Summary
Vi beskriver en utforming av eksperimenter metode som kan brukes til å bestemme og model påvirkning av transgene regulatoriske elementer, plantevekst og utvikling parametere og inkuberingsbetingelser på transient ekspresjon av monoklonale antistoffer og reporter proteiner i planter.
Abstract
Planter gir flere fordeler for produksjon av biofarmasøytiske inkludert lave kostnader, skalerbarhet og sikkerhet. Gående uttrykk tilbyr den ekstra fordelen av kort utvikling og produksjonstider, men uttrykk nivåer kan variere betydelig mellom partier og dermed gi opphav til regulatoriske bekymringer i sammenheng med god framstillingspraksis. Vi brukte et design av eksperimenter (DoE) tilnærming for å fastslå effekten av store faktorer som regulatoriske elementer i uttrykket konstruere, plantevekst og utvikling parametere og inkuberingsforhold under uttrykk, på den variasjonen av uttrykk mellom partiene. Vi testet planter som uttrykker en modell for anti-HIV-monoklonalt antistoff (2G12) og et fluorescerende markørprotein (DsRed). Vi diskuterer begrunnelsen for valg av visse egenskaper ved modellen og identifisere sine potensielle begrensninger. Den generelle fremgangsmåten kan lett overføres til andre problemer, fordi prinsippene for modellen enre bredt gjeldende: kunnskapsbasert parametervalg, redusere kompleksitet ved å splitte den innledende problem i mindre moduler, programvare-veiledet oppsett av optimale eksperimentkombinasjoner og trinnvis utforming styrking. Derfor er metoden som er ikke bare nyttig for å karakterisere protein ekspresjon i planter, men også for å undersøke andre komplekse systemer som mangler en mekanistisk beskrivelse. Den prediktive ligninger som beskriver sammenkopling mellom parametrene kan anvendes for å etablere mekanistiske modeller for andre komplekse systemer.
Introduction
Produksjonen av biofarmasøytiske proteiner i planter er fordelaktig fordi plantene er billig å vokse, kan plattformen bli skalert opp bare ved å dyrke flere planter, og humane patogener er ute av stand til å replikere 1,2. Gående uttrykk strategier basert for eksempel på infiltrasjon av blader med Agrobacterium tumefaciens gir ekstra fordeler fordi tiden mellom det punktet av DNA levering og levering av et renset produkt reduseres fra år til mindre enn 2 måneder 3. Gående uttrykk brukes også for funksjonsanalyse, for eksempel for å teste gener for sin evne til å utfylle tap-av-funksjon mutanter eller å undersøke protein interaksjoner 4-6. Imidlertid transiente ekspresjonssystemer nivåer tendens til å vise større batch-til-batch variasjon enn uttrykk nivåer i transgene planter 7-9. Dette reduserer sannsynligheten for at biofarmasøytiske produksjonsprosesser basert på transient ekspresjon will være godkjent i sammenheng med Good Manufacturing Practice (GMP) fordi reproduserbarhet er en kritisk kvalitetsegenskap og er underlagt risikovurdering 10. Slike variasjoner kan også maskere eventuelle interaksjoner som forskerne har til hensikt å undersøke. Derfor setter vi ut for å identifisere de viktigste faktorene som påvirker forbigående uttrykk nivåer i planter og å bygge en høy kvalitet kvantitative prediktiv modell.
Den ene-factor-på-en-gang (OFAT) tilnærmingen er ofte brukt for å karakterisere virkningen (effekt) av visse parametre (faktorer) på utfallet (respons) av et eksperiment 11. Men dette er suboptimal fordi de enkelte testene (løper) under en etterforskning (eksperiment) vil bli justert som perler på en snor gjennom potensielt område spredt av de faktorene som er testet (design plass). Dekningen av utformingen plass og dermed graden av informasjon avledet fra forsøket erlav, som vist i figur 1A 12. Videre kan avhengigheter mellom forskjellige faktorer (faktor interaksjoner) forblir skjult resulterer i dårlige modeller og / eller prediksjon av falsk optima, som vist i figur 1B 13.
Ulempene beskrevet ovenfor, kan unngås ved å bruke en utforming av eksperimenter (DOE) tilnærming der forsøkene i et eksperiment er spredt mer jevnt gjennom hele utformingen mellomrom, noe som betyr at mer enn en faktor varieres mellom to omganger 14. Det er spesialiserte design for blandinger, screening faktorer (fakultet design) og kvantifisering av faktor virkninger på svar (svar overflatemetoder, RSM s) 15. Videre kan RSMs bli realisert som sentrale-kompositt design, men kan også gjøres effektivt ved hjelp av spesialisert programvare som kan bruke forskjellige kriterier for valg av løyper. For eksempel, den såkalte D-optimality kriterier vil velge kjøres så for å minimalisere feil i koeffisientene for den resulterende modell, de IV-Optimality kriterium velges løper som oppnår den beste forutsigelse variansen i løpet av utformingen plass 15,16. RSM vi beskriver her tillater presis kvantifisering av forbigående protein uttrykk i planter, men det kan lett overføres til ethvert system som involverer flere (~ 5-8) numeriske faktorer (f.eks temperatur, tid, konsentrasjon) og noen få (~ 2 - 4) categoric faktorer (for eksempel promoter, farge), hvori en mekanistisk beskrivelse er tilgjengelig eller er for kompliserte til å modellere.
Den DoE tilnærming oppsto i landbruksvitenskap, men har spredt seg til andre områder fordi det er overførbar til enhver situasjon der det er nyttig å redusere antall løyper som er nødvendige for å få pålitelige data og generere beskrivende modeller for kompliserte prosesser. Dette har igjen ført til inkludering av DoE i "Veiledning forIndustri, Q8 (R2) Pharmaceutical Development "utgitt av den internasjonale konferansen om harmonisering av tekniske krav til registrering av legemidler for mennesker (ICH) 17. DoE brukes nå mye i vitenskapelig forskning og industri 18. Imidlertid må man være forsiktig under planlegging og gjennomføring av forsøket fordi velge en utilbørlig polynom grad for den multiple-lineær-regresjonsmodell (grunnmodellen) kan innføre et behov for flere løyper å modellere alle faktoreffekter på riktig måte. Videre ødelagt eller manglende data generere feil modeller og feil spådommer, og kan også forhindre modellbygging forsøk som beskrevet i protokollen og diskusjonsdelene 18. I protokollen delen, vil vi i utgangspunktet satt ut de viktigste planleggingstrinn for en RSM-baserte eksperiment og deretter forklare design basert på DoE programvare DesignExpert v8.1. Men lignende design kan bygges med annen programvare including JMP, Modde, og STATISTICA. De eksperimentelle prosedyrer blir fulgt av instruksjoner for dataanalyse og evaluering.
Figur 1. Sammenligning av OFAT og DoE. A. Sekvensiell variant av én faktor om gangen (OFAT) i et eksperiment (svart, rød og blå sirkler) oppnår en lav dekning av design plass (klekket regioner). I kontrast, variasjonen av mer enn én faktor om gangen med design av eksperimenter (DoE) strategi (grønne sirkler) forbedrer dekningen og dermed presisjonen i de resulterende modeller. B. Den partisk design plass dekning betyr at OFAT eksperimenter (svarte sirkler) kan også mislykkes i å finne optimale drifts regioner (rød) og forutsi sub-optimale løsninger (stor svart sirkel), mens DoE Strategies (svarte stjerner) er mer sannsynlig å identifisere foret forhold (stor svart stjerne).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Planlegger du en DoE Strategi
- Identifisere relevante faktorer og tiltak for inkludering i design.
- Definere ett eller flere svar for måling. Her ble 2G12 og DsRed ekspresjonsnivåer brukes (ug / ml), inkludert det minimum påviselig forskjell anses som relevante (10 og 20 ug / ml, henholdsvis), og en tilnærmet verdi for den beregnede standardavviket av systemet (4 og 8 ug / ml, respektivt) basert på tidligere forsøk.
- Bruk tilgjengelig litteratur, data fra tidligere eksperimenter eller spesialiserte screening design (for eksempel et faktorielt design, se innledningen) til å velge viktige faktorer som har innvirkning på svarene skal kvantifiseres (Tabell 1) 7,8,19,20.
- Fordele typer faktor (numeriske eller categoric) og velge områder innenfor der de numeriske faktorene vil endres i løpet av DoE undersøkelse (Tabell 1).
- Identifiser numeric forhold som kontinuerlig variasjon er vanskelig å gjennomføre.
- Unngå å bruke kontinuerlig variasjon for faktorer som ikke kan justeres nøyaktig til et bestemt nivå. F.eks Inkubasjonstemperaturen kan typisk kontrolleres kun innenfor ± 2 ° C, og derfor kontinuerlig variasjon ved hjelp av verdier som 27,2 °, 25,9 ° og 29,3 ° C must unngås.
- I stedet velger et antall diskrete nivåer for disse faktorene (tabell 1). Antall nivåer bør matche den forventede basismodellen (trinn 1,2). Dette er bare viktig for optimal design, fordi sentrale kompositt design alltid har diskrete faktor nivåer.
- Tildele om en categoric faktor er nominell, dvs. ingen implisitt rekkefølge (for eksempel ulike produsenter), eller ordens og dermed en diskret numerisk parameter (f.eks forskjellige blader på en plante).
- Velg nivåer for begge typer categoric faktorer. </ Li>
- Velg en nyttig base modell.
- På grunnlag av de innledende eksperimenter og litteratur, forutse forholdet mellom hver faktor og responsen samt faktor interaksjoner og responsen. For eksempel, lineær (jo mer jo bedre), kvadratisk (single optimal eller ikke-lineær økning / reduksjon) eller kubikk (skjev optimal).
