Karakterisering af komplekse systemer ved hjælp af udformning af eksperimenter Fremgangsmåde: Transient Protein Expression i tobak som et casestudie

Summary

Vi beskriver en udformning af eksperimenter tilgang, der kan anvendes til at bestemme og modellere indflydelse transgene regulatoriske elementer, parametre planters vækst og udvikling og inkuberingsbetingelser på forbigående ekspression af monoklonale antistoffer og reporter-proteiner i planter.

Abstract

Planter giver flere fordele for produktionen af ​​biofarmaceutiske herunder lave omkostninger, skalerbarhed og sikkerhed. Forbigående udtryk giver den yderligere fordel af korte udviklings-og produktionstider, men udtryk niveauer kan variere betydeligt mellem partier og dermed give anledning til samme reguleringsmæssige problemer i forbindelse med god fremstillingspraksis. Vi brugte et design af eksperimenter (DOE) tilgang til at fastslå virkningen af ​​væsentlige faktorer, såsom regulatoriske elementer i ekspressionskonstruktet, plantevækst og udvikling parametre og inkubationsbetingelserne under udtryk, om variabilitet i udtryk mellem partier. Vi testede planter, der udtrykker en model anti-HIV monoklonale antistof (2G12) og en fluorescerende markør protein (DsRed). Vi diskuterer begrundelsen for at vælge bestemte egenskaber af model og identificere dens potentielle begrænsninger. Den generelle indstilling kan nemt overføres til andre problemer, fordi principperne i modellen enre bredt anvendelig: videnbaseret parameter udvælgelse, kompleksitet reduktion ved at opdele det oprindelige problem i mindre moduler, software-guidet opsætning af optimale eksperimentkombinationer og trinvis design augmentation. Derfor er den metode er ikke kun nyttig til at karakterisere protein ekspression i planter, men også til undersøgelse af andre komplekse systemer, der mangler en mekanistisk beskrivelse. De prædiktive ligninger, der beskriver sammenkoblingen mellem parametre kan bruges til at etablere mekanistiske modeller for andre komplekse systemer.

Introduction

Produktionen af biofarmaceutiske proteiner i planter er fordelagtig, fordi planter er billig at vokse, kan platformen blive skaleret op blot ved at dyrke flere planter og humane patogener er i stand til at replikere ^1,2. Transiente ekspressionssystemer strategier baseret for eksempel på infiltration af blade med Agrobacterium tumefaciens giver yderligere fordele, fordi tiden mellem det punkt af DNA levering og levering af et renset produkt nedsættes fra år til mindre end 2 måneder ^3. Transient ekspression er også anvendes til funktionel analyse, fx at teste gener for deres evne til at komplementere tab af funktion mutanter eller for at undersøge protein-interaktioner ^4-6. Men forbigående udtryk niveauer tendens til at vise større batch-til-batch variation end ekspressionsniveauer i transgene planter ^7-9. Dette reducerer sandsynligheden for, at biofarmaceutiske fremstillingsprocesser baseret på forbigående ekspression will blive godkendt i forbindelse med god fremstillingspraksis (GMP), fordi reproducerbarhed er en attribut kritisk kvalitet og er underlagt risikovurdering ^10. Sådanne variationer kan også maskere enhver interaktion, forskerne har til hensigt at undersøge. Derfor er vi i gang med at identificere de væsentligste faktorer, der påvirker forbigående ekspressionsniveauer i planter og til at opbygge en høj kvalitet kvantitativ prædiktiv model.

Den ene-faktor-på-en-tid (OFAT) metode bruges ofte til at karakterisere effekten (virkning) for visse parametre (faktorer) om resultatet (respons) af et eksperiment ^11. Men det er ikke optimalt, fordi de enkelte tests (kører) under en kontrolundersøgelse (eksperiment) vil blive rettet ind som perler på en snor gennem det potentielle areal udspændt af de faktorer, der er testet (design plads). Dækningen af ​​designet rum og dermed graden af ​​information udledt fra eksperimentetlav, som det er vist i figur 1A ^12. Desuden kan den indbyrdes afhængighed mellem de forskellige faktorer (faktor interaktioner) forbliver skjult resulterer i dårlige modeller og / eller forudsigelse af falsk optima, som vist i figur 1B ^13.

De ovenfor beskrevne ulemper kan undgås ved hjælp af et design af eksperimenter (DOE) tilgang, hvor kørsler af et eksperiment er spredt mere jævnt over hele design plads, hvilket betyder, at mere end én faktor er varieret mellem to kørsler ^14. Der er specialiserede designs for blandinger, screening faktorer (Faktorforsøg) og kvantificering af faktor virkninger på reaktioner (respons overflade metoder RSM s) ^15. Desuden kan RSMs realiseres som centrale-komposit design, men kan også opnås effektivt ved hjælp af specialiseret software, som kan anvende forskellige kriterier for udvælgelse af kørsler. For eksempel, den såkaldte D-optimality kriterium vælger løber så at minimere fejlen i koefficienterne af den resulterende model, mens IV-optimalitet kriterium vælger kørsler, der opnår den laveste forudsigelse varians i hele design plads ^15,16. RSM vi beskriver her tillader præcis kvantificering af forbigående protein ekspression i planter, men det kan nemt overføres til en hvilken som helst system, der involverer flere (~ 5-8) numeriske faktorer (fx. temperatur, tid, koncentration), og et par (~ 2 - 4) kategorisk faktorer (fx promotor, farve), i hvilken en mekanistisk beskrivelse er utilgængelig eller for komplekse til at modellere.

DOE tilgang opstod i jordbrugsvidenskab, men har spredt sig til andre områder, fordi det kan overføres til en hvilken som helst situation, hvor det er nyttigt at reducere antallet af kørsler er nødvendige for at opnå pålidelige data og generere beskrivende modeller for komplekse processer. Dette har igen ført til inddragelse af DoE i "Vejledning forIndustri, Q8 (R2) Farmaceutisk udvikling "udgivet af Den Internationale Konference om Harmonisering af tekniske krav til registrering af lægemidler til mennesker (ICH) ^17. DoE er nu anvendes bredt i videnskabelig forskning og industri ^{18 år.} Dog skal man være omhyggelig under planlægning og udførelse af forsøget, fordi du vælger en forkert polynomium for flere lineær regressionsmodel (basismodel) kan introducere et behov for yderligere kørsler til at modellere alle faktor virkninger korrekt. Desuden beskadiget eller manglende data genererer forkerte modeller og fejlbehæftet forudsigelser, og kan endda forhindre enhver modelbygning forsøg som beskrevet i protokollen og diskussion § ^18. i protokollen afsnit vil vi oprindeligt fastsat de vigtigste planlægning skridt til et RSM-baserede eksperiment og derefter forklare design baseret på DoE software DesignExpert v8.1. Men lignende design kan bygges med anden software including JMP, MODDE og STATISTISK. De eksperimentelle procedurer følges af instruktioner til dataanalyse og evaluering.

Figur 1. Sammenligning af OFAT og DoE. A. Sekventiel variation af én faktor ad gangen (OFAT) i et eksperiment (sort, rød og blå cirkler) opnår en lav dækning af designet rum (skraverede områder). I modsætning hertil variation af mere end én faktor ad gangen ved hjælp af udformning af eksperimenter (DOE) strategi (grønne cirkler) forbedrer dækning og dermed præcisionen af de resulterende modeller. B. Den forudindtaget design plads dækning betyder, at OFAT eksperimenter (sorte cirkler) kan også undlade at identificere optimale drifts-regioner (rød) og forudsige sub-optimale løsninger (stor sort cirkel), mens DoE strategyes (sorte stjerner) er mere tilbøjelige til at identificere foretrukne forhold (store sorte stjerne).

