Utero-Tubal Embryo Transfer och vasektomi i musmodell

Summary

Utero-Tubal embryotransfer använder utero-Tubal korsningen som en barriär för att förhindra embryot utflöde som kan uppstå när du utför livmoderöverföring. Vasektomiserade män krävs för att få pseudo mottagare för embryoöverföring. Båda teknikerna diskuteras.

Abstract

Överföringen av preimplantatorisk embryon till en surrogat hona är ett obligatoriskt steg för produktion av genetiskt modifierade möss eller att studera effekterna av epigenetiska förändringar har sitt ursprung under preimplantatorisk utveckling på senare fosterutveckling och vuxenhälsa. Användningen av en effektiv och konsekvent embryotransfer teknik är avgörande för att stärka den generation av genetiskt modifierade djur och att fastställa effekten av olika behandlingar på implantation priser och överlevnad på sikt. Embryon vid blastocyststadiet överförs vanligtvis genom livmoderöverföring, utför en punktering i livmoderväggen för att införa embryomanipulation pipett. Öppningen utförs i livmodern inte stänga efter pipetten har dragits tillbaka, och embryona kan utflöde till bukhålan på grund av övertryck i livmodern. Punkteringen kan också producera en blödning som försämrar implantation, blockerar överföringspipetten och kan påverka embryo dtveckling, speciellt när embryon utan zona överförs. Följaktligen resulterar denna teknik ofta i mycket rörliga och övergripande låg embryo överlevnad. Att undvika dessa negativa effekter, utero-Tubal embryotransfer dra nytta av utero-Tubal korsningen som en naturlig barriär som hindrar embryo utflöde och undvika punktion av livmoderväggen. Vasektomiserade män krävs för att erhålla pseudo mottagare. En teknik för att utföra vasektomi beskrivs som ett komplement till den utero-Tubal embryotransfer.

Introduction

Embryotransfer är förmodligen den vanligaste kirurgiska proceduren utfördes i musmodell. Denna teknik är avgörande för att få avkomma från embryon som utsatts för in vitro-manipulation tekniker och utgör därför ett nödvändigt steg för utvecklingen av genetiskt modifierade modeller av pronukleär injektion, lentiviral transduktion eller chimär bildning. Dessutom gör tekniken studiet av utvecklingseffekter av olika förolämpningar som inträffar under preimplantatorisk utveckling. Användningen av konstgjord befruktning ¹ eller exponering för onormala halter av olika ämnen eller metaboliter ^{2 maj} påverka embryoutvecklingen resulterar i implantation eller placentation misslyckanden och långsiktiga effekter hos avkomman. En tillförlitlig och reproducerbar embryotransfer teknik är avgörande för att testa eventuella negativa effekter av den experimentella behandlingen om implantation och fosterutveckling på ett konsekvent människaner.

Murina preimplantatorisk embryon kan överföras till en mottagare hona antingen in i äggledaren via ampuller på 0,5 dagar efter coitum (DPC) pseudo mottagare (äggledare överföring) ^3,4 eller in i livmodern på 2,5 dpc pseudo mottagare (livmoderöverföring) ^5,6 beroende på deras utvecklingsstadium. Embryon vid blastocyststadiet, såsom de som användes för att generera chimära möss genom injektion av embryonala eller inducerade pluripotenta stamceller, överförs vanligtvis genom livmoderöverföring. Blastocyster kan också överföras till äggledaren hos en 0,5 dpc mottagaren, men den utgör en mindre fysiologiska test för utvecklingsstörningar störande eftersom embryot genomgår diapaus och har två dagar för att återhämta sig från insult innan implantationen sker. Livmoder byte innebär att punktera livmoderväggen med en smal nål i syfte att alstra en öppning som medger åtkomst av ett embryo manipulation pipetten i livmoderns lumen. ETTlthough denna teknik kan ge goda resultat, (det vill säga andelen embryon som utvecklas till en valp) är överlevnaden på sikt ofta låg och oförutsägbar ^7,8.

