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Bioengineering

एक केस स्टडी के रूप में तंबाकू में क्षणिक प्रोटीन अभिव्यक्ति: प्रयोगों दृष्टिकोण की डिजाइन का उपयोग कर परिसर सिस्टम की विशेषता

Published: January 31, 2014 doi: 10.3791/51216
Automatic Translation
1, 1,2
1Institute for Molecular Biotechnology, RWTH Aachen University, 2Institute for Molecular Biology and Applied Ecology, Fraunhofer Gesellschaft

Summary

हम पौधों में मोनोक्लोनल एंटीबॉडी और रिपोर्टर प्रोटीन की क्षणिक अभिव्यक्ति पर transgene नियामक तत्वों, पौधों की वृद्धि और विकास के मापदंडों, और ऊष्मायन की स्थिति के प्रभाव का निर्धारण और मॉडल का उपयोग किया जा सकता है कि प्रयोगों दृष्टिकोण का एक डिजाइन का वर्णन.

Abstract

पौधे कम लागत, scalability, और सुरक्षा सहित biopharmaceuticals के उत्पादन के लिए कई लाभ प्रदान करते हैं. क्षणिक अभिव्यक्ति कम विकास और उत्पादन टाइम्स के अतिरिक्त लाभ प्रदान करता है, लेकिन अभिव्यक्ति के स्तर इस प्रकार अच्छा विनिर्माण अभ्यास के संदर्भ में नियामक संबंधी चिंताओं को जन्म देने के बैचों के बीच काफी भिन्न हो सकते हैं. हम इस तरह के बैचों के बीच अभिव्यक्ति की परिवर्तनशीलता पर अभिव्यक्ति के दौरान विनियामक अभिव्यक्ति निर्माण में तत्वों, पौधों की वृद्धि और विकास के मापदंडों, और ऊष्मायन शर्तों, जैसे प्रमुख कारकों के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए प्रयोग (डीओई) दृष्टिकोण का एक डिजाइन इस्तेमाल किया. हम एक मॉडल विरोधी एचआईवी मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (2G12) और एक फ्लोरोसेंट मार्कर प्रोटीन (DsRed) व्यक्त पौधों का परीक्षण किया. हम मॉडल की कुछ संपत्तियों के चयन के लिए औचित्य पर चर्चा करने और अपने संभावित सीमाओं की पहचान. सामान्य दृष्टिकोण आसानी से अन्य समस्याओं को हस्तांतरित किया जा सकता है, क्योंकि मॉडल एक के सिद्धांतोंमोटे तौर पर फिर से लागू हो: छोटे मॉड्यूल, इष्टतम प्रयोग संयोजन के सॉफ्टवेयर निर्देशित सेटअप और कदम के लिहाज से डिजाइन वृद्धि में प्रारंभिक समस्या बंटवारे से ज्ञान आधारित पैरामीटर चयन, जटिलता में कमी. इसलिए, कार्यप्रणाली न केवल पौधों में प्रोटीन अभिव्यक्ति निस्र्पक के लिए, लेकिन यह भी एक यंत्रवत विवरण कमी अन्य जटिल प्रणालियों की जांच के लिए उपयोगी है. मापदंडों के बीच इंटरकनेक्टिविटी का वर्णन भविष्य कहनेवाला समीकरणों अन्य जटिल प्रणालियों के लिए यंत्रवत मॉडल स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Introduction

पौधों को विकसित करने के लिए सस्ती कर रहे हैं, क्योंकि पौधों में biopharmaceutical प्रोटीन का उत्पादन फायदेमंद है, मंच अभी और अधिक बढ़ पौधों द्वारा बढ़ाया जा सकता है, और मानव रोगज़नक़ों 1,2 नकल करने में असमर्थ हैं. डीएनए वितरण और एक शुद्ध उत्पाद की डिलीवरी की बात के बीच समय साल से कम से कम 2 महीने 3 के लिए कम है क्योंकि Agrobacterium tumefaciens साथ पत्ते की घुसपैठ पर उदाहरण के लिए आधारित क्षणिक अभिव्यक्ति रणनीतियों अतिरिक्त लाभ प्रदान करता है. क्षणिक अभिव्यक्ति भी नुकसान के समारोह म्यूटेंट करने के लिए पूरक या प्रोटीन बातचीत 4-6 की जांच करने की क्षमता के लिए जीन परीक्षण करने के लिए कार्यात्मक विश्लेषण, उदाहरण के लिए प्रयोग किया जाता है. हालांकि, क्षणिक अभिव्यक्ति के स्तर ट्रांसजेनिक पौधों 7-9 में अभिव्यक्ति के स्तर की तुलना में अधिक से अधिक बैच को बैच भिन्नता दिखाने के लिए करते हैं. इस biopharmaceutical विनिर्माण प्रक्रियाओं क्षणिक अभिव्यक्ति वाई के आधार पर संभावना है कि कम कर देता हैreproducibility के एक महत्वपूर्ण गुणवत्ता विशेषता है और जोखिम मूल्यांकन 10 के अधीन है क्योंकि अच्छा विनिर्माण प्रैक्टिस (जीएमपी) के संदर्भ में अनुमोदित किया जाएगा. इस तरह की भिन्नता भी शोधकर्ताओं की जांच करने का इरादा है कि किसी भी बातचीत कर सकते हैं मुखौटा. इसलिए, हम पौधों में क्षणिक अभिव्यक्ति के स्तर को प्रभावित और एक उच्च गुणवत्ता वाले मात्रात्मक भविष्य कहनेवाला मॉडल का निर्माण करने के लिए प्रमुख कारक है कि पहचान करने के लिए निकल पड़े.

एक पहलू पर एक समय (OFAT) दृष्टिकोण अक्सर एक प्रयोग 11 के परिणाम पर कुछ मापदंडों (कारक) का प्रभाव (प्रभाव) (प्रतिक्रिया) चिह्नित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. एक जांच (प्रयोग) के दौरान व्यक्तिगत परीक्षण (रन) (डिजाइन अंतरिक्ष) का परीक्षण कर रहे हैं कि कारकों से फैला संभावित क्षेत्र के माध्यम से एक तार पर मोती की तरह गठबंधन किया जाएगा बल्कि इसलिए कि इस suboptimal है. अंतरिक्ष डिजाइन और प्रयोग से प्राप्त जानकारी के इसलिए डिग्री की कवरेज हैकम, चित्रा 1 ए 12 में दिखाया गया है. चित्रा 1 बी 13 के रूप में दिखाया इसके अलावा, विभिन्न कारकों (कारक बातचीत) के घटकों के बीच, गरीब मॉडल और / या झूठी ओप्टिमा की भविष्यवाणी में जिसके परिणामस्वरूप छुपा रह सकता है.

ऊपर वर्णित कमियां एक से अधिक कारक दो रन 14 के बीच विभिन्न जिसका अर्थ है कि एक प्रयोग के रन डिजाइन अंतरिक्ष में और अधिक समान रूप से बिखरे हुए हैं जिसमें प्रयोगों (डीओई) दृष्टिकोण का एक डिजाइन का उपयोग करके बचा जा सकता है. कारकों (भाज्य डिजाइन) और प्रतिक्रियाओं पर कारक प्रभावों के quantitation (प्रतिक्रिया सतह तरीकों, RSM ओं) 15 स्क्रीनिंग मिश्रण के लिए विशेष डिजाइन कर रहे हैं. इसके अलावा, RSMs केंद्रीय समग्र डिजाइन के रूप में महसूस किया जा सकता है लेकिन यह भी रन के चयन के लिए विभिन्न मापदंड लागू कर सकते हैं कि विशेष सॉफ्टवेयर का उपयोग करके प्रभावी ढंग से हासिल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, तथाकथित डी optimalitY कसौटी चतुर्थ optimality कसौटी डिजाइन अंतरिक्ष 15,16 भर में सबसे कम भविष्यवाणी विचरण को प्राप्त है कि रन का चयन करता है, जबकि ऐसा है, जिसके परिणामस्वरूप मॉडल के गुणांक में त्रुटि को कम करने के लिए रन का चयन करेंगे. हम यहाँ वर्णन RSM पौधों में क्षणिक प्रोटीन अभिव्यक्ति की सटीक quantitation की अनुमति देता है, लेकिन यह आसानी से (5-8 ~) कई शामिल किसी भी प्रणाली को हस्तांतरित किया जा सकता है सांख्यिक कारकों (जैसे तापमान, समय, एकाग्रता) और कुछ (~ 2 - 4) एक यंत्रवत विवरण मॉडल पर अनुपलब्ध या बहुत जटिल है categoric कारकों (जैसे प्रमोटर, रंग) जिसमें.

डो दृष्टिकोण कृषि विज्ञान में जन्म लिया है, लेकिन यह यह विश्वसनीय आंकड़े प्राप्त करने के लिए आवश्यक रन की संख्या को कम करने और जटिल प्रक्रियाओं के लिए वर्णनात्मक मॉडल उत्पन्न करने के लिए उपयोगी है, जहां किसी भी स्थिति के लिए हस्तांतरणीय है क्योंकि अन्य क्षेत्रों में फैल गया है. यह बदले में लिए "मार्गदर्शन डो में शामिल किए जाने के लिए प्रेरित कियाउद्योग, मानव उपयोग के लिए औषधि (आईसीएच) 17 के पंजीकरण के लिए तकनीकी आवश्यकताओं के Harmonisation पर अंतर्राष्ट्रीय सम्मेलन द्वारा प्रकाशित प्रश्न 8 (R2) औषधि विकास ". डो अब वैज्ञानिक अनुसंधान और उद्योग के 18 में व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाता है. हालांकि, देखभाल के दौरान लिया जाना चाहिए एकाधिक रेखीय प्रतिगमन मॉडल (बेस मॉडल) के लिए एक अनुचित बहुपद डिग्री के चयन क्योंकि योजना और प्रयोग का निष्पादन सही ढंग से सभी कारक प्रभाव मॉडल पर अतिरिक्त रनों के लिए एक की जरूरत को पेश कर सकते हैं. इसके अलावा, भ्रष्ट या लापता डेटा गलत मॉडल और त्रुटिपूर्ण उत्पन्न भविष्यवाणियों, और यहां तक कि प्रोटोकॉल और चर्चा वर्गों 18 में वर्णित के रूप में किसी भी मॉडल के निर्माण के प्रयास को रोक सकता है. प्रोटोकॉल खंड में, हम शुरू में एक RSM आधारित प्रयोग के लिए सबसे महत्वपूर्ण योजना बना कदम बाहर सेट और उसके बाद डो के आधार पर डिजाइन की व्याख्या करेगा सॉफ्टवेयर DesignExpert v8.1. लेकिन इसी तरह की डिजाइन अन्य सॉफ्टवेयर includi के साथ बनाया जा सकता हैएनजी जेएमपी, Modde, और statistica. प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं डेटा विश्लेषण और मूल्यांकन के लिए निर्देश द्वारा पीछा कर रहे हैं.

चित्रा 1
चित्रा 1. OFAT और डो. एक की तुलना. एक प्रयोग (काले, लाल और नीला हलकों) में एक समय (OFAT) में एक कारक के अनुक्रमिक भिन्नता डिजाइन अंतरिक्ष (रची क्षेत्रों) के एक कम कवरेज प्राप्त होता है. इसके विपरीत, प्रयोगों (डीओई) रणनीति (हरी हलकों) की डिजाइन का उपयोग कर एक समय में एक से अधिक कारक की भिन्नता कवरेज और जिसके परिणामस्वरूप मॉडल. बी के इस प्रकार परिशुद्धता बढ़ाता है. पक्षपाती डिजाइन अंतरिक्ष कवरेज OFAT प्रयोगों (काला हलकों) भी, इष्टतम ऑपरेटिंग क्षेत्रों (लाल) की पहचान और उप इष्टतम समाधान (बड़े काले वृत्त) की भविष्यवाणी करने में असफल हो सकता है कि इसका मतलब है जबकि डो strategiतों (काला सितारों) बेहतर स्थितियां (बड़े ब्लैक स्टार) की पहचान करने की संभावना है.

