यापक हो सकता है, लेकिन आसानी से घुसना और utero-ट्यूबल जंक्शन के माध्यम से प्रगति करने के लिए पर्याप्त छोटे. चाहिए Zona pellucida हस्तांतरण से पहले हटा दिया गया है, तो ब्लास्टोसिस्ट्स आमतौर पर एक बड़ा व्यास के लिए विस्तार. इस मामले में, यह ट्रोफेक्टोडर्म कोशिकाओं को कोई नुकसान से बचने के लिए एक व्यापक एपर्चर (130-180 माइक्रोन) के साथ व्यापक pipettes बनाने के लिए सलाह दी जाती है. Zona हटा दिया गया है, खासकर अगर और मलबे से अवरुद्ध किया जा रहा से पिपेट टिप से बचने के लिए - टिप पोलिश डिंबवाहिनी, गर्भाशय की दीवार और भ्रूण को नुकसान पहुँचाए से बचने के लिए महत्वपूर्ण है. हालांकि, चमकाने के बाद, एपर्चर पता होना चाहिएव्यास में तेजी से कमी प्रवाह की गति में अचानक परिवर्तन का कारण होगा के रूप में ओ.टी., पिपेट का भीतरी व्यास के साथ तुलना में बहुत छोटा हो. वातशोषक मुखपत्र एक अधिक सटीक प्रवाह नियंत्रण के साथ ही हाथ से नियंत्रित उपकरणों की तुलना में एक और अधिक आरामदायक स्थिति हाथ प्रदान करता है. (उदाहरण के लिए lentivirus इलाज भ्रूण से छेड़छाड़ हो) यदि जरूरी हुआ तो फिर भी, एक हाथ से नियंत्रित डिवाइस का इस्तेमाल किया जा सकता है. एक इष्टतम प्रवाह और खनिज तेल के हस्तांतरण से बचने के लिए, यह बजाय हेरफेर मीडिया के लिए संस्कृति मीडिया से भ्रूण स्थानांतरित करने के लिए प्रयोग किया जाता है कि के भ्रूण स्थानांतरण के लिए एक नया पिपेट का उपयोग करने के लिए भी सलाह दी जाती है. अंत में, डिंबवाहिनी के माध्यम से पिपेट को शुरू करते हुए, केशिका यानी, सीधे नियंत्रित किया जाना चाहिए. एक फर्म पकड़ प्राप्त करने के लिए, कांच और नहीं वातशोषक का प्लास्टिक संभाल हथियाने. भ्रूण स्थानांतरण के लिए इस्तेमाल किया बढ़ाई सर्जन के दृश्य तीक्ष्णता पर निर्भर करता है कि एक निजी मामला है. हम एक व्यापक दृश्य क्षेत्र है करने के लिए कम बढ़ाई उपयोग करने के लिए पसंद करते हैं,इसलिए हम एक 10X अंतिम बढ़ाई (10X आंख और 1X उद्देश्य) का उपयोग करें.
प्राप्तकर्ताओं में कम से कम 8 सप्ताह पुराना हो सकता है और 27-40 ग्राम के बीच तौलना चाहिए. ऐसे CD1 या स्विस वेबस्टर के रूप में चूहों एक अच्छा मातृ व्यवहार प्रदर्शित करने और उत्कृष्ट प्राप्तकर्ता हैं Outbreed. उपयोग नहीं किया उन दो सप्ताह में अपनी सामान्य साइकिल चालन गतिविधि ठीक हो जाएगी, क्योंकि यह अतिरिक्त प्राप्तकर्ताओं प्राप्त करने के लिए प्रजनन स्थापित करने के लिए सलाह दी जाती है. Mated होने के बावजूद, कुछ महिलाओं निगम ल्युटिया (चित्रा 3 जी) नहीं हो सकता है और इसलिए स्थानांतरित कर भ्रूण को स्वीकार नहीं करेंगे. इस कारण से, अंडाशय 2.5 पर डीपीसी स्पष्ट रूप से अंडाशय (चित्रा 3F) में लाल उज्ज्वल संरचनाओं के रूप में पहचाना जा सकता है जो निगम ल्युटिया, की उपस्थिति के लिए जाँच की जानी चाहिए. अंडाशय और गर्भाशय के अत्यधिक हेरफेर luteolysis में हो सकता है, सर्जरी के दौरान यह बजाय डिम्बग्रंथि वसा पैड हथियाने द्वारा प्रजनन पथ के साथ संपर्क को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है. manipulatio की शुरूआतडिंबवाहिनी में पता पिपेट प्रोटोकॉल का सबसे जटिल कदम है. कुछ प्राप्तकर्ताओं में, डिंबवाहिनी बहुत मुड़ जाता है और गर्भाशय के साथ जंक्शन से 2 मिमी सीधे खिंचाव नहीं है. उस मामले में डिंबवाहिनी की व्यवस्था है और पहले मोड़ में पंचर प्रदर्शन करते हैं. ऊपर विस्तृत रूप में, एक अच्छा हेरफेर पिपेट वास्तव में एक फर्क पड़ता है. पिपेट utero-ट्यूबल जंक्शन के माध्यम से पारित कर दिया गया है, यह आसानी से स्लाइड. यदि ऐसा नहीं होता, पिपेट डिंबवाहिनी से भटक और गर्भाशय लुमेन तक पहुँच नहीं हो सकता है. मीडिया प्रवाह नहीं है अगर एक बार गर्भाशय के अंदर, थोड़ा बाहर या में पिपेट कदम है और फिर कोशिश करें. यह अभी भी प्रवाह नहीं करता है, पिपेट हेरफेर मीडिया के साथ पकवान में सामग्री जारी है और उसी या अन्य पिपेट पुनः लोड, गर्भाशय से इसे बाहर ले, भरा हुआ है. डिलिवरी आमतौर पर भ्रूण स्थानांतरण के बाद 17 दिनों जगह लेता है. नरभक्षण रोकने के लिए, अग्रिम में 2 दिनों सामग्री पोटा प्रदान करने और प्रसव के बाद पहले दिन के दौरान पिंजरे बदल नहीं है.