Punkterings av livmoderväggen medför några skadliga biverkningar. För det första är myometrium en mycket vaskulariserad vävnad och dess punktering resulterar ofta i en liten blödning. Blod kan blockera embryotransfer pipett eller invadera livmoderns lumen orsakar embryonal död och / eller implantation misslyckande. Detta är särskilt relevant när embryon utan zona överförs, eftersom blodkroppar och skräp kan fästa till blastomererna. För det andra gör öppningen utförs inte tätar efter embryon har överförts, så att de kan flyta tillbaka genom öppningen och utvisas till bukhålan då en för stor volym har introducera in i livmodern. Den utero-äggledarna embryoöverföring som beskrivs häri utnyttjar den utero-äggledarna korsning för att leverera den embryos i livmodern utan behov av punktering av livmoderväggen och därmed undvika de negativa konsekvenserna ^9.

De pseudo mottagande honor som används för embryoöverföring erhålls genom naturlig parning med vasektomiserade hanar ^8. De nyskapande sekret som produceras av en steril hane krävs för livmodern att bli mottaglig för de överförda embryon. För att få en mottagare, är högst 2 honor av 8 veckor till 6 månaders ålder placeras med en vasektomiserade hane på eftermiddagen. Följande morgon, är honor kontrolleras med avseende på förekomst av en vaginal samlag plugg, en klump koagulerat protein från den manliga sädesvätskan. Som parning inträffar vanligen under midnatt, är dagen för vaginal plugg upptäckt anses vara 0,5 DPC. Även vasektomiserade hanar kan köpas från vissa leverantörer, är relativt lätt det kirurgiska ingreppet som beskrivs här och inte kräver några ytterligare instrument än vad som krävs för embryoöverföring.

Protocol

Alla djurförsök godkändes av Beltsville området Djurvård och användning Comittees (BAACUC 11-015) enligt USDA Animal Care och användning Riktlinjer.

1. Anestesi och Analgesia (Gemensamt för båda kirurgiska ingrepp)

1. Väg musen och ladda följande bedövningsmedel och smärtstillande i två 1 ml sprutor med 27 G-nålar:
   1. Ketamin (0,1 mg / g: 0,01 ml / g av en 10 mg / ml lösning) och xylazin (0,01 mg / g: 0,005 ml / g av en 2 mg / ml lösning).
   2. Buprenorfin (0,1 ug / g: 0,01 ml av en 0,01 mg / ml lösning).
2. Immobilisera musen genom att plocka upp i nackskinnet av sin hals så nära käkarna som möjligt med tummen och pekfingret och hålla svansen mellan de små och ringfinger.
3. Injicera ketamin-xylazin blandning intraperitonealt. För att undvika att punktera inre organ, håll musen medhuvudet något under nivån för sina höfter (Figur 1A)
4. Injicera buprenorfin subkutant i nackskinnet av nack grepp mellan tummen och pekfingret (Figur 1B).
5. Lämna musen i buren (rena och utan något annat djur) på en varm stadium.
6. När medvetslös, kontrollera om avsaknaden av bakre fot reflex (kontrolleras av tå nypa). Applicera ögonsalva för att undvika torrhet i ögat och för att kontrollera om avsaknaden av ögonlocksreflexer (Figur 1C).
7. Protokollet ger en kirurgisk anestesi plan i minst 30 minuter, tillräckligt för att utföra de förfaranden som beskrivs nedan (protokoll 2 och 3). Om längre tid behövs, kan ytterligare en injektion av ketamin + xylazin med hälften av den dos som beskrivs i 1.1.1 tillämpas efter 30 min. En förändring i andningsmönstret för att en snabbare och oregelbunden ett indikerar loss av rätt anestesi planet.