Protocol

1.. Planlægning af en DoE strategi

1. Identificere relevante faktorer og reaktioner til optagelse i designet.
   1. Definer et eller flere svar for måling. Her blev 2G12 og dsRed ekspressionsniveauer bruges (mg / ml), herunder den laveste påviselige forskel betragtes som relevante (10 og 20 mg / ml), og en tilnærmet værdi for den anslåede standardafvigelse af systemet (4 og 8 mg / ml) baseret på tidligere forsøg.
   2. Brug den tilgængelige litteratur, data fra tidligere eksperimenter eller specialiserede screening designs (fx en faktor design, jf. indledningen) for at vælge væsentlige faktorer, hvis indflydelse på svarene vil blive kvantificeret (tabel 1) ^7,8,19,20.
   3. Tildele faktor typer (numeriske eller kategorisk), og vælg intervaller, inden for hvilke de numeriske faktorer vil blive varieret i DoE undersøgelse (tabel 1).
   4. Identificer numeric faktorer, som kontinuerlig variation er vanskelig at gennemføre.
      1. Undgå at bruge kontinuerlig variation for faktorer, som ikke kan justeres præcist til et bestemt niveau. F.eks Inkubationstemperatur kan typisk kun styres inden for ± 2 ° C, derfor kontinuerlig variation ved hjælp af værdier såsom 27,2 ° C, 25,9 ° C og 29,3 ° C skal undgås.
      2. Vælg i stedet et antal diskrete niveauer for disse faktorer (tabel 1). Antallet af niveauer bør matche den forventede base model (trin 1.2). Det er kun vigtigt for optimale designs, fordi centrale sammensatte designs altid har diskrete faktor niveauer.
   5. Tildel om et kategorisk faktor er nominel, dvs ingen stiltiende rækkefølge (f.eks forskellige producenter), eller ordenstal og dermed en diskret numerisk parameter (fx forskellige blade på en plante).
   6. Vælg de niveauer for begge typer kategorisk faktorer. </ Li>
2. Vælg en nyttig base model.
   1. På baggrund af de indledende forsøg og litteratur, foregribe forholdet mellem de enkelte faktorer og indsats samt faktor interaktioner og svaret. For eksempel lineær (jo flere, jo bedre), kvadratisk (enkelt optimal eller ikke-lineær stigning / fald) eller kubisk (skæv optimal).
   2. Sørg for, at antallet af niveauer for diskrete numeriske faktorer er n + 1, idet n er det polynomiets grad af forholdet mellem faktor og respons. For eksempel hvis temperaturen forventes at have en kvadratisk effekt på respons, n = 2 og dermed bør undersøges mindst tre temperaturniveauer at opnå en tilpasning til den kvadratiske effekt.
3. Definer den fraktion af design plads (FDS), hvor forudsigelse varians bør være under en vis grænse (alpha-niveau). FDS skal være> 0,95 (dækker mere end 95% af design rum) for at opnå modeller, der giver robuste forudsigelser helehele design plads ^21-23.
   Bemærk: En tærskel på 0,05 svarer til et signifikansniveau på 5% (type I fejl) og er en typisk værdi. Øger denne værdi vil reducere antallet af forsøg, der er nødvendige for en DoE strategi, men vil samtidig øge sandsynligheden for, at betydelige virkninger vil blive savnet og at skøn over deres indvirkning på svar vil være forkert.

Tabel 1. Faktorer, der påvirker forbigående protein udtryk i tobak, herunder variationen svinger i løbet af DoE. Faktorer i fed kun blev medtaget i designet til de beskrevne eksperimenter under "En beskrivende model for DsRed akkumulering ved transient ekspression ved hjælp af forskellige promoter / 5'UTRs", mens faktorer i kursiv blev kun medtaget i design for "Optimering incubation betingelser og høst ordninger for produktion af monoklonale antistoffer i planter ved hjælp af forbigående udtryk ".

Figur 2. DoE planlægningsproces. Faktorer med en betydelig indvirkning på den respons, der undersøges, er udvalgt på baggrund af tilgængelige data. Så faktor attributter (f.eks numeriske), komfurer og niveauer er tildelt. Tidligere viden og eksperimenter bruges til at definere en passende base model. De prædiktive strømkrav er defineret baseret på anvendelse / formål af den endelige model. De indsamlede data kan derefter overføres i en passende DoE software.

2. Opsætning af en RSM i DesignExpert

1. Start DesignExpert og vælg "Nyt design". I "Reaktion Surface" vinduet, skal du vælge &# 34, Optimal "og indtast antallet af numeriske og kategorisk faktorer er udvalgt i afsnit 1.1).
2. Indtast faktor navne, enheder, typer, sub-typer, antal niveauer / niveau grænser og værdier for de niveauer for alle faktorer i de relevante felter.
3. Fortsæt til næste side og under "Søg" muligheder at vælge "Best" samt den ønskede "Optimalitet" kriterium her "D-optimale".
4. I "Rediger model ..." menuen, vælg den model, der indeholder de faktorer og interaktioner forventes i afsnit 1.2). Hvis du er usikker, skal du vælge en komplet model, der dækker alle faktorer og interaktioner for en vis polynomiets grad, her "kvadratiske". Bemærk, at du vælger en fuld model (indeholdende alle interaktioner) kan øge antallet af forsøg, der kræves for DoE.
5. Vælg antallet af "blokke". Her blev en enkelt blok bruges, fordi alle planter blev fra samme parti, alle bakterier er blevet dyrket samtidigt ogalle injektioner blev udført på den samme dag af samme operatør. Brug mere end en blok, hvis mere end et parti af planter er brugt eller flere operatører håndtere injektioner.
6. Balance design
   1. Aktiver "Tving kategorisk balance" for at distribuere kørsler af eksperimentet jævnt blandt de kategoriske faktorniveauerne, fx forskellige promotorer, der testes.
      Bemærk: dette kan reducere den optimalitet af designet i en grad, DesignExpert vil rapportere som en%-værdi, afhængigt af de punkter udvalgt af optimalitet algoritmen.
   2. Genberegne design flere gange ved hjælp af den implementerede random seed algoritme til at minimere den reduktion i optimalitet.
      Bemærk: tab i optimality kan variere fra ~ 3-40% ved hjælp af de samme inddata, men at ændre antallet af gentagelser kan bruges til at opretholde kategorisk balance.
7. Softwaren vil foreslå en værdi for antallet af "Model punkter" baseret på basismodellen, Her 70 kørsler. Justere antallet af kørsler for "Gentagelser" og "For at estimere den manglende fit" at sikre, at det er> 5% af antallet af "Model points" for hver, her 10 kørsler hver.
8. Fortsæt til næste side, skal du vælge antallet af svar og indtaste deres navne og enheder. Yderligere reaktioner kan også tilføjes på ethvert tidspunkt under evalueringen af ​​data uden nogen negativ indvirkning på design.
9. Fortsæt for at starte den algoritme, beregne faktorniveauerne for kørsler i DoE. Hvis den valgte basismodellen ikke svarer antallet af niveauer for en bestemt faktor, vil en meddelelse blive vist, og beregningen vil ikke starte. I dette tilfælde enten:
   1. Øge antallet af niveauer for denne faktor, eller
   2. Fravælg vilkårene i basismodellen, der ikke kan beregnes på grundlag af det nuværende antal niveauer.
   3. For eksempel, hvis der er to niveauer for faktor "Inkubationstid" t (dvs. 2 d og 5 d) tHan nuværende design og en kvadratisk base model, herunder udtrykket t ² blev valgt, enten tilføje et tredje niveau for t (dvs. 8 d), eller fjerne den faktor t ² fra modellen.
10. Gem regnearket, der indeholder de optimale kombinationer faktor, der vises, når beregningen er færdig.
11. I "Design" node vælge "Evaluation" sub-node og gå til "Graphs" fanen.
    1. I "Grafer værktøjet" vælge "FDS" og i "FDS Graph" box vælge "Pred" som fejltypen. Indtast derefter den laveste påviselige forskel samt den omtrentlige værdi for den estimerede standardafvigelse af systemet er defineret i afsnit 1.1.1) som værdier for "d" og "s" henholdsvis (her 20 og 8 mg / ml for DsRed). Indtast også alfa-niveau (acceptabel% mangler en signifikant effekt) passer til ansøgningen, typisk 0,05 (5%).
    2. Hvis dette ikke er tilfældet (som findes her, FDS var 1%, som vist i figur 3A), gå tilbage til "Design" node og i proceslinjen skal du vælge "Design Tools", derefter "Augment Design ..." og vælg " Forøge ".
    3. Vælg den samme "Søg" og "optimalitet" kriterier som tidligere. Også valgte den samme "Rediger model" og "force kategorisk balance" indstillinger. Hvis designet augmentation udføres før nogen forsøg (som gjort her), derefter ændre "Put løber ind i blok" til "Block1".
    4. I afsnittet "Kører" Indtast antallet af yderligere "Model punkter", at opretholde mindst 5% "Gentagelser" og "At estimere manglendeaf fit "i det samlede design. Her var 100 ekstra kørsler tilføjet, og ingen" Gentagelser "og" For at estimere manglende fit "blev inkluderet.
    5. Når beregningen er afsluttet, revurderer FDS grafen som beskrevet ovenfor. Hvis FDS stadig ikke er tilfredsstillende, gentages design forstærkning som beskrevet ovenfor. Her var FDS 100% efter forstærkning og dermed ingen yderligere forstærkning var nødvendig (figur 3B).

Figur 3. Sammenligning af FDS plots. A. Et DoE bestående af 90 kørsler producerer en utilstrækkelig FDS på kun 1% for standardafvigelsen forudsigelse ved hjælp af en kvadratisk base model i kombination med værdierne for den laveste påviselige forskel (20 mg / ml) og skønparrede standardafvigelse af systemet (8 ug / ml). B. Augmentation af DoE til i alt 210 kørsler opnået en 100% FDS og en flad kurve angiver ensartet præcision af modellen i hele design rummet.