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Protocol

1. एक डो रणनीति की योजना

  1. डिजाइन में शामिल किए जाने के लिए प्रासंगिक कारकों और प्रतिक्रियाओं को पहचानें.
    1. माप के लिए एक या कई प्रतिक्रियाओं को परिभाषित करें. इधर, 2G12 और DsRed अभिव्यक्ति के स्तर प्रासंगिक (क्रमशः 10 और 20 माइक्रोग्राम / एमएल) के रूप में माना न्यूनतम detectable अंतर है और इस प्रणाली की अनुमानित मानक विचलन के लिए एक अनुमानित मूल्य (4 और 8 ग्राम सहित (माइक्रोग्राम / एमएल) का इस्तेमाल किया गया / एमएल, क्रमशः) पिछले प्रयोगों पर आधारित है.
    2. उपलब्ध साहित्य का प्रयोग, पिछले प्रयोगों या विशेष स्क्रीनिंग डिजाइन से डेटा जिसका प्रभाव प्रतिक्रियाओं पर मात्रा निर्धारित किया जाएगा (तालिका 1) 7,8,19,20 महत्वपूर्ण कारकों का चयन करने के लिए (जैसे एक भाज्य डिजाइन, परिचय देखें).
    3. कारक प्रकार (सांख्यिक या categoric) का आवंटन और सांख्यिक कारकों डो जांच (1 टेबल) के दौरान अलग किया जाएगा, जो भीतर श्रेणियों का चयन.
    4. Numeri पहचानेंसी कारकों जिसके लिए निरंतर परिवर्तन को लागू करने के लिए मुश्किल है.
      1. एक निश्चित स्तर तक ठीक से समायोजित नहीं किया जा सकता कि कारकों के लिए निरंतर परिवर्तन प्रयोग से बचें. जैसे ऊष्मायन तापमान आम तौर पर केवल ± 2 डिग्री सेल्सियस के भीतर नियंत्रित किया जा सकता है, इस तरह के 27.2 डिग्री सेल्सियस, 25.9 डिग्री सेल्सियस, और 29.3 डिग्री सेल्सियस चाहिए के रूप में मूल्यों का प्रयोग इसलिए निरंतर परिवर्तन बचा जाना.
      2. इसके बजाय, इन कारकों (तालिका 1) के लिए असतत स्तरों के एक नंबर का चयन करें. स्तरों की संख्या प्रत्याशित बेस मॉडल (1.2 चरण) मैच चाहिए. केंद्रीय समग्र डिजाइन हमेशा असतत कारक स्तर है, क्योंकि यह इष्टतम डिजाइन के लिए ही महत्वपूर्ण है.
    5. एक categoric कारक नाममात्र का है कि क्या निरुपित कोई निहित आदेश (जैसे विभिन्न निर्माताओं), या क्रमसूचक और इस तरह एक असतत सांख्यिक पैरामीटर (एक संयंत्र पर जैसे विभिन्न पत्ते) अर्थात्.
    6. Categoric कारकों के दोनों प्रकार के स्तरों का चयन करें. </ ली>
  2. एक उपयोगी बेस मॉडल का चयन करें.
    1. प्रारंभिक प्रयोगों और साहित्य के आधार पर, प्रत्येक पहलू और प्रतिक्रिया के रूप में अच्छी तरह से कारक बातचीत और प्रतिक्रिया के बीच संबंध की आशा. उदाहरण के लिए, रैखिक (अधिक बेहतर), द्विघात (एकल इष्टतम या nonlinear वृद्धि / कमी) या घन (इष्टतम विषम).
    2. असतत सांख्यिक कारकों के लिए स्तरों की संख्या n कारक और प्रतिक्रिया के बीच संबंध का बहुपद डिग्री होने के साथ, एन 1 है कि सुनिश्चित करें. उदाहरण के लिए, यदि तापमान एन = 2, प्रतिक्रिया पर एक द्विघात प्रभाव होने की संभावना है और इसलिए कम से कम तीन तापमान के स्तर द्विघात प्रभाव के लिए एक फिट प्राप्त करने के लिए जांच की जानी चाहिए.
  3. भविष्यवाणी विचरण एक निश्चित सीमा (अल्फा स्तर) नीचे होना चाहिए, जिसके लिए डिजाइन अंतरिक्ष के अंश (एफडी) को परिभाषित करें. एफडी भर में मजबूत भविष्यवाणियों उपज मॉडल है कि प्राप्त करने के लिए (डिजाइन अंतरिक्ष के 95% से अधिक कवर)> 0.95 होना चाहिएपूरे डिजाइन अंतरिक्ष 21-23.
    नोट: 0.05 की एक सीमा से एक 5% महत्व स्तर (प्रकार मैं त्रुटि) से मेल खाती है और एक विशिष्ट मूल्य है. इस मान को बढ़ाना एक डो रणनीति के लिए आवश्यक प्रयोगों की संख्या कम हो जाएगा लेकिन एक साथ महत्वपूर्ण प्रभाव याद किया और प्रतिक्रिया पर उनके प्रभाव का अनुमान गलत होगा कि हो जाएगा कि संभावना में वृद्धि होगी.

तालिका 1
तालिका 1. विभिन्नता सहित तंबाकू में क्षणिक प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रभावित करने वाले कारक बोल्ड डो. कारक ही "अलग प्रमोटर / 5'UTRs का उपयोग क्षणिक अभिव्यक्ति दौरान DsRed संचय के लिए एक वर्णनात्मक मॉडल 'के तहत वर्णित प्रयोगों के लिए डिजाइन में शामिल थे दौरान पर्वतमाला जबकि इटैलिक में कारकों केवल "incubatio अनुकूलन के लिए डिजाइन में शामिल थेn स्थितियां और "क्षणिक अभिव्यक्ति का उपयोग पौधों में मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के उत्पादन के लिए फसल योजनाओं.

चित्रा 2
चित्रा 2. डो नियोजन प्रक्रिया. जांच के तहत प्रतिक्रिया पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव के साथ कारक उपलब्ध आंकड़ों के आधार पर चुने गए हैं. तब कारक विशेषताएँ (जैसे संख्यात्मक), सीमाओं और स्तरों सौंपा है. पिछले ज्ञान और प्रयोगों एक उपयुक्त बेस मॉडल को परिभाषित करने के लिए उपयोग किया जाता है. भविष्य कहनेवाला शक्ति आवश्यकताओं के अंतिम मॉडल के आवेदन / उद्देश्य के आधार पर परिभाषित कर रहे हैं. संकलित डाटा तो उचित डो सॉफ्टवेयर में स्थानांतरित किया जा सकता है.

2. DesignExpert में एक RSM स्थापना

  1. DesignExpert शुरू करें और "नई डिजाइन" का चयन करें. "उत्तर भूतल 'विंडो में, चयन और# 34; इष्टतम "और खंड 1.1 में चयनित सांख्यिक और categoric कारकों) की संख्या दर्ज करें.
  2. इसी क्षेत्र में सभी कारकों के लिए कारक नाम, इकाइयों, प्रकार, उप प्रकार, स्तर / स्तर सीमाओं और स्तर के लिए मूल्यों की संख्या दर्ज करें.
  3. अगले पृष्ठ पर और के तहत जारी "खोज" विकल्प "सर्वश्रेष्ठ" के रूप में भी वांछित "optimality" कसौटी, यहां 'डी इष्टतम "का चयन करें.
  4. "संपादन मॉडल ..." मेनू में, कारकों और धारा 1.2 में प्रत्याशित बातचीत) होता है कि मॉडल का चयन करें. अनिश्चित हैं, तो यहाँ एक निश्चित बहुपद डिग्री के लिए सभी कारकों और बातचीत, "द्विघात" को शामिल किया गया है कि एक पूरा मॉडल का चयन करें. (सभी बातचीत युक्त) एक पूरा मॉडल का चयन डो के लिए आवश्यक प्रयोगों की संख्या में वृद्धि हो सकता है.
  5. "ब्लाक" की संख्या का चयन करें. सभी पौधों को एक ही बैच से, सभी बैक्टीरिया एक साथ सुसंस्कृत और किया गया था, क्योंकि यहां, एक ही ब्लॉक का इस्तेमाल किया गया थासभी इंजेक्शन एक ही ऑपरेटर द्वारा एक ही दिन में किए गए. पौधों की एक से अधिक बैच इस्तेमाल किया है या कई ऑपरेटरों इंजेक्शन संभाल रहा है अगर एक से अधिक ब्लॉक का प्रयोग करें.
  6. डिजाइन शेष
    1. , Categoric कारक के स्तर के बीच समान रूप से प्रयोग की रन वितरित करने के क्रम में परीक्षण कर रहे हैं कि जैसे विभिन्न प्रमोटरों "categoric संतुलन बाध्य करें" सक्षम करें.
      नोट: इस DesignExpert optimality कलन विधि द्वारा चयनित अंक के आधार पर एक% मूल्य के रूप में रिपोर्ट करेंगे कि एक हद तक डिजाइन के optimality कम कर सकते हैं.
    2. Optimality में कमी को कम करने के लिए लागू यादृच्छिक बीज कलन विधि का उपयोग डिजाइन कई बार पुनर्गणना.
      नोट: optimality में घाटा लेकर कर सकते हैं 3-40% ही इनपुट डेटा का उपयोग कर, लेकिन replicates की संख्या categoric संतुलन बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता बदलते ~ से.
  7. सॉफ्टवेयर बेस मॉडल पर आधारित "मॉडल अंक" की संख्या के लिए एक मूल्य का सुझाव देगा, यहां 70 रन. यह यहां प्रत्येक के लिए "मॉडल अंक", 10 रन प्रत्येक की संख्या का> 5% है यह सुनिश्चित करने के लिए "फिट की कमी का अनुमान लगाने के लिए" "replicates" और के लिए रन की संख्या को समायोजित करें.
  8. प्रतिक्रियाओं की संख्या का चयन और उनके नाम और इकाइयों दर्ज करें, अगले पृष्ठ पर जारी रखें. अतिरिक्त प्रतिक्रियाएं भी डिजाइन पर कोई नकारात्मक प्रभाव के बिना डेटा मूल्यांकन के दौरान किसी भी समय जोड़ा जा सकता है.
  9. माता का रन के लिए कारक के स्तर की गणना एल्गोरिथ्म शुरू करने के लिए आगे बढ़ें. चयनित बेस मॉडल एक खास पहलू के लिए स्तरों की संख्या से मेल नहीं खाता, तो एक अधिसूचना प्रदर्शित किया जाएगा और गणना शुरू नहीं होगा. इस मामले में या तो:
    1. इस पहलू के लिए स्तरों की संख्या में वृद्धि, या
    2. स्तरों की वर्तमान संख्या के आधार पर गणना नहीं की जा सकती कि बेस मॉडल में शर्तों का चयन रद्द करें.
    3. उदाहरण के लिए, टी में कारक "ऊष्मायन समय" टी (यानी 2 डी और 5 डी) के लिए दो स्तर हैं अगरवह वर्तमान डिजाइन और 2 चयनित किया गया था अवधि टी सहित एक द्विघात बेस मॉडल, टी के लिए एक तिहाई स्तर (यानी 8 डी) जोड़ने या मॉडल से कारक टी 2 से हटाता है.
  10. गणना पूरी होने के बाद प्रदर्शित होने वाली इष्टतम कारक संयोजन युक्त स्प्रेडशीट सहेजें.
  11. "डिजाइन" नोड में "मूल्यांकन" उप नोड का चयन करें और "रेखाचित्र" टैब पर जाएं.
    1. "रेखांकन उपकरण" में "एफडी" का चयन करें और "एफडी ग्राफ" बॉक्स में त्रुटि प्रकार के रूप में "Pred" चुनें. फिर क्रमश: 'डी' और 'एस' के लिए मान DsRed के लिए (यहां 20 और 8 ग्राम / एमएल) के रूप में खंड 1.1.1 में परिभाषित प्रणाली का अनुमानित मानक विचलन के लिए न्यूनतम detectable अंतर के साथ ही अनुमानित मूल्य) दर्ज करें. इसके अलावा आवेदन के लिए उपयुक्त अल्फा लेवल (स्वीकार्य% एक महत्वपूर्ण प्रभाव लापता), आम तौर पर 0.05 (5%) दर्ज करें.
    2. इस मामले (यहाँ पाया के रूप में चित्रा 3 में दिखाया गया है, एफडी 1% थी) नहीं है, तो 'वापस' डिजाइन 'नोड के लिए जाने के लिए और कार्य पट्टी में "डिजाइन उपकरण", फिर चुनें "बढ़ाने के डिजाइन ..." और चयन "वृद्धि.
    3. पहले की तरह ही "खोज" और "optimality" मापदंड का चयन करें. इसके अलावा एक ही "संपादित मॉडल" और "categoric संतुलन बाध्य करें" सेटिंग चुना है. डिजाइन वृद्धि (यहाँ किया) के रूप में किसी भी प्रयोग पहले किया जाता है, तो बदल "Block1" करने के लिए सेटिंग "ब्लॉक में रन रखें".
    4. "रन" अनुभाग में अभाव अनुमान करने के लिए कम से कम 5% "replicates" और "बनाए रखने, अतिरिक्त" मॉडल अंक "का नंबर दर्जका फिट "कुल डिजाइन में है. यहाँ, 100 अतिरिक्त रन जोड़े थे और कोई" replicates "और" फिट का अभाव अनुमान करने के लिए "शामिल थे.
    5. गणना समाप्त हो जाने के बाद, जैसा कि ऊपर वर्णित एफडी ग्राफ reexamine. एफडी अभी भी संतोषजनक नहीं है, जैसा कि ऊपर वर्णित डिजाइन वृद्धि दोहराएँ. यहाँ FDS वृद्धि बाद 100% और प्रकार कोई आगे वृद्धि (चित्रा 3B) जरूरत थी.