- Kontroller at antall nivåer for diskrete numeriske faktorene er n + 1, idet n er det polynomiske grad av forholdet mellom faktor og respons. For eksempel, hvis temperatur forventes å ha en kvadratisk effekt på responsen, n = 2 og således i det minste tre temperaturnivåer bør undersøkes for å oppnå en tilpasning til den kvadratiske virkning.
- Definer brøkdel av utformingen mellomrom (FDS) hvor prediksjon variansen bør være under en viss terskel (alfa-nivå). Den FDS bør være> 0.95 (dekke mer enn 95% av den design plass) for å oppnå modeller som gir robuste forutsigelser i helehele design plass 21-23.
Merk: En terskel på 0,05 tilsvarer en 5% signifikansnivå (type I-feil), og er en typisk verdi. Å øke denne verdien vil redusere antall eksperimenter som kreves for en DoE strategi, men vil samtidig øke sannsynligheten for at betydelige virkninger vil bli savnet og at estimater av deres innvirkning på responsen blir feil.
Tabell 1. Faktorer som påvirker forbigående protein uttrykk i tobakk inkludert variasjonen varierer under DoE. Faktorer i fet skrift ble bare med i design for forsøkene som er beskrevet under "Et beskrivende modell for DsRed akkumulering under gående uttrykk ved hjelp av ulike promoter / 5'UTRs" mens faktorer i kursiv ble bare inkludert i design for "Optimalisere utrugningn forhold og slakte ordninger for produksjon av monoklonale antistoffer i planter ved hjelp av forbigående uttrykk ".
Figur 2. DoE planprosessen. Faktorer med en betydelig innvirkning på responsen under etterforskning er valgt basert på tilgjengelige data. Deretter faktor attributter (f.eks numeriske), komfyrer og nivåer er tildelt. Tidligere kunnskap og eksperimenter blir brukt til å definere en egnet base modell. Den prediktive kraftbehov er definert basert på anvendelsen / formålet av den endelige modell. De sammenstilte data kan da bli overført til passende DoE programvare.
2. Sette opp en RSM i DesignExpert
- Begynn DesignExpert og velg "New Design". I "Response Surface"-vinduet, velger &# 34; Optimal "og angi antall numeriske og categoric faktorer valgt i avsnitt 1.1).
- Oppgi faktor navn, enheter, typer, sub-typer, antall nivåer / nivå grenser og verdier for de nivåer for alle faktorer i de tilhørende feltene.
- Fortsett til neste side og under "Søk" alternativer å velge "Best" samt ønsket "optimalitet" kriteriet, her "D-optimal".
- I "Rediger modell ..."-menyen, velg den modellen som inneholder de faktorer og interaksjoner forventet i avsnitt 1.2). Hvis du er usikker, velg en full modell som dekker alle faktorer og interaksjoner for en viss polynom grad, her "Kvadratiske". Legg merke til at å velge en fullstendig modell (inneholdende alle interaksjoner) kan øke antall eksperimenter kreves for DOE.
- Velg antall "Blocks". Her ble en enkelt blokk som brukes, fordi alle plantene var fra den samme batch, alle bakterier ble dyrket samtidig ogAlle injeksjoner ble foretatt på samme dag av samme operatør. Bruk mer enn ett kvartal hvis mer enn ett parti av planter er brukt eller flere operatører håndtere injeksjoner.
- Balansere design
- Aktiver "Tving categoric balanse" for å fordele kjøringer av eksperimentet jevnt blant de categoric faktor nivåer, for eksempel ulike arrangører som er testet.
Merk: Dette kan redusere optimalitet av design i en grad som DesignExpert vil rapportere som en%-verdi avhengig av valgt av optimalitet algoritmen poeng. - Rekalkulere design flere ganger ved hjelp av den implementerte tilfeldig frø algoritme for å minimere reduksjon i optimalitet.
Merk: tap i optimalitet kan variere fra ~ 3-40% ved hjelp av de samme inngangsdata, men endring kan brukes til å opprettholde categoric balanse antall replikater bli.
- Aktiver "Tving categoric balanse" for å fordele kjøringer av eksperimentet jevnt blant de categoric faktor nivåer, for eksempel ulike arrangører som er testet.
- Programvaren vil foreslå en verdi for antall "Modell poeng" basert på grunnmodellen, Her 70 runs. Juster antall løyper for "Replikater" og "For å estimere mangelen på fit" for å sikre at det er> 5% av antall "Modell poeng" for hver, her 10 runs hver.
- Fortsett til neste side, velg antall svar og skriv navnene deres og enheter. Andre reaksjoner kan også legges til når som helst i løpet av dataanalyse uten noen negativ innvirkning på utformingen.
- Fortsett å starte algoritmen, beregning av faktornivåene for kjøringer av DoE. Hvis det valgte basismodellen ikke stemmer overens med antall nivåer for en bestemt faktor, vil en varsling og beregningen vil ikke starte. I dette tilfelle enten:
- Øke antall nivåer for denne faktor, eller
- Fjern markeringen vilkårene i basismodell som ikke kan beregnes basert på dagens antall nivåer.
- For eksempel, hvis det er to nivåer for den faktor "Inkubasjonstid" t (dvs. 2 d og 5 d) i tHan nåværende utforming og en kvadratisk grunnmodell som uttrykket t 2 ble valgt, enten til et tredje nivå for t (dvs. 8 d) eller fjerner faktor t 2 fra modellen.
- Lagre regnearket som inneholder den optimale faktorkombinasjoner som vises når beregningen er fullført.
- I "Design" node velg "Evaluering" sub-node og gå til "Grafer"-kategorien.
- I "Grafer funksjonen" velg "FDS" og i "FDS Graph" boksen velger "Pred" som feiltypen. Deretter angir minimum påvisbar forskjell i tillegg til den omtrentlige verdi for den anslåtte standardavvik av systemet er definert i avsnitt 1.1.1) som verdiene for "d" og "s" henholdsvis (her 20 og 8 pg / ml for DsRed). Angi det alfa nivå (akseptabel% mangler en betydelig effekt) egnet for programmet, typisk 0,05 (5%).
- Hvis dette ikke er tilfelle (som finnes her, var FDS 1% som vist i figur 3A), gå tilbake til "Design" node og i oppgavelinjen velg "Design Tools" og deretter "Augment Design ..." og velg " Forsterke ".
- Velg de samme "Søk" og kriterier "optimalitet" som før. Valgte også den samme "Edit modellen" og "Tvungen categoric balanse" innstillinger. Hvis utformingen forstørrelse utføres før forsøket (som gjort her), deretter endre "Put går inn i blokk" til "Block1".
- I "Kjører"-delen angir antall ekstra "Modell poeng", opprettholde minst 5% "Replikater" og "For å estimere mangelenav fit "i total design. Her ble 100 flere kjøringer lagt og ingen" Replikater "og" For å estimere manglende passform "ble inkludert.
- Når beregningen er fullført, reexamine FDS graf som beskrevet ovenfor. Hvis den FDS er fortsatt ikke tilfredsstillende, gjenta utforming forstørrelse som beskrevet ovenfor. Her FDS var 100% etter silikonpupper og dermed ikke lenger forstørrelse var nødvendig (Figur 3B).
Figur 3. Sammenligning av FDS tomter. A. Doe bestående av 90 kjøringer gir en utilstrekkelig FDS på bare 1% for standardfeilen for prediksjon, ved hjelp av en kvadratisk grunnmodell i kombinasjon med verdiene for det minimum påviselig forskjell (20 pg / ml) og estiparret standardavvik av systemet (8 ug / ml). B. Augmentation med DOE til totalt 210 løper oppnådd en 100% FDS, og en flat kurve som viser uniform presisjon av modellen gjennom designområde.
Tre. Kloning og analyse av Expression Kassetter
- Dyrke Escherichia coli i 5 ml LB medium (10 g / l trypton, 5 g / l gjærekstrakt, 170 mM NaCl, 50 mg / L ampicillin, for LB-agarplater med 15 g / l agar) ved 37 ° C i 6 -8 time eller over natten på en orbital shaker på 160 rpm. FORSIKTIG: ampicillin er et skadelig stoff. Inokuler LB medium med enten 50 pl av kulturvæsken eller overføre celler fra kolonier dyrket på plater ved hjelp av en pipette.
- For rensing av PSO plasmid DNA, og andre derivater av pPAM (GenBank AY027531), fra E. coli K12 belastning DH5a, følg instruksjonene i DNA rensing kit manuell 24. FORSIKTIG: rensing kdet inneholder skadelige kjemikalier (se ovenfor manual for detaljer). Plasmidet sekvens er beskrevet på figur 4 og av Kjøper et al. 20..
- Bestem DNA-konsentrasjon i den rensede eluatet ved å måle absorbansen av en 2 ul prøve ved 260 nm i et Nanodrop enhet.
- Bekrefte identiteten av det rensede plasmid-DNA ved oppslutning med restriksjonsendonukleaser (RES).
- Velg RES i henhold til plasmid-sekvensen, slik at unike og skjelnes fragmentmønster genereres. I henhold til produsentens anbefalinger for fordøyelsen forhold som reaksjonsvolum, tid, temperatur og konsentrasjon av stabilisatoren bovint serumalbumin. Avhengig av følsomheten av analyseenheten, brukes 50 til 500 ng av plasmid-DNA pr fordøyelsen.
- Forbered 0,8 til 2,0% geler for separasjon av DNA-fragmentene ved koking agarose i Tris-borat-EDTA (TBE)-buffer (90 mM Tris, 90 mM borat, 2 mM EDTA, pH 8,0). THan større de forventede fragmentene bør mindre agarose anvendes i gelen.