2. Vasektomi

1. Använd en hane med en beprövad parningsförmågan.
2. Sterilisera kirurgiska instrument, rengöra ytorna där operationen ska utföras och torka av dem med 70% etanol.
3. Utför anestesi som tidigare i detalj (protokoll 1), kontroll av förlust av reflexer.
4. Placera musen på ett varmt skede avlägsna päls med elektriska hårklippningsmaskiner från den ventrala området mellan två imaginära tvärgående linjer placerade 0,5 cm och 2,5 cm över penis (Figur 2A).
5. Hygienbehandla det rakade området genom sekventiell torkning med 10% povidon-jod och 70% etanol.
6. Placera musen i liggande ställning med svansen mot kirurgen och locket med en steril handduk med ett hål exponerar det rakade området. Belysa operationsområdet.
7. Utför en 10-15 mm längd hud incision i mediallinjen av buken, cirka 1 cm över penis. Håll huden med dressing tandade pincett och sedan klippa med sax (fig. 2A och 2B).
8. Utför en 5-10 mm längsgående snitt i linea alba. Håll muskeln med microdissecting tandade pincett och skär med en sax (figur 2C).
9. Ta testikel fett pad på ena sidan med mikro dissekera tandade pincett och dra den för att avslöja testiklar, sädesledare och bitestiklar. Vas deferens ligger mediala till testiklarna och det är en klart urskiljbar fri rör (ej fäst testiklarna väggen som den epididymis) med ett blodkärl som går längs ena sidan (figur 2D).
10. Hålla sädesledaren med en mikro dissekera tandade pincett, brand dressing pincett tills de blir röda (figur 2E bränna sädesledaren på två punkter på en gång (figur 2F). Snittet bör ta bort en del av ca 5 mm och lämnar två tydligt separerade flamberats ändar (figur 2G).
11. Flytta testikeln, bitestiklarna och sädesledarna tillbaka till bukhålan.
12. Fortsätt från steg 9 i den andra testikeln.
13. Sutur muskeln med en eller två horisontella madrass stygn gjorda med 5/0 absorberbara suturer (Figur 2H).
14. Sutur huden med en eller två lindade klippare (fig. 2i).
15. Identifiera vasektomiserad manlig (öronring, finger tatuering ...), flytta den buren placeras på en varm scen och observera tills den återhämtar sig från anestesi (medvetet och underhålla sternala VILA). En 0,5-1 ml subkutan injektion av varm koksaltlösning förbättrar reåterhämtning. Anteckna eventuella incidenter som inträffar under vasektomi överföring, lägga antibiotika i dricksvattnet.
16. Sårklämmor kan tas bort 10 dagar efter vasektomi med ett sår clipper remover eller ett par av tänder pincett. Den vasektomiserade män kommer att vara redo att para två veckor efter operationen.
17. Testa infertilitet hos vasektomiserade manliga genom parning med fertila honor innan du använder den för att få mottagarna.

