Karakterisering av komplexa system Använda Försöks Tillvägagångssätt: Transient Protein Expression i tobak som en fallstudie

Summary

Vi beskriver en design av experiment tillvägagångssätt som kan användas för att bestämma och modellera inverkan av transgen regulatoriska element, tillväxt och utveckling parametrar växt och inkubationsbetingelser för transient expression av monoklonala antikroppar och reporter proteiner i växter.

Abstract

Växter ger flera fördelar för produktion av biologiska läkemedel, inklusive låga kostnader, skalbarhet och säkerhet. Övergående uttryck ger den ytterligare fördelen med korta utvecklings-och produktionstider, men uttrycksnivåer kan variera kraftigt mellan partier vilket ger upphov till regleringsproblem i samband med god tillverkningssed. Vi använde en försöks (DoE) metod för att bedöma effekten av viktiga faktorer såsom reglerande element i expressionskonstruktet, växternas tillväxt och utveckling parametrar och inkubationsbetingelserna under uttryck, om variationen i uttryck mellan partier. Vi testade växter som uttrycker en modell anti-HIV-monoklonal antikropp (2G12), och ett fluorescerande markörprotein (DsRed). Vi diskuterar den logiska grunden för att välja vissa egenskaper hos den modell och identifiera dess potentiella begränsningar. Kan enkelt överföras till andra problem Den allmänna inriktningen, eftersom principerna i modellen enre bred tillämpning: kunskaps parameterval, komplexitet minskning genom att dela upp det ursprungliga problemet i mindre moduler, program-guidad installation av optimala experimentkombinationer och stegvis konstruktion augmentation. Därför är inte bara användbar för att karakterisera proteinuttryck i växter utan också för undersökning av andra komplexa system som saknar en mekanistisk beskrivning av metodiken. De prediktiva ekvationer som beskriver sammankoppling parametrar kan användas för att etablera mekanistiska modeller för andra komplexa system.

Introduction

Produktionen av biofarmaceutiska proteiner i växter är fördelaktig eftersom växter är billig att växa, kan plattformen skalas upp bara genom att växa mer växter, och humana patogener är oförmögna att replikera ^1,2. Transienta expressionsstrategier baserade till exempel på infiltration av blad med Agrobacterium tumefaciens ger ytterligare fördelar eftersom tiden mellan punkten för DNA-leverans och leverans av en renad produkt reduceras från år till mindre än två månader ^3. Transient uttryck används också för funktionell analys, t.ex. för att testa gener för sin förmåga att komplettera förlust av funktion mutanter eller för att undersöka protein-interaktioner ^4-6. Emellertid transienta expressionsnivåer tenderar att visa större batch-to-batch variation än expressionsnivåer i transgena växter ^7-9. Detta minskar sannolikheten för att biofarmaceutiska tillverkningsprocesser baserade på transient expression will godkännas inom ramen för god tillverkningssed (GMP) eftersom reproducerbarhet är en kritisk attribut kvalitet och är föremål för riskbedömning ^10. Denna variation kan också maskera eventuella interaktioner som forskare har för avsikt att undersöka. Därför satte vi ut för att identifiera de viktigaste faktorerna som påverkar övergående uttrycksnivåer hos växter och att bygga en högkvalitativ kvantitativ prediktiv modell.

Den en-faktor-på-en-gång (OFAT) metod används ofta för att karakterisera effekten (effekt) av vissa parametrar (faktorer) om resultatet (respons) i ett experiment ^11. Men detta är suboptimal eftersom de enskilda tester (kör) under en undersökning (experiment) kommer att anpassas som pärlor på ett snöre genom det potentiella området sträckte sig från de faktorer som testas (design utrymme). Täckningen av design utrymme och därmed graden av information från försöket ärlåg, såsom visas i figur 1 A ^12. Dessutom kan ömsesidiga sambandet mellan olika faktorer (faktor interaktioner) förblir dold resulterar i dåliga modeller och / eller förutsägelse av falsk optima, såsom visas i Figur 1B ^13.

De ovan beskrivna nackdelarna kan undvikas genom användning av en design av experiment (DOE) strategi, där körningar av ett experiment är utspridda jämnare över hela designutrymmet, vilket innebär att mer än en faktor varieras mellan två körningar ^14. Det finns specialiserade designer för blandningar, screening faktorer (faktorförsök) och kvantifiering av faktor påverkan på svaren (metoder svars yta, RSM s) ^15. Dessutom kan RSMS realiseras som central-komposit konstruktioner men kan även ske med hjälp av specialiserad programvara som kan använda olika kriterier för urval av körningar. Till exempel, det så kallade D-optimality kriterium väljer körningar så att minimera felet i koefficienterna den resulterande modellen, medan IV-optima kriteriet väljer körningar som uppnår den lägsta förutsägelse variansen i hela designen utrymmet ^15,16. RSM vi beskriver här låter exakt kvantifiering av övergående proteinuttryck i växter, men det kan lätt överföras till något system med flera (~ 5-8) numeriska faktorer (t.ex. temperatur, tid, koncentration) och några (~ 2 - 4) kategoriska faktorer (t.ex. promotor, färg), i vilken en mekanistisk beskrivning är tillgänglig eller är alltför komplicerade för att modellera.

DOE strategi har sitt ursprung i de areella näringarna, men har spridit sig till andra områden, eftersom det är överförbart till alla situationer där det är lämpligt att minska antalet körningar som krävs för att få tillförlitliga data och generera beskrivande modeller för komplexa processer. Detta i sin tur har lett till införandet av DoE i "Vägledning förIndustri, Q8 (R2) Pharmaceutical Development "som publiceras av den internationella konferensen om harmonisering av tekniska krav för registrering av humanläkemedel (ICH) ^17. DoE används nu i stor utsträckning i vetenskaplig forskning och industri ^18. Dock måste man vara försiktig vid planering och genomförande av experimentet, eftersom du väljer en felaktig polynom grad för multipel-linjär regressionsmodell (basmodellen) kan införa ett behov av ytterligare körningar för att modellera alla faktoreffekter på rätt sätt. Dessutom skadade eller saknade uppgifter genererar felaktiga modeller och bristfällig förutsägelser, och kan till och med förhindra modellbygge försök som beskrivs i protokollet och diskussionssektioner ^18. I protokollet avsnitt kommer vi inledningsvis anges de viktigaste planeringssteg för en RSM-baserade experiment och sedan förklara design baserad på DoE programvara DesignExpert v8.1. Men liknande konstruktioner kan byggas med annan programvara including JMP, Modde och STATISTICA. De experimentella procedurer följs av anvisningar för dataanalys och utvärdering.

Figur 1. Jämförelse av OFAT och DoE. A. Sekventiell variant av en faktor i taget (OFAT) i ett experiment (svarta, röda och blå cirklar) uppnår en låg täckning av design utrymme (skuggade områden). Däremot variationen av mer än en faktor i taget med hjälp av försöksplanering (DoE) strategi (gröna cirklar) förbättrar täckningen och därmed precisionen i de resulterande modellerna. B. Den partisk design utrymme täckning innebär att OFAT experiment (svarta cirklar) också kan misslyckas med att identifiera optimala driftsområden (röd) och förutsäga suboptimala lösningar (stor svart cirkel), medan DoE strategisktes (svarta stjärnor) är mer benägna att identifiera föredra förhållanden (stor svart stjärna).