- Tilsett 5 ul av fem ganger prøvebuffer (5 x sabu, 0,1% (w / v) bromfenolblått, 0,1% (w / v) xylen cyanol, 10% (w / v) glycerol oppløst i TBE) til 50 pl av den RE-behandlede DNA-prøve, og separere fragmentene ved agarosegel-elektroforese ved 100 V i ~ 40 min eller inntil klar separering av fragmentene er oppnådd. På hver gel, inkluderer et kjørefelt som inneholder DNA stigen størrelse markører for sammenligning, for eksempel 2-3 mL 1-kb stigen.
- Sett på omega 5'UTR i PSO med en av de tre andre 5'UTRs.
- Slipp omega 5'UTR sekvens fra ~ 4 ug renset PSO DNA ved behandling med 20 enheter av Eco RI-HF og Nco I-HF Res i NEBuffer 4 ved 37 ° C i ~ 60 min. Deretter separere fragmentene som beskrevet i avsnitt 3.4.2 og 3.4.3.
- Isoler det større fragmentet (pS, "backbone") fra agarosegel ved å bruke en gel ekstraDette skjer kit i henhold til produsentens håndbok 25 og bestemme konsentrasjonen av renset DNA som beskrevet i kapittel 3.3). FORSIKTIG: gelen utvinning kit inneholder skadelige kjemikalier, se håndboken for detaljer.
- Isoler CHS, CHS-LPH-og TL 5'UTRs fra egnede donor vektorer ved å behandle ~ 10 pg av hver vektor med 20 enheter av Eco RI-HF og Nco I-HF Res i NEBuffer 4 ved 37 ° C i ~ 60 min. Deretter separere fragmentene som beskrevet i avsnitt 3.4.2 og 3.4.3 og rense den mindre 5'UTR-holdige fragment beskrevet i seksjon 3.5.2.
- Ligate de isolerte rensede 5'UTRs i separate delprøver til den isolerte renset lineær pS vektor ved 25 ° C i 5 min i henhold til produsentens anbefalinger 26. Bruk ~ 50 ng av vektor DNA og et tre gangers molart overskudd av 5'UTR DNA i et totalt volum på 20 pl.
- Transformation E coli-celler med the rekombinante plasmider 26,27.
- Legg ~ 10 ng (~ 4-5 mL) av ligation blanding (se avsnitt 3.5.4) til 50 mL RbCl kompetent E. coli og bland forsiktig og inkuberes i 30-60 minutter på is. Termisk sjokk i 1,5 min ved 42 ° C og chill på is i 5-30 min.
- Til 950 mL av antibiotika-fritt LB-medium og inkuberes i 1 time ved 37 ° C og 160 rpm. For valg av transformanter, spres 50 og 100 pl av kulturen på LB agarplater inneholdende ampicillin, og inkuber i ~ 16 til 20 timer ved 37 ° C.
- Vaksinere 5-10 separate kolonier som representerer hver promoter-5'UTR ligation beskrevet i pkt. 3.1 i 5-ml mengder av LB medium som inneholder ampicillin. Deretter rense plasmid DNA og bekrefte sin identitet som beskrevet i pkt. 3.2 til 3.4.
- Bytt ut 35SS arrangøren med nos promoter i hver av de fire 5'UTR plasmider ved hjelp Asc I og Eco RI Res i NEBuffeh 4 ved 37 ° C i 1 time slik det er beskrevet i avsnitt 3.5 og 3.6.
- Introduser hver av de åtte resulterende plasmider inn i A. tumefaciens belastning GV3101: pMP90RK etter elektroporering 28.
- Til ~ 500 ng av renset plasmid DNA til 50 ul kompetente A. tumefaciens celler på is. Bland forsiktig og overfør til en prechilled 0,2 cm electroporation kyvette. Kontroller at blandingen er i bunnen av kyvetten og ikke inneholder bobler.
- Puls celler ved 2,5 kV til 5 msek og bekrefter intensiteten og varigheten av pulsen.
- Unngå høye saltkonsentrasjoner i DNA-prøve eller feil tilberedning av vedkommende A. tumefaciens celler fordi disse kan resultere i høye ione strømmer forårsaker øyeblikkelig fordamping av cellesuspensjonen, noe som reduserer transformasjonen effekt.
- Til 950 mL av YEB medium uten antibiotika (5 g / l oksekjøtt-ekstrakt, 1 g / L gjærekstrakt, 5 g / l peptone, 5 g / L sukrose, 2 mM MgSO 4, pH 7,0), bland forsiktig og overføres umiddelbart til en steril 1,5 ml reaksjonsrør. Inkuber i 2-4 timer ved 26-28 ° C og 160 rpm.
- Spre 1-2 mL på YEB agar plater som inneholder antibiotika (50 mg / L Carbenicillin, 25 mg / L kanamycin, 25 mg / L rifampicin) for valg av transformanter. FORSIKTIG: rifampicin er et giftig stoff.
- Vaksinere tre 5-ml mengder av YEB medium som inneholder antibiotika med celler fra separate kolonier som representerer hver promoter-5'UTR ligation og inkuberes i 48-72 timer ved 26-28 ° C og 160 rpm.
- Bekreft suksessen til A. tumefaciens transformasjon.
- Overføring 2 pl av hver prøve fra avsnitt 3.8.6 for å skille 48 ul alikvoter av PCR Mastermix (2 ul av hver 10 uM primer lager (400 nM endelig konsentrasjon av hver primer),1 pl 10 mM dNTP blanding (200 pM endelig konsentrasjon av hvert deoxynucleosid trifosfat), 5 pl 10 ganger Expand High Fidelity-buffer med 15 mM MgCl 2, 0,75 mL Expand High Fidelity enzymblandingen, og 39,25 pl sterilt, destillert vann).
- Forsterke ekspresjonskassett av hvert plasmid ved hjelp av egnede primere (FWD: 5'-CCT CAG GAA GAG CAA TAC-3 ', binding 1026 nukleotider oppstrøms for promotoren; REV: 5'-CCA AAG CGA GTA CAC AAC-3', bindende innenfor 35S polyadenyleringssetet) under egnede PCR-forhold. Her ble det 94 ° C brukes for innledende denaturering, etterfulgt av 30 sykluser av 94 ° C denaturering i 15 sekunder, 51 ° C annealing i 30 sekunder og 72 ° C bruddforlengelse på 120 sekunder og en sluttforlengelse trinn ved 72 ° C i 8 min.
- Bestem størrelsen på PCR produktene etter agarosegelelektroforese som beskrevet i kapittel 3.4.3.
- Forbered A. tumefaciens glyserol aksjer etterå blande 500 pl 50% (v / v) steril glycerol med 500 pl av A. tumefaciens kulturer fra avsnitt 3.8.6 som transformasjon har blitt bekreftet (avsnitt 3.9.3). Oppbevar glyserol aksjer ved -80 ° C inntil videre bruk.
- Beregn brette energiene til de forskjellige mRNA ved hjelp av RNAfold webserver 29 og omfatter nukleotidsekvensen fra transkripsjonsstartsetet gjennom til de første 50 bp av den kodende regionen.
- I "Fold algoritmer og grunnleggende alternativer"-delen velger du "minimum fri energi (MFE) og partisjonsfunksjonen" og "unngå isolerte basepar" alternativer.
- I "Avanserte falsing" velger "dingler energier på begge sider av en helix i alle fall", "RNA parametere (Turner modell, 2004)" og endre "skalere energi parametere til gitt temperatur (C)" til 25 ° C.
- I "Output options" seksjonen velger alle alternativene.
Fig. 4. Promotoren og 5'-UTR-varianter. De ekspresjonskassetter ble samlet ved trinnvis utskiftning av 5'UTR, noe som resulterer i fire kombinasjoner med CaMV 35SS promoter, fulgt av erstatning av denne promoter med nos-sekvens som gir fire ytterligere varianter og totalt åtte forskjellige promoter / 5'UTR kombinasjoner.
4. Plant Dyrking
- Forbered en 0,1% løsning av gjødsel FertyTo mega i deionisert vann ved pH 5,9.
- Forbered 10 x 10 x 8 cm rockwool blokker av omfattende spyling med avionisert vann for å fjerne rester av kjemikalier og til slutt stabilisere seg med gjødsel.
- Seed tobakksplanter ved å plassere 1-2 tobakk frø på hver rockwool blokk etterfulgt av en kort flukt med gjødsel å være nøye med å unngå å vaske frøene unna.
- Spire og dyrke tobakksplanter for 42 dager i et drivhus på 25/22 ° C dag / natt temperatur, 70% relativ luftfuktighet og en 16-timers daglengde (180 mmol sek -1 m -2; λ = 400-700 nm) . I løpet av denne fotoperiode, vanne med gjødsel for 15 minutter hver time i hydroponic kultur.
5. Forbigående Protein Expression
- Forbered A. tumefaciens for injeksjon i blader.
- Vaksinere 5-50 ml YEB medium som inneholder antibiotika med en% A. tumefaciens cryo-lager kultur og inkuberes ved 27 ° C til OD <sub> 600nm når 5,0 (~ 48-72 timer, avhengig av mengde og type fartøy).
- Fortynne A. tumefaciens kulturen med vann og to ganger infiltrasjon medium (4,3 g / L Murashige-og Skoog-salter (pH 5,6), 5 g / l sakkarose, 1,8 g / L glukose, 100 mM acetosyringone) for å passe OD 600nm som kreves for injeksjon. Bekreft OD 600nm like før injeksjon. Merk: En OD 600nm på 1,0 tilsvarer ~ 1,43 ± 0,12 x 10 9 kolonidannende enheter per ml.
- Injisere A. tumefaciens suspensjon i blader.