3. Kloning og analyse af ekspressionskassetter

1. Dyrk Escherichia coli i 5 ml LB-medium (10 g / l trypton, 5 g / L gær ekstrakt, 170 mM NaCI, 50 mg / L ampicillin, til LB-agarplader omfatter 15 g / L agar) ved 37 ° C i 6 -8 hr eller natten på en orbitalryster ved 160 rpm. ADVARSEL: ampicillin er et skadeligt stof. Pode LB-medium med enten 50 pi flydende kultur eller overføre celler fra kolonier dyrket på plader ved hjælp af en pipette spids.
2. Til rensning af PSO plasmid-DNA'et, og andre derivater af ppam (GenBank AY027531), fra E. coli K12 stamme DH5a Følg instruktionerne i DNA'et rensning kit manual ^24. ADVARSEL: rensning kdet indeholder skadelige kemikalier (se ovenstående manual for detaljer). Plasmidet sekvens er beskrevet i figur 4 og af Køber et al. ^20..
3. Bestem DNA-koncentrationen i den rensede eluat ved at måle absorbansen af ​​en 2 pi prøve ved 260 nm i et NanoDrop enhed.
4. Bekræfte identiteten af ​​det oprensede plasmid-DNA ved fordøjelse med restriktionsendonukleaser (RES).
   1. Vælg RES ifølge plasmidsekvensen så unikke og skelnelige fragment mønstre er genereret. Følg producentens anbefalinger for fordøjelsen betingelser såsom reaktion volumen, tid, temperatur og koncentration af stabilisatoren bovine serum albumin. Afhængigt af følsomheden af ​​analysen skal der anvendes 50-500 ng plasmid DNA pr fordøjelsen.
   2. Forbered 0,8-2,0% geler til adskillelse af DNA-fragmenter ved kogning agarose i Tris-borat-EDTA (TBE)-buffer (90 mM Tris, 90 mM borat, 2 mM EDTA, pH 8,0). Than større de forventede fragmenter bør mindre agarose anvendes i gelen.
   3. Tilsæt 5 pi fem gange prøvepuffer (5x Sabu, 0,1% (w / v) bromphenolblåt, 0,1% (w / v) xylencyanol, 10% (w / v) glycerol opløst i TBE) til 50 ul af RE-behandlede DNA-prøve og adskille fragmenter ved agarosegelelektroforese ved 100 V for ~ 40 min, eller indtil en klar adskillelse af fragmenterne er opnået. På hver gel, omfatter en bane, der indeholder DNA-stigen størrelse markører for sammenligning, fx 2-3 pi 1-kb stige.
5. Udskift omega 5'UTR i PSO med en af ​​de tre andre 5'UTRs.
   1. Slip omega 5'UTR-sekvens fra ~ 4 ug renset PSO DNA ved behandling med 20 enheder Eco RI-HF og NcoI-HF RE'er i NEBuffer 4 ved 37 ° C i ~ 60 min. Så adskille fragmenter som beskrevet i afsnit 3.4.2 og 3.4.3.
   2. Isoler større fragment (pS "rygrad") fra agarosegelen ved hjælp af en gel ekstraIndsatsen kit ifølge producentens manual ²⁵ og bestemme koncentrationen af det oprensede DNA som beskrevet i afsnit 3.3). ADVARSEL: den gelekstraktionskittet indeholder skadelige kemikalier, se manualen for detaljer.
   3. Isoler CHS, CHS-LPH og TL 5'UTRs fra egnede donorer vektorer ved at behandle ~ 10 ug af hver vektor med 20 enheder Eco RI-HF og NcoI-HF RE'er i NEBuffer 4 ved 37 ° C i ~ 60 min. Så adskille fragmenter som beskrevet i afsnit 3.4.2 og 3.4.3 og rense mindre 5'UTR-holdige fragment som beskrevet i afsnit 3.5.2.
   4. Ligere de isolerede oprensede 5'UTRs i separate portioner til den isolerede oprensede lineære pS vektor ved 25 ° C i 5 minutter i henhold til producentens anbefalinger ^26. Brug ~ 50 ng vektor-DNA og en tre-fold molært overskud af 5'UTR DNA i et totalt volumen på 20 ul.
6. Transformation E coli celler med the rekombinante plasmider ^26,27.
   1. Læg ~ 10 ng (~ 4-5 ul) ligeringsblanding (se afsnit 3.5.4) til 50 pi RbCl kompetente E. coli og blandes forsigtigt, og derefter inkuberes i 30-60 min på is. Varmechok i 1,5 min ved 42 ° C og chill på is i 5-30 minutter.
   2. Tilføj 950 pi antibiotikum-frit LB-medium og inkuberes i 1 time ved 37 ° C og 160 rpm. Ved udvælgelsen af ​​transformanter fordelt 50 og 100 pi af kultur på LB-agarplader indeholdende ampicillin og inkuberes i ~ 16-20 timer ved 37 ° C.
   3. Podes 5-10 separate kolonier repræsenterer hver promotor-5'UTR ligatur beskrevet i afsnit 3.1 i 5 ml portioner af LB-medium indeholdende ampicillin. Derefter rense plasmid DNA og bekræfte sin identitet, som beskrevet i punkt 3.2 til 3.4.
7. Udskift 35SS promotor med nos promotor i hver af de fire 5'UTR plasmider ved hjælp af Asc I og Eco RI RE'er i NEBuffis 4 ved 37 ° C i 1 time, som beskrevet i afsnit 3.5 og 3.6.
8. Indføre hver af de otte resulterende plasmider i A. tumefaciens stamme GV3101: pMP90RK ved elektroporering ^28.
   1. Læg ~ 500 ng oprenset plasmid-DNA til 50 ul kompetente A. tumefaciens celler på is. Bland forsigtigt og overføres til en forud afkølet 0,2 cm elektroporeringskuvette. Sørg for, at blandingen er i bunden af ​​kuvetten og ikke indeholder bobler.
   2. Pulse cellerne ved 2,5 kV til 5 msek og bekræft intensiteten og varigheden af ​​impulsen.
   3. Undgå forhøjede saltkoncentrationer i DNA-prøven eller ukorrekt forberedelse af den kompetente A. tumefaciens celler, fordi disse kan resultere i høje ionstrømme forårsager øjeblikkelig fordampning af cellesuspensionen, hvilket reducerer omdannelsen effekt.
   4. Tilføj 950 pi YEB medium uden antibiotika (5 g / L kødekstrakt, 1 g / l gærekstrakt, 5 g / l peptone, 5 g / l saccharose, 2 mM _MgSO4, pH 7,0), bland forsigtigt og overføres straks til en steril 1,5 ml reaktionsglas. Inkuber i 2-4 timer ved 26-28 ° C og 160 rpm.
   5. Spred 1-2 pi på YEB-agarplader indeholdende antibiotika (50 mg / L   carbenicillin, 25 mg / L kanamycin, 25 mg / L rifampicin) til udvælgelse af transformanter. ADVARSEL: Rifampicin er et giftigt stof.
   6. Der podes tre 5 ml portioner af YEB medium indeholdende antibiotika med celler fra separate kolonier repræsenterer hver promotor-5'UTR ligatur og inkuberes i 48-72 timer ved 26-28 ° C og 160 rpm.
9. Bekræft succes A. tumefaciens transformation.
   1. Overfør 2 ul af hver portion fra punkt 3.8.6 til at adskille 48 gl portioner af PCR mastermiksens (2 pi af hver 10 uM primer lager (400 nM slutkoncentration af hver primer),1 pi 10 mM dNTP-blanding (200 pM slutkoncentration af hver deoxynucleosidtriphosphat), 5 pi 10 gange Expand High Fidelity buffer med 15 mM _MgCl2, 0,75 pi Expand High Fidelity enzym-blandingen, og 39,25 pi sterilt destilleret vand).
   2. Forstærk ekspressionskassetten af ​​hvert plasmid under anvendelse af passende primere (FWD: 5'-CCT CAG GAA GAG CAA TAC-3 ', bindende 1026 nukleotider opstrøms for promotoren, REV: 5'-CCA AAG CGA GTA CAC AAC-3', bindende inden 35S polyadenyleringsstedet) under passende PCR-betingelser. Her blev 94 ° C anvendes til indledende denaturering efterfulgt af 30 cyklusser af 94 ° C denaturering i 15 sekunder, 51 ° C. annealing i 30 sek og 72 ° C forlængelse i 120 sek, og en endelig forlængelse ved 72 ° C i 8 min.
   3. Bestem størrelsen af ​​PCR-produkter ved agarosegelelektroforese som beskrevet i afsnit 3.4.3.
10. Forbered A. tumefaciens glycerolstamopløsninger vedblanding af 500 pi 50% (v / v) steril glycerol med 500 pi A. tumefaciens kulturer fra punkt 3.8.6, for hvilken transformation er blevet bekræftet (afsnit 3.9.3). Opbevar glycerolstamopløsninger ved -80 ° C indtil videre brug.
11. Beregn folde energier i de forskellige mRNA'er ved hjælp af RNAfold webserver ²⁹ og omfatter nukleotidsekvensen fra det transkriptionelle startsted igennem til de første 50 bp af den kodende region.
    1. I sektionen "Fold algoritmer og grundlæggende indstillinger" vælge "minimum fri energi (MFE) og partition funktion" og "undgå isolerede basepar" muligheder.
    2. I "Advanced foldningsmuligheder" vælg "dinglende energier på begge sider af en helix i hvert fald", "RNA-parametre (Turner model, 2004)" og ændre "rescale energi parametre given temperatur (C)" til 25 ° C.
    3. I afsnittet "Output options" vælge alle muligheder.