Protocol

1. Planera en DoE strategi

1. Identifiera relevanta faktorer och svar för att ingå i konstruktionen.
   1. Definiera ett eller flera svar för mätningen. Här var 2G12 och DsRed uttrycksnivåer som används (ng / ml), däribland det minsta detekterbara skillnad betraktas som relevanta (10 och 20 mikrogram / ml) och ett ungefärligt värde för den uppskattade standardavvikelsen för systemet (4 och 8 mikrogram / ml) baserat på tidigare experiment.
   2. Använd tillgänglig litteratur, uppgifter från tidigare experiment eller specialiserade screening mönster (t.ex. en faktoriell design, se inledningen) för att markera viktiga faktorer vars inverkan på svaren kommer att kvantifieras (Tabell 1) ^7,8,19,20.
   3. Fördela faktortyper (numeriska eller kategoriska) och väljer intervall inom vilket de numeriska faktorer varieras under DoE utredningen (tabell 1).
   4. Identifiera numerisktc faktorer som kontinuerlig variation är svår att genomföra.
      1. Undvik kontinuerlig variation av faktorer som inte kan justeras exakt till en viss nivå. T.ex. Inkubationstemperatur kan normalt regleras endast inom ± 2 ° C, alltså kontinuerlig variation med hjälp av värden som 27,2 ° C, 25,9 ° C och 29,3 ° C måste undvikas.
      2. I stället väljer ett antal bestämda nivåer för dessa faktorer (tabell 1). Antalet nivåer ska matcha den förväntade basmodellen (steg 1,2). Det är bara viktigt för optimala konstruktioner, eftersom centrala sammansatta mönster har alltid diskreta faktornivåer.
   5. Tilldela om en kategorisk faktor är nominellt, dvs ingen implicit ordning (t.ex. olika tillverkare) eller ordinal och därmed en diskret numerisk parameter (t.ex. olika blad på en växt).
   6. Välj de nivåer för båda typerna av kategoriska faktorer. </ Li>
2. Välj en användbar basmodell.
   1. Baserat på preliminära experiment och litteratur, räknar förhållandet mellan varje faktor och svar samt faktorinteraktioner och svaret. Till exempel, linjär (ju mer desto bättre), kvadratisk (enda optimala eller icke-linjär ökning / minskning) eller kubisk (skev optimalt).
   2. Se till att antalet nivåer för diskreta numeriska faktorer är n + 1, med n är polynomets grad av relationen mellan faktorn och svar. Till exempel, om temperaturen förväntas ha en kvadratisk effekt på responsen, n = 2 och därmed åtminstone tre temperaturnivåer bör undersökas för att uppnå en passning till den kvadratiska verkan.
3. Definiera bråkdel av design utrymme (FDS) för vilken förutsägelsen variansen bör vara under en viss nivå (alfa-nivå). Den FDS bör vara> 0,95 (täcker mer än 95% av designutrymme) för att åstadkomma modeller som ger robusta förutsägelser helahela designutrymmet ^21-23.
   Anmärkning: En tröskel på 0,05 motsvarar en 5% signifikansnivå (typ I-fel) och är ett typiskt värde. Öka detta värde kommer att minska antalet försök som behövs för en DoE strategi, men kommer samtidigt att öka sannolikheten att betydande effekter kommer att saknas och att uppskattningar av deras inverkan på svaret blir felaktig.

Tabell 1. Faktorer som påverkar övergående proteinuttryck i tobak, inklusive variationen varierar under DoE. Faktorer i fetstil var bara med i utformningen av de experiment som beskrivs i "En beskrivande modell för DsRed ackumulation under gående uttryck med olika promotor / 5'UTRs" medan faktorer i kursiv stil var bara med i design för "Optimera incubation förhållanden och skördesystem för produktion av monoklonala antikroppar i anläggningar som använder gående uttryck ".

Figur 2. DoE planeringsprocessen. Faktorer med betydande inverkan på svaret under utredning väljs utifrån tillgängliga data. Sedan faktor attribut (t.ex. numeriska), intervall och nivåer är tilldelade. Förkunskaper och experiment används för att definiera en lämplig bas modell. De prediktiva effektkraven definieras utifrån tillämpningen / syftet med den slutliga modellen. De sammanställda data kan sedan överföras till lämplig DoE programvara.

2. Att sätta upp en RSM i DesignExpert

1. Starta DesignExpert och välj "Ny design". I "Response Surface"-fönstret, välj &# 34, Optimal "och ange antal numeriska och kategoriska faktorer som valts i avsnitt 1.1).
2. Ange faktornamn, enheter, typer, undertyper, antal nivåer / nivågränser och värden för de nivåer för alla faktorer i motsvarande fält.
3. Fortsätt till nästa sida och under "Sök" alternativ att välja "Bästa" och den önskade "optimalitet" kriteriet, här "D-optimal".
4. I menyn "Redigera modell ...", välj den modell som innehåller de faktorer och interaktioner förväntade i avsnitt 1.2). Är du osäker, välj en fullständig modell som omfattar alla faktorer och interaktioner för en viss polynom grad, här "kvadratiska". Observera att du väljer en fullständig modell (som innehåller all interaktion) kan öka antalet försök som krävs för DoE.
5. Välj antal "block". Här var ett enda block som används eftersom alla växter från samma parti, alla bakterier hade odlats samtidigt ochalla injektioner utfördes på samma dag av samma operatör. Använd mer än ett block om mer än ett parti med växter används eller flera operatörer hanterar injektionerna.
6. Balansera konstruktion
   1. Enable "Force kategoriskt balans" för att fördela de körningar av experimentet jämnt bland kategoriska faktornivåer, t.ex. olika promotorer som är testade.
      OBS: detta kan minska optima av designen till en grad som DesignExpert kommer att rapportera i% värde beroende på de punkter som valts av optimaalgoritmen.
   2. Räkna om designen flera gånger med hjälp av förs slump frö algoritm för att minimera minskningen av optimalitet.
      Anm: förluster i optima kan variera från ~ 3 till 40% med användning av samma indata, men att ändra antalet replikat kan användas för att upprätthålla kategoriskt balans.
7. Programvaran kommer att föreslå ett värde för antalet "Model punkter" utifrån basmodellen, Här 70 körningar. Justera antalet körningar för "Replikat" och "För att uppskatta brist på passning" för att säkerställa att den är> 5% av antalet "Model punkter" för varje, här 10 körningar vardera.
8. Fortsätt till nästa sida väljer du hur många svar och ange deras namn och enheter. Ytterligare åtgärder kan också läggas till när som helst under utvärderingsuppgifter utan någon negativ inverkan på utformningen.
9. Fortsätt att starta algoritm beräkna faktornivåerna för körningar av DOE. Om den valda basmodellen inte matchar antalet nivåer för en viss faktor, kommer ett meddelande att visas och beräkningen startar inte. I det här fallet antingen:
   1. Öka antalet nivåer för denna faktor, eller
   2. Avmarkera villkoren i basmodellen som inte kan beräknas baserat på nuvarande antal nivåer.
   3. Till exempel, om det finns två nivåer för faktorn "Inkubationstid" t (dvs. 2 d och 5 d) i than aktuell design och en kvadratisk bas modell inklusive termen t ² valdes, antingen lägga till en tredje nivå för t (dvs. 8 d) eller ta bort den faktorn t ² från modellen.
10. Spara kalkylbladet som innehåller de optimala faktorkombinationer som visas när beräkningen är klar.
11. I "Design" nod välja "Evaluation" sub-nod och gå till "Graphs" fliken.
    1. I "Grafer funktionen" välj "FDS" och i "FDS Graph" rutan väljer du "Pred" som typ av fel. Ange sedan den minsta detekterbara skillnad samt det ungefärliga värdet för den uppskattade standardavvikelsen för det system som definieras i avsnitt 1.1.1) som värden för "d" och "s" respektive (här 20 och 8 mikrogram / ml för DsRed). Också ange alfanivå (acceptabel% saknar en signifikant effekt) lämplig för tillämpningen, typiskt 0,05 (5%).
    2. Om så inte är fallet (som finns här, FDS var 1% som visas i figur 3A), gå tillbaka till "Design" nod och i aktivitetsfältet välj "Designverktyg", sedan "Utöka design ..." och välj " Öka ".
    3. Välj samma "Sök" och "Optimalitets" kriterier som tidigare. Också valde samma "Redigera modell" och "kraft kategoriskt balans" inställningar. Om konstruktionen augmentation utförs innan något experiment (som gjort här), ändra sedan "Sätt körs i blocket" till "Block1".
    4. I avsnittet "Runs" anger antalet ytterligare "Model punkter", bibehålla minst 5% "Replikat" och "För att uppskatta avsaknadenför passa "i den totala designen. Här var 100 extra körningar till och inga" Replikat "och" För att uppskatta brist på passning "ingick.
    5. När beräkningen är klar reexamine FDS graf såsom beskrivits ovan. Om FDS är fortfarande inte tillfredsställande, upprepa designen förstärkning enligt ovan. Här FDS var 100% efter augmentation och därmed ingen ytterligare förstärkning behövdes (Figur 3B).