चित्रा 3
एफडी भूखंडों की 3. तुलना चित्रा. 90 रन से मिलकर. एक डो न्यूनतम detectable अंतर (20 ​​माइक्रोग्राम / एमएल) और अनुमान के लिए मूल्यों के साथ संयोजन में एक वर्ग के बेस मॉडल का उपयोग कर, भविष्यवाणी की मानक त्रुटि के लिए केवल 1% की अपर्याप्त एफडी का उत्पादनप्रणाली (8 ग्राम / एमएल). बी का मानक विचलन mated. 210 रन के कुल डो का विस्तार डिजाइन अंतरिक्ष में मॉडल की वर्दी परिशुद्धता का संकेत एक 100% एफडी और एक फ्लैट की अवस्था को प्राप्त किया.

3. क्लोनिंग और अभिव्यक्ति की विश्लेषण कैसेट्स

  1. 5 मिलीलीटर लेग माध्यम में Escherichia कोलाई खेती (10 जी / एल tryptone, 5 ग्राम / एल खमीर निकालने, 170 मिमी NaCl, 50 मिलीग्राम / एल एम्पीसिलीन, लेग अगर प्लेट 15 जी / एल अग्रवाल शामिल हैं के लिए) 6 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 160 rpm पर एक कक्षीय हिलनेवाला पर -8 घंटे या रात भर. चेतावनी: एम्पीसिलीन एक हानिकारक पदार्थ है. एक विंदुक टिप का उपयोग प्लेटों पर हो कॉलोनियों से तरल संस्कृति अथवा स्थानांतरण की कोशिकाओं के 50 μl के साथ या तो लेग माध्यम के टीका लगाना.
  2. PSO प्लास्मिड डीएनए की शुद्धि, और ई. से pPAM (GenBank AY027531) के अन्य डेरिवेटिव के लिए कोलाई K12 तनाव DH5a, डीएनए शुद्धि किट पुस्तिका 24 में दिए गए निर्देशों का पालन करें. चेतावनी: शुद्धि कश्मीरयह (विवरण के लिए मैन्युअल ऊपर देखें) हानिकारक रसायन होते हैं. प्लाज्मिड अनुक्रम चित्रा 4 में और क्रेता एट अल. में 20 से वर्णन किया गया है.
  3. एक NanoDrop डिवाइस में 260 एनएम पर एक 2 μl नमूना के absorbance को मापने के द्वारा शुद्ध eluate में डीएनए एकाग्रता का निर्धारण.
  4. प्रतिबंध endonucleases (छोड़कर) के साथ पाचन द्वारा शुद्ध प्लास्मिड डीएनए की पहचान की पुष्टि.
    1. अनूठा और अलग पहचाना टुकड़ा पैटर्न उत्पन्न कर रहे हैं कि इतनी प्लाज्मिड अनुक्रम के अनुसार जोड़कर चयन करें. ऐसी प्रतिक्रिया मात्रा, समय, तापमान और स्टेबलाइजर गोजातीय सीरम albumin की एकाग्रता के रूप में पाचन स्थितियों के लिए निर्माता की सिफारिशों का पालन करें. संवेदनशीलता के आधार पर विश्लेषण डिवाइस, पाचन प्रति प्लास्मिड डीएनए के 50-500 एनजी का उपयोग करें.
    2. Tris-borate EDTA (TBE) बफर (; 8.0 पीएच 90 मिमी Tris, 90 मिमी borate, 2 मिमी EDTA) में agarose उबलते द्वारा डीएनए टुकड़े के विभाजन के लिए 0.8-2.0% जैल तैयार करें. टीवह बड़ा उम्मीद टुकड़े, कम agarose जेल में इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
    3. के 50 μl को पांच गुना नमूना बफर के 5 μl (5x साबू, 0.1% (w / v) bromophenol नीले, 0.1% (w / v) xylene cyanol, 10% (TBE में भंग w / v) ग्लिसरॉल) जोड़ें डीएनए नमूना फिर से इलाज किया और ~ 40 मिनट या टुकड़े का स्पष्ट विभाजन तक हासिल की है के लिए 100 वी पर agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा टुकड़े अलग. प्रत्येक जेल में तुलना के लिए डीएनए सीढ़ी आकार मार्कर युक्त एक लेन, जैसे 2-3 μl 1-KB सीढ़ी शामिल हैं.
  5. अन्य तीन 5'UTRs में से एक के साथ PSO में ओमेगा 5'UTR बदलें.
    1. से 60 मिनट ~ के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 पारिस्थितिकी आरआई-HF की इकाइयों और NEBuffer 4 में NCO I-HF रिस साथ इलाज के द्वारा ~ 4 ग्राम शुद्ध PSO डीएनए से ओमेगा 5'UTR अनुक्रम रिलीज. वर्गों 3.4.2 और 3.4.3 में वर्णित के रूप में फिर टुकड़े अलग.
    2. अतिरिक्त एक जेल का उपयोग agarose जेल से बड़ा टुकड़ा (पुनश्च, "रीढ़ की हड्डी") को अलगनिर्माता की पुस्तिका 25 और धारा 3.3 में वर्णित के रूप में शुद्ध डीएनए की एकाग्रता का निर्धारण) के अनुसार ction किट. चेतावनी: जेल निकालना किट हानिकारक रसायन होते हैं, विवरण के लिए मैन्युअल देखें.
    3. 60 मिनट के लिए ~ 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 पारिस्थितिकी आरआई-HF की इकाइयों और NEBuffer 4 में NCO मैं-HF रिस साथ प्रत्येक वेक्टर की ~ 10 ग्राम के इलाज से उपयुक्त दाता वैक्टर से सीएचएस, CHS-LPH और टीएल 5'UTRs अलग. फिर वर्गों 3.4.2 और 3.4.3 में वर्णित के रूप में टुकड़ों को अलग और खंड 3.5.2 में वर्णित के रूप में छोटे 5'UTR युक्त टुकड़ा शुद्ध.
    4. निर्माता की सिफारिशों 26 के अनुसार 5 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर अलग शुद्ध रैखिक पुनश्च वेक्टर के लिए अलग aliquots में पृथक शुद्ध 5'UTRs ligate. ~ 50 वेक्टर डीएनए की एनजी और 20 μl की कुल मात्रा में 5'UTR डीएनए के तीन गुना दाढ़ अतिरिक्त प्रयोग करें.
  6. वें के साथ परिवर्तन ई कोलाई कोशिकाओंई पुनः संयोजक प्लास्मिड 26,27.
    1. जोड़ें ~ 10 एनजी बंधाव मिश्रण के (~ 4-5 μl) (धारा 3.5.4 देखें) से 50 μl RbCl सक्षम ई. कोली और धीरे मिश्रण, और फिर बर्फ पर 30-60 मिनट के लिए सेते हैं. 5-30 मिनट के लिए बर्फ पर 42 डिग्री सेल्सियस और ठंड में 1.5 मिनट के लिए गर्मी झटका.
    2. एंटीबायोटिक मुक्त लेग माध्यम के 950 μl जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे और 160 आरपीएम के लिए सेते हैं. Transformants के चयन के लिए, एम्पीसिलीन युक्त लेग अगर प्लेटों पर संस्कृति के 50 और 100 μl फैल गया और 37 डिग्री सेल्सियस पर ~ 16-20 घंटे के लिए सेते
    3. एम्पीसिलीन युक्त लेग मध्यम के 5 एमएल aliquots में धारा 3.1 में वर्णित प्रत्येक प्रमोटर 5'UTR बंधाव का प्रतिनिधित्व 5-10 अलग कालोनियों टीका लगाना. फिर प्लाज्मिड डीएनए को शुद्ध और वर्गों 3.2-3.4 में वर्णित के रूप में अपनी पहचान की पुष्टि.
  7. NEBuff में ए एस सी मैं और पारिस्थितिकी आरआई को छोड़कर उपयोग कर चार 5'UTR plasmids के प्रत्येक में ओपन स्कूल प्रमोटर के साथ 35SS प्रमोटर बदलेंएर वर्गों 3.5 और 3.6 में 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 वर्णित है.
  8. ए में आठ परिणामस्वरूप plasmids के प्रत्येक परिचय electroporation 28 से pMP90RK: तनाव GV3101 tumefaciens.
    1. 50 μl सक्षम ए को शुद्ध प्लास्मिड डीएनए के ~ 500 एनजी जोड़ें बर्फ पर कोशिकाओं tumefaciens. धीरे मिश्रण और एक prechilled 0.2 सेमी electroporation क्युवेट में स्थानांतरण. मिश्रण क्युवेट के नीचे स्थित है और बुलबुले को शामिल नहीं करता कि सुनिश्चित करें.
    2. पल्स कोशिकाओं 5 मिसे के लिए 2.5 केवी और नाड़ी की तीव्रता और अवधि की पुष्टि करें.
    3. डीएनए का नमूना या सक्षम ए की गलत तैयारी में ऊंचा नमक सांद्रता से बचें इनमें से बहुत परिवर्तन प्रभावकारिता को कम करने, सेल निलंबन की तत्काल वाष्पीकरण के कारण उच्च आयन धाराओं में परिणाम कर सकते हैं क्योंकि कोशिकाओं tumefaciens.
    4. एंटीबायोटिक दवाओं के बिना YEB माध्यम के 950 μl (5 ग्राम / एल मांस निकालने, 1 जी / एल खमीर निकालने, 5 ग्राम / एल pepton जोड़ेंई, 5 ग्राम / एल सुक्रोज, 2 मिमी MgSO 4, पीएच 7.0), धीरे मिश्रण और एक बाँझ 1.5 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब में तुरंत हस्तांतरण. 26-28 डिग्री सेल्सियस और 160 rpm पर 2-4 घंटे के लिए सेते हैं.
    5. (50 मिलीग्राम / एल एंटीबायोटिक दवाओं युक्त YEB अगर प्लेटों पर 1-2 μl बिखरा   transformants के चयन के लिए कार्बेनिसिलिन, 25 मिलीग्राम / एल केनामाइसिन, 25 मिलीग्राम / एल रिफैम्पिसिन). चेतावनी: रिफैम्पिसिन एक जहरीले पदार्थ है.
    6. प्रत्येक प्रमोटर 5'UTR बंधाव का प्रतिनिधित्व अलग कालोनियों से कोशिकाओं के साथ एंटीबायोटिक दवाओं युक्त YEB माध्यम की तीन 5 मिलीलीटर aliquots टीका लगाना और 26-28 डिग्री सेल्सियस और 160 rpm पर 48-72 घंटे के लिए सेते हैं.
  9. ए की सफलता की पुष्टि परिवर्तन tumefaciens.
    1. स्थानांतरण खंड 3.8.6 से प्रत्येक विभाज्य के 2 μl पीसीआर mastermix के 48 μl aliquots (प्रत्येक 10 माइक्रोन प्राइमर शेयर के 2 μl (प्रत्येक प्राइमर के 400 एनएम अंतिम एकाग्रता), अलग करने के लिए1 μl में 10 मिमी dNTP मिश्रण (प्रत्येक deoxynucleoside triphosphate के 200 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता), 5 μl से 10 गुना 0.75 μl) उच्च फिडेलिटी एंजाइम मिश्रण का विस्तार, और 39.25 μl बाँझ आसुत जल, 15 मिमी 2 MgCl साथ उच्च फिडेलिटी बफर का विस्तार.
    2. उपयुक्त प्राइमरों का उपयोग कर प्रत्येक प्लाज्मिड की अभिव्यक्ति कैसेट (अग्रेषित बढ़ाना: 5'-सीसीटी सीएजी GAA भूमिकाः CAA टीएसी 3 ', प्रमोटर के अपस्ट्रीम 1026 न्यूक्लियोटाइड बंधन, Rev: 5'-सीसीए आग सीजीए जीटीए सीएसी एएसी -3', बंधन उचित पीसीआर की शर्तों के तहत) 35S polyadenylation साइट के भीतर. इधर, 94 डिग्री सेल्सियस 15 सेकंड के लिए 94 डिग्री सेल्सियस विकृतीकरण के 30 चक्रों के बाद प्रारंभिक विकृतीकरण के लिए इस्तेमाल किया गया था, 30 सेकंड और 120 सेकंड के लिए 72 डिग्री सेल्सियस बढ़ाव के लिए 51 डिग्री सेल्सियस annealing, और 8 के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर एक अंतिम बढ़ाव कदम मि.
    3. खंड 3.4.3 में वर्णित के रूप में agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा पीसीआर उत्पादों के आकार का निर्धारण.
  10. ए की तैयारी द्वारा ग्लिसरॉल शेयरों tumefaciensए के 500 μl के साथ 500 μl 50% मिश्रण (v / v) बाँझ ग्लिसरॉल परिवर्तन (धारा 3.9.3) पुष्टि की गई है, जिसके लिए खंड 3.8.6 से संस्कृतियों tumefaciens. आगे उपयोग करें जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर ग्लिसरॉल शेयरों स्टोर.
  11. RNAfold वेबसर्वर 29 का उपयोग कर अलग mRNAs की तह ऊर्जा की गणना और कोडिंग क्षेत्र के पहले 50 बीपी के माध्यम से transcriptional शुरू साइट से nucleotide अनुक्रम में शामिल हैं.
    1. "एल्गोरिदम और बुनियादी विकल्प मोड़ो" खंड में "न्यूनतम मुक्त ऊर्जा (यूके) और विभाजन समारोह" और विकल्प "पृथक आधार जोड़े बचने" का चयन करें.
    2. में "उन्नत तह विकल्प" "किसी भी मामले में एक हेलिक्स के दोनों किनारों पर ऊर्जा झूलने" चुनें, "शाही सेना मानकों (टर्नर मॉडल, 2004)" और 25 डिग्री सेल्सियस के लिए "दिया तापमान (सी) के लिए ऊर्जा मापदंडों rescale" परिवर्तन
    3. "आउटपुट विकल्प" खंड में सभी विकल्पों का चयन करें.