Figur 4.. Promotoren og 5 'UTR varianter. Ekspressionskassetterne blev dannet ved trinvis udveksling af 5'UTR, hvilket resulterer i fire kombinationer med CaMV 35SS-promotor, efterfulgt af udskiftning af denne promotor med nos-sekvensen til opnåelse af fire yderligere varianter og i alt otte forskellige promotor / 5'UTR kombinationer.

4.. Plant Dyrkning

1. Forbered en 0,1% opløsning af gødningen Ferty2 Mega i afioniseret vand ved pH 5,9.
2. Forbered 10 x 10 x 8 cm rockwool blokke af omfattende skylning med deioniseret vand for at fjerne tilbageværende kemikalier og endelig ligevægt med gødning.
3. Seed tobaksplanter ved at placere 1-2 tobak frø på hver rockwool blokken efterfulgt af en kort flush med gødning være omhyggelig med at undgå at vaske frøene derfra.
4. Spire og dyrke tobaksplanter i 42 dage i et drivhus på 25/22 ° C dag / nat temperatur, 70% relativ fugtighed og en 16-timers lysperiode (180 mmol sec ^-1 m ^-2; λ = 400-700 nm) . I løbet af denne fotoperioden, overrisle med gødning i 15 minutter hver time i hydroponiske kultur.

5.. Transient Protein Expression

1. Forbered A. tumefaciens til injektion i blade.
   1. Podes 5-50 ml YEB medium indeholdende antibiotika med 1% A. tumefaciens cryo-stamkultur og inkuberes ved 27 ° C, indtil OD <sub> 600nm når 5,0 (~ 48-72 hr afhængigt af mængden og skibstype).
   2. Fortynd A. tumefaciens kulturen med vand og 2-fold infiltration medium (4,3 g / l Murashige og Skoog salte (pH 5.6), 5 g / l saccharose, 1,8 g / L glucose, 100 mM acetosyringon) svarer til OD _600nm kræves til injektion. Bekræft OD _600nm lige før injektion. Bemærk: En OD _{600 nm} på 1,0 svarer til ~ 1,43 ± 0,12 x 10 ⁹ kolonidannende enheder per ml.
2. Sprøjt A. tumefaciens suspensionen i blade.
   1. Vælg og mærke de noncotyledon blade og positioner derpå skal behandles (fx efter en DoE strategi).
   2. Må ikke injiceres anderledes A. tumefaciens løsninger i den samme interkostale område. Brug i stedet modsatrettede sektioner på hver side af midt-vene akse. Hvis mere end to forskellige løsninger skal sprøjtes på den samme position bruger en additional anlægget.
   3. Ryst A. tumefaciens løsning til at resuspendere eventuelle celler, der måske har bosat sig, siden at forberede fortynding og aspirere til en 1-ml sprøjte.
   4. Ridse forsigtigt epidermis ved den position, er beregnet til injektion med en pipettespids eller lignende for at lette tilgangen af A. tumefaciens løsning. Undgå brud bladpladen mens du gør det.
   5. Hold sprøjten vinkelret på bladpladen rører cylinderen mod interkostale område, der skal behandles, og forsigtigt skubbe udløbet (uden nål) på den nederste side af bladet. Tryk på oversiden af ​​bladet forsigtigt samtidig at forhindre, at bladpladen fra skiftende eller brud.
   6. Skub forsigtigt sprøjten stemplet. A. tumefaciens opløsning træder intercellulære rum i bladpladen som angivet ved de behandlede områder er anført mørkere grøn og fugtig. Gentag denne procedure på flere positioner, indtil hele intercostal felt er infiltreret med A. tumefaciens. Fortsæt derefter med den næste interkostale felt.
   7. Sørg for, at sprøjten forbliver vinkelret på bladet. Vippe sprøjten vil forårsage bakteriesuspensionen at sprøjte ud under højt tryk.
   8. Hvis forskelligt A. anvendes tumefaciens-løsninger (fx at teste forskellige promotorer), fjerne eventuel overskydende opløsning tilbage på undersiden af bladet fra den første injektion ved hjælp af et stykke køkkenrulle eller lignende, før du anvender den næste løsning.
3. Post-infiltration inkubation af planter og prøveudtagning.
   1. Forbered en phytotron for de behandlede planter ~ 24 timer før injektion, for temperatur og fugtighed ligevægt på de niveauer, der er nødvendige for DoE.
   2. Efter injektion, overføres planterne til phytotron og placere dem i skufferne er store nok til kunstvanding med vand, indtil slutningen af ​​inkubationstiden bestemmes af DoE.
   3. Etablere en 16 hr photoperiod bruge seks Osram kølige hvide 36 W lysstofrør pr 0,7 m ² (75 mmol sek ^-1 m ^-2; λ = 400-700 nm). Forhindrer planterne i at skygge hinanden ved at begrænse antallet af planter til seks pr 0,7 m ^2.
   4. Før prøvetagning, skal du sørge for korrekte interkostale område blev valgt ved at sammenligne etiketten tilføjet i afsnit 5.2.1 og DoE planen.
   5. Brug en korkbor at fjerne 4-5 bladskiver fra de behandlede interkostale felter på positioner og tidspunkter angivet af DoE. Du må ikke fjerne hele blad fra planten under prøveudtagning. Stabilisere bladet med en håndholdt køkkenrulle og samtidig fjerne skiverne for at forhindre brud.
   6. Bestem massen af ​​hver prøve og placere den i en 1,5 ml plast reaktion rør mærket med prøven navn og masse. Opbevare prøverne ved -20 ° C eller -80 ° C før protein kvantificering. Processen kan afbrydes midlertidigt på dette stadium i flere måneder afhængig af prøvens stabilitetog opbevaringstemperatur.

6.. Protein Mængdebestemmelse

1. Uddrag proteiner fra bladskive prøver.
   1. Tilsæt 3 ml ekstraktionsbuffer (50 mM natriumphosphat, 500 mM natriumchlorid, pH 8,0) per mg prøvemasse og male bladskiver i reaktionsrøret med en elektrisk pistil indtil der ikke store fragmenter tilbage. Undgå overophedning af prøven.
   2. Fjern dispergerede faststoffer ved centrifugering af prøven to gange ved 16.000 x g i 20 min ved 4 ° C. Supernatanten overføres til et rent 1,5 ml reaktionsrør efter hvert trin, uden at forstyrre pellet.
   3. Efter centrifugering kan standses midlertidigt ved frysning af planteekstrakter ved -20 ° C eller -80 ° C i flere måneder afhængigt af prøvens stabilitet og opbevaringstemperatur. Bekræfte, at en fryse-tø-cyklus ikke påvirker koncentrationen af ​​målproteinet (r).
2. Mål DsRed fluorescens.
   1. Forbered tre tekniske gentagelser af hver prøve i sort 96-brønds halv-området plader (50 ul ekstrakt pr godt). Undgå dannelse af bobler under pipettering.
   2. Brug et sæt på seks fortyndinger (0, 25, 75, 125, 175 og 225 ug / ml) af en DsRed standard per 96-brønds plade til at frembringe en foring referencekurve. Forbered fortyndinger i PBS og gemme dem ved 4 ° C til brug inden for 3 måneder.
   3. Måle fluorescens to gange, sekventielt, i en 96-brønds pladelæser monteret med 530/25 nm excitations-og 590/35 nm emissionsfiltre.
   4. For hver prøve, gennemsnittet for fluorescens over to læser og de tre tekniske gentagelser og trække værdier registreret for blindproevekontrollen indeholdende 0 ug / ml DsRed. Også trække denne værdi fra læser af standardfortyndinger og bruge disse datoer-korrigerede værdier for en lineær regression gav en referencekurve (gennem oprindelsen ordinataksen).
   5. Brug hældning referencekurven at konvertere fluorescence målt for prøverne i dsRed koncentrationer. Hvis det er nødvendigt, fortyndes prøverne, således at udlæsningen falder koncentrationen interval af standarderne og overveje denne fortyndingsfaktor i efterfølgende beregninger.
3. Bestem koncentrationen af ​​2G12.
   1. Forbered en overflade plasmon resonans (SPR) indretning til måling af antistofkoncentration ved at koble protein A til den aktiverede overflade af en flow-celle. Brug en anden flowcelle som reference ved at inaktivere overfladen uden kobling af protein A ^30,31.
   2. Fortyndet planteekstrakter 1:20 i SPR kører puffer (10 mM HEPES, pH 7,4, 3 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,05% v / v Tween-20) og måle responsenheder (RU) af antistofbinding til protein A i tre tekniske replikater af hver prøve ved afslutningen af ​​en 90 ul injektion (180 sek ved 30 ul / min). Fratræk RUC målt i dennes referencepunkt flow celle (ingen protein A) fra RUC målt i den eksperimentelle flow celle (Protein A overflade).
   3. Måle en 585 ng / ml 2G12 standard efter hver 10-15 prøver og trække værdien målt i henvisning flow celler som beskrevet ovenfor. Brug det gennemsnitlige RU af disse standarder til at beregne en lineær henvisning kurve gennem oprindelse ordinat.
   4. Beregn 2G12 koncentrationerne i prøverne baseret på fortyndet 1:20 og hældningen af ​​referencekurven.
   5. Check for stærk uspecifik binding til cellereferencen, der kan ødelægge målingen. Også kontrollere, om 2G12 standarder fastholde omtrent konstante værdier (<5% variation) i hele analysen, da en større variation afspejler ældning af protein A overfladen.