3. Utero-Tubal Embryo Transfer

1. Mus morulae eller blastocyster kan överföras genom denna teknik till en pseudo mottagare hona på 2,5 DPC.
2. Förbered embryomanipulation glaspipett:
   1. Polera spetsarna på glaskapillärer för att undvika skador på pipetten hållaren.
   2. Mjuka upp ett mittparti av glaset kapillär genom upphettning med en fin flamma medan svagt roterandekapillären med båda händerna synkront. När kapillärsektionen blir mjukt och formbart (ljusröd färg), dra tillbaka den snabbt från lågan och dra båda ändarna för att begränsa dess yttre diameter på 130-150 nm.
   3. Vänta på glaset för att svalna och sedan skär den genom att lätt dödat den smala delen med en diamant-punkt penna, nötande sten eller nagelfil och dra från båda sidor. Avbrottet ska vara ren och vinkelrät
3. Polera spetsen genom att mycket snabbt flammande, lämnar en 100-130 um öppning. Pipetter kan lagras för senare användning.
4. Varm embryo manipulation media (CZBH eller M2, se diskussion).
5. Sterilisera kirurgiska instrument, rengöra ytorna där operationen ska utföras och torka av dem med 70% etanol.
6. Utför anestesi som tidigare i detalj (protokoll 1), kontroll av förlust av reflexer.
7. Att hålla than muspekaren över ett varmt skede avlägsna päls med elektriska hårklippningsmaskiner från den dorsala ytan mellan knäna och den distala ribbor (fig. 3A och 3B).
8. Hygienbehandla det rakade området genom sekventiell torkning med 10% povidon-jod och 70% etanol.
9. Flytta embryon från inkubatorn till den förvärmda embryomanipulation media.
10. Flytta mottagaren till en varm scen i stereomikroskop och placera den i liggande ställning i sidled till kirurgen (med huvudet tittar till höger eller vänster sida av kirurgen).
11. Täck området med en steril handduk med ett hål exponerar det rakade området och belysa det kirurgiska området.
12. Utför en 1 cm tvärgående (vertikal) snitt i huden på en plats som ligger på kraniella ⅓ av linjen mellan sista revbenet och höfterna och rygg ⅓ av linjen mellan ryggen och buken (fig. 3A ennd 3B). Håll huden med dressing tandade pincett och skär med en sax (Figur 3C).
13. När huden har skurits, kan äggstocken (röd / orange) eller fett pad omger äggstocken (vit) visualiseras genom kroppsväggen. Utför en 0,3-0,5 cm tvärgående (vertikal) snitt i kroppsväggen över äggstocken eller fett pad på en plats där snittet inte skär någon större blodkärl. Håll muskeln med mikro dissekera tandade pincett och skär med en sax (Figur 3D).
14. Flytta musen för att ha huvudet vänt mot kirurgen.
15. Ladda embryot manipulation pipett (Figur 3E):
    1. Tillåt CZBH medier för att stiga genom kapillärverkan genom den smala delen av manipulation pipetten tills ca 5 mm från den bredare delen.
    2. Ta upp en liten luftbubbla (0,2-0,5 mm).
    3. Presentera embryon (5-10) ien minimal mängd material (2-4 mm).
    4. Ta upp en annan liten luftbubbla (0,2-0,5 mm) och en liten mängd av medier (0,5-1 mm).
    5. Låt glaspipett bifogas munnen aspirator innehavaren eller till den handmanövrerad anordning, redo för steg 3.17.
16. Ta adipose dynan omgivande äggstocken med mikro dissekera sågtandade pincett och dra den mot musen huvud för att exponera i äggstockarna, äggledaren, och en liten del av den övre livmoder ur bukhålan (figurerna 3F och 3G).
17. Håll aspiratorn munstycket i munnen, redo att användas, ta tag i fett pad med mikro dissekera tandade pincett för att flytta äggledare och exponera utero-Tubal korsning (det vill säga där äggledaren möter livmodern).
18. Att hålla utero-Tubal korsningen tillgänglig, ta små böjda mikro dissektion pincett med vänster hand (om höger hand) och placera dem precis nedanförden utero-Tubal korsningen tag i äggledaren ungefär 2 mm över den delen.
19. Håll utero-Tubal korsningen med små böjda mikro dissektion pincett, punktera äggledare sektionen nära tången med en 27 G nål (figur 3H).
20. Sätt embryot manipulation pipetten i öppningen utförs med nålen och gå vidare till livmodern genom utero-Tubal korsningen (Siffror 3I och 3J). När pipetten har passerat utero-Tubal korsningen (figur 3K) den glider lätt. Inte utvecklas mycket långt in i livmodern för att förhindra endometrial skador (inte mer än 3 mm) och pipett blockering av skräp.
21. Släpp embryona i livmodern genom att försiktigt blåsa (Figur 3L). Båda luftbubblor måste passera genom livmodern. Några av de material över den första bubblankan också släppas ut i livmodern, men undvika att införa mer luft, eftersom det kan hämma implantation.
22. Avlägsna pipetten precis efter embryon har släppts in i livmodern.
23. Flytta äggledare och äggstock tillbaka till bukhålan genom att ta tag i fett pad.
24. Sutur muskeln med en horisontell madrass stygn med 5/0 absorberbara suturer (Figur 3 M).
25. Sutur huden med ett sår Clipper (Figur 3 N).
26. Fortsätt från steg 10 på den andra sidan om det behövs.
27. Identifiera mottagaren (öronring, finger tatuering ...), flytta den till sin bur (placerad på en varm scen) och observera tills den återhämtar sig från anestesi (medvetet och behålla sternala VILA).
28. Kommentera eventuella incidenter som inträffar under embryotransfer och lägga antibiotika i dricksvattnet. En 0,5-1 ml subkutan injektion av varmt saline lösning förbättrar återhämtningen.
29. Wound klipp kan tas bort 10 dagar efter embryotransfer med ett sår clipper remover eller två par pincett (Figur 3O). Mottagaren kan vägas på den dagen för att bedöma graviditet och uppskatta antalet valpar. Ge inbäddat material till mottagaren 15 dagar efter embryotransfer.