चित्रा 4
चित्रा 4. प्रमोटर और 5 'UTR की अभिव्यक्ति कैसेट नग अनुक्रम चार अतिरिक्त वेरिएंट उपज और के साथ इस प्रमोटर के प्रतिस्थापन द्वारा पीछा CaMV 35SS प्रमोटर के साथ चार संयोजन, जिसके परिणामस्वरूप में 5'UTR की stepwise विनिमय द्वारा उत्पन्न किया गया. वेरिएंट आठ अलग प्रमोटर / 5'UTR संयोजनों की कुल.

4. पौधों की खेती

  1. उर्वरक की एक 0.1% समाधान तैयार Fertyपीएच 5.9 में de-ionized पानी में 2 मेगा.
  2. अवशिष्ट रसायनों को हटाने और अंत में उर्वरक के साथ संतुलित करने के लिए विआयनीकृत पानी के साथ व्यापक निस्तब्धता द्वारा 10 x 10 x 8 सेमी Rockwool ब्लॉक तैयार करें.
  3. उर्वरक दूर बीज धोने से बचने के लिए सावधान किया जा रहा है के साथ एक छोटी फ्लश द्वारा पीछा प्रत्येक Rockwool ब्लॉक पर 1-2 तम्बाकू बीज रखकर बीज तम्बाकू पौधों.
  4. उगना और 25/22 डिग्री सेल्सियस दिन / रात के तापमान, 70% सापेक्ष आर्द्रता और एक 16 घंटे photoperiod में एक ग्रीन हाउस में 42 दिनों के लिए तम्बाकू पौधों की खेती (180 mmol सेकंड -1 एम -2, λ = 400-700 एनएम) . इस photoperiod के दौरान, हाइड्रोपोनिक कल्चर में 15 मिनट हर घंटे के लिए उर्वरक के साथ सिंचाई की.

5. क्षणिक प्रोटीन अभिव्यक्ति

  1. ए की तैयारी पत्तियों में इंजेक्शन के लिए tumefaciens.
    1. 1% ए के साथ एंटीबायोटिक दवाओं युक्त YEB माध्यम के 5-50 मिलीलीटर टीका लगाना क्रायो शेयर संस्कृति tumefaciens और आयुध डिपो <तक 27 डिग्री सेल्सियस पर सेतेउप> 600nm 5.0 (~ 48-72 घंटा मात्रा और पोत के प्रकार पर निर्भर करता है) तक पहुँचता है.
    2. ए पतला पानी और इंजेक्शन के लिए आवश्यक आयुध डिपो 600nm मैच के लिए 2 गुना घुसपैठ मध्यम (4.3 छ / एल Murashige और Skoog लवण (पीएच 5.6), 5 ग्राम / एल सुक्रोज, 1.8 ग्राम / एल ग्लूकोज, 100 मिमी acetosyringone) के साथ tumefaciens संस्कृति. सिर्फ इंजेक्शन से पहले आयुध डिपो 600nm की पुष्टि करें. नोट: ~ 1.43 ± 0.12 x 10 9 कॉलोनी मिलीलीटर प्रति इकाइयों के गठन के लिए 1.0 मेल खाती के एक आयुध डिपो 600nm.
  2. ए इंजेक्षन पत्तियों में निलंबन tumefaciens.
    1. चुने और (जैसे एक डो रणनीति के अनुसार) में इलाज किया जा उस पर noncotyledon पत्तियों और पदों लेबल.
    2. विभिन्न ए इंजेक्षन मत करो एक ही पसलियों के क्षेत्र में समाधान tumefaciens. इसके बजाय, मध्य नस अक्ष के प्रत्येक पक्ष पर विरोध वर्गों का उपयोग करें. अधिक से अधिक दो अलग अलग समाधान एक ही स्थान पर इंजेक्शन जा जरूरत है एक additiona उपयोगएल संयंत्र.
    3. अच्छी तरह से ए हिला एक 1 मिलीलीटर सिरिंज में कमजोर पड़ने और महाप्राण तैयारी के बाद से बसे हो सकता है कि किसी भी कोशिकाओं resuspend tumefaciens समाधान.
    4. धीरे ए की आमद की सुविधा के लिए इसी तरह की एक पिपेट टिप या साथ इंजेक्शन के लिए इरादा स्थिति में एपिडर्मिस खरोंच समाधान tumefaciens. जबकि ऐसा करने का पत्ता ब्लेड rupturing से बचें.
    5. इलाज और धीरे पत्ती के नीचे की ओर पर (संलग्न नहीं सुई के साथ) के आउटलेट धक्का किए जाने की पसलियों के बीच क्षेत्र के खिलाफ बैरल को छू पत्ता ब्लेड सीधा करने के लिए सिरिंज पकड़ो. स्थानांतरण या rupturing से पत्ता ब्लेड को रोकने के लिए धीरे एक ही समय में पत्ती के ऊपर की ओर दबाएं.
    6. धीरे सिरिंज पिस्टन नीचे धक्का. ए गहरे हरे रंग और नम दिखने इलाज क्षेत्रों से संकेत के रूप tumefaciens समाधान पत्ता ब्लेड भीतर कहनेवाला रिक्त स्थान में प्रवेश करेगा. पूरे intercosta तक कई पदों पर इस प्रक्रिया को दोहराएँएल क्षेत्र ए के साथ घुसपैठ की है tumefaciens. फिर अगले पसलियों के बीच क्षेत्र के साथ जारी है.
    7. यकीन सिरिंज पत्ती को सीधा बना हुआ है. सिरिंज झुकाना जीवाणु निलंबन उच्च दबाव के तहत बाहर उछाल का कारण होगा.
    8. यदि विभिन्न ए tumefaciens समाधान (जैसे विभिन्न प्रमोटरों का परीक्षण करने के लिए) का उपयोग किया जाता है, तो अगले समाधान लागू करने से पहले इसी तरह की एक कागज तौलिया या का उपयोग करते हुए पहले इंजेक्शन से पत्ती के नीचे पर शेष किसी भी अतिरिक्त समाधान निकालने.
  3. पौधों और नमूने के बाद घुसपैठ ऊष्मायन.
    1. इलाज के पौधों के लिए एक phytotron तैयार करें ~ डो के लिए आवश्यक स्तरों पर तापमान और नमी संतुलन अनुमति देने के लिए इंजेक्शन से पहले 24 घंटे.
    2. इंजेक्शन के बाद, phytotron में पौधों के लिए स्थानांतरण और डो द्वारा निर्धारित ऊष्मायन अवधि के अंत तक पानी से सिंचाई के लिए पर्याप्त बड़े ट्रे में उन्हें जगह है.
    3. एक 16 घंटा phot की स्थापनाoperiod 0.7 एम 2 प्रति छह ओसराम शांत सफेद 36 डब्ल्यू फ्लोरोसेंट ट्यूब का उपयोग (75 mmol सेकंड -1 एम -2, λ = 400-700 एनएम). 0.7 एम 2 के अनुसार छह से पौधों की संख्या को सीमित करके एक दूसरे छायांकन से पौधों को रोकने.
    4. नमूना लेने से पहले, सही पसलियों के बीच क्षेत्र खंड 5.2.1 और डो योजना में जोड़ा लेबल की तुलना द्वारा चुना गया था सुनिश्चित करें.
    5. डो द्वारा संकेत स्थिति और समय पर इलाज पसलियों के बीच खेतों से 4-5 पत्ती डिस्क को हटाने के लिए एक काग छिद्रक का प्रयोग करें. नमूने के दौरान संयंत्र से पूरी पत्ती न निकालें. टूटना को रोकने के लिए डिस्क हटाने के दौरान एक हाथ से आयोजित कागज तौलिया के साथ पत्ती को स्थिर.
    6. प्रत्येक नमूना के द्रव्यमान का निर्धारण और नमूना नाम और जन के साथ लेबल एक 1.5 मिलीलीटर की प्लास्टिक प्रतिक्रिया ट्यूब में जगह है. प्रोटीन quantitation से पहले -20 डिग्री सेल्सियस या -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की दुकान. प्रक्रिया नमूना स्थिरता के आधार पर कई महीनों के लिए इस चरण में रोक दिया जा सकता हैऔर भंडारण तापमान.

6. प्रोटीन Quantitation

  1. पत्ता डिस्क के नमूनों से प्रोटीन निकालें.
    1. नमूना जन की मिलीग्राम प्रति और कोई बड़े टुकड़े रहना जब तक एक बिजली के मूसल का उपयोग कर प्रतिक्रिया ट्यूब में पत्ती डिस्क पीस, (8.0 पीएच 50 मिमी सोडियम फास्फेट, 500 मिमी सोडियम क्लोराइड) निष्कर्षण बफर के 3 मिलीलीटर जोड़ें. नमूना के overheating से बचने.
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 16,000 XG पर दो बार नमूना centrifuging द्वारा छितरी ठोस निकालें गोली परेशान बिना हर कदम के बाद एक साफ 1.5 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण.
    3. Centrifugation के बाद, प्रक्रिया संयंत्र नमूना स्थिरता और भंडारण के तापमान पर निर्भर करता है कई महीनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस या -80 डिग्री सेल्सियस पर निकालती ठंड से रोक दिया जा सकता है. एक फ्रीज पिघलना चक्र लक्ष्य प्रोटीन (ओं) की एकाग्रता प्रभावित नहीं करता है की पुष्टि करें.
  2. DsRed प्रतिदीप्ति उपाय.
    1. काला 96 अच्छी तरह से आधे क्षेत्र प्लेट (अच्छी तरह से प्रति 50 μl निकालने) में प्रत्येक नमूने के तीन तकनीकी प्रतिकृति तैयार करें. Pipetting दौरान बुलबुले के गठन से बचने.
    2. एक लाइनर संदर्भ वक्र उत्पन्न करने के लिए 96 अच्छी तरह से थाली प्रति एक DsRed मानक के छह dilutions (0, 25, 75, 125, 175 और 225 माइक्रोग्राम / एमएल) का एक सेट का प्रयोग करें. पीबीएस में dilutions तैयार है और 3 महीने के भीतर उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें दुकान.
    3. 530/25 एनएम उत्तेजना और 590/35 एनएम उत्सर्जन फिल्टर के साथ लगे एक 96 अच्छी तरह से थाली पाठक में, क्रमिक रूप से, दो बार प्रतिदीप्ति उपाय.
    4. प्रत्येक नमूना के लिए, दो से अधिक प्रतिदीप्ति पढ़ता है और तीन तकनीकी replicates औसत और 0 ग्राम / एमएल DsRed युक्त रिक्त नियंत्रण के लिए दर्ज की गई मूल्य घटाना. इसके अलावा मानक dilutions की पढ़ता से इस मूल्य घटाना और (तालमेल की उत्पत्ति के माध्यम से) एक संदर्भ वक्र उपज एक रेखीय प्रतिगमन के लिए इन रिक्त सही मूल्यों का उपयोग करें.
    5. एफ कन्वर्ट करने के लिए संदर्भ वक्र के ढलान का प्रयोग करेंDsRed सांद्रता में नमूने के लिए मापा luorescence. यदि आवश्यक हो, readout के मानकों की एकाग्रता अंतराल के भीतर गिर जाता है, ताकि नमूने पतला और बाद की गणना में यह कमजोर पड़ने कारक पर विचार करें.
  3. 2G12 की एकाग्रता का निर्धारण.
    1. एक प्रवाह सेल के सक्रिय सतह के लिए प्रोटीन एक युग्मन द्वारा प्रतिरक्षी एकाग्रता की माप के लिए एक सतह plasmon अनुनाद (एसपीआर) डिवाइस तैयार करें. एक प्रोटीन 30,31 के युग्मन के बिना सतह निष्क्रिय द्वारा संदर्भ के रूप में एक और प्रवाह सेल का प्रयोग करें.
    2. संयंत्र एसपीआर चल बफर (10 मिमी HEPES पीएच 7.4, 3 मिमी EDTA, 150 मिमी NaCl, 0.05% v / v बीच 20) में 1:20 अर्क पतला और तीन में एक प्रोटीन के लिए बाध्य एंटीबॉडी की प्रतिक्रिया इकाइयों (आरयू) उपाय एक 90 μl इंजेक्शन (30 μl / मिनट पर 180 सेकंड) के अंत में प्रत्येक नमूने की तकनीकी replicates. प्रयोगात्मक FL में मापा आरयू से संदर्भ प्रवाह सेल (कोई एक प्रोटीन) में मापा आरयू घटाएँओउ सेल (एक प्रोटीन सतह).
    3. प्रत्येक 10-15 नमूनों के बाद एक 585 एनजी / एमएल 2G12 मानक उपाय और ऊपर वर्णित के रूप में संदर्भ प्रवाह कोशिकाओं में मापा मूल्य घटाना. तालमेल की उत्पत्ति के माध्यम से एक रेखीय संदर्भ वक्र की गणना करने के लिए इन मानकों का औसत आरयू प्रयोग करें.
    4. 1:20 कमजोर पड़ने और संदर्भ वक्र की ढलान पर आधारित नमूने में 2G12 सांद्रता की गणना.
    5. जो भ्रष्ट कर सकते हैं माप, संदर्भ सेल को मजबूत अविशिष्ट बाइंडिंग के लिए जाँच करें. इसके अलावा अधिक से अधिक भिन्नता के एक प्रोटीन सतह की उम्र बढ़ने को दर्शाता रूप 2G12 मानकों, विश्लेषण के दौरान लगभग स्थिर मूल्यों (<5% परिवर्तन) को बनाए रखने या नहीं.