7.. Dataanalyse og evaluering

1. Manuelt analysere observeret respons i udtrykket forsøg til (i) ekstreme værdier (høj eller lav), der indikerer målefejl (ii) usædvanlige resultater, f.eks faktorkombinationer at gensats uventede reaktioner indikerer dataudveksling, og (iii) manglende værdier.
   Bemærk: Brug disse handlinger for at forhindre model bygning baseret på fejlagtige oplysninger.
2. Overfør de analyserede svardataene (her koncentrationerne protein) i "Design" knudepunkt DesignExpert. Sørg for, at respons data korrekt er tildelt den tilsvarende faktor indstillinger. Der er en omfattende hjælp sektion rådighed i DesignExpert software, der dækker de aspekter, behandles nedenfor.
3. I "Analyse" knude, skal du vælge det svar, der skal analyseres og i første omgang vælge "none" i fanen transformation.
   Bemærk: en transformation anbefales til min / max nøgletal svaret større end 10. Den mest nyttige transformation kan fås fra Box-Cox-plot i "Diagnose" fanen i afsnittet "Diagnosticering" i "Diagnose værktøj" beskrevet nedenfor (afsnit 7.8). En Log ₁₀ transformation er ofte hensigtsmæssigt.
(fx to-faktor vekselvirkninger, kvadratiske effekter). Softwaren vil foreslå en indledende model baseret på dets betydning.
4. I fanebladet "Model", er en indledende model forvalgt baseret på "Fit summary" resultater. Brug den automatiske modus til at redigere denne model:
   1. Vælg en "Process orden", der er en ordre over den foreslåede model, fx hvis den foreslåede model er "2FI" (to-faktor interaktion) og derefter vælge "Kvadratisk".
   2. Vælg "tilbagestående" i "Selection" felt, som iterativt vil fjerne ikke er væsentlige vilkår fra modellen efter fortsætter til "ANOVA" fanen baseret på "Alpha out" værdi, som oprindeligt skulle være 0.100.
   3. Hvis du bliver spurgt af softwaren, altid automatisk korrigere modelhierarkiet fordi det er necessary at generere pålidelige modeller ^32,33.
5. I "ANOVA" fanen, undersøge den foreslåede model og de medfølgende faktorer. Hvis det er nødvendigt, skal du manuelt fjerne alle faktorer med p-værdier over en foruddefineret tærskel (her 0,05, svarende til et 5% signifikansniveau), eller dem, der er næppe baseret på mekanistiske overvejelser ved at skifte tilbage til fanen "Model", ændre "Selection" til "Manual" og fjerne de relevante faktorer fra modellen.
6. Tilbage i "ANOVA" fanen, evaluere den opdaterede model i form af p-værdi af "Model" (en lav værdi er ønskelig, fordi dette indikerer betydning) og "Lack-of-fit" (en høj værdi er ønskelig fordi dette indikerer manglende betydning) samt værdierne for "R-squared", "Justeret R-squared" og "Predicted R-squared" (værdier> 0,80 er ønskelig for alle tre værdier).
   1. Sammenlign disse værdier for forskellige modeller, herunder / eksklusive faktorer på flere signifikansniveauer.
      Bemærk: Det kan være nyttigt at duplikere kolonnen svar i "Design" node og udføre hver analyse enkeltvis, eller at eksportere hele "ANOVA" bord i et andet program, såsom et regneark.
7. Fortsæt til fanen "Diagnose" for at bekræfte kvaliteten af ​​model og afsløre potentielle outliers i datasættet, der har en stærk indflydelse på modellen ved at undersøge alle fanerne i "Diagnose Tool" ("Diagnose" og afsnit "indflydelse") .
   1. I afsnittet "Diagnose" i "Diagnose værktøj", skal du udføre følgende handlinger:
      1. Sørg punkterne er tilfældigt spredt inden for de grænser i "Rester vs Predicted" chart. Her en Chevron-formet fordeling peger på et behov for data transformation.
      2. Sikre punkter er tilfældigt spredt inden for grænserne i det"Rester vs Predicted" chart. Her en Chevron-formet fordeling peger på et behov for data transformation.
      3. Undersøg, om punkterne i "Residualer vs run" chart scatter tilfældigt inden for grænserne. Et mønster (fx "trappe") angiver en tendens i data og blokere bygning kan bruges til at modvirke dens indflydelse på modellen.
      4. Kig efter en lige diagonal linje, der angiver den ideelle model i "Predicted versus Actual" plot. Jo større spredning af data omkring diagonalen, jo mindre nøjagtig modellen.
      5. Check for en overlapning af det blå (bedst) og grøn (faktisk) lodrette linier i Box-Cox-plot indikerer data transformation. Hvis den grønne linje ikke passer den blå (uden for intervallet angivet af den røde lodrette linjer) gå tilbage til afsnit 7.3 og forbedre modelbygning runde ved at vælge datatransformation foreslået af Box-Cox-plot. Igen gentagelse af den fornyedespons kolonne kan være nyttigt at sammenligne forskellige modeller.
      6. Sørg for, at de punkter i "Residualer vs Factor" diagrammer (der er en diagram for hver model faktor) scatter tilfældigt inden for grænserne. Krumning datadistributionen kan indikere en faktor mangler i modellen.
   2. I afsnittet "Influence" af "Diagnose værktøj", sørg for at der er tilfældig spredning af data inden for grænserne i de "Eksternt studentized residualer", "leverage", "DFFITS" og "DFBETAS" plots og jævnt lav fordeling uden ekstreme værdier i "Cooks Distance" plot.
8. I fanebladet "Model grafer", visualisere den evaluerede model. For et begrænset antal numeriske faktorer (f.eks 3) svaret overflade ("3D overflade") repræsentation er nyttigt at vurdere Optima / egenskaber manuelt.
   Bemærk: respons overflader kun illustrere effekten af ​​to FACtorer på responset under efterforskning. Effekten af ​​eventuelle yderligere faktor på svaret er afsløret ved at ændre dens værdi (numeriske faktorer) eller niveau (kategorisk faktorer) i "Faktorer værktøjet" vinduet. Alternativt kan faktorer tildeles plottet aksen ved at højreklikke på dem i "Faktorer værktøjet" vinduet og vælge den ønskede uafhængige variabel akse.
   1. Manipulere faktorniveauerne og tildele dem til grafen ordinat ved hjælp af "Faktorer værktøj".
   2. Eksport grafer ved hjælp af "Eksporter graf til fil ..." kommando i fanebladet "Filer".
9. Brug "Numerisk" sub-node i "optimering" node til optimering af responsen numerisk (minimere, maksimere i området), afhængigt af modellen faktorer, som til gengæld visse begrænsninger kan anvendes (f.eks grænser og vægte) via fanebladet "Kriterier".
   1. Beregn og undersøge numeriske løsninger på de "løsninger"fane baseret på input i fanebladet "Kriterier".
   2. Eksportere disse løsninger til andre software (f.eks regneark) for yderligere analyse (f.eks histogrammer) afsløre faktor indstillinger i forbindelse med høje eller lave svarværdier.
      Bemærk: Dette er nyttigt, hvis mere end tre numeriske faktorer er undersøgt, og 3D-repræsentation er vanskelig.
10. Brug "Point forudsigelse" sub-node til at forudsige respons for specifik faktor indstillinger.
    1. Brug denne forudsigelse for alle indstillinger, der skal evalueres (her alle promotor og 5'UTR kombinationer samt alle blade og inkubationstider eller blad positioner og inkubationstemperaturer).
    2. Eksportere de forudsagte værdier og samle dem til en data-array, som kan bruges til at beskrive forbigående ekspression i tobaksplanter, fx ved at beregne udtrykket for en specifik promotor-5'UTR kombination på et bestemt tidspunkt i gennemsnit over alle blad positioner eller across alle bladene på en plante.
    3. Normalisere udtryk data baseret på masserne af de forskellige blade for at give det specifikt udtryk niveau (mg g ^-1) eller specifik ekspression sats (pg g ^-1 hr ^-1).
    4. Alternativt eksportere koefficienter "Final ligning" fra bunden af ​​"ANOVA" fanen i et regneark og multiplicerer dem med et array af faktor indstillinger til opnåelse af de samme data array.
       Bemærk: dette array må kun indeholde faktorværdier fra inden for den oprindelige design plads, fordi den model ligning ikke er velegnet til ekstrapolation.
11. Foretag en bekræftelse eksperiment til model punkter, som er af stor interesse.
    1. Udfør forbigående protein udtryk under betingelser, der er udvalgt til "Point forudsigelse" (afsnit 7.11). Fx bruger de samme temperaturer og blade mv
    2. Bestem koncentrationen protein for denne forbigående ekspression eXperiment som beskrevet ovenfor (afsnit 6) og sammenligne dem med de værdier forudsagt af modellen.
    3. Kontroller, om den gennemsnitlige proteinkoncentration i bekræftelsen eksperimentet falder inden for svar overflade model forudsigelse interval opnået under punkt forudsigelse. En match bekræfter forudsigende magt modellen. Et misforhold angiver kan kræves en lav model kvalitet og yderligere kørsler.
    4. Bemærk: plante batch-til-batch variation udvider forudsigelse interval og kan devaluere bekræftelser forsøg udført med en anden batch af planter. Prøver, der blev ikke anvendt til at generere den model, men der stammer fra den samme plante parti som prøverne indeholdt i modellen, kan dog fungere som en effektiv kontrol.