Figur 3. Jämförelse av FDS plottningar. A. A DoE bestående av 90 körningar ger en otillräcklig FDS på endast 1% för standardavvikelsen för prediktionen, med hjälp av en kvadratisk grundmodell i kombination med värdena för den minsta detekterbara skillnad (20 mikrogram / ​​ml) och uppskattparat standardavvikelse av systemet (8 mikrogram / ​​ml). B. Augmentation av DoE till totalt 210 körningar uppnått en 100% FDS och en platt kurva som anger jämn precision av modellen i hela design utrymme.

3. Kloning och analys av expressionskassetter

1. Odla Escherichia coli i 5 ml LB-medium (10 g / liter trypton, 5 g / L jästextrakt, 170 mM NaCl, 50 mg / l ampicillin; för LB-agarplattor innefattar 15 g / L agar) vid 37 ° C under 6 -8 timme eller över natten på en roterande skak vid 160 rpm. VARNING: ampicillin är ett skadligt ämne. Inokulera LB-medium med antingen 50 | il flytande kultur eller överföra celler från kolonier odlade på plattor med användning av en pipettspets.
2. För rening av PSO-plasmid-DNA, och andra derivat av ppam (GenBank AY027531), från E. coli K12 stam DH5a, följ instruktionerna i DNA-rening kit handbok ^24. VARNING: renings kden innehåller skadliga kemikalier (se ovan manual för detaljer). Plasmiden sekvens beskrivs i Figur 4 och av Köparen et al. ^20.
3. Bestäm DNA-koncentrationen i det renade eluatet genom mätning av absorbansen av ett prov 2 | il vid 260 nm i en Nanodrop enhet.
4. Bekräfta identiteten av renad plasmid-DNA genom digerering med restriktionsendonukleaser (RES).
   1. Välj registreringsenheterna enligt plasmiden sekvens, så att unika och urskiljbara fragmentmönster genereras. Följ tillverkarens rekommendationer för matsmältningen förhållanden såsom reaktionsvolym, tid, temperatur och koncentration av stabilisatorn bovinserumalbumin. Beroende på känslighetsanalysen enhet använder 50-500 ng av plasmid-DNA per matsmältningen.
   2. Bered 0,8 till 2,0% geler för separation av DNA-fragment genom kokning agaros i Tris-borat-EDTA (TBE)-buffert (90 mM Tris, 90 mM borat, 2 mM EDTA, pH 8,0). Than större de förväntade fragmenten bör mindre agaros användas i gelén.
   3. Lägg 5 pl av fem-faldig provbuffert (5x SABU, 0,1% (vikt / vol) bromfenolblått, 0,1% (vikt / vol) xylencyanol, 10% (vikt / volym) glycerol löst i TBE) till 50 | il av RE-behandlade DNA-provet och separera fragmenten genom agarosgel-elektrofores vid 100 V under ca 40 min eller tills en klar separering av fragmenten uppnås. På varje gel, inkluderar en bana som innehåller DNA-stege storleksmarkörer för jämförelse, t ex 2-3 pl 1 kb stege.
5. Byt omega 5'UTR i PSO med en av de andra tre 5'UTRs.
   1. Släpp omega 5'UTR sekvens från ~ 4 ^ g renad PSO-DNA genom behandling med 20 enheter EcoRI-HF och Ncol-HF-RE i NEBuffer 4 vid 37 ° C under ~ 60 min. Sedan separera fragment som beskrivs i avsnitten 3.4.2 och 3.4.3.
   2. Isolera det större fragmentet (PS, "ryggrad") ur agarosgel med hjälp av en gel extraInsatser kit enligt tillverkarens instruktionsbok ²⁵ och bestämma koncentrationen av det renade DNA, såsom beskrivs i avsnitt 3.3). VARNING: den gelextraktionskit innehåller skadliga kemikalier, se manualen för detaljer.
   3. Isolera CHS CHS-LPH och TL 5'UTRs från lämpliga givarvektorerna genom behandling av ~ 10 ^ g av var och en vektor med 20 enheter EcoRI-HF och Ncol-HF-RE i NEBuffer 4 vid 37 ° C under ~ 60 min. Sedan separera fragment som beskrivs i avsnitten 3.4.2 och 3.4.3 och rena mindre 5'UTR innehåller fragment som beskrivs i avsnitt 3.5.2.
   4. Ligera de isolerade renade 5'UTRs i separata alikvoter till isolerade renat vektor den linjära pS vid 25 ° C i 5 minuter i enlighet med tillverkarens rekommendationer ^26. Använd ~ 50 ng av vektor-DNA och ett tre-faldigt molärt överskott av 5'UTR-DNA i en total volym av 20 | il.
6. Transformation E coli-celler med the rekombinanta plasmider ^26,27.
   1. Lägg ~ 10 ng (~ 4-5 pl) av ligeringsblandningen (se avsnitt 3.5.4) till 50 ^ RbCl kompetent E. coli och blanda försiktigt, och sedan inkubera under 30-60 minuter på is. Värmechock efter 1,5 min vid 42 ° C och kyla på is i 5-30 min.
   2. Addera 950 pl av antibiotikafritt LB-medium och inkubera under 1 timme vid 37 ° C och 160 rpm. För urval av transformanter, spred 50 och 100 | il av kulturen på LB-agarplattor innehållande ampicillin och inkubera under ~ 16-20 timmar vid 37 ° C.
   3. Inokulera 5-10 separata kolonier representerar varje promotor-5'UTR ligation som beskrivs i avsnitt 3.1 i 5-ml alikvoter av LB-medium innehållande ampicillin. Renar sedan plasmid-DNA och bekräfta dess identitet som beskrivs i avsnitten 3,2-3,4.
7. Ersätt 35SS promotorn med nos-promotorn i varje av de fyra 5'UTR plasmider med användning av Asc I-och EcoRI-RE i NEBuffER 4 vid 37 ° C under 1 h, såsom beskrivits i avsnitt 3.5 och 3.6.
8. Presentera de åtta resulte plasmider i A. tumefaciens stam GV3101: pMP90RK genom elektroporering ^28.
   1. Lägg ~ 500 ng renat plasmid-DNA till 50 l kompetent A. tumefaciens celler på is. Blanda försiktigt och överför till en förkyld 0,2 cm elektroporation kyvett. Se till att blandningen är på botten av kyvetten och inte innehåller bubblor.
   2. Puls celler vid 2,5 kV för 5 ms och bekräfta intensiteten och varaktigheten av pulsen.
   3. Undvik höga saltkoncentrationer i DNA-provet eller felaktig beredning av den behöriga A. tumefaciens celler eftersom dessa kan resultera i höga jon strömmar orsakar omedelbar förångning av cellsuspensionen, vilket kraftigt minskar omvandlings effekt.
   4. Lägg till 950 l av YEB medium utan antibiotika (5 g / L nötkött extrakt, 1 g / L jästextrakt, 5 g / L peptone, 5 g / liter sackaros, 2 mM MgSO _4, pH 7,0), blanda försiktigt och överför omedelbart i en steril 1,5 ml reaktionsrör. Inkubera under 2-4 timmar vid 26 till 28 ° C och 160 rpm.
   5. Sprid 1-2 | il på YEB-agarplattor innehållande antibiotika (50 mg / L   karbenicillin, 25 mg / L kanamycin, 25 mg / L rifampicin) för urval av transformanter. VARNING: rifampicin är ett giftigt ämne.
   6. Inokulera tre 5-ml alikvoter av YEB medium innehållande antibiotika med celler från separata kolonier representerar varje promotor-5'UTR ligation och inkubera i 48-72 timmar vid 26-28 ° C och 160 rpm.
9. Bekräfta framgången för A. tumefaciens förvandling.
   1. Överför 2 l av varje alikvot från avsnitt 3.8.6 för att separera 48 l alikvoter av PCR Mastermix (2 mikroliter av varje 10 ^ M primer lager (400 nM slutlig koncentration av varje primer),1 | il 10 mM dNTP-blandning (200 ^ M slutlig koncentration av varje deoxinukleosidtrifosfat), 5 | il 10-faldigt Expand High Fidelity-buffert med 15 mM _MgCl2, 0,75 pl Expand High Fidelity enzymblandning, och 39,25 ^ il sterilt destillerat vatten).
   2. Amplify expressionskassetten av varje plasmid med användning av lämpliga primrar (FWD: 5'-GTT CAG GAA GAG CAA TAC-3 ', bindande 1026 nukleotider uppströms om promotorn; REV: 5'-CCA AAG CGA GTA CAC AAC-3', bindande inom 35S polyadenyleringsställe) under lämpliga PCR-betingelser. Här, var 94 ° C, som används för initial denaturering, följt av 30 cykler av 94 ° C denaturering under 15 sek, 51 ° C annealing under 30 sek och 72 ° C förlängning under 120 sek, och ett slutligt förlängningssteg vid 72 ° C under 8 min.
   3. Bestäm storleken på PCR-produkter från agarosgelelektrofores som beskrivs i avsnitt 3.4.3.
10. Förbered A. tumefaciens glycerol lager avblanda 500 ^ il 50% (v / v) steril glycerol med 500 | il av A. tumefaciens kulturer från avsnitt 3.8.6 för vilka omvandling har bekräftats (avsnitt 3.9.3). Förvara glycerolstam vid -80 ° C tills vidare användning.
11. Beräkna de fällbara energier av de olika mRNA-sekvenser med hjälp av RNAfold webbserver ²⁹ och innefattar nukleotidsekvensen från transkriptionsstartstället genom att det första 50 bp av den kodande regionen.
    1. I avsnittet "Fold algoritmer och grundläggande alternativ" väljer "minsta fria energi (MFE) och partitionsfunktionen" och "undvika enstaka baspar" alternativ.
    2. I "Avancerade fällbara alternativ" väljer "dinglande energier på båda sidor av en helix i alla fall", "RNA-parametrar (Turner modell, 2004)" och ändra "skala om energiparametrar till given temperatur (C)" till 25 ° C.
    3. I avsnittet "Output alternativ" välj alla alternativ.