7. डेटा विश्लेषण और मूल्यांकन

  1. (Ii) असामान्य परिणाम, जैसे कारक संयोजनों कि जीन, स्वयं (मैं) चरम मूल्यों का संकेत (उच्च या कम) माप त्रुटियों के लिए अभिव्यक्ति प्रयोगों में मनाया प्रतिक्रियाओं का विश्लेषणडाटा इंटरचेंज का संकेत अप्रत्याशित प्रतिक्रियाओं की दर, और (iii) मान गायब है.
    नोट: दोषपूर्ण डेटा पर आधारित मॉडल के निर्माण को रोकने के लिए इन क्रियाओं का उपयोग करें.
  2. DesignExpert की "डिजाइन" नोड में विश्लेषण किया प्रतिक्रिया डेटा (यहाँ प्रोटीन सांद्रता) स्थानांतरण. प्रतिक्रिया डेटा सही ढंग से इसी कारक सेटिंग्स करने के लिए आवंटित कर रहे हैं कि सुनिश्चित करें. पहलुओं नीचे संबोधित शामिल किया गया है कि DesignExpert सॉफ्टवेयर में उपलब्ध एक व्यापक सहायता अनुभाग है.
  3. "विश्लेषण" नोड में, विश्लेषण करने की प्रतिक्रिया का चयन और शुरू में परिवर्तन टैब में "कोई नहीं" का चयन करें.
    नोट: एक परिवर्तन 10 से बड़ा प्रतिक्रिया की न्यूनतम / अधिकतम अनुपात के लिए सिफारिश की है. सबसे उपयोगी परिवर्तन नीचे वर्णित "निदान उपकरण" (धारा 7.8) के "निदान" खंड में "निदान" टैब में बॉक्स कॉक्स साजिश से प्राप्त किया जा सकता है. एक प्रवेश 10 परिवर्तन अक्सर उपयुक्त है.
    4. (जैसे दो कारक बातचीत, द्विघात प्रभाव) के लिए महत्वपूर्ण हैं कि कारकों के बारे में सामान्य जानकारी प्रदान करता है जो "फ़िट सारांश" टैब, पर जारी. सॉफ्टवेयर इसके महत्व पर आधारित एक प्रारंभिक मॉडल का सुझाव देगा.
  4. "आदर्श" टैब में, एक प्रारंभिक मॉडल "फ़िट सारांश" परिणामों के आधार पर चुने हुए है. इस मॉडल को संपादित करने के लिए स्वचालित मोड का उपयोग करें:
    1. सुझाव मॉडल "2FI" (दो कारक बातचीत) है तो "द्विघात" का चयन एक आदेश सुझाव मॉडल से ऊपर है कि एक "प्रक्रिया आदेश", जैसे चुनें.
    2. Iteratively शुरू में 0.100 जो होना चाहिए "अल्फा बाहर" मूल्य पर आधारित "एनोवा" टैब के लिए आगे बढ़ने के बाद मॉडल से nonsignificant शर्तें हटा देगा जो, "चुनाव" क्षेत्र में 'पिछड़े' चुनें.
    3. सॉफ्टवेयर से पूछा तो यह necessar है, क्योंकि हमेशा स्वतः मॉडल पदानुक्रम सहीविश्वसनीय मॉडल 32,33 उत्पन्न करने के लिए वाई.
  5. "एनोवा" टैब में, सुझाव मॉडल और शामिल कारकों की जांच. यदि आवश्यक हो, स्वयं को "चुनाव" बदल रहा है, वापस "मॉडल" टैब में जाने से (एक 5% महत्व स्तर के संगत, यहां 0.05) एक पूर्वनिर्धारित सीमा से ऊपर पी मूल्यों के साथ किसी भी कारकों को हटाने या संभावना नहीं यंत्रवत विचार पर आधारित हैं कि उन करने के लिए "मैनुअल" और मॉडल से उचित कारकों को नष्ट करने.
  6. वापस "एनोवा" टैब में, "मॉडल" (इस महत्व को इंगित करता है क्योंकि एक कम मूल्य वांछनीय है) और "की कमी के फिट" (एक उच्च मूल्य के पी मूल्य के संदर्भ में ताजा मॉडल का मूल्यांकन वांछनीय है इस महत्व की कमी) और साथ ही "आर चुकता" के लिए मूल्यों को इंगित करता है क्योंकि (> 0.80 मानों सभी तीन मूल्यों के लिए वांछित हैं), "आर चुकता समायोजित" और "आर चुकता भविष्यवाणी '.
    1. के लिए इन मूल्यों की तुलना करेंकई महत्व स्तर पर कारकों को छोड़कर / सहित विभिन्न मॉडल आर.
      नोट: यह "डिजाइन" नोड में प्रतिक्रिया स्तंभ नकली और व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक विश्लेषण करते हैं, या ऐसे किसी स्प्रेडशीट के रूप में एक अन्य कार्यक्रम में पूरे "एनोवा" तालिका निर्यात करने के लिए सहायक हो सकता है.
  7. मॉडल की गुणवत्ता की पुष्टि करें और "निदान उपकरण" में सभी टैब ("निदान" और "प्रभाव" अनुभाग) का परीक्षण करके मॉडल पर एक मजबूत प्रभाव है जो डाटासेट में संभावित outliers पता लगाने के लिए "निदान" टैब पर जारी .
    1. "निदान उपकरण" का "निदान" अनुभाग में, निम्न क्रियाएँ:
      1. सुनिश्चित अंक बेतरतीब ढंग में सीमा के भीतर बिखरे हुए हैं चार्ट "बच बनाम अनुमानित". इधर, एक शेवरॉन के आकार का वितरण डेटा परिवर्तन के लिए एक की जरूरत को दर्शाता है.
      2. सुनिश्चित अंक बेतरतीब ढंग में सीमा के भीतर बिखरे हुए हैंचार्ट "बच बनाम भविष्यवाणी '. इधर, एक शेवरॉन के आकार का वितरण डेटा परिवर्तन के लिए एक की जरूरत को दर्शाता है.
      3. जांच "बच रन बनाम" चार्ट स्कैटर में अंक बेतरतीब ढंग से सीमा के भीतर चाहे. एक पैटर्न (उदाहरण के लिए "सीढ़ी") मॉडल पर इसके प्रभाव प्रतिक्रिया करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है डेटा और ब्लॉक भवन में एक प्रवृत्ति को इंगित करता है.
      4. साजिश "वास्तविक बनाम भविष्यवाणी 'में आदर्श मॉडल का संकेत सीधे विकर्ण लाइन के लिए देखो. विकर्ण के आसपास डेटा के बिखरने, अधिक से अधिक मॉडल कम सटीक.
      5. डेटा परिवर्तन का संकेत नीले (सबसे अच्छा) और ग्रीन बॉक्स कॉक्स साजिश में (वास्तविक) ऊर्ध्वाधर लाइनों की एक ओवरलैप के लिए जाँच करें. ग्रीन लाइन (लाल खड़ी रेखा ने संकेत दिया अंतराल के बाहर) नीले रंग की एक से मेल नहीं खाता, तो वापस अनुभाग 7.3 के लिए जाना और बॉक्स कॉक्स साजिश द्वारा सुझाए गए डेटा परिवर्तन का चयन करके मॉडल इमारत दौर में सुधार होगा. फिर पुनः के दोहरावत्वरित कार्रवाई स्तंभ विभिन्न मॉडलों की तुलना करने के लिए उपयोगी हो सकता है.
      6. "बच फैक्टर बनाम" चार्ट (प्रत्येक मॉडल कारक के लिए एक चार्ट है) में अंक सीमा के भीतर बेतरतीब ढंग से तितर बितर कि सुनिश्चित करें. डेटा वितरण में वक्रता मॉडल में लापता एक कारक संकेत हो सकता है.
    2. "निदान उपकरण" के "प्रभाव" अनुभाग में, "लाभ", "DFFITS" और "DFBETAS" भूखंडों और समान रूप से कम वितरण के बिना, यकीन है कि "बाह्य studentized बच" में सीमा के भीतर डेटा के यादृच्छिक बिखरने वहाँ बनाने "कुक की दूरी" साजिश में चरम मानों.
  8. "मॉडल रेखांकन" टैब में, का मूल्यांकन मॉडल कल्पना. सांख्यिक कारकों में से एक सीमित संख्या में (जैसे 3) प्रतिक्रिया सतह ("3 डी सतह") प्रतिनिधित्व मैन्युअल रूप ओप्टिमा / विशेषताओं का आकलन करने के लिए उपयोगी है.
    नोट: प्रतिक्रिया सतहों केवल दो कारकों के प्रभाव को वर्णनजांच के तहत प्रतिक्रिया पर tors. प्रतिक्रिया पर कोई अतिरिक्त कारक के प्रभाव "कारकों उपकरण" खिड़की में इसकी कीमत (सांख्यिक कारकों) या स्तर (categoric कारकों) बदलकर पता चला है. वैकल्पिक रूप से, कारकों "कारकों उपकरण" खिड़की में उन्हें राइट क्लिक करके और वांछित स्वतंत्र चर अक्ष का चयन करके प्लाट अक्ष को सौंपा जा सकता है.
    1. कारक के स्तर में हेरफेर और "कारकों उपकरण" की मदद ग्राफ तालमेल करने के लिए उन्हें आवंटित.
    2. "फाइल" टैब में आदेश "... फ़ाइल को निर्यात ग्राफ" का उपयोग कर निर्यात रेखांकन.
  9. माध्यम (जैसे सीमा और वजन) बदले में कुछ बाधाओं लागू किया जा सकता है, जो मॉडल कारकों पर निर्भर करता है (रेंज में, अधिकतम, न्यूनतम) संख्यानुसार प्रतिक्रिया अनुकूलन करने के लिए "अनुकूलन" नोड में "न्यूमेरिकल" उप नोड का उपयोग "मापदंड" टैब.
    1. "समाधान" में गणना और संख्यात्मक समाधान की जांच"मापदंड" टैब में प्रदान की इनपुट के आधार पर टैब.
    2. उच्च या कम प्रतिक्रिया मूल्यों के साथ जुड़े कारक सेटिंग्स खुलासा आगे के विश्लेषण (जैसे histograms) के लिए अन्य सॉफ्टवेयर (जैसे स्प्रेडशीट्स) करने के लिए इन समाधान निर्यात करें.
      नोट: अधिक से अधिक तीन सांख्यिक कारकों की जांच की और 3 डी प्रतिनिधित्व मुश्किल है, तो यह सहायक है.
  10. विशिष्ट कारक सेटिंग्स के लिए प्रतिक्रिया की भविष्यवाणी करने के लिए "बिंदु भविष्यवाणी" उप नोड का प्रयोग करें.
    1. सभी सेटिंग्स (, यहाँ सब प्रमोटर और 5'UTR संयोजन के साथ ही सभी पत्ते और ऊष्मायन बार या पत्ती की दशा और ऊष्मायन तापमान) मूल्यांकन किया जाना है के लिए इस भविष्यवाणी का प्रयोग करें.
    2. भविष्यवाणी मूल्यों निर्यात और एक निश्चित समय पर एक विशिष्ट प्रमोटर-5'UTR संयोजन के लिए अभिव्यक्ति की गणना के द्वारा जैसे तम्बाकू पौधों में क्षणिक अभिव्यक्ति का वर्णन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जो एक डेटा सरणी, उन्हें संकलन सभी पत्ती पदों या एक्रो पर औसतनएक संयंत्र एस.एस. सभी पत्ते.
    3. विशिष्ट अभिव्यक्ति के स्तर (माइक्रोग्राम जी -1) या विशिष्ट अभिव्यक्ति की दर (माइक्रोग्राम जी -1 घंटा -1) उपज के लिए अलग पत्तियों की जनता पर आधारित अभिव्यक्ति डेटा मानक के अनुसार.
    4. वैकल्पिक रूप से, एक स्प्रेडशीट में "एनोवा" टैब के नीचे से "अंतिम समीकरण" के गुणांक निर्यात और एक ही डेटा सरणी उपज के लिए कारक सेटिंग्स की एक सरणी के साथ उन्हें गुणा.
      नोट: सज्जित मॉडल समीकरण एक्सट्रपलेशन के लिए अनुकूल नहीं है क्योंकि इस सरणी ही, प्रारंभिक डिजाइन अंतरिक्ष के भीतर से कारक मान हो सकता है.
  11. प्रमुख ब्याज की हैं कि मॉडल अंक के लिए एक वही प्रयोग आचरण.
    1. "प्वाइंट भविष्यवाणी" (खंड 7.11) के लिए चयनित स्थितियों के तहत क्षणिक प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रदर्शन करना. जैसे उसी तापमान और पत्तियों आदि का उपयोग
    2. इस क्षणिक अभिव्यक्ति ई के लिए प्रोटीन सांद्रता निर्धारितके रूप में (धारा 6) ऊपर का वर्णन है और मॉडल के आधार पर भविष्यवाणी मूल्यों के साथ उनकी तुलना xperiment.
    3. पुष्टि प्रयोग में औसत प्रोटीन एकाग्रता बिंदु भविष्यवाणी के दौरान प्राप्त प्रतिक्रिया सतह मॉडल की भविष्यवाणी अंतराल के भीतर गिर जाता है या नहीं. एक मैच मॉडल की भविष्यवाणी करने की शक्ति की पुष्टि की. एक बेमेल एक कम मॉडल की गुणवत्ता और अतिरिक्त रनों की आवश्यकता हो सकता है इंगित करता है.
    4. नोट: संयंत्र बैच को बैच परिवर्तनशीलता भविष्यवाणी अंतराल broadens और पौधों की एक अलग बैच के साथ प्रदर्शन किया पुष्टि प्रयोगों अवमूल्यन करना हो सकता है. हालांकि, मॉडल उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया, लेकिन नमूने मॉडल में निहित है कि एक ही पौधे बैच से उत्पन्न नहीं किए गए नमूने के रूप में प्रभावी नियंत्रण सेवा कर सकता है.