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Disclosures
लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की घोषणा.
Acknowledgments
इस काम बीटी के लिए पशु और पक्षी विज्ञान विभाग से धन के द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | VEDCO | Ketaved ANADA 200-257 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | Anased NADA #139-236 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Buprenorphine | Generic | NDC 400-42-010-01 | To be ordered by a licensed veterinarian. |
| Eye ointment | Novartis | Genteal | |
| Antibiotic | Pfizer | Clavamox NADA #55-101. | Added to drinking water (0.3 mg/ml of amoxicillin trihydrate and 0.075 mg/ml of clavulanate potassium). Add 1.5 ml of the reconstituted 15 ml bottle to 250 ml of water. |
| Dressing serrated forceps | ROBOZ | RS-8120 | Any medium size surgical-grade steel straight forceps will work. |
| Microdissecting serrated forceps | ROBOZ | RS-5137 | These ones are curved at a 90º angle. Straight forceps can be used if preferred. |
| Slight curved micro dissection forceps | ROBOZ | RS-5136 | This model is particularly useful to hold the oviduct. |
| Scissors | ROBOZ | RS-5880 | Any regular surgical grade steel small straight scissors will work. |
| 27 G needles | Beckton-Dickinson | 305136 | Smaller needles (30 G) can be also used. 25 G may be a bit too big. |
| Clip applier | MiKRon | 42763 | |
| 9 mm Clips | MiKRon | 427631 | |
| Clip remover | MiKRon | 7637 | Two pairs of teeth forceps (ROBOZ RS-8160) can be used instead. |
| Suture needle holder | ROBOZ | RS-7820 | |
| Suture | Dowist Gell | 5-0 Dexon S 7204-21 | Can be substituted for any 4-0 to 6-0 absorbable suture with a narrow curved needle. |
| Glass capillaries | VWR | 100 ul calibrated pipettes 53432-921 | It includes a mouth aspirator system that only requires to attach a 0.22 µm filter in the tubing to be ready to use. More information can be obtained in Nagy et al.8 |
| Burner | KISAG AG | Typ 2002 | Gas operated burner, can be charged with Kigas (CH-4512, from the same vendor). Alcohol burners may be also used, but gas provides a higher temperature and this burner provides a small and precise flame. |
| Stereomicroscope | Leica | MZFLIII | This is an expensive estereomicroscope with fluorescence, that can be also used for other purposes. There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few. It is better to use two stereomicroscopes, one for handling the embryos (which does not need to be a very nice one) and another one for the recipient. The one used for the recipient should display a long distance from the stage plate to the objective lense, in order to be able to focus 3-4 cm above the stage plate (where the oviduct will be placed) and still leave some room for the surgeon; most of the stereomicroscopes can do this, but some cannot. |
| Fiber optics ilumination | Dolan Jenner | Fiber lite | To iluminate the surgical area. There are different systems available. |
| Warm stages | American scope | http://store.amscope.com/tcs-100.html | These can be placed over the stage plate of the stereomicroscope. Some modifications (inserting a stick to level the stage) may be needed if it is too short for the stereomicroscope. A big warm stage can be used for warming the cage if it is available. If not, a regular heating pad can be used, but temperature must be checked. |
| Culture dishes for embryo manipulation | Falcon | 353001 | 351008 may be also used; they made narrower drops. |
References
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