- Merk og merke noncotyledon bladene og posisjoner derpå å bli behandlet (for eksempel i henhold til en doe-strategi).
- Må ikke injiseres annerledes A. tumefaciens løsninger i det samme feltet interkostalrom. I stedet bruker motstående seksjoner på hver side av midt-vene akse. Hvis mer enn to forskjellige løsninger må injiseres ved den samme posisjon bruke en additional anlegget.
- Grundig riste A. tumefaciens løsning å resuspendere eventuelle celler som kan ha avgjort siden forbereder fortynning og aspirer til en 1-ml sprøyte.
- Forsiktig skrape epidermis ved posisjonen beregnet for injeksjon med en pipette tips eller lignende for å lette tilstrømningen av A. tumefaciens løsning. Unngå sprekker bladet bladet mens du gjør det.
- Hold sprøyten vinkelrett på bladet bladet berører sylinderen mot interkostalrom feltet som skal behandles og skyv utløpet (uten nål festet) på den nedre side av bladet. Trykk på oversiden av bladet lett ved samtidig å hindre at bladet bladet fra å forflytte seg eller sprekker.
- Trykk forsiktig ned sprøytestempelet. Den A. tumefaciens løsningen vil angi de intercellulære mellomrom innenfor bladet bladet som indikert av de behandlede områder som opptrer mørkere grønn og fuktig. Gjenta denne prosedyren på flere posisjoner inntil hele intercostal-feltet er infiltrert med A. tumefaciens. Deretter fortsetter du med neste interkostalrom feltet.
- Sørg for at sprøyten forblir vinkelrett på bladet. Helning på sprøyten vil føre til bakteriesuspensjonen for å sprute ut under høyt trykk.
- Dersom annet A. tumefaciens løsninger (for eksempel for å teste forskjellige arrangører) som brukes, fjern overflødig oppløsning igjen på undersiden av bladet fra første injeksjon ved hjelp av et papirhåndkle eller lignende før du påfører neste løsning.
- Post-infiltrasjon inkubering av planter og prøvetaking.
- Forbered en phytotron for de behandlede plantene ~ 24 timer før injeksjon for å tillate temperatur og luftfuktighet vektutjevning på de nivåene som kreves for DoE.
- Etter injeksjon, overfører planter i phytotron og plassere dem i skuffer som er store nok til vanning med vann inntil slutten av inkubasjonstiden bestemt av DOE.
- Etablere en 16 timers photoperiod bruker seks Osram kjølig hvitt 36 W lysrør pr 0,7 m 2 (75 mmol sek -1 m -2; λ = 400-700 nm). Forhindre plantene fra skygge hverandre ved å begrense antall planter til seks per 0,7 m 2.
- Før prøvetaking, sørg for riktig interkostalrom-feltet er valgt ved å sammenligne etiketten lagt i avsnitt 5.2.1 og DoE plan.
- Bruk en kork borer for å fjerne 4-5 blad plater fra de behandlede interkostalrom feltene ved posisjoner og tider angitt av DoE. Ikke fjern hele blad fra planten under prøvetaking. Stabilisere blad med en håndholdt papirhåndkle mens fjerne platene for å hindre brudd.
- Bestem massen til hver prøve og plassere den i et 1,5 ml plast reaksjonsrøret som er merket med navn og prøvemassen. Oppbevar prøvene ved -20 ° C eller -80 ° C før protein kvantifisering. Fremgangsmåten kan bli stanset på dette stadiet i flere måneder avhengig av prøvens stabilitetog lagringstemperatur.
6. Protein Kvanitifisering
- Utdrag proteiner fra prøvene Leaf plate.
- Tilsett 3 ml ekstraksjons-buffer (50 mM natriumfosfat, 500 mM natriumklorid, pH 8,0) per mg av prøvemassen og slipe blad plater i reaksjonsrøret ved hjelp av en elektrisk pistill inntil det ikke noen store fragmenter forblir. Unngå overoppheting av prøven.
- Fjern dispergerte faste stoffer ved sentrifugering av prøven to ganger ved 16 000 xg i 20 min ved 4 ° C. Overfør supernatanten til et rent 1,5 ml reaksjonsrøret etter hvert trinn uten å forstyrre pelleten.
- Etter sentrifugering, kan prosessen stanset ved å fryse den plante-ekstrakter ved -20 ° C eller -80 ° C i flere måneder avhengig av prøve stabilitet og lagringstemperatur. Bekrefte at en fryse-tine syklus ikke påvirker konsentrasjonen av målproteinet (e).
- Mål DsRed fluorescens.
- Forbered tre tekniske replikater av hver prøve i svart 96-brønners halv-området plater (50 mL ekstrakt per brønn). Unngå dannelse av bobler under pipettering.
- Bruke et sett med seks fortynninger (0, 25, 75, 125, 175 og 225 mikrogram / ml) av en DsRed standard per 96-brønners plate for å generere en liner referansekurve. Klargjør fortynninger i PBS og lagres ved 4 ° C til bruk i løpet av 3 måneder.
- Mål fluorescens to ganger, sekvensielt, i en 96-brønn plate-leser utstyrt med 530/25 nm eksitasjon og 590/35 nm emisjonsfiltre.
- For hver prøve, gjennomsnittlig fluorescens over to leser og de tre tekniske replikater og trekke fra verdien som er registrert for den tomme kontroll inneholder 0 mg / ml DsRed. Også subtrahere denne verdi fra den leser av standard fortynninger og bruke disse tomme-korrigerte verdier for en lineær regresjon gir en referansekurve (gjennom opprinnelsen til koordinatene).
- Bruk skråningen av referansekurven for å konvertere fluorescence målt for prøvene i DsRed konsentrasjoner. Hvis det er nødvendig, fortynne prøvene slik at avlesning faller innenfor konsentrasjonsintervallet av standardene og vurdere dette fortynning faktor i påfølgende beregninger.
- Bestem konsentrasjonen av 2G12.
- Tilbered en overflate-plasmonresonans (SPR) anordning for måling av antistoffkonsentrasjon ved kobling av protein A på den aktiverte overflaten av en strømningscelle. Bruk en annen strømningscelle som referanse ved å inaktivere overflaten uten kopling av protein A 30,31.
- Fortynn planteekstrakter 1:20 i SPR rennende buffer (10 mM HEPES pH 7,4, 3 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,05% v / v Tween-20) og måle responsen heter (RU) av antistoff-binding til protein A i tre tekniske replikater av hver prøve ved slutten av en 90 ul injeksjon (180 sek ved 30 mL / min). Trekk fra RU målt på referansestrømningscellen (ingen Protein A) fra RU målt i den eksperimentelle flow celle (Protein En overflate).
- Mål en 585 ng / ml 2G12 standard etter hver 10-15 prøver og trekke fra verdien målt i referanse flyt celler som beskrevet ovenfor. Bruk den gjennomsnittlige RU av disse standardene for å beregne en lineær referansekurve gjennom opprinnelsen til koordinatene.
- Beregn 2G12 konsentrasjonene i prøvene basert på 1:20 fortynning, og helningen av referansekurven.
- Kontroller for sterke ikke-spesifikk binding til referansecellen, noe som kan ødelegge målingen. Også sjekke hvorvidt 2G12 standardene opprettholde tilnærmet konstante verdier (<5% variasjon) i hele analysen, da større variasjon skyldes aldring av Protein A overflate.
7. Dataanalyse og evaluering
- Manuelt analysere svarene observert i uttrykket eksperimenter for (i) ekstreme verdier (høye eller lave) som indikerer målefeil, (ii) uvanlige resultater, f.eks faktorkombinasjoner som genetrangere uventede reaksjoner indikerer datautveksling, og (iii) manglende verdier.
Merk: Bruk disse handlingene for å forhindre modellbygging basert på feilaktige data. - Overfør de analyserte responsdata (her protein konsentrasjoner) inn i "Design" node av DesignExpert. Sørg for at responsdata er korrekt tildelt tilsvarende innstillinger faktor. Det er et omfattende hjelpe delen tilgjengelig i DesignExpert programvare som dekker aspekter omtalt nedenfor.
- I "Analyse" node, velger responsen som skal analyseres, og i utgangspunktet velge "none" i kategorien transformasjon.
Merk: en transformasjon er anbefalt for min / maks prosenter av responsen større enn 10. Den mest nyttige transformasjon kan fås fra Box-Cox-tomten i "Diagnostics" kategorien i "Diagnostics"-delen av "verktøy Diagnostics" beskrevet nedenfor (pkt. 7.8). Log 10 transformasjon er ofte hensiktsmessig. - I "modell"-kategorien, er en første modell forhåndsvalgt basert på "Fit Sammendrag" resultater. Bruk automatisert modus for å redigere denne modellen:
- Velg en "Process order" som er en ordre over det foreslåtte modellen, for eksempel hvis den foreslåtte modellen er "2FI" (to-faktor samspill) velg deretter "Kvadratisk".
- Velg "bakover" i "Selection"-feltet, som vil iterativt fjerne betydnigsløst vilkår fra modellen etter går videre til "ANOVA" fanen basert på "Alpha out" verdi som i utgangspunktet skal være 0.100.
- Hvis spurt av programvaren, alltid automatisk korrigere modellen hierarkiet fordi dette er nødveny å generere pålitelige modeller 32,33.
- I "ANOVA"-kategorien, undersøke den foreslåtte modellen og de inkluderte faktorene. Hvis det er nødvendig, manuelt fjerne alle faktorer med p-verdier over et forhåndsdefinert terskel (her 0,05, tilsvarende en 5% signifikansnivå) eller de som er lite sannsynlig basert på mekanistisk betraktning ved å bytte tilbake til "Model"-kategorien, endre "Selection" "Manuell" og eliminere de riktige faktorene fra modell.