Figur 4. Promotorn och 5 'UTR-varianter. Expressionskassettema alstrades genom stegvis utbyte av 5'UTR, vilket resulterar i fyra kombinationer med CaMV 35SS-promotorn, följt av ersättandet av denna promotor med nos-sekvens, vilket gav ytterligare fyra varianterna samt totalt åtta olika promotor / 5'UTR kombinationer.

4. Växtodling

1. Bered en 0,1% lösning av gödningsmedlet Ferty2 Mega i avjoniserat vatten vid pH 5,9.
2. Förbered 10 x 10 x 8 cm Rockwool block av omfattande sköljning med avjoniserat vatten för att avlägsna kvarvarande kemikalier och slutligen jämvikta med gödningsmedel.
3. Seed tobaksplantor genom att placera 1-2 tobaksfrön på varje stenull blocket följt av en kort flush med gödsel var noga med att undvika att tvätta fröna bort.
4. Gro och odla tobaksplantor i 42 dagar i ett växthus vid 25/22 ° C dag / natt temperatur, 70% relativ fuktighet och en 16-hr fotoperiod (180 mmol sek ^-1 m ^-2, λ = 400-700 nm) . Under denna fotoperiod, vattna med gödsel i 15 minuter varje timme i hydrokultur.

5. Transient Protein Expression

1. Förbered A. tumefaciens för injektion i bladen.
   1. Inokulera 5-50 ml YEB medium innehållande antibiotika med 1% A. tumefaciens kryo-stamkultur och inkubera vid 27 ° C tills OD <sub> 600 nm når 5,0 (~ 48-72 timmar beroende på volym och fartygstyp).
   2. Späd A. tumefaciens kultur med vatten och 2-faldig infiltration mediet (4,3 g / L Murashige och Skoog salter (pH 5,6), 5 g / L sackaros, 1,8 g / L glukos, 100 mM acetosyringon) för att matcha OD _{600 nm} krävs för injektion. Bekräfta OD _600nm strax före injektion. Anm: En OD _{600 nm} på 1,0 motsvarar ~ 1,43 ± 0,12 x 10 ⁹ kolonibildande enheter per ml.
2. Injicera A. tumefaciens suspensionen i bladen.
   1. Välj och märka noncotyledon blad och positioner på dessa ska behandlas (t.ex. enligt ett DoE strategi).
   2. Injicera inte annorlunda A. tumefaciens lösningar i samma interkostala fältet. Använd i stället motsatta sektioner på var sida om mitt ven axel. Om fler än två olika lösningar måste injiceras vid samma position använda en additional växt.
   3. Skaka A. tumefaciens-lösning för att återsuspendera de celler som kan ha satts efter framställning av den utspädning och aspirera in i en 1 ml-spruta.
   4. Skrapa försiktigt epidermis i det läge avsett för injektion med en pipett eller liknande för att underlätta inflödet av A. tumefaciens-lösning. Undvik spricker bladet bladet medan du gör det.
   5. Håll sprutan vinkelrätt mot bladet bladet röra pipan mot den interkostala området som skall behandlas och tryck försiktigt utlopp (utan nål fastsatt) på undersidan av bladet. Tryck på den övre sidan av bladet försiktigt samtidigt för att förhindra att bladet bladet från att flytta eller brista.
   6. Tryck försiktigt ned sprutan kolven. Den A. tumefaciens lösning kommer in i intercellulära utrymmen i blad blad som indikeras av de behandlade områdena förekommer mörkare grönt och fuktigt. Upprepa denna procedur vid flera positioner tills hela intercostal fält är infiltrerade med A. tumefaciens. Fortsätt sedan med nästa interkostala fält.
   7. Se till sprutan förblir vinkelrätt mot bladet. Tippning av sprutan orsakar bakteriesuspensionen att spruta ut under högt tryck.
   8. Om annan A. tumefaciens lösningar används (t.ex. för att testa olika promotorer), ta bort överskottslösning kvar på undersidan av bladet från första injektion med en pappershandduk eller liknande innan nästa lösning.
3. Post-infiltration inkubation av växter och provtagning.
   1. Förbered en fytotron för de behandlade växterna ~ 24 timmar innan injektion för att temperatur och fuktighet jämvikt på de nivåer som krävs för DoE.
   2. Efter injektionen, överföra växter i fytotron och placera dem i fack är tillräckligt stora för bevattning med vatten fram till slutet av inkubationstiden bestäms av DoE.
   3. Upprätta en 16 hr photoperiod med sex Osram Kallvit 36 W lysrör per 0,7 m ² (75 mmol sek ^-1 m ^-2, λ = 400-700 nm). Förhindra växterna från skuggning varandra genom att begränsa antalet plantor till sex per 0,7 m ^2.
   4. Före provtagning, kontrollera att rätt revbensområdet valdes genom att jämföra etiketten till i avsnitt 5.2.1 och DoE planen.
   5. Använd en korkborr för att ta bort 4-5 bladskivor från de behandlade interkostalmusklerna fälten vid de positioner och gånger som den DoE. Ta inte bort hela blad från växten under provtagningen. Stabilisera blad med en handhållen pappershandduk och ta av skivorna för att förhindra brott.
   6. Bestäm massan för varje prov och placera det i en 1,5 ml plastreaktionsröret märkt med provnamn och massa. Förvara proverna vid -20 ° C eller -80 ° C innan protein kvantifiering. Processen kan pausas i detta stadium i flera månader beroende på provets stabilitetoch lagringstemperaturen.