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Representative Results

विभिन्न प्रमोटरों और 5'UTRs का उपयोग क्षणिक अभिव्यक्ति दौरान DsRed संचय के लिए एक वर्णनात्मक मॉडल

पत्ती निष्कर्षों में DsRed प्रतिदीप्ति पुनः संयोजक प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर से संकेत मिलता है और इस प्रकार डो रणनीति में प्रतिक्रिया के रूप में इस्तेमाल किया गया था इस्तेमाल किया गया था. हम प्रासंगिक माना न्यूनतम detectable अंतर 20 माइक्रोग्राम / एमएल था और इस प्रणाली की अनुमानित मानक विचलन प्रारंभिक प्रयोगों के आधार पर 8 ग्राम / एमएल था. क्षणिक अभिव्यक्ति मॉडल में शामिल कारक साहित्य डेटा 7,8 और हमारे परिणाम पिछले 9 के आधार पर चयन किया गया था. जांच की सीमाओं को भी इन आंकड़ों के अनुसार चुने गए हैं (तालिका 1). कम से कम तीन स्तरों एक द्विघात बेस मॉडल की गणना की अनुमति के लिए सभी असतत सांख्यिक कारकों के लिए चयन किया गया था. एक D-इष्टतम चयन एल्गोरिथ्म डो के चयन के लिए चुना गया था के लिए सबसे सटीक अनुमान प्राप्त करने के लिए चलाता हैप्रतिगमन मॉडल के गुणांक. शुरू में DesignExpert द्वारा सुझाए डिजाइन 90 रन शामिल थे लेकिन एफडी भविष्यवाणी (चित्रा 3) के एक 1% मानक त्रुटि प्राप्त करने के लिए अपर्याप्त था. 210 रन के कुल करने के लिए डिजाइन की डी इष्टतम वृद्धि इस मुद्दे को हल करने और फ्लैट वक्र (चित्रा 3 बी) ने संकेत दिया डिजाइन अंतरिक्ष में और अधिक समान भविष्यवाणी सटीकता के साथ 100% की एक एफडी में हुई.

DsRed सांद्रता सभी 210 रन के लिए निर्धारित और डेटा तब्दील प्रवेश 10 थे. मॉडल कारकों 0.100 के एक अल्फा के स्तर के साथ एक घन मॉडल से स्वचालित रूप से पिछड़े चयन द्वारा चुने गए हैं. यह कई सहसंबंध गुणांक (तालिका 2) के लिए तुच्छ कमी के लिए फिट और उच्च मूल्यों के साथ एक महत्वपूर्ण मॉडल (तालिका 2) में हुई. सभी मॉडल कारकों के पी मूल्य <0.05 था और इस तरह के मॉडल के आगे नहीं मैनुअल हेरफेर की आवश्यकता थी. निहित मॉडलप्रारंभिक द्विघात बेस मॉडल का हिस्सा नहीं थे कि तीन कारक बातचीत (2 तालिका). पुनर्मूल्यांकन अंतिम भविष्यवाणी मॉडल में शामिल सभी कारकों का उपयोग एफडी ग्राफ की भविष्यवाणी की मानक त्रुटि के लिए एफडी काफी अतिरिक्त तीन कारक बातचीत (= 0.99 एफडी) को शामिल करके कम नहीं था कि पता चला.

(आंकड़े 5 ए और 5 ब DesignExpert में मॉडल गुणवत्ता नैदानिक ​​उपकरण डेटा परिवर्तन उपयोगी संकेत दिया कि और बच के सामान्य प्लाट रैखिक व्यवहार दिखाया और कोई विशिष्ट पैटर्न की भविष्यवाणी की साजिश बनाम बच में मनाया गया, क्योंकि मॉडल में कोई लापता कारकों वहाँ थे ). एक छिपे हुए समय पर निर्भर चर (चित्रा 5C) इंगित करने के लिए प्रयोग के पाठ्यक्रम में कोई प्रवृत्ति भी नहीं था. इसके बजाय, मॉडल भविष्यवाणियों मनाया DsRed प्रतिदीप्ति (चित्रा 5D) के साथ बहुत अच्छा समझौते में थे. हम टीherefore चयनित मॉडल 8 दिनों तक चलने वाले एक के बाद घुसपैठ ऊष्मायन अवधि के दौरान विभिन्न प्रमोटर / 5'UTR संयोजन द्वारा संचालित गैर गर्भदल तम्बाकू के पत्ते में DsRed का क्षणिक अभिव्यक्ति की भविष्यवाणी करने के लिए उपयोगी था कि ग्रहण किया. हम भी (चित्रा 6) गलत कारक चयन और परिवर्तन के परिणामों को वर्णन करने के लिए डेटा परिवर्तन के बिना एक कृत्रिम रेखीय प्रतिगमन मॉडल का चयन किया. जाहिर है, बच के सामान्य प्लाट उम्मीद रैखिक व्यवहार (चित्रा 6A) से भटक जाता है और एक 'वी' के आकार बच में पैटर्न बनाम साजिश के बजाय एक यादृच्छिक तितर बितर (चित्रा 6B) की भविष्यवाणी की है. भविष्यवाणियों, दोनों के लिए गरीब छोटे और उच्च मान रहे हैं, जबकि इसके अतिरिक्त, बच बनाम रन साजिश इष्टतम मॉडल (विकर्ण) (चित्रा 6D) से हटने, दो चरम मानों (चित्रा 6C) पर प्रकाश डाला गया.

CaMV 35 के साथ 5'UTR संयोजनपहले 34 सूचना दी और इसी कारकों डो मॉडल (तालिका 2) में महत्वपूर्ण होना पाया गया है के रूप में एसएस प्रमोटर ओपन स्कूल प्रवर्तक (आंकड़े 5 ए और 5 ब) के साथ संयोजन की तुलना में मजबूत DsRed अभिव्यक्ति में हुई. मॉडल भी पत्ता उम्र हमारे पिछले निष्कर्ष 19 और दूसरों 7,8 के लोगों के साथ अच्छे समझौते में था जो युवा पत्तियों में अधिक होना दिखाया अभिव्यक्ति के स्तर (आंकड़े 7B और 7 दिन) के साथ एक महत्वपूर्ण कारक (तालिका 2) था कि भविष्यवाणी की. पत्तियों में DsRed संचय की प्रगति रेखीय या घातीय नहीं था लेकिन मॉडल के अनुसार बाद घुसपैठ ऊष्मायन के 8 दिनों के दौरान एक sigmoidal वक्र का पालन किया. दिलचस्प है, DsRed अभिव्यक्ति इसी के संदर्भ में 5'UTRs का कोई निश्चित क्रम नहीं था. इसलिए, एक 5'UTR की "ताकत" साथ प्रमोटर पर निर्भर था. यह संभावना नहीं है कि इसप्रमोटर और 5'UTR के बीच अन्योन्याश्रय एक OFAT प्रयोग का उपयोग कर पता चला गया होता. भविष्य कहनेवाला मॉडल भी संकेत दिया है कि प्रमोटर / 5'UTR संयोजन (जैसे. CaMV 35SS/CHS और ओपन स्कूल / CHS (आंकड़े 7A और 7B), CaMV 35SS/omega और ओपन स्कूल / CHS या CaMV 35SS/CHS और CaMV 35SS / के कुछ जोड़े टीएल) सभी पत्ते और ऊष्मायन बार> 2 दिनों (जैसे. CaMV 35SS/omega और ओपन स्कूल / सीएचएस के लिए अनुपात ~ 8.0 था) 20 के पार एक परिभाषित अनुपात से कम से कम 30% से भिन्न, एक संतुलित अभिव्यक्ति के स्तर में हुई. इस तरह संतुलित अभिव्यक्ति इस तरह के एक परिभाषित stoichiometry 35,36 साथ आईजी के रूप में multimeric प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए उपयोगी होगा.

चित्रा 5
चित्रा 5. ग्रैपमॉडल गुणवत्ता की hical मूल्यांकन. बच गया एक लाइन का पालन करें क्योंकि आंतरिक studentized बच के एक. सामान्य संभावना साजिश सामान्य वितरण इंगित करता है. बी. आंतरिक studentized बच एक उपयुक्त डेटा परिवर्तन. सी का संकेत भविष्यवाणी की प्रतिक्रिया (प्रतिदीप्ति) की सभी श्रेणियों के लिए मूल्य शून्य के आसपास बिखेरा. आंतरिक studentized बच छिपा अस्थायी प्रभाव का अभाव दिखा, प्रयोग के पूरे कोर्स के दौरान मूल्य शून्य के आसपास बिखेरा. डी. भविष्यवाणी की है और प्रतिक्रिया के वास्तविक मूल्यों को सभी बिंदुओं विकर्ण (आदर्श मॉडल) के करीब झूठ के रूप में अच्छा समझौते में हैं.