- Tilbake i "ANOVA"-kategorien, evaluere den oppdaterte modellen i form av p-verdien av "modell" (en lav verdi er ønskelig fordi dette indikerer betydning) og "Lack-of-fit" (en høy verdi er ønskelig fordi dette indikerer mangel på betydning), så vel som verdiene for "R-squared", "Justert R-squared" og "Forutsagt R-squared" (verdier> 0,80 er ønskelig for alle de tre verdier).
- Sammenlign disse verdiene for ulike modeller, inkludert / unntatt faktorer på flere betydning nivåer.
OBS: det kan være nyttig å kopiere responsen kolonnen i "Design" node og utføre hver analyse individuelt, eller å eksportere hele "ANOVA" tabellen inn i et annet program, for eksempel et regneark.
- Sammenlign disse verdiene for ulike modeller, inkludert / unntatt faktorer på flere betydning nivåer.
- Fortsett til "Diagnostics" fanen for å bekrefte kvaliteten på modellen og oppdage potensielle rammer i datasettet som har en sterk innflytelse på modellen ved å undersøke alle kategoriene i "Diagnostics Tool" ("Diagnose" og "Influence"-seksjon) .
- I "Diagnostics"-delen av "verktøy Diagnostics", utføre følgende handlinger:
- Sørg punktene er tilfeldig spredt innenfor grensene i "Rester vs Predicted" diagram. Her indikerer en vinkelformet fordelings et behov for datatransformasjon.
- Sørg punktene er tilfeldig spredt innenfor grensene i"Rester vs Predicted" diagram. Her indikerer en vinkelformet fordelings et behov for datatransformasjon.
- Undersøk om punktene i "Rester vs run" diagram scatter tilfeldig innenfor grensene. Et mønster (for eksempel "trapp") indikerer en trend i datablokken, og bygningen kan brukes til å motvirke dens innflytelse på modellen.
- Se etter en rett diagonal linje som angir den ideelle modellen i "Predicted kontra faktisk" plot. Jo større spredning av data rundt diagonalen, jo mindre nøyaktige modellen.
- Se etter en overlapping av det blå (best) og grønn (faktiske) vertikale linjer i Box-Cox-plott som viser data transformasjon. Hvis den grønne linjen ikke samsvarer med den blå (utenfor intervallet er angitt med røde vertikale linjer) gå tilbake til pkt. 7.3 og forbedre modellbygging runde ved å velge data transformasjon foreslått av Box-Cox-plot. Igjen duplisering av rerespons kolonnen kan være nyttig å sammenligne ulike modeller.
- Sørg for at punktene i "Rester vs Factor" diagrammer (det er ett diagram for hver modell faktor) spre tilfeldig innenfor grensene. Krumning i datafordeling kan indikere en faktor som mangler i modellen.
- I "Influence"-delen av "verktøy Diagnostics", sørge for at det er tilfeldig spredning av data innenfor grensene i "Eksternt studentized rester", "utnytte", "DFFITS" og "DFBETAS" plott og jevnt lav distribusjon uten ekstremverdier i "Cooks Distance" tomt.
- I "Diagnostics"-delen av "verktøy Diagnostics", utføre følgende handlinger:
- I "Modell grafer"-kategorien, visualisere evaluert modellen. For et begrenset antall numeriske faktorer (f.eks tre) responsflaten ("3D overflate") representasjon er nyttig for å vurdere optima / karakteristika manuelt.
Merk: responsflater bare illustrere effekten av to factorer på responsen under etterforskning. Effekten av eventuelle ytterligere faktor på responsen er avslørt ved å endre sin verdi (numeriske faktorer) eller nivå (categoric faktorer) i "Faktorer funksjonen"-vinduet. Alternativt, kan faktorer bli tildelt tomten aksen ved å høyreklikke på dem i "Faktorer funksjonen"-vinduet og velge ønsket uavhengige variabelen aksen.- Manipulere faktornivåer og tildele dem til grafen koordinatene ved hjelp av "Faktorer verktøyet".
- Eksport grafer ved hjelp av "Export grafen til fil ..." kommandoen i "Fil"-kategorien.
- Bruk "Numerisk" sub-node i "optimalisering" node for å optimalisere responsen numerisk (minimer, maksimer, i utvalg), avhengig av modell faktorer, som i sin tur visse begrensninger kan brukes (f.eks grenser og vekter) via "Kriterier"-kategorien.
- Beregn og undersøke numeriske løsninger i "Solutions"Kategorien basert på innspill gitt i "Kriterier"-kategorien.
- Eksportere disse løsningene til annen programvare (f.eks regneark) for videre analyse (f.eks histogrammer) avslørende faktor innstillinger forbundet med høye eller lave grenseverdier.
Merk: Dette er nyttig hvis mer enn tre numeriske faktorer er undersøkt og 3D-representasjon er vanskelig.
- Bruk "Point prediksjon" sub-node å forutsi responsen for spesifikke faktor innstillinger.
- Bruk denne spådommen for alle innstillinger som skal evalueres (her, all arrangøren og 5'UTR kombinasjoner samt alle blader og inkubasjonstidene eller blad posisjoner og inkubasjonstemperaturer).
- Export de anslåtte verdier og samle dem til en dataoppstilling som kan brukes for å beskrive transient ekspresjon i tobakksplanter, for eksempel ved å beregne et uttrykk for en spesifikk promoter-5'UTR kombinasjon på et bestemt tidspunkt i gjennomsnitt over alle bladstillinger eller akross alle bladene av en plante.
- Normalisere uttrykket data basert på massene av de forskjellige bladene til å vike den spesifikke uttrykk nivå (mikrogram g -1) eller spesifikke uttrykk rente (mikrogram g -1 hr -1).
- Alternativt eksportere koeffisientene "den endelige ligning" fra bunnen av "ANOVA" tab til et regneark og multiplisere dem med en matrise av faktor innstillinger for å gi det samme data array.
Merk: denne tabellen kan bare inneholde faktorverdier fra innenfor den innledende design plass, fordi den tilpassede modellen ligningen ikke er egnet for ekstrapolering.
- Gjennomføre en bekreftelse eksperiment for modell punkter som er av stor interesse.
- Utfør forbigående protein uttrykk under betingelser som er valgt for "Point prediksjon" (pkt. 7.11). Eg bruker de samme temperaturer og blader etc.
- Bestem proteinkonsentrasjonen for transient ekspresjon eXperiment som beskrevet ovenfor (§ 6) og sammenligne dem med de verdiene spådd av modellen.
- Sjekk om den gjennomsnittlige proteinkonsentrasjonen i bekreftelses eksperiment faller innenfor respons overflaten modellens prediksjonsintervall innhentet under punkt prediksjon. En kamp bekrefter prediktiv kraft av modellen. En mismatch indikerer kan bli pålagt en lav modell kvalitet og flere løyper.
- Merk: plante batch-til-batch variasjon utvider prediksjonsintervall og kan devaluere bekreftelses eksperimenter utført med en annen gruppe med planter. Imidlertid kan prøver som ikke ble brukt til å generere den modellen, men som stammer fra den samme planten batch som prøvene inneholdt i modellen tjene som effektive kontroller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et beskrivende modell for DsRed akkumulering under gående uttrykk ved hjelp av ulike arrangører og 5'UTRs
DsRed fluorescens i blad ekstrakter ble anvendt til å indikere nivået av ekspresjon av rekombinant protein og således ble brukt som respons i DoE strategi. Den minste påvisbare forskjellen vi betraktet som relevant var 20 pg / ml, og den anslåtte standardavvik i systemet var 8 mg / ml basert på innledende forsøk. Faktorer som inngår i gående uttrykk modellen ble valgt basert på litteraturdata 7,8 og våre tidligere resultater 9. De undersøkte serier ble også velges i henhold til disse data (tabell 1). Minst tre nivåer ble valgt for alle diskrete numeriske faktorene til å tillate beregning av en kvadratisk grunnmodell. En D-optimal utvalg algoritme ble valgt for valg av DoE går å få de mest nøyaktige anslag forkoeffisientene regresjonsmodellen. Utformingen opprinnelig foreslått av DesignExpert besto av 90 løper men FDS var utilstrekkelig til å oppnå en 1% standard prediksjonsfeil (figur 3A). D-optimal styrking av designet til totalt 210 løper løst dette problemet, og resulterte i et FDS på 100% med mer ensartet prediksjonsnøyaktigheten over design plass angitt med den flate kurven (figur 3B).
De DsRed konsentrasjonene ble bestemt for alle 210 runs og dataene ble Logg ti forvandlet. Modell faktorer ble valgt av automatiserte bakover utvalg fra en kubisk modell med en alfa nivå av 0.100. Dette resulterte i en signifikant modell (tabell 2) med ubetydelige mangel-of-fit og høye verdier for flere korrelasjonskoeffisienter (tabell 2). Den p-verdien av alle modell faktorer var <0,05, og dermed ikke lenger manuell manipulering av modellen var nødvendig. Modellen inneholdttre-faktor interaksjoner som ikke var en del av den innledende kvadratisk grunnmodellen (tabell 2). Re-evaluering av FDS grafen ved hjelp av alle faktorer som inngår i den endelige prediksjonsmodell avslørte at FDS for standardfeilen for prediksjon ikke hadde signifikant redusert ved å inkludere ytterligere tre-faktor interaksjoner (FDS = 0,99).