6. Protein Kvantifiering

1. Utdrag proteiner från bladskivprov.
   1. Tillsätt 3 ml extraktionsbuffert (50 mM natriumfosfat, 500 mM natriumklorid, pH 8,0) per mg provmassan och mala bladskivor i reaktionsröret med hjälp av en elektrisk mortelstöt tills inga stora fragment finns kvar. Undvik överhettning av provet.
   2. Avlägsna dispergerade fastämnen genom centrifugering av provet två gånger vid 16.000 x g under 20 min vid 4 ° C. Överför supernatanten till ett rent 1,5 ml reaktionsröret efter varje steg utan att störa pelleten.
   3. Efter centrifugering, kan processen att pausas genom frysning av växtextrakt vid -20 ° C eller -80 ° C under flera månader beroende på provets stabilitet och lagringstemperaturen. Kontrollera att en frysnings-upptiningscykel inte påverkar koncentrationen av mål-protein (er).
2. Mät DsRed fluorescens.
   1. Förbered tre tekniska replikat av varje prov till svarta 96-brunnsplattor halv-området (50 ^ il extrakt per brunn). Undvik bildning av bubblor under pipettering.
   2. Använd en uppsättning av sex spädningar (0, 25, 75, 125, 175 och 225 pg / ml) av en DsRed standard per 96-brunnars platta för att alstra en linjereferenskurva. Förbered spädningar i PBS och förvara dem vid 4 ° C för användning inom tre månader.
   3. Mät fluorescensen två gånger, i följd, i en 96-brunnsplattläsare utrustad med 530/25 nm excitations-och 590/35 nm emissionsfilter.
   4. För varje prov, i genomsnitt fluorescens över två läsningar och de tre tekniska replikat och subtrahera värdet för blankprov innehållande 0 ng / ml DsRed. Subtrahera Även detta värde från den läser av standardspädningar och använda dessa tomma korrigerade värden för en linjär regression gav en referenskurva (genom origo i ordinatan).
   5. Använd lutningen på referenskurvan för att omvandla den fluorescence mäts för prover i DsRed koncentrationer. Om så är nödvändigt, späd proverna så att utläsningen faller inom koncentrationsintervallet av standarderna och betrakta denna utspädningsfaktor i efterföljande beräkningar.
3. Bestäm koncentrationen av 2G12.
   1. Förbered ett ytplasmonresonans (SPR)-anordning för mätning av antikroppskoncentration genom koppling av protein A till den aktiverade ytan av en flödescell. Använd en annan flödescell som referens genom att inaktivera ytan utan koppling av protein A ^30,31.
   2. Späd växtextrakt 1:20 i SPR rinnande buffert (10 mM HEPES pH 7,4, 3 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,05% volym / volym Tween-20) och mäta de svarsenheter (RU) av antikroppsbindning till protein A i tre tekniska replikat av varje prov vid slutet av en 90 | il injektion (180 sek vid 30 ^ il / min). Subtrahera RU mätas vid referensflödescell (inget protein A) från RU uppmätts i försöks flow cell (protein A-yta).
   3. Mät en 585 ng / ml 2G12 standard efter varje 10 till 15 prover och subtrahera det värde som uppmättes i referensflödescellerna såsom beskrivits ovan. Använd den genomsnittliga RU av dessa standarder för att beräkna en linjär referenskurva genom origo för koordinaterna.
   4. Beräkna 2G12 koncentrationerna i proverna baserade på 1:20 utspädning och lutningen på referenskurvan.
   5. Kontrollera för en stark icke-specifik bindning till referenscellen, som kan fördärva mätningen. Kontrollera också om de 2G12 standarderna behålla ungefär konstanta värden (<5% variation) genom analys, eftersom större variation speglar åldrande protein A ytan.

7. Dataanalys och utvärdering

1. Analysera svaren som observerats i de uttrycksexperiment för (i) extrema mätvärden fel (hög eller låg) anger manuellt, (ii) ovanliga resultat, t.ex. faktorkombinationer som gengradera oväntade svar som indikerar datautbyte, och (iii) saknade värden.
   Obs: använd dessa åtgärder för att förhindra modellbygge bygger på felaktiga uppgifter.
2. Överför de analyserade svarsdata (här proteinkoncentrationer) till "Design" nod DesignExpert. Se till att svarsdata är korrekt tilldelas motsvarande faktorinställningarna. Det finns en omfattande hjälpsektion finns i DesignExpert program som täcker de aspekter som behandlas nedan.
3. I "Analysis" nod, välja vilket svar som skall analyseras och inledningsvis välja "ingen" i flik transformation.
   Obs: en omvandling rekommenderas för min / max förhållanden av svaret större än 10. Den mest användbara transformation kan erhållas från Box-Cox-tomt i "Diagnostik" fliken i "Diagnostik" i "diagnostik" som beskrivs nedan (avsnitt 7.8). En Log ₁₀ förvandling är ofta lämpligt.
(t.ex. två-faktorinteraktioner, kvadratiska effekter). Programvaran kommer att föreslå en första modell baserad på dess betydelse.
4. I "Model" fliken, är en första modell förvald baserat på "Fit sammanfattande" resultat. Använd den automatiska läget för att redigera denna modell:
   1. Välj en "Process order" som är en order över den föreslagna modellen, till exempel om den föreslagna modellen är "2Fi" (två faktor interaktion) välj sedan "Quadratic".
   2. Välj "bakåt" i "Val"-fältet, som iterativt tar bort icke-signifikanta termer från modellen efter vidare till "ANOVA" fliken baserat på värdet "Alpha out" som från början skulle vara 0.100.
   3. På begäran av programvaran, alltid automatiskt korrigera modellhierarkin, eftersom detta är nödvändigtvisy för att skapa tillförlitliga modeller ^32,33.
5. I "ANOVA" fliken, undersöka den föreslagna modellen och de ingående faktorerna. Om det behövs, manuellt ta bort alla faktorer med p-värden över ett fördefinierat tröskelvärde (här 0,05, vilket motsvarar en 5% signifikansnivå) eller de som sannolikt inte är baserade på mekanistiska överväganden genom att växla tillbaka till "Model" fliken, ändra "Selection" till "Manuell" och eliminera de lämpliga faktorer från modellen.
6. Tillbaka i "ANOVA" fliken, utvärdera uppdateras modellen i termer av p-värdet för "Model" (ett lågt värde är önskvärt eftersom detta indikerar signifikans) och "Lack-of-fit" (ett högt värde är önskvärt eftersom detta indikerar avsaknaden av betydelse) såväl som värdena för "R-kvadrat", "Justerad R-kvadrat" och "Predicted R-kvadrat" (värden> 0,80 är önskvärt att alla tre värden).
   1. Jämför dessa värden for olika modeller inklusive / exklusive faktorer på olika signifikansnivåer.
      Obs: Det kan vara bra att duplicera svarskolumnen i "Design" nod och utföra varje analys för sig, eller att exportera hela "ANOVA" bord till ett annat program, t.ex. ett kalkylblad.
7. Fortsätt till fliken "Diagnostik" att bekräfta modellens kvalitet och upptäcka eventuella avvikelser i den datamängd som har en stark påverkan på modellen genom att undersöka alla flikarna i "Diagnostikverktyget" ("Diagnostik" och avsnittet "Influence") .
   1. I avsnittet "Diagnostik" i "diagnostik", utföra följande åtgärder:
      1. Se till att punkterna är slumpmässigt utspridda inom gränserna i "Förbättringar vs Predicted" diagram. Här visar en fiskbensformad fördelning behövs data transformation.
      2. Se till att punkterna är slumpmässigt utspridda inom gränserna i"Förbättringar vs Predicted" diagram. Här visar en fiskbensformad fördelning behövs data transformation.
      3. Undersök om punkterna i "Residuals vs run" diagram scatter slumpvis inom gränserna. Ett mönster (t.ex. "trappa") indikerar en trend i data och blockera byggnaden kan användas för att motverka dess påverkan på modellen.
      4. Leta efter en rak diagonal linje indikerar den ideala modellen i "Predicted vs Actual" tomt. Ju större spridningen av data kring diagonalen, den mindre exakt modellen.
      5. Kontrollera om en överlappning av det blå (bäst) och grön (faktiska) vertikala linjer i Box-Cox-plot som visar data transformation. Om den gröna linjen inte matchar den blå en (utanför det intervall som anges av de röda vertikala linjer) gå tillbaka till punkt 7.3 och förbättra modellen byggnad runda genom att välja dataomvandlings föreslagits av Box-Cox-plot. Återigen en dubblering av reResponse kolonn kan vara användbart att jämföra olika modeller.
      6. Se till att punkterna i "Residuals vs Factor" sjökort (det finns ett diagram för varje modell faktor) sprider slumpvis inom gränserna. Krökning i datadistribution kan tyda på en faktor som saknas i modellen.
   2. I "Influence" i "diagnostik", se till att det är slumpmässig spridning av data inom gränserna i "Externt studentized rester", "Leverage", "DFFITS" och "DFBETAS" tomter och jämnt låg spridning utan extremvärden i "Cooks Avstånd" tomt.
8. Under fliken "Modell grafer", visualisera den utvärderade modellen. För ett begränsat antal numeriska faktorer (t.ex. 3) svaret ytan ("3D-yta") representation är användbar för att bedöma optima / egenskaper manuellt.
   OBS: responsytor visar endast effekten av två faktorerrer på svar under utredning. Effekten av eventuella ytterligare faktor på svaret avslöjas genom att ändra dess värde (numeriska faktorer) eller nivå (kategoriska faktorer) i "Faktorer funktionen" fönstret. Alternativt kan faktorer delas tomten axeln genom att högerklicka på dem i "Faktorer funktionen"-fönstret och välja önskad oberoende variabeln axel.
   1. Manipulera faktornivåer och tilldela dem till graf koordinater med hjälp av "Faktorer funktionen".
   2. Exportera grafer med hjälp av "Exportera grafen till fil ..." kommando i "Arkiv"-fliken.
9. Använd "Numerical" sub-nod i "Optimering" nod för att optimera svaret numeriskt (minimera, maximera, inom intervallet) beroende på modellfaktorer, vilken i sin tur vissa begränsningar kan tillämpas (t.ex. gränser och vikter) via "Kriterier" fliken.
   1. Beräkna och undersöka numeriska lösningar på de "lösningar"flik baserat på de indata som i fliken "Kriterier".
   2. Exportera dessa lösningar till andra program (t.ex. kalkylblad) för vidare analys (t.ex. histogram) avslöjar faktorinställningarna förknippade med höga eller låga svarsvärden.
      OBS: Detta är användbart om mer än tre numeriska faktorer utreds och 3D-representation är svårt.
10. Använd "Point förutsägelse" sub-nod för att förutsäga svaret för specifika faktorinställningar.
    1. Använd denna förutsägelse för alla inställningar som skall utvärderas (här, all promotor och 5'UTR kombinationer samt alla blad och inkubationstider eller bladpositioner och inkuberingstemperaturer).
    2. Exportera de predikterade värdena och sammanställa dem till en datauppställning som kan användas för att beskriva övergående uttryck i tobaksväxter, till exempel genom att beräkna uttrycket för en specifik promotor-5'UTR kombination vid en viss tidpunkt i genomsnitt för alla bladpositioner eller across alla bladen på en växt.
    3. Normalisera uttrycksdata baserat på den stora massan av de olika bladen som ger den specifika uttrycksnivån (ng g ^-1) eller specifikt uttryck hastighet (ng g ^-1 tim ^-1).
    4. Alternativt exportera koefficienterna i "Final ekvation" från botten av "ANOVA"-fliken i ett kalkylprogram och multiplicera dem med en mängd av faktor inställningar för att ge samma datauppställningen.
       Obs: denna samling får endast innehålla faktorvärden inifrån ursprungliga design utrymme, eftersom den anpassade modell ekvationen inte lämpar sig för extrapolering.
11. Genomföra en bekräftelse experiment för modell punkter som är av stort intresse.
    1. Utför gående proteinuttryck under förhållanden som valts för "Point förutsägelse" (avsnitt 7.11). T.ex. använder samma temperaturer och löv etc.
    2. Bestäm proteinkoncentrationerna för gående uttryck eXperiment som beskrivs ovan (avsnitt 6) och jämföra dem med de värden som förutsägs av modellen.
    3. Kontrollera om den genomsnittliga proteinkoncentrationen i bekräftelse experimentet faller inom svarsytan modellens prediktionsintervall erhållits under punkt förutsägelse. En match bekräftar den prediktiva kraften i modellen. En obalans indikerar kan krävas en låg modell kvalitet och extra körningar.
    4. OBS: växt batch-till-batch variabilitet breddar prediktionsintervall och kan devalvera bekräftelse experiment utförda med en annan sats av växter. Emellertid kan prover som inte användes för att generera modellen, men som har sitt ursprung från samma planta sats som proverna innehöll i modellen fungerar som effektiva kontroller.