चित्रा 6
चित्रा 6. निदान का संकेत कम मॉडल गुणवत्ता. एक बी से विचलित क्योंकि आंतरिक studentized बच के सामान्य संभावना साजिश गैर सामान्य वितरण इंगित करता है. आंतरिक studentized बच एक अनुचित डेटा परिवर्तन का संकेत एक 'वी' के आकार का वितरण दिखा. सी. आंतरिक studentized बच प्रयोग के पूरे कोर्स के दौरान मूल्य शून्य के आसपास नहीं तितर बितर, लेकिन सकारात्मक मूल्यों की दिशा में एक प्रवृत्ति दिखा रहे हैं. इसके अतिरिक्त, दो चरम मानों पाया जा सकता है. डी. भविष्यवाणी की है और सबसे अधिक अंक विकर्ण (आदर्श मॉडल) से विचलित के रूप में प्रतिक्रिया के वास्तविक मूल्यों गरीब समझौते में हैं.

चित्रा 7
चित्रा 7. रिस्पांस तम्बाकू के पत्ते में क्षणिक DsRed अभिव्यक्ति के लिए सतहों. एक . पत्ती 2 में टुनिशिया> नग / CHS, बी. CaMV पत्ती 2 में 35SS/CHS, सी. पत्ती 6 में CaMV 35SS/TL, डी. पत्ती 6 CaMV 35SS/CHS. DsRed सांद्रता ऊष्मायन अवधि के दौरान एक sigmoidal ढंग से वृद्धि हुई है. अभिव्यक्ति के स्तर युवा पत्तियों (सी और डी में जैसे पत्ती 6) को और CaMV 35SS प्रमोटर (बी) की तुलना में ओपन स्कूल (ए) के लिए की तुलना में पुराने पत्तों में (ए और बी में जैसे पत्ती 2) कम थे. 5'UTR भी DsRed अभिव्यक्ति (सीएचएस बनाम जैसे टीएल (सी) (डी)) लेकिन अभिव्यक्ति ताकत साथ प्रमोटर पर निर्भर था पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ा.

"> DF
स्रोत वर्गों का योग वर्ग मतलब एफ मूल्य पी मूल्य
मॉडल 174.85 95 1.84 182.12 <0.0001
पत्ती की स्थिति (एक) 0.16 1 0.16 16.06 0.0001
ऊष्मायन समय (बी) 112.46 1 112.46 11,128.22 <0.0001
पत्ता उम्र (सी) 15.24 7 2.18 215.39 <0.0001
प्रमोटर (डी) 23.49 1 23.49 2324.29 <0.0001
5'UTR (ई) 0.93 3 0.31 30.61 <0.0001
एसी 0.24 7 0.034 3.38 0.0026
ई.पू. 1.46 7 0.21 20.64 <0.0001
बी.डी. 2.27 1 2.27 224.51 <0.0001
इ 0.87 3 0.29 28.74 <0.0001
सीडी 0.29 7 0.042 4.11 0.0005
सीई 0.43 21 0.021 2.04 0.0093
डे 0.48 3 0.16 15.73 <0.0001
बी 2 6.34 1 6.34 627.29 <0.0001
बीसीडी 0.95 7 0.14 13.42 <0.0001
ईसा पूर्व 0.39 21 0.019 0.0230
BDE 0.16 3 0.054 5.37 0.0017
B2D 1.49 1 1.49 147.93 <0.0001
अवशिष्ट 1.15 114 0.010
अभाव के फिट 1.08 104 0.010 1.45 0.2669
शुद्ध त्रुटि 0.072 10 7.153E-003
सहसंबंध कुल 176.01 209
सहसंबंध गुणांक मूल्य
आर चुकता 0.9935
समायोजित आर चुकता 0.9880
अनुमानित आर चुकता 0.9770

तालिका 2. भविष्य कहनेवाला में शामिल कारकतंबाकू में क्षणिक DsRed अभिव्यक्ति के लिए मॉडल अलग प्रमोटर / 5 'UTR संयोजन का उपयोग कर छोड़ देता है. तीन कारक बातचीत बोल्ड में डाला जाता है.

ऊष्मायन शर्तों और क्षणिक अभिव्यक्ति द्वारा पौधों में मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के उत्पादन के लिए फसल योजनाओं का अनुकूलन

डो दृष्टिकोण भी तम्बाकू 19 में मोनोक्लोनल एचआईवी उदासीन एंटीबॉडी 2G12 और DsRed के एक साथ उत्पादन के लिए ऊष्मायन तापमान, पत्ती घुसपैठ, संयंत्र उम्र और फसल योजनाओं के लिए जीवाणु OD600nm, अनुकूलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. फसल योजना पत्ते छह ऊपरवाला पत्तियों जैसे, प्रोटीन निकासी के लिए इस्तेमाल किया गया है, जो निर्धारित की. पुराने = परिपक्व कली चरण = 47 दिनों में फसल के बाद देखते हैं, इसलिए हम (युवा = जल्दी कली चरण = 40 दिनों में फसल बोने के बाद अलग अलग उम्र में पौधों में प्रत्येक प्रोटीन (2G12 और DsRed) के अभिव्यक्ति के लिए एक भविष्य कहनेवाला मॉडल स्थापितडिंग). ये चार मॉडल फिर से मूल्यांकन किया और प्रत्येक कारक शामिल है कि स्थापित एक आम सहमति मॉडल अलग अलग मॉडल में महत्वपूर्ण होना पाया गया है. हम तो आम सहमति मॉडल अभी भी सभी प्रारंभिक डेटा सेट (तालिका 3) का अच्छा प्रतिनिधित्व था कि पुष्टि की. आम सहमति मॉडल तो दोनों प्रोटीन के लिए इष्टतम ऊष्मायन तापमान (~ 22 ° 2G12 के लिए सी और ~ 25 डिग्री सेल्सियस DsRed के लिए) और बैक्टीरियल आयुध डिपो 600nm (~ 1.0) की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. ये इष्टतम स्थितियों तो सभी पत्ते (1-8) और पत्ती पदों युवा और पुराने संयंत्रों में (1-4) में प्रोटीन सांद्रता भविष्यवाणी करने के लिए इस्तेमाल किया गया. एकाग्रता प्रोफाइल अलग पत्तियों और पौधे उम्र (चित्रा 8A) से प्राप्त लक्ष्य प्रोटीन की पूर्ण राशि उपज के लिए बायोमास डेटा 19 के साथ एकीकृत किया गया. निरपेक्ष प्रोटीन की मात्रा तो हमें प्रत्येक पत्ती / संयंत्र उम्र के प्रसंस्करण के लिए एक लागत लाभ विश्लेषण से बाहर ले जाने के लिए अनुमति एसोसिएटेड नीचे की ओर लागत के साथ सहसंबद्ध थे. यह पता चला है किप्रोटीन पुराने पौधों (आंकड़े 8B और 8C) की तुलना में कम कुल बायोमास के बावजूद कम वृद्धि की अवधि के दौरान उच्च सांद्रता तक पहुँच क्योंकि युवा पौधों क्षणिक अभिव्यक्ति के लिए लाभप्रद थे. हम भी पुराने पौधों से सभी पत्ते प्रसंस्करण पत्ते 1-3 discarding और बजाय बैच प्रति पौधे (चित्रा 8D) की संख्या में वृद्धि की तुलना में महंगा था. इसलिए, डो आधारित मॉडल प्रक्रिया के विश्लेषण के और अधिक जटिल पहलुओं की सुविधा के लिए एक प्रयोग के अंतिम चरण के लिए चिह्नित करने के लिए न केवल उपयुक्त है, लेकिन यह भी अन्य डेटा के साथ संयोजन के लिए कर रहे हैं. एक biopharmaceutical प्रोटीन के लिए पूरी उत्पादन प्रक्रिया को कवर परस्पर मॉडल की एक श्रृंखला परम लक्ष्य हो सकता है.

8 चित्रा
चित्रा 8. एकीकृत पूर्ण प्रोटीन उपज और प्रक्रिया लागत में जिसके परिणामस्वरूप बायोमास और प्रोटीन एकाग्रता डेटा के आयन. एक. पत्ता बायोमास और लक्ष्य प्रोटीन एकाग्रता युवा पत्तियों. बी में 2G12 के एक पक्षपाती संचय में जिसके परिणामस्वरूप एक समरेख ढंग से विकसित नहीं किया. DsRed और ~ का एक ही राशि 2G12 के 65% एक ~ 50% कम औसत बायोमास. सी के बावजूद पुराने लोगों की तुलना में युवा पौधों में पाया गया था. इस युवा पौधों में उच्च विशिष्ट प्रोटीन अभिव्यक्ति परिलक्षित. डी. कम बायोमास कम ग्रीनहाउस अंतरिक्ष, कम उपभोग्य (जैसे. फिल्टर), और कम बहाव के उपकरणों की आवश्यकता होती है संसाधित करने की जरूरत है क्योंकि वृद्धि की विशिष्ट अभिव्यक्ति दोनों प्रोटीन के लिए कम उत्पादन लागत में अनुवाद.

पीटी, चौड़ाई: 48pt "चौड़ाई =" 64 "> संयंत्र उम्र [डीपीएस] टी ">
40 47
लक्ष्य प्रोटीन [-] DsRed 2G12 DsRed 2G12
मॉडल [-] प्रारंभिक आम राय प्रारंभिक आम राय प्रारंभिक आम राय प्रारंभिक आम राय
आर चुकता [-] 0.9829 0.9577 0.9321 0.9099 0.9436 0.9403 0.8826 0.8782
समायोजित आर चुकता [-] 0.9711 0.9480 .9059 0.8893 0.9362 0.9350 0.8716 0.8674
अनुमानित आर चुकता [-] 0.9510 0.9336 .8272 .8587 .9254 0.9282 .8554 .8516

तालिका 3. सहसंबंध की तुलना प्रारंभिक रुपये के लिए coefficientsएम मॉडल और तंबाकू के पौधों में DsRed और 2G12 अभिव्यक्ति की अंतिम आम सहमति मॉडल.

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Discussion

संसाधनों की स्थिति खराब है और महंगे हैं क्योंकि हर प्रयोग सावधान योजना की आवश्यकता है. नियोजन चरण (जैसे सभी महत्वपूर्ण कारक बातचीत को कवर नहीं करता है कि एक बेस मॉडल का चयन) के दौरान त्रुटियों को काफी परिणामस्वरूप मॉडल की भविष्यवाणी करने की शक्ति कम हो जाना और इस तरह पूरे प्रयोग के अवमूल्यन कर सकते हैं क्योंकि यह डो रणनीतियों के लिए विशेष रूप से सच है. हालांकि, इन त्रुटियों को आसानी से बुनियादी प्रक्रियाओं का पालन करके बचा जा सकता है.

डो योजना के दौरान विचार

सबसे पहले, यह प्रत्येक डो रन के लिए (सकारात्मक या नकारात्मक) परिणाम का मूल्यांकन करने के लिए उपयुक्त है कि एक प्रतिक्रिया का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है. उदाहरण के लिए: यूवी अवशोषण 37 द्वारा निर्धारित लक्ष्य प्रोटीन की एकाग्रता एक निश्चित प्रमोटर / 5'UTR संयोजन की गतिविधियों का आकलन करने के लिए उपयोगी है. हालांकि, एक प्रोटीन के कार्यात्मक मूल्यांकन (जैसे. DsRed के मामले में प्रतिदीप्ति द्वारा या कैस में एक प्रोटीन के लिए बाध्ययह भी एक प्रोटीन की गुणवत्ता पहलू भी शामिल है क्योंकि 2G12 का ई) भी बेहतर है. प्रतिक्रियाएँ भी ऐसी (पावर इनपुट से गणना, घूर्णन गति और दोषी व्यास) किण्वन प्रयोगों में सत्ता संख्या एनपी के रूप में दो या दो से अधिक अलग मापदंडों से मूल्यों की गणना हो सकता है. प्रतिक्रिया उच्च परिशुद्धता (यानी कम मानक विचलन) और सटीकता मॉडल की गुणवत्ता में सुधार करने के लिए (यानी शून्य या कुछ दखल पैरामीटर) के साथ मान उपज चाहिए. यदि आवश्यक हो तो उपयुक्त उपकरणों का पता लगाने और तरीकों इसलिए पूर्व प्रयोग अनुकूलित किया जाना चाहिए.