De modell kvalitet diagnostiske verktøy i DesignExpert indikerte at datatransformasjonen var nyttige, og det var ingen manglende forhold i modellen fordi den normale plott av restprodukter viste lineær oppførsel og ingen bestemt mønster ble observert i residualene g. predikert plottet (figur 5A og 5B ). Det var heller ingen utvikling i løpet av forsøket for å indikere en skjult tidsavhengig variabel (figur 5C). I stedet, de modellprediksjoner var i meget god avtale med den observerte DsRed fluorescens (figur 5D). Vi there antok at den valgte modellen var nyttig å forutsi gående uttrykk av DsRed i ikke-cotyledon tobakk blader drevet av forskjellig promoter / 5'UTR kombinasjoner i løpet av en post-infiltrasjon inkubasjonstiden varer åtte dager. Vi har også valgt en kunstig lineær regresjonsmodell uten datatransformasjon for å illustrere konsekvensene av feil faktor seleksjon og transformasjon (figur 6). Åpenbart normal plott av restprodukter avviker fra den forventede lineær oppførsel (figur 6A), og det er en "V"-formet mønster i restene g. sies plottet i stedet for en tilfeldig spredning (figur 6B). I tillegg fremhever residualene vs løp tomten to ekstreme verdier (figur 6C), mens spådommer er dårlig for begge, små og høye verdier, avviker fra den optimale modellen (diagonalt) (Figur 6D).
De 5'UTR kombinasjoner med CaMV 35SS promoter resultert i sterkere DsRed uttrykk enn kombinasjoner med nos promoter (figur 5A og 5B) som tidligere rapportert 34 og de tilsvarende faktorer ble funnet å være av betydning i DoE-modellen (tabell 2). Modellen har også spådd at blad alder var en betydelig faktor (tabell 2) med uttrykk nivåer vist å være høyere hos unge blader (figur 7B og 7D) som var i god overensstemmelse med våre tidligere funn 19 og andres 7,8. Progresjon av DsRed akkumulering i bladene var ikke lineær eller eksponentiell men fulgte en sigmoidal kurve i løpet av de åtte dagene etter infiltrasjon inkubasjon i henhold til modellen. Interessant nok var det ingen fast rekkefølge av de 5'UTRs i form av tilsvarende DsRed ekspresjon. Derfor "styrken" av et 5'UTR var avhengig av den tilhørende promoter. Det er lite trolig at denneavhengighet mellom promotoren og 5'UTR ville blitt avdekket ved hjelp av en OFAT eksperiment. Den prediktive modellen indikerte også at enkelte par av arrangøren / 5'UTR kombinasjoner (f.eks. CaMV 35SS/CHS og NOS / CHS (7A og 7B), CaMV 35SS/omega og nos / CHS eller CaMV 35SS/CHS og CaMV 35SS / TL) resulterte i en balansert uttrykk nivåer, avviker med mindre enn 30% fra ytelsesforhold på tvers av alle blader og inkubasjonstidene> 2 dager (f.eks. for CaMV 35SS/omega og nos / CHS forholdet var ~ 8,0) 20. Slike balansert uttrykk ville være nyttig for uttrykket av multimere proteiner som IgA med en definert støkiometri 35,36.
Figur 5. Graphical evaluering av modellkvalitet. A. Den normale sannsynlighetsplott av de internt studentized residualene tyder på normal distribusjon fordi residualene følger en linje. B. Internt studentized rester spre rundt verdien null for alle områder av den anslåtte respons (fluorescens) som indikerer en passende data transformasjon. C. Internt studentized restene sprede rundt verdien null gjennom hele løpet av forsøket, som viser fravær av skjulte tidsmessige effekter. D. Spådd og faktiske verdier av responsen er i god avtale som alle punktene ligger nær diagonalen (ideell modell).
Figur 6. Diagnostics indikerer lav modellkvalitet. A B. Internt studentized residualene viser en "V"-formet fordeling som indikerer en upassende datatransformasjon. C. Internt studentized residualer sprede ikke rundt verdien null under hele løpet av eksperimentet, men utviser en tendens mot positive verdier. I tillegg kan to ekstreme verdier funnet. D. Spådd og faktiske verdier av responsen er i dårlig avtale som de fleste punkter avviker fra diagonalen (ideell modell).
Figur 7. Response overflater for forbigående DsRed uttrykk i tobakksblader. A . trong> nos / CHS i blad 2, B. CaMV 35SS/CHS i blad 2, C. CaMV 35SS/TL i blad 6; D. CaMV 35SS/CHS i blad seks. DsRed konsentrasjonene økte i en sigmoidal måte i løpet av inkubasjonsperioden. Expression nivåene var lavere hos gamle blader (f.eks blad 2 i A-og B) sammenlignet med unge blader (f.eks blad 6 i C og D), og for nos (A) i forhold til CaMV 35SS promoter (B). Den 5'UTR også hatt en betydelig innvirkning på DsRed uttrykk (f.eks TL (C) vs CHS (D)), men uttrykket styrke var avhengig av den medfølgende arrangøren.
| Source | Sum av kvadrater | "> DfMean square | F-verdi | p-verdi | |
| Modell | 174,85 | 95 | 1,84 | 182,12 | <0.0001 |
| Posisjon på blad (A) | 0,16 | 1 | 0,16 | 16.06 | 0.0001 |
| Inkubasjonstid (B) | 112,46 | 1 | 112,46 | 11128,22 | <0.0001 |
| Blad alder (C) | 15.24 | 7 | 2,18 | 215,39 | <0.0001 |
| Promoter (D) | 23.49 | 1 | 23.49 | 2324.29 | <0.0001 |
| 5'UTR (E) | 0,93 | 3 | 0,31 | 30.61 | <0.0001 |
| AC | 0,24 | 7 | 0.034 | 3,38 | 0,0026 |
| BC | 1,46 | 7 | 0,21 | 20.64 | <0.0001 |
| BD | 2,27 | 1 | 2,27 | 224,51 | <0.0001 |
| BE | 0,87 | 3 | 0,29 | 28.74 | <0.0001 |
| CD | 0,29 | 7 | 0.042 | 4,11 | 0.0005 |
| CE | 0,43 | 21 | 0.021 | 2,04 | 0,0093 |
| DE | 0,48 | 3 | 0,16 | 15.73 | <0.0001 |
| B2 | 6.34 | 1 | 6.34 | 627,29 | <0.0001 |
| BCD | 0,95 | 7 | 0,14 | 13.42 | <0.0001 |
| BCE | 0,39 | 21 | 0.019 | | 0,0230 | |
| BDE | 0,16 | 3 | 0.054 | 5.37 | 0,0017 |
| B2D | 1,49 | 1 | 1,49 | 147,93 | <0.0001 |
| Residual | 1,15 | 114 | 0.010 | ||
| Mangel-of-fit | 1,08 | 104 | 0.010 | 1,45 | 0,2669 |
| Pure feil | 0.072 | 10 | 7.153E-003 | ||
| Korrelasjon total | 176,01 | 209 | |||
| Korrelasjonskoeffisienter | Verdi | ||||
| R-Squared | 0,9935 | ||||
| Justert R-Squared | 0,9880 | ||||
| Spådd R-Squared | 0,9770 |
Tabell 2. Faktorer som inngår i den prediktivemodell for forbigående DsRed uttrykk i tobakksblader ved hjelp av ulike promoter / 5 'UTR kombinasjoner. Tre-faktor interaksjoner er markert med fet skrift.
Optimalisere inkuberingsforhold og høste ordninger for produksjon av monoklonale antistoffer i planter ved forbigående uttrykk
Den DoE tilnærmingen ble også brukt til å optimalisere inkubasjonstemperaturen, bakteriell OD600nm for blad infiltrasjon, anlegg alder og slakte ordninger, for samtidig produksjon av monoklonale HIV-nøytraliserende antistoff 2G12 og DsRed i tobakks 19. Innhøstingen ordningen bestemt hvilke blader ble brukt for protein utvinning, for eksempel de seks øverste bladene. Vi har derfor etablert en prediktiv modell for uttrykket av hvert protein (2G12 og DsRed) i planter på ulike aldre (unge = tidlig knopp scenen = innhøsting på 40 dager etter såing, gamle = moden knopp scenen = innhøsting på 47 dager etter seding). Disse fire modellene ble deretter evaluert og en konsensus modellen etablert som inkluderte hver faktor funnet å være av betydning i de enkelte modellene. Vi bekreftet at konsensus-modellen var fremdeles en god representasjon av alle opprinnelige datasett (tabell 3). Konsensus-modellen ble så brukt for å identifisere optimale inkubasjonstemperaturer (~ 22 ° C i 2G12 og ~ 25 ° C i DsRed) og bakteriell OD 600nm (~ 1,0) for begge proteiner. Disse optimale forhold ble deretter brukt til å forutsi protein-konsentrasjoner i alle blader (1-8) og bladstillingene (1-4) hos unge og gamle planter. Konsentrasjons profiler ble integrert med biomassedata 19 for å gi den absolutte mengden av target-proteiner oppnådd fra forskjellige blader og plante aldre (figur 8A). Absolutte protein beløp ble deretter korrelert med tilhørende nedstrømskostnader tillater oss en kost-nytte-analyse for å utføre for behandlingen av hvert blad / plante alder. Denne viste atunge plantene var fordelaktig for gående uttrykk fordi proteinene nådd høyere konsentrasjoner i løpet av kortere vekstperioder til tross for lavere totale biomassen i forhold til gamle planter (Tall 8B og 8C). Vi fant også at behandlingen av alle bladene fra gamle planter var dyrere enn å forkaste blader 1-3 og øke antall planter per batch stedet (figur 8D). Derfor DOE-baserte modeller er egnet ikke bare for å markere det siste trinnet i et eksperiment, men også for kombinasjon med andre data for å lette mer kompliserte deler av prosessanalyse. En serie av sammenkoblede modeller som dekker hele produksjonsprosessen for en biofarmasøytisk protein kan være det endelige mål.