Representative Results

En beskrivande modell för DsRed ackumulation under gående uttryck med hjälp av olika promotorer och 5'UTRs

DsRed fluorescens i bladextrakt användes för att indikera expressionsnivån av det rekombinanta proteinet och sålunda användes som svar på DOE-strategin. Den minsta detekterbara skillnaden vi anses relevant var 20 | ig / ml och den uppskattade standardavvikelsen för systemet var 8 | ig / ml baserat på inledande experiment. Faktorer som ingår i den övergående uttryck modellen valdes utifrån litteraturuppgifter ^7,8 och våra tidigare resultat ^9. De undersökta Banden har också valt enligt dessa uppgifter (tabell 1). Minst tre nivåer valdes ut för alla diskreta numeriska faktorer för att möjliggöra beräkningen av en kvadratisk grundmodell. En D-optimal urvalsalgoritm valdes för valet av DoE går att få den mest exakta beräkningar förkoefficienterna för regressionsmodellen. Designen ursprungligen föreslagits av DesignExpert bestod av 90 körningar men FDS var otillräcklig för att uppnå en 1% standardavvikelsen för prediktionen (Figur 3A). D-optimal förstärkning av designen till totalt 210 körningar löst denna fråga och resulterade i en FDS på 100% med jämnare förutsägelse noggrannhet över designen utrymmet anges med den platta kurvan (Figur 3B).

De DsRed koncentrationerna bestämdes för alla 210 körningar och data var Log ₁₀ omvandlas. Modell faktorer valdes av automatiserade bakåt val från en kubisk modell med en alfanivå på 0,100. Detta resulterade i en signifikant modellen (tabell 2) med obetydliga brist-of-fit och höga värden för de multipla korrelationskoefficienterna (tabell 2). Det p-värde för alla modell faktorer var <0,05 och därmed ingen ytterligare manuell manipulation av modellen krävdes. Modellen innehölltre-faktorinteraktioner som inte ingick i den ursprungliga kvadratiska basmodellen (tabell 2). Omprövning av FDS grafen med hjälp av alla faktorer som ingår i den slutliga prediktionsmodell avslöjade att FDS för standardavvikelsen för prediktionen inte signifikant hade minskat genom att inkludera ytterligare tre-faktorinteraktioner (FDS = 0,99).

De diagnostiska verktyg modell kvalitet i DesignExpert indikerade att data transformation var användbart och det fanns inga saknade faktorer i modellen eftersom den normala tomt på rester visade linjära beteende och inget specifikt mönster iakttogs i residualerna vs förutspått tomt (fig. 5A och 5B ). Det fanns också ingen trend under hela experimentet för att indikera en dold tidsberoende variabel (figur 5C). Istället modellprognoser var i mycket god överensstämmelse med den observerade DsRed fluorescens (figur 5D). Vi therefore antas att den valda modellen var användbart för att förutsäga gående uttryck av DsRed i icke-Cotyledon tobaksblad som drivs av olika promotor / 5'UTR kombinationer under en post-infiltration inkubationstid som varar 8 dagar. Vi valde också en konstgjord linjär regressionsmodell utan data transformation för att belysa konsekvenserna av fel faktor urval och transformation (Figur 6). Helt klart avviker normalplot av residualer från den förväntade linjära beteende (figur 6A) och det finns en "v"-formade mönster i residualerna vs förutspått tomt istället för en slumpmässig spridning (figur 6B). Dessutom belyser rester vs köra tomt två extremvärden (figur 6C), medan förutsägelser är dålig för både små och stora värden, som avviker från den optimala modellen (diagonalt) (figur 6D).