Representative Results

En beskrivende model for DsRed akkumulering ved transient ekspression ved hjælp af forskellige initiativtagere og 5'UTRs

DsRed fluorescens i bladekstrakter blev anvendt til at indikere ekspressionsniveauet af det rekombinante protein og således blev anvendt som respons i DoE strategi. Den mindste påviselige forskel, vi anset for relevante var 20 pg / ml og den anslåede standardafvigelse af systemet var 8 mg / ml baseret på indledende forsøg. Faktorer, der indgår i den forbigående ekspression model blev udvalgt på grundlag af litteratur af data ^7,8 og vores tidligere resultater ^9. De undersøgte områder blev også valgt i overensstemmelse med disse data (tabel 1). Mindst tre niveauer blev udvalgt for alle diskrete numeriske faktorer for at gøre det muligt at beregne en kvadratisk base model. En D-optimale valg algoritme blev valgt til valget af DoE løber for at få de mest præcise estimater forkoefficienterne i regressionsmodellen. Designet oprindeligt foreslået af DesignExpert bestod af 90 kørsler, men FDS var utilstrækkelige til at opnå en 1% standard fejl af forudsigelse (figur 3A). D-optimal forstærkning af designet til i alt 210 kørsler løst dette problem, og resulterede i en FDS 100% med mere ensartet forudsigelse nøjagtighed i design rum angivet ved den flade kurve (figur 3B).

De dsRed koncentrationer blev bestemt for alle 210 kørsler, og dataene blev Log ₁₀ forvandlet. Modelfaktorer blev valgt af automatiseret baglæns valg fra en kubisk model med et alfa-niveau på 0,100. Dette resulterede i en signifikant model (tabel 2) med ubetydelige mangel-of-fit og høje værdier for de multiple korrelationskoefficienter (tabel 2). P-værdien af ​​alle modelfaktorer var <0,05 og dermed ingen yderligere manuel håndtering af modellen var påkrævet. Modellen indeholdttre-faktor interaktioner, der ikke var en del af den oprindelige kvadratiske basismodellen (Tabel 2). Revurdering af FDS grafen ved hjælp af alle faktorer, som indgår i den endelige forudsigelse model viste, at FDS for standard fejl af forudsigelse ikke var væsentlig mindre ved at inkludere yderligere tre-faktor interaktioner (FDS = 0,99).

Modellen kvalitet diagnostiske værktøjer i DesignExpert indikerede, at data transformation var nyttigt og der var ingen manglende faktorer i modellen, da den normale plot af residualer udviste lineær adfærd og ingen bestemt mønster blev observeret i residualerne vs forudsagt plot (5A og 5B ). Der var også nogen tendens i løbet af forsøget for at indikere en skjult tidsafhængig variabel (figur 5C). Stedet modellens forudsigelser var i meget god aftale med den observerede DsRed fluorescens (figur 5D). Vi therefore antages, at den valgte model var nyttigt at forudsige forbigående udtryk for DsRed i ikke-cotyledon tobaksblade drevet af forskellige promoter / 5'UTR kombinationer i løbet af en post-infiltration inkubationstid på 8 dage. Vi valgte også en kunstig lineær regressionsmodel uden datatransformation at illustrere konsekvenserne af forkert faktor udvælgelse og transformation (figur 6). Klart, at normal afbildning af restprodukter afviger fra den forventede lineære egenskaber (figur 6A), og der er en "v"-formet mønster residualer versus forudsagte plot i stedet for en tilfældig spredning (figur 6B). Derudover residualer versus køre plot fremhæver to ekstreme værdier (figur 6C), mens forudsigelser er dårlig for både små og store værdier, der afviger fra den optimale model (diagonal) (figur 6D).

5'UTR kombinationer med CaMV 35SS-promotoren, medførte stærkere DsRed udtryk end kombinationer med nos promotor (5A og 5B) som tidligere rapporteret ³⁴ og de ​​tilsvarende faktorer fandtes at være betydelige i DoE model (Tabel 2). Modellen forudsagde også, at blad alder var en betydelig faktor (Tabel 2) med ekspressionsniveauer vist sig at være højere i unge blade (figur 7B og 7D) som var i god overensstemmelse med vores tidligere resultater ¹⁹ og andres ^7,8. Progression af DsRed akkumulering i blade ikke var lineær eller eksponentiel men fulgte en S-formet kurve i løbet af de 8 dage post-infiltration inkubation i henhold til modellen. Interessant, var der ingen fast rækkefølge 5'UTRs i form af tilsvarende DsRed udtryk. Derfor er den "styrke" af 5'UTR var afhængig af den ledsagende promotor. Det er usandsynligt, at denneafhængighed mellem promotoren og 5'UTR ville være blevet afsløret ved hjælp af en OFAT eksperiment. Den prognosemodel også anført, at visse par af promotor / 5'UTR kombinationer (f.eks. CaMV 35SS/CHS og nos / CHS (7A og 7B), CaMV 35SS/omega og nos / CHS eller CaMV 35SS/CHS og CaMV 35SS / TL) resulterede i en afbalanceret ekspressionsniveauer afvigelse på mindre end 30% fra et bestemt forhold på tværs af alle blade og inkubationstiderne> 2 dage (f.eks. til CaMV 35SS/omega og nos / CHS forholdet var ~ 8,0) ^20. En sådan afbalanceret udtryk ville være nyttigt for ekspression af multimeriske proteiner såsom IgA med en defineret støkiometri ^35,36.

Figur 5. Graphical evaluering af model kvalitet. A. Den normale sandsynlighed plot af de internt studentized residualer indikerer normal fordeling, fordi residualerne følger en linje. B. Internt studentized residualer scatter omkring værdien nul for alle områder af den forventede respons (fluorescens) med en passende data transformation. C. Internt studentized residualer scatter omkring nul i hele forløbet af eksperimentet, der viser mangel på skjulte tidsmæssige virkninger. D. Forudsagt og aktuelle værdier for reaktionen er i god aftale, da alle punkter ligger tæt på diagonalen (ideel model).

Figur 6.. Diagnostics indikerer lav model kvalitet. A B. Internt studentized residualer viser et "v"-formet fordeling indikerer en upassende data transformation. C. Internt studentized residualer scatter ikke omkring nul i hele løbet af forsøget, men udviser en tendens til positive værdier. Derudover kan to ekstreme værdier kan findes. D. Forudsagt og aktuelle værdier for reaktionen er i dårlig aftale, da de fleste punkter afviger fra den diagonal (ideel model).