Figur 8. Integrat ion av biomasse og protein konsentrasjons data resulterer i absolutte proteinmengde og prosesskostnader. A. Leaf biomasse og target proteinkonsentrasjon utviklet seg ikke i en kollineære måte som resulterer i en forspent akkumulering av 2G12 hos unge blader. B. Samme mengde DsRed og ~ 65% av 2G12 ble funnet i unge planter i forhold til gamle til tross for en ~ 50% lavere gjennomsnittlig biomasse. C. Dette gjenspeilte høyere spesifikk protein uttrykk i unge planter. D. Den økte spesifikke uttrykk oversatt til reduserte produksjonskostnader for både proteiner, fordi mindre biomasse som trengs for å bli behandlet som krever mindre drivhus plass, færre forbruksartikler (f.eks. Filtre), og mindre nedstrøms utstyr.
| 40 | 47 | |||||||
| Target protein [-] | DsRed | 2G12 | DsRed | 2G12 | ||||
| Modell [-] | Initial | Konsensus | Initial | Konsensus | Initial | Konsensus | Initial | Konsensus | R-squared [-] | 0,9829 | 0,9577 | 0,9321 | 0,9099 | 0,9436 | 0,9403 | 0,8826 | 0,8782 |
| Justert R-squared [-] | 0,9711 | 0,9480 | 0,9059 | 0,8893 | 0,9362 | 0,9350 | 0,8716 | 0,8674 |
| Spådd R-squared [-] | 0,9510 | 0,9336 | 0,8272 | 0,8587 | 0,9254 | 0,9282 | 0,8554 | 0,8516 |
Tabell 3. Sammenligning av korrelasjonskoeffisienter for første RSM modeller og den endelige konsensus modell av DsRed og 2G12 uttrykk i tobakksplanter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hvert eksperiment krever nøye planlegging fordi ressursene er ofte knappe og dyre. Dette er spesielt sant for DoE strategier fordi feil i planleggingsfasen (f.eks velge en grunnmodell som ikke dekker alle vesentlige faktor interaksjoner) kan ha stor negativ prediktiv kraft av modellene og dermed devaluere hele eksperimentet. Imidlertid, kan disse feilene lett unngås ved å følge vanlige fremgangsmåter.
Hensyn under DoE planlegging
For det første er det viktig å velge en respons som er egnet til å vurdere resultatet (positiv eller negativ) for hver DoE løp. For eksempel: konsentrasjonen av et målprotein bestemt ved UV-absorpsjon 37 er nyttig for å vurdere aktiviteten av en viss promoter / 5'UTR kombinasjon. Imidlertid funksjonell vurdering av et protein (f.eks. Med fluorescens i tilfelle av DsRed eller binding til protein A i case av 2G12) er enda bedre fordi det inkluderer også en proteinkvalitet aspekt. Responser kan også være beregnet fra to eller flere separate parametre, slik som strømnummeret NP i gjæringsforsøk (beregnet fra inngangseffekt, rotasjonshastighet og røre diameter). Reaksjonen bør gi verdier med høy nøyaktighet (dvs. lavt standardavvik) og nøyaktighet (dvs. null eller noen få parametre interfererende) for å bedre kvaliteten av modellen. Egnede detektorer og fremgangsmåter må derfor optimaliseres før eksperimentet om nødvendig.
Faktorer som påvirker responsen må identifiseres før DoE gjennomføres fordi RSM blir brukt til å bestemme den nøyaktige virkning av faktorene og ikke å velge dem. Utvalget av faktorer med en betydelig innflytelse på responsen kan oppnås ved å studere litteraturdata, men full eller delvis faktorielle DoE strategier er mer effektive. Disse screening eksperimenter børogså brukes for å bestemme et område for hver faktor innen hvilke meningsfulle resultater kan oppnås, for eksempel i biologiske systemer faktoren "temperatur" er ofte begrenset til området 10-40 ° C. Diskrete nivåer bør da defineres innenfor disse områdene for numeriske faktorer som er teknisk vanskelig å kontrollere, f.eks phytotron temperaturer har en toleranse på ± 2,0 ° C, så det er upassende å undersøke temperaturforskjeller på ± 1,0 ° C. Praktiske begrensninger kan også komme inn i bildet, for eksempel ved hjelp av> 25 ulike konsentrasjoner av en spesiell forbindelse. Imidlertid må antall nivåer være minst en større enn det forventede polynom orden som faktor i grunnmodellen, for eksempel hvis det polynomiske rekkefølgen av temperaturen er n = 2, og deretter minst tre temperaturnivåer må undersøkes. Bruke grunnmodeller av høy polynom orden (kubikk eller over) er et alternativ hvis polynomet rekkefølgen på en faktor er usikkert.Men dette kan i betydelig grad øke antall kjører kreves for DoE.
For komplekse systemer med mange faktorer og høye polynom bestillinger kan dette resultere i design som ikke kan beregnes effektivt. I slike tilfeller kan det være lurt å dele opp problemet i to eller flere motiver undersøker ulike undergrupper av faktorer. Imidlertid må de betydelige faktorer utelatt fra slike "split-design" justeres nøye til faste verdier for å forhindre forvrengning av resultatene. Hver split-design bør gjentas med forskjellige innstillinger for de utelatte faktorer for å avdekke samspillet mellom dem og de faktorene som inngår i design. Det er gunstig å identifisere hvilke faktorer som har størst innvirkning på responsen og inkludere dem i alle utførelser.
Kritiske aspekter under DoE evaluering
Den FDS bør være den første parameter vurdert i en nylig beregnet DoE. Operatøren må bekrefte at the DoE gir nødvendig dekning av design plass for den nødvendige minimal påviselig forskjell og estimert standardavvik av responsen. Hvis dette ikke er tilfelle, bør utformingen bli utvidet med et passende antall løyper og gjentak før kravene er oppfylt. Fremgangsmåten for å beregne DoE løper kan bli initialisert flere ganger for å velge design med et minimalt tap av optimalitet dersom balansen mellom categoric faktorer er aktivert.
Transformasjon av data bør gjennomføres hvis grenseverdier span mer enn en størrelsesorden. Log 10 transformasjon er ofte hensiktsmessig, men den Box-Cox tomten vil foreslå transformasjon som vil gi den mest stabile modell. Omformingen foreslått i denne tomten kan endre seg når den endelige modellen har blitt valgt og bør derfor revurderes. Kun vesentlige faktorer (p-verdi <0,05) som skal inkluderes i responsoverflatemodell for å kunne garantere den prediktive power. Unntak kan gjøres for å opprettholde modellen hierarkiet 32,33 eller for å omfatte faktorer som er kjent for å ha en virkning basert på tidligere resultater. I sistnevnte tilfelle, er det tilrådelig å undersøke hvorfor slike viktige faktorer som ikke ble funnet å være av betydning i dagens DoE. Mangelen-of-fit parameter kan benyttes i kombinasjon med R-kvadratverdien (tabell 2 og 3) for rask deteksjon av dårlige modeller / anfall, mens den justerte R-kvadrat indikerer om for mange / ubetydelige faktorer har blitt valgt og spådd R-squared er en indikator for prediktiv kraft av modellen. Imidlertid residualplott gitt i diagnostikk i DesignExpert er enda viktigere for å vurdere kvaliteten av modellen fordi de tillater deteksjon av trender i datasettet som indikerer tilstedeværelsen av skjulte faktorer samt identifisering av ekstremverdier. Sistnevnte har en over gjennomsnittlig innvirkning på passform og forvrenge modellen. Slike verdier kan stamme fra mangelfulle data (f.eks permut verdier) som må rettes, eller fra mislykkede eksperimenter som må gjentas. Ved en ekstrem verdi er funnet å være "fast" i slike repetisjon eksperimenter er det tilrådelig å legge flere kjøringer i nærhet av denne verdi til å forbedre kvaliteten av modellen innenfor denne regionen av designområde.
Korreksjoner til design som er ufullkommen eller for liten
Uansett hvorfor flere løyper kan være nødvendig (f.eks manglende data, mislyktes løyper, ekte ekstreme verdier og regioner, uventede høye ordre faktor interaksjoner), bør disse kjører legges til eksisterende design på en ordnet måte ved hjelp av "Design silikonpupper"-verktøyet å introdusere de nye kjører i en egen blokk. Gjør du det vil lette bruken av forrige datasett mens du velger de mest meningsfulle ekstra kjøringer. Resultatet vil være en modell som passer til dataene og tillater påliteligprediksjon av fremtidige resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Publikasjonen gebyr ble delvis sponset av selskapene Statease, Inc. (USA) og Statcon (Tyskland), som ikke var involvert i de involverte i utarbeidelsen av manuskriptet eller ansvarlig for noe av innholdet.