Representative Results

Utero-Tubal embryotransfer ger ett medel för att överföra embryon till livmodern att undvika några av de komplikationer i samband med livmoderembryotransfer ^2,9,10. I tabell 1 visar vi några representativa resultat vi har fått överföra CD1 blastocyster som utsätts för olika typer av manipulationer till CD 1-mottagare efter det protokoll som beskrivs. Överlevnaden för termen (% av embryon som resulterar i en valp) eller överlevnad till E15 (i fallet med lentivirus exponerad) liknar mellan embryon helt enkelt odlas in vitro från zygot stadiet (IVC), embryon utsatta för iPSC injektion för att generera chimära pups och embryon som hade deras zona bort och utsattes för lentivirus för 7 timmar före embryotransfer. Därför är utero-Tubal embryotransfer en tillförlitlig teknik för att överföra embryon särskilt komplicerade som de som saknar zona pellucida och inkuberas med lentivirus.

Figur 1. Injektion av narkosmedel och smärtstillande medel. A) intraperitoneal injektion av ketamin-xylazin. B) subkutan injektion av C) Tillämpning av ögonsalva Buprenorfin..

Figur 2. . Vasektomi protokoll A) Snittet punkten (avbildad med ett rött "X") placeras ca 1 cm ovanför penis, ta bort päls 0,5-2,5 cm över penis (svarta linjer) B) Hud snitt C) Muskel snitt... D) Vas deferens (svart pil) och provär (*). E) Flaming av pincetten för frätskador. F) frätskador av sädesledaren i två punkter på en gång. G) Vas deferens tydligt uppdelad i två flamberats ändar. H) Muscle sutur. I) Hud sutur. Klicka här för att visa en större bild.

Figur 3. A, B) Dorsal Utero-Tubal embryo transfer protocol och lateral av snittpunkten (avbildad med ett rött "X"). Svarta linjer mellan sista revbenet och höfterna (A, B) och mellan rygg och buk (B) fungera som en guide. C) Hud snitt. E) Embryo manipulation glaspipett laddad med 5 blastocyster redo att överföras. F, G) Representativa äggstockar med (F) eller utan (G) gulkroppar, indikeras med svarta pilar. HK) för representation , en simulering av utero-äggledarna embryoöverföring utfördes laddar ett glas manipulation pipett med 0,4% trypanblått lösning. H) Punktering av äggledaren (svart pil) nära livmodern (*). I) Införande av embryot manipulation pipetten i öppningen utfört tidigare. J) Embryot manipulation pipett avancerar genom utero-Tubal korsningen. K) En volym trypanblått lösning motsvarande den som släpptes i en embryoöverföring har utvisats i livmoderns lumen (svart pil). L) Till testa effektiv stängning produceras av utero-Tubal korsningen, helainnehåll manipulation pipetten släpptes in i livmodern, utero-Tubal korsningen (pil) hindrar återflöde av den trypanblått lösningen släpps ut i livmodern (*) M) Muskel sutur N) Hud sutur O) Klipp bort.... P) 15 dagar efter embryotransfer ge inbäddat material till mottagaren. Q) chimär kull erhölls efter denna teknik. Klicka här för att visa en större bild.

Behandling	Antal överföringar	Embryon	Ungar som levereras	Överlevnad till term (%)
IVC	11	110	82	74,5
iPSC injektion	3	50	35	70,0
Lentivirus	6	60	44	73,3

Tabell 1. Representativa resultat erhålls efter överföring av tre olika grupper av manipulerade embryon efter utero-Tubal embryotransfer. 1) Embryon odlas in vitro (IVC) från zygoten stadiet till blastocyststadiet, 2) in vivo producerade blastocyster injicerats med 10 mouse iPSC att skapa chimära möss, 3) in vivo-producerade blastocyster som hade deras zona bort och inkuberades under 7 timmar med en lentivirus uttrycker GFP. Data representerar antalet kutar som föds ur antalet embryon som överförs förutom lentivirus exponerade gruppen, där de utgör antalet livsdugliga foster 10 dagar efter embryoöverföring, eftersom dräktigheten inte var möjligt att komma vidare.