Figur 7.. Respons overflader til transient DsRed ekspression i tobaksblade. A . Trong> nos / CHS i blad 2 b. CaMV 35SS/CHS i blad 2; C. CaMV 35SS/TL i blad 6; D. CaMV 35SS/CHS i blad 6. DsRed koncentrationerne steg en sigmoidal måde under inkubationstiden. Ekspressionsniveauer var lavere i gamle blade (fx blad 2 i A og B) sammenlignet med unge blade (fx blade 6 i C og D) og for nos (A) i forhold til CaMV 35SS promotor (B). 5'UTR havde også en betydelig indflydelse på DsRed udtryk (f.eks TL (C) vs CHS (D)), men udtrykket styrke var afhængig af den medfølgende promotor.

"> Df

Kilde	Sum af kvadrater	Middelværdi	F-værdien	p-værdi
Model	174.85	95	1,84	182,12	<0,0001
Holdning om blad (A)	0.16	1	0.16	16.06	0,0001
Inkubationstiden (B)	112,46	1	112,46	11128,22	<0,0001
Leaf alder (C)	15.24	7	2.18	215,39	<0,0001
Promotor (D)	23.49	1	23.49	2324.29	<0,0001
5'UTR (E)	0,93	3	0.31	30,61	<0,0001
AC	0,24	7	0.034	3,38	0,0026
BC	1,46	7	0,21	20.64	<0,0001
BD	2,27	1	2,27	224,51	<0,0001
BE	0,87	3	0.29	28.74	<0,0001
CD	0.29	7	0.042	4.11	0,0005
CE	0,43	21	0.021	2,04	0,0093
DE	0,48	3	0.16	15.73	<0,0001
B2	6.34	1	6.34	627,29	<0,0001
BCD	0.95	7	0.14	13.42	<0,0001
BCE	0,39	21	0.019		0,0230
BDE	0.16	3	0.054	5.37	0,0017
B2D	1,49	1	1,49	147,93	<0,0001
Resterende	1.15	114	0.010
Mangel-of-fit	1.08	104	0.010	1.45	0,2669
Pure fejl	0.072	10	7.153E-003
Sammenhæng i alt	176,01	209
Korrelationskoefficienter	Value
R-Squared	0,9935
Justeret R-Squared	0,9880
Predicted R-Squared	0,9770

Tabel 2. Faktorer, der indgår i den prædiktivemodel for forbigående DsRed ekspression i tobaksblade ved hjælp af forskellige promoter / 5 'UTR kombinationer. Tre-faktor interaktioner er fremhævet med fed skrift.

Optimering inkubationsforhold og høst ordninger for produktion af monoklonale antistoffer i planter ved forbigående udtryk

DOE fremgangsmåde blev også benyttet til at optimere inkuberingstemperatur bakteriel OD600nm for blad infiltration, plante alder og høst ordninger til samtidig produktion af monoklonale HIV-neutraliserende antistof 2G12 og DsRed i tobak ^19. Høsten ordning fastlagt, hvilke blade blev brugt for protein udvinding, fx de seks øverste blade. Vi har derfor etableret en prædiktiv model for ekspression af hvert protein (2G12 og DsRed) i planter ved forskellige aldre (ung = tidligt knopstadiet = høst på 40 dage efter såning, gammel = moden knopstadiet = høst i 47 dage efter seding). Disse fire modeller blev derefter evalueret, og en konsensus-model etableres der omfattede hver faktor sig at være betydelig i de enkelte modeller. Vi derefter bekræftet, at konsensus-model var stadig en god repræsentation af alle oprindelige datasæt (Tabel 3). Den konsensus-modellen blev derefter anvendt til at identificere optimale inkubationstemperatur (~ 22 ° C i 2G12 og ~ 25 ° C i DsRed) og bakteriel OD _600nm (~ 1.0) for begge proteiner. Disse optimale betingelser blev derefter anvendt til at forudsige proteinkoncentrationer i alle bladene (1-8) og blad positioner (1-4) i unge og gamle planter. Koncentrationsprofilerne blev integreret med biomassedata ¹⁹ for at give den absolutte mængde af target protein fremstillet af forskellige blade og plante aldre (figur 8A). Absolutte protein beløb blev derefter korreleret med tilhørende downstream omkostninger tillader os at udføre en cost-benefit-analyse for behandling af hvert blad / anlæg alder. Det fremgik, atunge planter var fordelagtigt for transient ekspression fordi proteinerne nåede højere koncentrationer i løbet af kortere vækstperioder trods lavere samlet biomasse i forhold til gamle anlæg (figur 8B og 8C). Vi fandt også, at behandle alle de blade fra gamle anlæg var dyrere end at kassere blade 1-3 og øge antallet af planter pr parti i stedet (figur 8D). Derfor DoE-baserede modeller ikke blot er egnede til at markere det sidste trin i et eksperiment, men også til kombination med andre data, der muliggør mere komplekse aspekter af processen analyse. En række indbyrdes forbundne modeller dækker hele produktionsprocessen for en biofarmaceutisk protein kunne være det ultimative mål.

Figur 8. Integrated ion af biomasse og proteinkoncentration data resulterer i absolutte proteinudbytte og procesomkostninger. A. Leaf biomasse og target proteinkoncentration ikke udvikle sig i en collinear måde, som resulterede i en forudindtaget ophobning af 2G12 i unge blade. B. Den samme mængde DsRed og ~ 65% af 2G12 blev fundet i unge planter i forhold til de gamle på trods af en ~ 50% lavere gennemsnitlige biomasse. C. Dette afspejlede højere specifik protein udtryk i unge planter. D. Den øgede særligt udtryk oversat til reducerede produktionsomkostninger for begge proteiner fordi mindre biomasse, der skal bearbejdes kræver mindre drivhus plads, færre forbrugsstoffer (f.eks. Filtre), og mindre nedstrøms udstyr.

pt, bredde: 48pt "width =" 64 "> Plant alder [dps] t ">

40				47
Målprotein [-]	DsRed		2G12		DsRed		2G12
Model [-]	Initial	Konsensus	Initial	Konsensus	Initial	Konsensus	Initial	Konsensus
R-kvadreret [-]	0,9829	0,9577	0,9321	0,9099	0,9436	0,9403	0,8826	0,8782
Justeret R-kvadreret [-]	0,9711	0,9480	0,9059	0,8893	0,9362	0,9350	0,8716	0,8674
Predicted R-squared [-]	0,9510	0,9336	0,8272	0,8587	0,9254	0,9282	0,8554	0,8516

Tabel 3. Sammenligning af korrelationskoefficient for oprindelige RSM-modeller og den endelige konsensus model DsRed og 2G12 udtryk i tobaksplanter.

Discussion

Hvert eksperiment kræver omhyggelig planlægning, fordi ressourcerne er ofte knappe og dyre. Dette gælder især for ministeriets strategier, fordi fejl i planlægningsfasen (fx vælge en base model, der ikke dækker alle væsentlige faktor interaktioner) væsentligt kan formindske den prædiktive effekt af de resulterende modeller, og dermed devaluere hele eksperimentet. Dog kan disse fejl let undgås ved at følge grundlæggende procedurer.

Overvejelser i løbet DoE planlægning

Først er det vigtigt at vælge et svar, der er egnet til at evaluere resultaterne (positiv eller negativ) for hver DoE løb. For eksempel: koncentrationen af et målprotein bestemmes ved UV-absorption ³⁷ er nyttig til at vurdere aktiviteten af en bestemt promotor / 5'UTR kombination. Funktionel evaluering af et protein (f.eks. Ved fluorescens i tilfælde af DsRed eller binding til protein A i case af 2G12), er endnu bedre, fordi det også omfatter et protein kvalitet aspekt. Reaktionerne kan også være værdier beregnet fra to eller flere separate parametre, såsom magt nummer NP i gæring eksperimenter (beregnet ud fra power input, omdrejningshastighed og omrører diameter). Svaret bør give værdier med høj præcision (dvs. lav standardafvigelse) og nøjagtighed (dvs. nul eller få forstyrrende parametre) for at forbedre modellen kvalitet. Egnede detektionsudstyr og metoder bør derfor optimeres før forsøget, hvis nødvendigt.