5'UTR kombinationer med CaMV 35SS promotorn resulterade i starkare DsRed uttryck än kombinationer med nos-promotorn (fig. 5A och 5B) som tidigare rapporterade ³⁴ och motsvarande faktorer befanns vara betydande i DoE modellen (tabell 2). Modellen förutspådde också att blad ålder var en viktig faktor (tabell 2) med uttrycksnivåer visat sig vara högre i unga blad (figur 7B och 7D) som var i god överensstämmelse med våra tidigare fynd ¹⁹ och andras ^7,8. Utvecklingen av DsRed ackumulering i bladen var inte linjär eller exponentiell men följde en sigmoidal kurva under de 8 dagarna efter infiltration inkubation enligt modellen. Intressant nog fanns det ingen fast ordningsföljd 5'UTRs i termer av motsvarande DsRed expression. Följaktligen är "styrka" av en 5'UTR var beroende på den åtföljande promotor. Det är osannolikt att dennaömsesidigt beroende mellan promotorn och 5'UTR skulle ha avslöjats med hjälp av en OFAT experiment. Den prediktiva modellen visade också att vissa par av promotor / 5'UTR kombinationer (t.ex.. CaMV 35SS/CHS och nos / CHS (fig. 7A och 7B), CaMV 35SS/omega och nos / CHS eller CaMV 35SS/CHS och CaMV 35SS / TL) resulterade i en balanserad expressionsnivåer, skiljer sig med mindre än 30% från ett definierat förhållande i alla blad och inkubationstider> 2 dagar (t ex. för CaMV 35SS/omega och nos / CHS förhållandet var ~ 8,0) ^20. Sådan balanserad expression skulle vara användbart för expression av multimera proteiner, såsom IgA med en definierad stökiometri ^35,36.

Figur 5. Graphical utvärdering av modellkvalitet. En. Den sannolikhetsdiagram för de internt studentized residualer visar normalfördelning eftersom residualerna följer en linje. B. Internt studentized restprodukter strö runt värdet noll för alla typer av den förväntade svaret (fluorescens) med lämplig data transformation. C. Internt studentized restprodukter strö runt värdet noll under hela loppet av experimentet visar frånvaron av dolda tidsmässiga effekter. D. Predicted och ärvärden för responsen är i god överensstämmelse som alla punkterna ligger nära diagonalen (ideal modell).

Figur 6. Diagnostik indikerar låg modell kvalitet. A B. Internt studentized residualerna visar ett "v"-formade fördelning som anger en olämplig data transformation. C. Internt studentized residualer strö inte runt värdet noll under hela kursen av experimentet, men uppvisar en tendens till positiva värden. Dessutom kan två extremvärden hittas. D. Förutses och verkliga värden av svaret är i dåligt överens eftersom de flesta punkter avviker från diagonalen (perfekt modell).

Figur 7. Response ytor för transient DsRed uttryck i tobaksblad. A . trong> nos / CHS i blad 2, B. CaMV 35SS/CHS i blad 2, C. CaMV 35SS/TL i blad 6, D. CaMV 35SS/CHS i blad 6. DsRed koncentrationer ökades en sigmoidal sätt under inkubationstiden. Uttrycksnivåer var lägre i gamla löv (t.ex. blad 2 i A och B) jämfört med unga blad (t.ex. blad 6 i C och D) och för nos (A) jämfört med CaMV 35SS promotorn (B). Den 5'UTR hade också en betydande inverkan på DsRed uttryck (t.ex. TL (C) vs CHS (D)) men uttrycket styrkan var beroende av den medföljande promotorn.

"> Df

Källa	Summan av kvadrater	Mean Square	F-värde	p-värde
Modell	174,85	95	1,84	182,12	<0,0001
Position på blad (A)	0,16	1	0,16	16,06	0,0001
Inkubationstiden (B)	112,46	1	112,46	11128,22	<0,0001
Leaf ålder (C)	15,24	7	2,18	215,39	<0,0001
Promoter (D)	23,49	1	23,49	2324.29	<0,0001
5'UTR (E)	0,93	3	0,31	30,61	<0,0001
AC	0,24	7	0,034	3,38	0,0026
BC	1,46	7	0,21	20,64	<0,0001
BD	2,27	1	2,27	224,51	<0,0001
VARA	0,87	3	0,29	28,74	<0,0001
CD	0,29	7	0,042	4,11	0,0005
CE	0,43	21	0,021	2,04	0,0093
DE	0,48	3	0,16	15,73	<0,0001
B2	6,34	1	6,34	627,29	<0,0001
BCD	0,95	7	0,14	13,42	<0,0001
BCE	0,39	21	0,019		0,0230
BDE	0,16	3	0,054	5,37	0,0017
B2D	1,49	1	1,49	147,93	<0,0001
Residual	1,15	114	0,010
Brist-of-fit	1,08	104	0,010	1,45	0,2669
Rent fel	0,072	10	7.153E-003
Korrelation totala	176,01	209
Korrelationskoefficienter	Värde
R-kvadrat	0,9935
Justerad R-kvadrat	0,9880
Predicted R-kvadrat	0,9770

Tabell 2. Faktorer som ingår i det prediktivamodell för transient DsRed uttryck i tobaksblad med olika promotor / 5 'UTR kombinationer. tre-faktorinteraktioner är markerade med fet stil.

Optimera inkubationsförhållanden och skördesystem för produktion av monoklonala antikroppar i växter genom gående uttryck

DOE tillvägagångssätt användes också för att optimera inkubationstemperatur, bakteriellt OD600nm för blad infiltration, växt ålder och skörd ordningar, för samtidig produktion av den monoklonala HIV-neutraliserande antikropp 2G12 och DsRed i tobak ^19. Skörden systemet bestäms vilka blad användes för proteinutvinning, till exempel de sex översta bladen. Vi etablerade därmed en prediktiv modell för uttrycket av varje protein (2G12 och DsRed) i växter vid olika åldrar (ung = tidig knoppstadiet = skörd på 40 dagar efter sådd, gammal = mogen knoppstadiet = skörd på 47 dagar efter att seding). Dessa fyra modeller utvärderades sedan och en konsensusmodell etablerad som inkluderade varje faktor visar sig vara betydande i de olika modellerna. Vi bekräftade sedan att konsensusmodellen var fortfarande en bra representation av alla initiala datamängder (tabell 3). Konsensus modell användes därefter för att identifiera optimala inkubationstemperaturer (~ 22 ° C under 2G12 och ~ 25 ° C under DsRed) och bakteriell OD _600nm (~ 1,0) för båda proteinerna. Dessa optimala betingelser användes sedan för att förutsäga proteinkoncentrationer i alla blad (1-8) och blad positioner (1-4) i unga och gamla anläggningar. Koncentrationsprofiler integrerades med biomassa uppgifter ¹⁹ för att ge den absoluta mängden målprotein som erhållits från olika blad och växt åldrar (figur 8A). Absoluta protein belopp har sedan korreleras med tillhörande kostnader i senare led gör att vi kan genomföra en kostnads-nyttoanalys för behandling av varje blad / växt ålder. Detta visade attunga plantor var fördelaktigt för övergående uttryck eftersom proteinerna nådde högre koncentrationer under kortare tillväxtperioder trots den lägre totala biomassan jämfört med gamla anläggningar (figur 8B och 8C). Vi fann också att bearbeta alla blad från gamla anläggningar var dyrare än kasta löv 1-3 och öka antalet plantor per sats istället (Figur 8D). Därför DoE-baserade modeller passar inte bara för att markera det sista steget i ett experiment, men även för kombination med andra data för att underlätta mer komplexa aspekter av processanalys. Ett antal sammankopplade modeller som täcker hela produktionsprocessen för ett biofarmaceutiskt protein kan vara det slutliga målet.