Discussion

Vasektomi är ett relativt enkelt kirurgisk teknik som inte innebär några större svårigheter. Vid preparering med povidon jod och etanol ser till att den sista tvätten (med etanol) avlägsnar povidon jod, eftersom det kan irritera bukhinnan. Tillgången till sädesledaren kan också uppnås genom att pungen eller att utföra en tvärgående snitt i buken ^8. Testikelcancer snitt har rekommenderats till övergripande buksnitt grund av den jämförelsevis mindre snitt behövs och något bättre postoperativa beteende ^11. Dock föredrar vi buksnitt över testikelcancer eftersom det ger en enklare och tydligare tillgång till vasa deferentia från båda testiklarna, förhindrar oerfarna kirurger från etsande två gånger samma sädesledaren och lämnar en funktionell sädesledaren. Mellan de båda buken tekniker, gynnar vi den längsgående snitt i linea alba över transversal eftersom den inte skär någon buken muskelfiber, undvika utvecklingen av buken bråck. Dock kan både vasektomi och utero-Tubal embryo överföringsprotokoll anpassas till tillgänglig utrustning eller till person lik av forskaren. Till exempel kan en glaspärla autoklav användas för att värma tången som används för att bränna sädesledaren. I varje fall är det viktigt att följa en aseptisk teknik, för att ge korrekt anestesi och smärtlindring för att maximera djurens välbefinnande, samt att följa gällande bestämmelser.

En annan aspekt är mottagliga för förändringar är anestesi-protokollet. Om inhalationsanestesi (isofluran) finns, uppmuntrar vi användning istället för parenteral (injicerbara) anestesi, eftersom det ger en mycket stabil anestesi plan och snabb återhämtning. Det är emellertid viktigt att konstatera att inhalationsanestesi kräver fortfarande användningen av ett analgetikum för intra-och postoperationssmärta, som bör vara administrastrerad innan operationen som premedicinering. Buprenorfin är en opioid som ger långsiktig smärtlindring i mus ^12. Parenterala anestesi ger också en bra bedövningsmedel plan för korta förfaranden såsom vasektomi och embryoöverföring. Ketamin-Xylazine är en mycket pålitlig kombination för mus operation ¹³ och vi har aldrig observerat några bedövande komplikationer med hjälp av denna kombination tillsammans med premedicinering med buprenorfin. Andra parente kombinationer kan användas ^12, men vi motverka användning av den narkotiska blandning avertin (tribromoethanol), eftersom bara en enda dos kan administrera och flera artiklar har rapporterat olika komplikationer i samband med dess användning, såsom lokal irritation, dålig smärtlindring, ileus , fibrösa sammanväxningar i bukhålan, nekros av subperitoneal muskelfibrer och bukorganen yta och även dödlighet ^14-18.

Embryoöverföring kräver god hantering av både embryon end mottagare. Som en allmän regel för embryoöverföring däggdjur, kan utvecklingsstadiet av embryona vara mer avancerad än den pseudodräktighet skede av mottagaren, men inte tvärtom. Med andra ord, kan embryona vänta på mamma, men mamman kan inte vänta på embryon, så denna teknik kan användas för att överföra morulae eller blastocyster, men inte tidigare skeden. Utero-Tubal embryotransfer kan utföras två dagar efter upptäckten av den vaginala kontakten från lunchtid (2,5 DPC) till kväll-natt (3 DPC), när utero-Tubal korsningen är öppen för att låta det naturliga transitering av embryon från äggledare till livmoderhornen. Med tanke på att de embryon kanske redan har drabbats av någon form av manipulation, bör embryo hantering minimera ytterligare skador. En utmärkt guide för musembryo manipulation kan hittas i Nagy et al. ⁸ De två mest använda mus embryo manipulation media, som har ett fysiologiskt pH i regelbunden vidatmosfären, är CZBH ¹⁹ och M2 ^20. Även in vivo-producerade musembryon kan övervinna exponering för kyla eller onormal pH under långa perioder ^21, bör manipulationsmedia vara uppvärmd. Om media är förvärmd i en odlingsskål, undvika att uppvärmningen under långa perioder (mer än 40 min), som osmolaritet medierna kommer att öka på grund av vatten avdunstning och det kan vara mer skadligt än kall manipulation media. På samma sätt bör den tid embryona bringat inuti manipulation pipett minimeras på grund av den lilla volymen närvarande i pipetten.