RSM कारकों की सटीक प्रभाव को निर्धारित करने और उन्हें चुनने के लिए नहीं किया जाता है क्योंकि डो कार्यान्वित किया जाता है इससे पहले प्रतिक्रिया को प्रभावित करने वाले कारकों की पहचान की जानी चाहिए. प्रतिक्रिया पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव के साथ कारकों का चयन साहित्य डेटा का अध्ययन करके प्राप्त किया जा सकता है, लेकिन पूर्ण या आंशिक भाज्य डो रणनीति और अधिक प्रभावी हैं. ये स्क्रीनिंग प्रयोग करना चाहिएभी सार्थक परिणाम जैसे जैविक प्रणालियों में कारक "तापमान" अक्सर सीमा 10-40 डिग्री सेल्सियस तक ही सीमित है, हासिल किया जा सकता है, जो भीतर प्रत्येक कारक के लिए एक सीमा निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा यह ± 1.0 डिग्री सेल्सियस का तापमान मतभेद की जांच करने के लिए अनुचित है तो असतत स्तरों तब नियंत्रण करने के लिए तकनीकी रूप से कठिन हैं कि सांख्यिक कारकों के लिए इन सीमाओं में परिभाषित किया जाना चाहिए, जैसे phytotron तापमान ± 2.0 डिग्री सेल्सियस के एक सहिष्णुता है व्यावहारिक सीमाओं को भी एक विशेष परिसर के> 25 विभिन्न सांद्रता का उपयोग जैसे, खेलने में आ सकता है. हालांकि, स्तरों की संख्या तापमान के बहुपद आदेश n = 2 है, तो कम से कम तीन तापमान के स्तर की जांच की जानी चाहिए बेस मॉडल, जैसे कि कारक के प्रत्याशित बहुपद आदेश से कम से कम एक बड़ा होना चाहिए. एक कारक की बहुपद क्रम अनिश्चित है अगर उच्च बहुपद आदेश (ऊपर घन या) के बेस मॉडल का उपयोग करना एक विकल्प है.हालांकि, यह काफी डो के लिए आवश्यक रन की संख्या को बढ़ा सकते हैं.

कई कारकों और उच्च बहुपद आदेश के साथ जटिल प्रणालियों के लिए यह प्रभावी रूप से गणना नहीं हो सकता है, जो डिजाइन में परिणाम कर सकते हैं. ऐसे मामलों में यह कारकों के विभिन्न सबसेट की जांच कर दो या अधिक डिजाइन में समस्या विभाजित करने की सलाह दी जा सकती. हालांकि, इस तरह के "विभाजन डिजाइन" से छोड़े गए महत्वपूर्ण कारकों को ध्यान से परिणामों के किसी भी विरूपण को रोकने के लिए निर्धारित मूल्यों को समायोजित किया जाना चाहिए. प्रत्येक विभाजन डिजाइन उन्हें और डिज़ाइन में शामिल कारकों के बीच बातचीत प्रकट करने के लिए छोड़े गए कारकों के लिए अलग सेटिंग्स में दोहराया जाना चाहिए. यह प्रतिक्रिया पर सबसे बड़ा प्रभाव के साथ कारकों की पहचान और सभी डिजाइन में उन्हें शामिल करने के लिए फायदेमंद है.

डो मूल्यांकन के दौरान महत्वपूर्ण पहलुओं

एफडी एक नव गणना की डो में मूल्यांकन पहली पैरामीटर होना चाहिए. ऑपरेटर कि वें पुष्टि करनी होगीई डो डिजाइन आवश्यक न्यूनतम detectable अंतर के लिए अंतरिक्ष और प्रतिक्रिया की अनुमानित मानक विचलन की आवश्यक कवरेज प्रदान करता है. यह मामला नहीं है, तो आवश्यकताओं को मिले हैं, जब तक डिजाइन रन और replicates का एक उपयुक्त संख्या के साथ संवर्धित किया जाना चाहिए. डो रन की गणना करने की प्रक्रिया categoric कारकों के बीच संतुलन सक्षम है, तो optimality की एक न्यूनतम हानि के साथ डिजाइन का चयन करने के लिए कई बार प्रारंभ की जा सकती है.

प्रतिक्रिया मूल्यों परिमाण के एक से अधिक आदेश हैं तो डाटा परिवर्तन बाहर किया जाना चाहिए. एक प्रवेश 10 परिवर्तन अक्सर उपयुक्त है लेकिन बॉक्स कॉक्स साजिश सबसे स्थिर मॉडल निकलेगा कि परिवर्तन का सुझाव देगा. अंतिम मॉडल चयनित किया गया है और इसलिए संघर्ष शुरू किया जाना चाहिए एक बार इस साजिश में सुझाव दिया परिवर्तन बदल सकते हैं. केवल महत्वपूर्ण कारकों (पी मूल्य <0.05) अपने भविष्य कहनेवाला पी गारंटी करने के लिये प्रतिक्रिया सतह मॉडल में शामिल किया जाना चाहिएower. अपवाद मॉडल पदानुक्रम 32,33 बनाए रखने के लिए या पिछले परिणामों पर आधारित एक प्रभाव है जाना जाता है कि कारकों में शामिल करने के लिए किया जा सकता है. उत्तरार्द्ध मामले में, यह इस तरह के महत्वपूर्ण कारक वर्तमान डो में महत्वपूर्ण हो पाया नहीं गया क्यों की जांच की सलाह दी जाती है. कमी के फिट पैरामीटर आर चुकता मूल्य के साथ संयोजन में उपयोग किया जा सकता है (टेबल्स 2 और 3) गरीब मॉडल / फिट बैठता का तेजी से पता लगाने के लिए, जबकि आर चुकता भी कई / तुच्छ कारकों चयनित किया गया है कि क्या इंगित करता समायोजित और अनुसंधान चुकता मॉडल की भविष्यवाणी करने की शक्ति के लिए एक संकेत है की भविष्यवाणी की. वे छिपे हुए कारकों की उपस्थिति के साथ ही चरम मूल्यों की पहचान का संकेत डाटासेट में प्रवृत्तियों का पता लगाने की अनुमति हालांकि, क्योंकि DesignExpert का निदान खंड में दिए अवशिष्ट भूखंडों और भी अधिक महत्वपूर्ण मॉडल की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए कर रहे हैं. उत्तरार्द्ध फिट पर एक औसत से ऊपर प्रभाव पड़ता है और मॉडल बिगाड़ना. इस तरह के मूल्यों को सही किया जाना चाहिए कि त्रुटिपूर्ण डेटा (जैसे permuted मान), या दोहराया जाना चाहिए कि असफल प्रयोगों से उत्पन्न कर सकते हैं. एक चरम मूल्य ऐसी पुनरावृत्ति प्रयोगों में 'असली' होना पाया जाता है, तो यह डिजाइन अंतरिक्ष के इस क्षेत्र के भीतर मॉडल की गुणवत्ता में सुधार के लिए इस मान की निकटता में कई रन जोड़ने की सलाह दी जाती है.

अपूर्ण या बहुत छोटे हैं, जो डिजाइन करने के लिए सुधार

भले ही अतिरिक्त रन आवश्यक हो सकता है क्यों की (जैसे डेटा याद, रन, वास्तविक चरम मूल्यों और क्षेत्रों, अप्रत्याशित उच्च आदेश कारक बातचीत विफल), इन रनों "डिजाइन वृद्धि" उपकरण का उपयोग करके एक आदेश तरीके से मौजूदा डिजाइन में जोड़ा जाना चाहिए अलग से एक ब्लॉक में नए रन शुरू करने की. सबसे सार्थक अतिरिक्त रनों का चयन करते समय ऐसा करने से पिछले डाटासेट का उपयोग की सुविधा होगी. परिणाम डेटा के लिए फिट बैठता है और विश्वसनीय की अनुमति देता है कि एक मॉडल हो जाएगाभविष्य के परिणाम की भविष्यवाणी.

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Disclosures

प्रकाशन शुल्क आंशिक रूप से पांडुलिपि या इसकी सामग्री के किसी भी के लिए जिम्मेदार की तैयारी में शामिल में शामिल नहीं थे जो कंपनियों Statease, इंक (यूएसए) और Statcon (जर्मनी), द्वारा प्रायोजित किया गया था.

Acknowledgments

लेखक इस अध्ययन में इस्तेमाल तम्बाकू पौधों की खेती के लिए pPAM संयंत्र अभिव्यक्ति वेक्टर और इब्राहिम अल Amedi उपलब्ध कराने के लिए डॉ. थॉमस Rademacher के लिए आभारी हैं. हम पांडुलिपि संपादन के साथ उसकी सहायता के लिए डॉ. रिचर्ड एम. Twyman धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम के हिस्से में यूरोपीय अनुसंधान परिषद उन्नत अनुदान "भविष्य फार्मा" द्वारा वित्त पोषित किया गया, प्रस्ताव संख्या 269110 और Fraunhofer Zukunftsstiftung (Fraunhofer फ्यूचर फाउंडेशन).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Design-Expert(R) 8 Stat-Ease, Inc. n.a. DoE software
Tryptone Carl Roth GmbH 8952.2 Media component
Yeast extract Carl Roth GmbH 2363.2 Media component
Sodium chloride Carl Roth GmbH P029.2 Media component
Ampicillin Carl Roth GmbH K029.2 Antibiotic
Agar-Agar Carl Roth GmbH 5210.2 Media component
Escherichia coli K12 DH5a Life Technologies 18263-012 Microorganism
pPAM GenBank AY027531 Cloning/expression vector; 
NucleoSpin Plasmid  MACHEREY-NAGEL GmbH 740588.250 Plasmid DNA isolation kit
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up MACHEREY-NAGEL GmbH 740609.250 Plasmid DNA purification kit
NanoDrop 2000 Thermo Scientific n.a. Spectrophotometer
NcoI New England Biolabs Inc. R3193L Restrictionendonuclease
EcoRI New England Biolabs Inc. R3101L Restrictionendonuclease
AscI New England Biolabs Inc. R0558L Restrictionendonuclease
NEB 4 New England Biolabs Inc. B7004S Restrictionendonuclease buffer
TRIS Carl Roth GmbH 4855.3 Media component
Disodium tetraborate Carl Roth GmbH 4403.3 Media component
EDTA Carl Roth GmbH 8040.2 Media component
Agarose Carl Roth GmbH 6352.4 Media component
Bromophenol blue Carl Roth GmbH A512.1 Color indicator
Xylene cyanol Carl Roth GmbH A513.1 Color indicator
Glycerol Carl Roth GmbH 7530.2 Media component
Mini-Sub Cell GT Cell BioRad 170-4406 Gel electrophoresis chamber
Agrobacterium tumefaciens strain GV3101:pMP90RK DSMZ 12365 Microorganism
Electroporator 2510 Eppendorf 4307000.658 Electroporator
Beef extract Carl Roth GmbH X975.2 Media component
Peptone Carl Roth GmbH 2365.2 Media component
Sucrose Carl Roth GmbH 4621.2 Media component
Magnesium sulfate Carl Roth GmbH 0261.3 Media component
Carbenicillin Carl Roth GmbH 6344.2 Antibiotic
Kanamycin Carl Roth GmbH T832.3 Antibiotic
Rifampicin Carl Roth GmbH 4163.2 Antibiotic
FWD primer Eurofins MWG Operon n.a. CCT CAG GAA GAG CAA TAC
REV primer Eurofins MWG Operon n.a. CCA AAG CGA GTA CAC AAC
2720 Thermal cycler Applied Biosystems 4359659 Thermocycler
RNAfold webserver University of Vienna n.a. Software
Ferty 2 Mega Kammlott 5.220072 Fertilizer
Grodan Rockwool Cubes 10 x10 cm Grodan n.a. Rockwool block
Greenhouse n.a. n.a. For plant cultivation
Phytotron Ilka Zell n.a. For plant cultivation
Omnifix-F Solo B. Braun 6064204 Syringe
Murashige and Skoog salts Duchefa M 0222.0010 Media component
Glucose Carl Roth GmbH 6780.2 Media component
Acetosyringone Sigma-Aldrich D134406-5G Phytohormon analogon
 BioPhotometer plus Eppendorf 6132 000.008 Photometer
Osram cool white 36 W Osram 4930440 Light source
Disodium phosphate Carl Roth GmbH 4984.3 Media component
Centrifuge 5415D Eppendorf 5424 000.410 Centrifuge
Forma -86C ULT freezer ThermoFisher 88400 Freezer
Synergy HT BioTek SIAFRT Fluorescence plate reader
Biacore T200 GE Healthcare n.a. SPR device
Protein A Life Technologies 10-1006 Antibody binding protein
HEPES Carl Roth GmbH 9105.3 Media component
Tween-20 Carl Roth GmbH 9127.3 Media component
2G12 antibody Polymun AB002 Reference antibody

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References

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जैव अभियांत्रिकी अंक 83 प्रयोगों (डो) डिजाइन क्षणिक प्रोटीन अभिव्यक्ति संयंत्र व्युत्पन्न biopharmaceuticals प्रमोटर 5'UTR फ्लोरोसेंट संवाददाता प्रोटीन मॉडल निर्माण ऊष्मायन शर्तों मोनोक्लोनल एंटीबॉडी
एक केस स्टडी के रूप में तंबाकू में क्षणिक प्रोटीन अभिव्यक्ति: प्रयोगों दृष्टिकोण की डिजाइन का उपयोग कर परिसर सिस्टम की विशेषता
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Buyel, J. F., Fischer, R. Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study. J. Vis. Exp. (83), e51216, doi:10.3791/51216 (2014).

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