Faktorer, der påvirker responsen, skal identificeres før DoE gennemføres, fordi RSM bruges til at bestemme den præcise virkning af de faktorer og ikke at vælge dem. Udvælgelsen af ​​faktorer med en betydelig indflydelse på den respons kan opnås ved at studere data fra litteraturen, men fuld eller fraktilblok-ministeriets strategier er mere effektive. Disse screening eksperimenter børogså anvendes til at identificere en række for hver faktor, inden for hvilket der kan opnås meningsfulde resultater, fx i biologiske systemer faktoren "temperatur" er ofte begrænset til intervallet 10-40 ° C. Skal derefter fastlægges diskrete niveauer inden for disse intervaller for numeriske faktorer, der er teknisk vanskeligt at kontrol, fx phytotron temperaturer har en tolerance på ± 2,0 ° C, så det er uhensigtsmæssigt at undersøge temperaturforskelle på ± 1,0 ° C. Praktiske begrænsninger kan også komme i spil, fx ved hjælp af> 25 forskellige koncentrationer af en særlig forbindelse. Antallet af niveauer, skal dog være mindst én større end den forventede polynomium kendelse faktor i basismodellen, fx hvis polynomiet orden temperatur er n = 2, så mindst tre temperaturniveauer skal undersøges. Brug basismodeller med høj polynomium orden (kubisk eller derover) er en mulighed, hvis polynomiet med en faktor er usikker.Men dette kan øge antallet af kørsler, der kræves for DoE.

For komplekse systemer med mange faktorer og høje polynomielle ordrer dette kan resultere i mønstre, som ikke kan beregnes effektivt. I sådanne tilfælde kan det være tilrådeligt at opdele problemet i to eller flere designs undersøger forskellige delgrupper i faktorer. Dog skal de væsentlige faktorer, udeladt fra sådanne "split-design" justeres omhyggeligt til faste værdier for at undgå enhver form for resultaterne. Hver split-design bør gentages ved forskellige indstillinger for de udeladte faktorer til at afsløre samspillet mellem dem og de faktorer, der indgår i konstruktionen. Det er gavnligt at identificere de faktorer, der har størst indflydelse på respons og inkludere dem i alle designs.

Kritiske aspekter under DoE evaluering

FDS bør være det første parameter vurderet i en nyligt beregnet DoE. Operatøren skal bekræfte, at the DoE giver den nødvendige dækning af designet plads til den nødvendige minimale påviselige forskel og skønnet standardafvigelse på svaret. Hvis dette ikke er tilfældet, skal designet være udvidet med et passende antal kørsler og gentagelser, indtil kravene er opfyldt. Proceduren for beregning DoE kørsler kan initialiseres flere gange for at vælge design med et minimalt tab af optimalitet hvis balancen mellem kategorisk faktorer er aktiveret.

Datatransformation bør udføres, hvis svarværdier spænde mere end én størrelsesorden. En Log ₁₀ transformation er ofte hensigtsmæssigt, men Box-Cox plot vil foreslå den forvandling, der vil give den mest stabile model. Forvandlingen foreslås i dette plot kan ændre sig, når den endelige model er valgt og derfor bør revurderes. Kun væsentlige faktorer (p-værdi <0,05) bør medtages i svaret overflade model for at sikre dens prædiktive power. Undtagelser kan gøres for at opretholde modelhierarkiet ^32,33 eller at omfatte faktorer, der vides at have en effekt baseret på tidligere resultater. I sidstnævnte tilfælde er det tilrådeligt at undersøge, hvorfor så vigtige faktorer, der ikke blev anset for at være af betydning i den nuværende DoE. Manglen-of-fit parameter kan bruges i kombination med R-kvadreret værdi (tabel 2 og 3) for hurtig påvisning af fattige modeller / anfald, mens den justerede R-squared angiver, om alt for mange / Ubetydelig faktorer er blevet udvalgt og den forudsagte R-squared er en indikator for den prædiktive effekt af modellen. Men de resterende grunde, der er fastsat i den diagnostiske del af DesignExpert er endnu vigtigere at vurdere modellens kvalitet, fordi de giver mulighed for påvisning af tendenser i datasættet indikerer tilstedeværelsen af ​​skjulte faktorer samt identifikation af ekstreme værdier. Sidstnævnte har en over gennemsnittet indflydelse på pasform og fordreje modellen. Disse værdier kan stamme fra mangelfulde oplysninger (f.eks permuterede værdier), der skal rettes, eller fra mislykkede eksperimenter, der skal gentages. Hvis en ekstrem værdi er fundet at være "rigtige" i sådanne gentagelse eksperimenter er det tilrådeligt at tilføje flere kørsler i nærheden af ​​denne værdi til at forbedre den model, kvalitet i denne region af designet plads.

Rettelser til design, som er ufuldstændig eller for lille

Uanset hvorfor kan der kræves yderligere kørsler (f.eks manglende data mislykkedes kørsler, ægte ekstreme værdier og regioner, uventede høje ordens faktor interaktioner) bør disse kørsler lægges til eksisterende design på en ordnet måde ved at bruge "Design augmentation" værktøj at indføre de nye kører i en separat blok. Dette vil lette brugen af ​​den tidligere datasæt, mens du vælger de mest meningsfulde ekstra kørsler. Resultatet vil være en model, der passer til dataene, og giver en pålideligforudsigelse af fremtidige resultater.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Design-Expert(R) 8	Stat-Ease, Inc.	n.a.	DoE software
Tryptone	Carl Roth GmbH	8952.2	Media component
Yeast extract	Carl Roth GmbH	2363.2	Media component
Sodium chloride	Carl Roth GmbH	P029.2	Media component
Ampicillin	Carl Roth GmbH	K029.2	Antibiotic
Agar-Agar	Carl Roth GmbH	5210.2	Media component
Escherichia coli K12 DH5a	Life Technologies	18263-012	Microorganism
pPAM	GenBank	AY027531	Cloning/expression vector;
NucleoSpin Plasmid	MACHEREY-NAGEL GmbH	740588.250	Plasmid DNA isolation kit
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up	MACHEREY-NAGEL GmbH	740609.250	Plasmid DNA purification kit
NanoDrop 2000	Thermo Scientific	n.a.	Spectrophotometer
NcoI	New England Biolabs Inc.	R3193L	Restrictionendonuclease
EcoRI	New England Biolabs Inc.	R3101L	Restrictionendonuclease
AscI	New England Biolabs Inc.	R0558L	Restrictionendonuclease
NEB 4	New England Biolabs Inc.	B7004S	Restrictionendonuclease buffer
TRIS	Carl Roth GmbH	4855.3	Media component
Disodium tetraborate	Carl Roth GmbH	4403.3	Media component
EDTA	Carl Roth GmbH	8040.2	Media component
Agarose	Carl Roth GmbH	6352.4	Media component
Bromophenol blue	Carl Roth GmbH	A512.1	Color indicator
Xylene cyanol	Carl Roth GmbH	A513.1	Color indicator
Glycerol	Carl Roth GmbH	7530.2	Media component
Mini-Sub Cell GT Cell	BioRad	170-4406	Gel electrophoresis chamber
Agrobacterium tumefaciens strain GV3101:pMP90RK	DSMZ	12365	Microorganism
Electroporator 2510	Eppendorf	4307000.658	Electroporator
Beef extract	Carl Roth GmbH	X975.2	Media component
Peptone	Carl Roth GmbH	2365.2	Media component
Sucrose	Carl Roth GmbH	4621.2	Media component
Magnesium sulfate	Carl Roth GmbH	0261.3	Media component
Carbenicillin	Carl Roth GmbH	6344.2	Antibiotic
Kanamycin	Carl Roth GmbH	T832.3	Antibiotic
Rifampicin	Carl Roth GmbH	4163.2	Antibiotic
FWD primer	Eurofins MWG Operon	n.a.	CCT CAG GAA GAG CAA TAC
REV primer	Eurofins MWG Operon	n.a.	CCA AAG CGA GTA CAC AAC
2720 Thermal cycler	Applied Biosystems	4359659	Thermocycler
RNAfold webserver	University of Vienna	n.a.	Software
Ferty 2 Mega	Kammlott	5.220072	Fertilizer
Grodan Rockwool Cubes 10 x10 cm	Grodan	n.a.	Rockwool block
Greenhouse	n.a.	n.a.	For plant cultivation
Phytotron	Ilka Zell	n.a.	For plant cultivation
Omnifix-F Solo	B. Braun	6064204	Syringe
Murashige and Skoog salts	Duchefa	M 0222.0010	Media component
Glucose	Carl Roth GmbH	6780.2	Media component
Acetosyringone	Sigma-Aldrich	D134406-5G	Phytohormon analogon
BioPhotometer plus	Eppendorf	6132 000.008	Photometer
Osram cool white 36 W	Osram	4930440	Light source
Disodium phosphate	Carl Roth GmbH	4984.3	Media component
Centrifuge 5415D	Eppendorf	5424 000.410	Centrifuge
Forma -86C ULT freezer	ThermoFisher	88400	Freezer
Synergy HT	BioTek	SIAFRT	Fluorescence plate reader
Biacore T200	GE Healthcare	n.a.	SPR device
Protein A	Life Technologies	10-1006	Antibody binding protein
HEPES	Carl Roth GmbH	9105.3	Media component
Tween-20	Carl Roth GmbH	9127.3	Media component
2G12 antibody	Polymun	AB002	Reference antibody