Användningen av en ordentlig embryomanipulation pipett är avgörande för att lyckas med protokollet. Manipulation pipetter kan tillverkas av glas kapillärer med en tunn glasvägg. Pasteur pipetter, som ofta används för att hantera stora djurembryon, kan också användas, men på grund av sin kortare avstånd från handtaget till spetsen, manipulation pipetter gjorda av glas kapillärer är mer comfortable att manövrera. Exponeringen för flamman och hastighet för att dra bestämma väggtjockleken och innerdiametern hos pipetten. Även manipulationspipetter kan lätt göras för hand efter lite övning, avdragare och mikro smedja också kan användas. Det är viktigt att investera tid på att producera flera optimala manipulation pipetter. Den manipulation pipett öppningen bör vara bredare än ett embryo för att möjliggöra ett smidigt flöde, men tillräckligt liten för att lätt penetrera och framsteg genom utero-Tubal korsningen. Om zona pellucida har tagits bort före överlåtelsen, blastocyster expandera vanligtvis till en större diameter. I det här fallet är det lämpligt att göra bredare pipetter med en större bländare (130-180 nm) för att undvika skador på trophectoderm cellerna. Tips polish är viktigt för att undvika skador på äggledare, livmoderväggen och embryot - speciellt om zona har tagits bort, och för att undvika pipettspetsen från att blockeras av skräp. Men efter polering, bländaren bör not vara för liten jämfört med innerdiametern av pipetten, som en kraftig minskning av diametern kommer att orsaka abrupta ändringar i flödeshastigheten. Aspiratorn munstycke ger en mer exakt flödeskontroll och en bekvämare handposition jämfört med handstyrda enheter. Trots detta kan en handstyrd enhet användas vid behov (t.ex. när manipulera lentivirus-behandlade embryon). För ett optimalt flöde och för att undvika överföring av mineralolja, är det också lämpligt att använda en ny pipett för överföring av embryon i stället för att användas för att flytta de embryon från odlingsmediet till manipulation medier. Slutligen, samtidigt införa pipetten genom äggledaren, kapillär ska hanteras direkt, dvs. gripa tag i glaset och inte plasthandtaget i aspirator, för att erhålla ett bra grepp. Förstoringen användas för överföring av embryon är en personlig fråga som beror på synskärpa av kirurgen. Vi föredrar att använda låg förstoring för att ha ett brett synfält,så vi använder en 10X slutlig förstoring (10X okular och 1X objektiv).