Acknowledgments
Forfatterne er takknemlige til Dr. Thomas Rademacher for å gi pPAM anlegget uttrykk vektor og Ibrahim Al Amedi for å dyrke tobakksplanter brukt i denne studien. Vi ønsker å takke dr. Richard M. Twyman for hans hjelp med å redigere manuskriptet. Dette arbeidet ble delvis finansiert av European Research Council Advanced Grant "Future-Pharma", forslag nummer 269110 og Fraunhofer Zukunftsstiftung (Fraunhofer Future Foundation).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Design-Expert(R) 8 | Stat-Ease, Inc. | n.a. | DoE software |
| Tryptone | Carl Roth GmbH | 8952.2 | Media component |
| Yeast extract | Carl Roth GmbH | 2363.2 | Media component |
| Sodium chloride | Carl Roth GmbH | P029.2 | Media component |
| Ampicillin | Carl Roth GmbH | K029.2 | Antibiotic |
| Agar-Agar | Carl Roth GmbH | 5210.2 | Media component |
| Escherichia coli K12 DH5a | Life Technologies | 18263-012 | Microorganism |
| pPAM | GenBank | AY027531 | Cloning/expression vector; |
| NucleoSpin Plasmid | MACHEREY-NAGEL GmbH | 740588.250 | Plasmid DNA isolation kit |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | MACHEREY-NAGEL GmbH | 740609.250 | Plasmid DNA purification kit |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | n.a. | Spectrophotometer |
| NcoI | New England Biolabs Inc. | R3193L | Restrictionendonuclease |
| EcoRI | New England Biolabs Inc. | R3101L | Restrictionendonuclease |
| AscI | New England Biolabs Inc. | R0558L | Restrictionendonuclease |
| NEB 4 | New England Biolabs Inc. | B7004S | Restrictionendonuclease buffer |
| TRIS | Carl Roth GmbH | 4855.3 | Media component |
| Disodium tetraborate | Carl Roth GmbH | 4403.3 | Media component |
| EDTA | Carl Roth GmbH | 8040.2 | Media component |
| Agarose | Carl Roth GmbH | 6352.4 | Media component |
| Bromophenol blue | Carl Roth GmbH | A512.1 | Color indicator |
| Xylene cyanol | Carl Roth GmbH | A513.1 | Color indicator |
| Glycerol | Carl Roth GmbH | 7530.2 | Media component |
| Mini-Sub Cell GT Cell | BioRad | 170-4406 | Gel electrophoresis chamber |
| Agrobacterium tumefaciens strain GV3101:pMP90RK | DSMZ | 12365 | Microorganism |
| Electroporator 2510 | Eppendorf | 4307000.658 | Electroporator |
| Beef extract | Carl Roth GmbH | X975.2 | Media component |
| Peptone | Carl Roth GmbH | 2365.2 | Media component |
| Sucrose | Carl Roth GmbH | 4621.2 | Media component |
| Magnesium sulfate | Carl Roth GmbH | 0261.3 | Media component |
| Carbenicillin | Carl Roth GmbH | 6344.2 | Antibiotic |
| Kanamycin | Carl Roth GmbH | T832.3 | Antibiotic |
| Rifampicin | Carl Roth GmbH | 4163.2 | Antibiotic |
| FWD primer | Eurofins MWG Operon | n.a. | CCT CAG GAA GAG CAA TAC |
| REV primer | Eurofins MWG Operon | n.a. | CCA AAG CGA GTA CAC AAC |
| 2720 Thermal cycler | Applied Biosystems | 4359659 | Thermocycler |
| RNAfold webserver | University of Vienna | n.a. | Software |
| Ferty 2 Mega | Kammlott | 5.220072 | Fertilizer |
| Grodan Rockwool Cubes 10 x10 cm | Grodan | n.a. | Rockwool block |
| Greenhouse | n.a. | n.a. | For plant cultivation |
| Phytotron | Ilka Zell | n.a. | For plant cultivation |
| Omnifix-F Solo | B. Braun | 6064204 | Syringe |
| Murashige and Skoog salts | Duchefa | M 0222.0010 | Media component |
| Glucose | Carl Roth GmbH | 6780.2 | Media component |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406-5G | Phytohormon analogon |
| BioPhotometer plus | Eppendorf | 6132 000.008 | Photometer |
| Osram cool white 36 W | Osram | 4930440 | Light source |
| Disodium phosphate | Carl Roth GmbH | 4984.3 | Media component |
| Centrifuge 5415D | Eppendorf | 5424 000.410 | Centrifuge |
| Forma -86C ULT freezer | ThermoFisher | 88400 | Freezer |
| Synergy HT | BioTek | SIAFRT | Fluorescence plate reader |
| Biacore T200 | GE Healthcare | n.a. | SPR device |
| Protein A | Life Technologies | 10-1006 | Antibody binding protein |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 9105.3 | Media component |
| Tween-20 | Carl Roth GmbH | 9127.3 | Media component |
| 2G12 antibody | Polymun | AB002 | Reference antibody |
References
- Fischer, R., Emans, N. Molecular farming of pharmaceutical proteins. Transgenic research. 9, 277-299 (2000).
- Commandeur, U., Twyman, R. M., Fischer, R. The biosafety of molecular farming in plants. AgBiotechNet. 5, 9 (2003).
- Shoji, Y., et al. A plant-based system for rapid production of influenza vaccine antigens. Influenza Other Resp. 6, 204-210 (2012).
- Goodin, M. M., Zaitlin, D., Naidu, R. A., Lommel, S. A. Nicotiana benthamiana: Its history and future as a model for plant-pathogen interactions. Mol Plant Microbe In. 21, 1015-1026 (2008).
- Berg, R. H., Beachy, R. N. Fluorescent protein applications in plants. Method Cell Biol. 85, 153 (2008).
- Chung, S. M., Vaidya, M., Tzfira, T. Agrobacterium is not alone: gene transfer to plants by viruses and other bacteria. Trends in plant science. 11, 1-4 (2006).
- Sheludko, Y. V., Sindarovska, Y. R., Gerasymenko, I. M., Bannikova, M. A., Kuchuk, N. V. Comparison of several Nicotiana species as hosts for high-scale Agrobacterium-mediated transient expression. Biotechnology and Bioengineering. 96, 608-614 (2007).
- Wydro, M., Kozubek, E., Lehmann, P. Optimization of transient Agrobacterium-mediated gene expression system in leaves of Nicotiana benthamiana. Acta Biochimica Polonica. 53, 289-298 (2006).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Processing heterogeneous biomass: Overcoming the hurdles in model building. Bioengineered. 4, (2013).
- Fischer, R., Schillberg, S., Hellwig, S., Twyman, R. M., Drossard, J. GMP issues for recombinant plant-derived pharmaceutical proteins. Biotechnol Adv. 30, 434-439 (2012).
- Daniel, C. One-at-a-time plans. Journal of the American Statistical Association. 68, 353-360 (1973).
- Czitrom, V. One-Factor-at-a-Time versus Designed Experiments The American Statistician. 53, 6 (1999).
- Anderson, M. J., Kraber, S. L. Keys to successful designed experiments. ASQ - The global voice of quality. 6, 6 (1999).
- Montgomery, D. C. Design and Analysis of Experiments. , John Wiley & Sons Inc. (2007).
- Myers, R. H., Montgomery, D. C., Anderson-Cook, C. M. Response Surface Methodology: Process and Product Optimization Using Designed Experiments. , Wiley. (2009).
- Piepel, G. F. Programs for generating extreme vertices and centroids of linearly constrained experimental regions. J Qual Technol. 20, 15 (1988).
- FDA. , U.S. Department of Health and Human Services. Rockville, MD, USA. (2009).
- Shivhare, M., McCreath, G. Practical Considerations for DoE Implementation in Quality By Design. BioProcess International. 8, 9 (2010).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Predictive models for transient protein expression in tobacco (Nicotiana tabacum L.) can optimize process time, yield, and downstream costs. Biotechnology and bioengineering. 109, 2575-2588 (2012).
- Buyel, J. F., Kaever, T., Buyel, J. J., Fischer, R. Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5'UTR combination. Biotechnology and bioengineering. 110, 471-482 (2013).
- Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. DOE Simplified: Practical Tools for Effective Experimentation. , Productivity Inc. (2000).
- Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. Response Surface Methods Simplified. , Productivity Press. (2005).
- De Gryze, S., Langhans, I., Vandebroek, M. Using the correct intervals for prediction: A tutorial on tolerance intervals for ordinary least-squares regression. Chemometr Intell Lab. 87, 147-154 (2007).
- Plasmid DNA purification User manual. , MACHEREY-NAGEL. Düren. (2012).
- PCR clean-up Gel extraction User manual. , MACHEREY-NAGEL. Düren. (2012).
- Quick Ligation Protocol. 4, NewEnglandBiolabs. Ipswich. (2009).
- Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High-Efficiency Transformation of Escherichia-Coli with Plasmids. Gene. 96, 23-28 (1990).
- Main, G. D., Reynolds, S., Gartland, J. S. Electroporation protocols for Agrobacterium. Methods in Molecular Biology. 44, 405-412 (1995).
- Gruber, A. R., Lorenz, R., Bernhart, S. H., Neubock, R., Hofacker, I. L. The Vienna RNA websuite. Nucleic acids research. 36, 70-74 (2008).
- Howell, S., Kenmore, M., Kirkland, M., Badley, R. A. High-density immobilization of an antibody fragment to a carboxymethylated dextran-linked biosensor surface. J Mol Recognit. 11, 200-203 (1998).
- Newcombe, A. R., et al. Evaluation of a biosensor assay to quantify polyclonal IgG in ovine serum used for the production of biotherapeutic antibody fragments. Process Biochem. 41, 842-847 (2006).
- Peixoto, J. L. Hierarchical Variable Selection in Polynomial Regression-Models. Am Stat. 41, 311-313 (1987).
- Peixoto, J. L. A Property of Well-Formulated Polynomial Regression-Models. Am Stat. 44, 26-30 (1990).
- Sanders, P. R., Winter, J. A., Barnason, A. R., Rogers, S. G., Fraley, R. T. Comparison of cauliflower mosaic virus 35S and nopaline synthase promoters in transgenic plants. Nucleic acids research. 15, 1543-1558 (1987).
- Ma, J. K. C., et al. Generation and Assembly of Secretory Antibodies in Plants. Science. 268, 716-719 (1995).
- Wycoff, K. L. Secretory IgA antibodies from plants. Curr Pharm Design. 11, 2429-2437 (2005).
- Pace, C. N., Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G., Gray, T. How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein. Protein Sci. 4, 2411-2423 (1995).