Mottagarna bör vara minst 8 veckor gamla och väger mellan 27-40 gram. Outbreed möss såsom CD 1 eller schweizisk Webster visa ett bra moderns beteende och är utmärkta mottagare. Det är lämpligt att upprätta avel för att få extra mottagare, eftersom de som inte används kommer att återfå sin normala cykelaktivitet i två veckor. Trots att paras, kan vissa kvinnor inte har gulkroppar (figur 3G), och därför inte kommer att vara mottaglig för de överförda embryon. Därför bör äggstockar kontrolleras med avseende på förekomst av corpora lutea, som vid 2,5 dpc tydligt kan identifieras som ljusa röda strukturer i äggstocken (Figur 3F). Under operationen är det viktigt att minimera kontakt med fortplantningsorganen, genom att gripa äggstocks adipose pad istället; överdriven manipulering av äggstocken och livmodern kan resultera i luteolys. Införandet av manipulation pipetten i äggledaren är den mest komplicerade steget i protokollet. I vissa mottagare, är äggledaren mycket vridna och det finns inte en 2 mm rak sträcka från korsningen med livmodern. I sådant fall ordna äggledaren och utför punkteringen i den första kurvan. Som beskrivs ovan, gör en trevlig manipulation pipett verkligen en skillnad. När pipetten har passerat genom utero-äggledarna korsningen, glider den lätt. Om den inte gör det, kanske pipetten har avvikit från äggledaren och inte nått livmoderns lumen. Väl inne i livmodern, om media inte flödar, flyttar pipetten lätt ut eller in och försök igen. Om det ändå inte flyter, är pipetten igensatt, ta ut ur livmodern, släpp innehållet i skålen med manipulation media och ladda om samma eller annan pipett. Leverans sker oftast 17 dagar efter embryotransfer. För att förhindra kannibalism, ge inbäddad material 2 dagar i förväg och ändra inte buren under de första dagarna efter förlossningen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	VEDCO	Ketaved ANADA 200-257	To be ordered by a licensed veterinarian.
Xylazine	Lloyd Laboratories	Anased NADA #139-236	To be ordered by a licensed veterinarian.
Buprenorphine	Generic	NDC 400-42-010-01	To be ordered by a licensed veterinarian.
Eye ointment	Novartis	Genteal
Antibiotic	Pfizer	Clavamox NADA #55-101.	Added to drinking water (0.3 mg/ml of amoxicillin trihydrate and 0.075 mg/ml of clavulanate potassium). Add 1.5 ml of the reconstituted 15 ml bottle to 250 ml of water.
Dressing serrated forceps	ROBOZ	RS-8120	Any medium size surgical-grade steel straight forceps will work.
Microdissecting serrated forceps	ROBOZ	RS-5137	These ones are curved at a 90º angle. Straight forceps can be used if preferred.
Slight curved micro dissection forceps	ROBOZ	RS-5136	This model is particularly useful to hold the oviduct.
Scissors	ROBOZ	RS-5880	Any regular surgical grade steel small straight scissors will work.
27 G needles	Beckton-Dickinson	305136	Smaller needles (30 G) can be also used. 25 G may be a bit too big.
Clip applier	MiKRon	42763
9 mm Clips	MiKRon	427631
Clip remover	MiKRon	7637	Two pairs of teeth forceps (ROBOZ RS-8160) can be used instead.
Suture needle holder	ROBOZ	RS-7820
Suture	Dowist Gell	5-0 Dexon S 7204-21	Can be substituted for any 4-0 to 6-0 absorbable suture with a narrow curved needle.
Glass capillaries	VWR	100 ul calibrated pipettes 53432-921	It includes a mouth aspirator system that only requires to attach a 0.22 µm filter in the tubing to be ready to use. More information can be obtained in Nagy et al.8
Burner	KISAG AG	Typ 2002	Gas operated burner, can be charged with Kigas (CH-4512, from the same vendor). Alcohol burners may be also used, but gas provides a higher temperature and this burner provides a small and precise flame.
Stereomicroscope	Leica	MZFLIII	This is an expensive estereomicroscope with fluorescence, that can be also used for other purposes. There are cheaper options such as Leica MZ8 or Nikon SMZ-10 or SMZ-2B, to name a few. It is better to use two stereomicroscopes, one for handling the embryos (which does not need to be a very nice one) and another one for the recipient. The one used for the recipient should display a long distance from the stage plate to the objective lense, in order to be able to focus 3-4 cm above the stage plate (where the oviduct will be placed) and still leave some room for the surgeon; most of the stereomicroscopes can do this, but some cannot.
Fiber optics ilumination	Dolan Jenner	Fiber lite	To iluminate the surgical area. There are different systems available.
Warm stages	American scope	http://store.amscope.com/tcs-100.html	These can be placed over the stage plate of the stereomicroscope. Some modifications (inserting a stick to level the stage) may be needed if it is too short for the stereomicroscope. A big warm stage can be used for warming the cage if it is available. If not, a regular heating pad can be used, but temperature must be checked.
Culture dishes for embryo manipulation	Falcon	353001	351008 may be also used; they made narrower drops.