Figur 8. INTEGRAT ion av koncentrationsuppgifter biomassa och protein resulterar i absoluta kostnader protein avkastning och process. A. Leaf biomassa och målprotein koncentration utvecklades inte på ett samlinjär sätt som resulterar i en partisk ansamling av 2G12 i unga blad. B. Samma mängd DsRed och ~ 65% av 2G12 hittades i unga plantor jämfört med gamla, trots en ~ genomsnitt 50% lägre biomassa. C. Detta återspeglade den högre specifika proteinuttryck i unga plantor. D. Den ökade specifika uttryck översättas till reducerade produktionskostnader för båda proteinerna eftersom mindre biomassa behövde bearbetas kräver mindre växthusutrymme, färre förbrukningsartiklar (t.ex.. Filter), och mindre utrustning nedströms.

pt, bredd: 48pt "width =" 64 "> Växt ålder [dps] t ">

40				47
Målprotein [-]	DsRed		2G12		DsRed		2G12
Model [-]	Initial	Consensus	Initial	Consensus	Initial	Consensus	Initial	Consensus
R-kvadrat [-]	0,9829	0,9577	0,9321	0,9099	0,9436	0,9403	0,8826	0,8782
Justerad R-kvadrat [-]	0,9711	0,9480	0,9059	0,8893	0,9362	0,9350	0,8716	0,8674
Predicted R-kvadrat [-]	0,9510	0,9336	0,8272	0,8587	0,9254	0,9282	0,8554	0,8516

Tabell 3. Jämförelse av korrelationskoefficienterna för inledande RSM-modeller och den slutliga konsensusmodellen DsRed och 2G12 uttryck i tobaksplantor.

Discussion

Varje experiment kräver noggrann planering eftersom resurserna är ofta knappa och dyra. Detta gäller särskilt för DoE strategier eftersom fel under planeringsfasen (t.ex. välja en basmodell som inte täcker alla viktiga faktor interaktioner) avsevärt kan minska den prediktiva kraften i de resulterande modellerna och därmed devalvera hela experimentet. Dock kan dessa fel lätt undvikas genom att följa grundläggande förfaranden.

Överväganden under DoE planering

För det första är det viktigt att välja ett svar som är lämpligt för att utvärdera resultatet (positiv eller negativ) för varje DoE loppet. Till exempel: den koncentration av ett målprotein som bestämdes genom UV-absorption ³⁷ är användbar för att utvärdera aktiviteten för en viss promotor / 5'UTR kombination. Emellertid funktionell utvärdering av ett protein (t ex. Genom fluorescens i fallet med DsRed eller bindning till protein A i CASe av 2G12) är ännu bättre eftersom det innehåller också en proteinkvalitetsaspekten. Svaren kan också vara värden som beräknats från två eller flera separata parametrar, till exempel kraftnummer NP i jäsningsexperiment (beräknat från ineffekt, varvtal och omrörare diameter). Svaret bör ge värden med hög precision (dvs låg standardavvikelse) och noggrannhet (dvs noll eller några störande parametrar) för att förbättra modellen kvaliteten. Lämpliga detektorer och metoder bör därför optimeras innan experimentet vid behov.

Faktorer som påverkar svaret måste identifieras innan DoE förs eftersom RSM används för att bestämma den exakta effekten av de faktorer och inte för att välja dem. Valet av faktorer med betydande inflytande på svaret kan uppnås genom att studera litteraturdata men fulla eller fraktionerade faktor DoE strategier är mer effektiva. Dessa screeningsexperiment börockså användas för att bestämma ett intervall för varje faktor inom vilket kan uppnås meningsfulla resultat, t ex i biologiska system faktorn "temperatur" är ofta begränsad till intervallet från 10 till 40 ° C. Diskreta nivåer bör då definieras inom dessa intervall för numeriska faktorer som är tekniskt svårt att kontrollera, t.ex. fytotron temperaturer har en tolerans på ± 2,0 ° C så det är olämpligt att undersöka temperaturskillnader på ± 1,0 ° C. Praktiska begränsningar kan också komma in i bilden, t.ex. med> 25 olika koncentrationer av en särskild förening. Dock måste antalet nivåer vara minst en som är större än den förväntade polynom ordning som faktor i basmodellen, t.ex. om polynomet ordning temperaturen är n = 2, så åtminstone tre temperaturnivåer måste undersökas. Använda basmodeller av hög polynom ordning (kubisk eller ovan) är ett alternativ om polynomet ordning av en faktor är osäker.Detta kan dock avsevärt öka antalet körningar som krävs för DoE.

För komplexa system med många faktorer och höga polynom order kan detta resultera i konstruktioner som inte kan beräknas på ett effektivt sätt. I sådana fall kan det vara lämpligt att dela upp problemet i två eller flera konstruktioner som undersöker olika undergrupper av faktorer. Dock måste de viktigaste faktorerna som utelämnats från sådana "split-design" justeras noggrant till fasta värden för att undvika en snedvridning av resultaten. Varje split-design bör upprepas vid olika inställningar för de utelämnade faktorer att avslöja samspelet mellan dessa och de faktorer som ingår i konstruktionen. Det är fördelaktigt att identifiera de faktorer som har störst inverkan på svaret och inkludera dem i alla utföranden.

Kritiska aspekter under DoE utvärdering

Den FDS bör vara den första parametern utvärderas i ett nyligen beräknat DoE. Operatören måste bekräfta att the DoE tillhandahåller erforderlig täckning av konstruktionsutrymme för den erforderliga minimala detekterbara skillnad och uppskattade standardavvikelsen för svaret. Om så inte är fallet, bör utformningen kompletteras med ett lämpligt antal körningar och replikat förrän kraven är uppfyllda. Förfarandet för beräkning DoE körningar kan initieras flera gånger för att välja mönster med en minimal förlust av optima om balansen mellan kategoriska faktorer är aktiverat.

Data omvandling bör genomföras om svarsvärdena spänner mer än en storleksordning. En Log ₁₀ förvandling är ofta lämpligt men Box-Cox tomten kommer att föreslå den omvandling som kommer att ge den mest stabila modellen. Omvandlingen föreslås i denna tomt kan förändras när den slutliga modellen har valts ut, och bör därför omprövas. Bara betydelsefulla faktorer (p-värde <0,05) bör ingå i svaret yta modell för att garantera dess prediktiva power. Undantag kan göras för att behålla modellen hierarkin ^32,33 eller att inkludera faktorer som är kända för att ha en effekt baserat på tidigare resultat. I det senare fallet är det lämpligt att undersöka varför dessa viktiga faktorer inte befanns vara betydande i den aktuella DoE. Bristen-of-fit parameter kan användas i kombination med R-kvadratvärdet (tabell 2 och 3) för snabb upptäckt av dåliga modeller / anfall, medan det justerade R-kvadrat visar om alltför många / obetydliga faktorer har valts och den förutsagda R-kvadrat är en indikator för den prediktiva kraften i modellen. Men de kvarvarande tomterna som finns i den del av DesignExpert diagnostik är ännu viktigare att bedöma modellens kvalitet eftersom de tillåter att upptäcka trender i datasetet som anger förekomsten av dolda faktorer samt identifiering av extremvärden. De senare har en över genomsnittet inverkan på passform och snedvrida modellen. Sådana värden kan komma från felaktiga uppgifter (t.ex. permuterat värden) som måste rättas till, eller från misslyckade experiment som måste upprepas. Om ett extremt värde visar sig vara "riktiga" i sådana upprepningsexperiment är det lämpligt att lägga till flera körningar i närheten av detta värde för att förbättra modellen kvalitet inom detta område av design utrymme.

Korrigeringar av mönster som är ofullständig eller för liten

Oavsett varför ytterligare körningar kan krävas (t.ex. uppgifter som saknas, missade körningar, äkta extremvärden och regioner, oförutsedda höga orderfaktor interaktioner) bör dessa körningar läggas till den befintliga konstruktionen på ett ordnat sätt, genom att använda "design augmentation" verktyg att införa de nya körs i ett separat block. Om du gör det kommer att underlätta användningen av det tidigare datasetet när du väljer de mest meningsfulla extra körningar. Resultatet kommer att vara en modell som passar till data och tillåter tillförlitligförutsäga framtida resultat.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Design-Expert(R) 8	Stat-Ease, Inc.	n.a.	DoE software
Tryptone	Carl Roth GmbH	8952.2	Media component
Yeast extract	Carl Roth GmbH	2363.2	Media component
Sodium chloride	Carl Roth GmbH	P029.2	Media component
Ampicillin	Carl Roth GmbH	K029.2	Antibiotic
Agar-Agar	Carl Roth GmbH	5210.2	Media component
Escherichia coli K12 DH5a	Life Technologies	18263-012	Microorganism
pPAM	GenBank	AY027531	Cloning/expression vector;
NucleoSpin Plasmid	MACHEREY-NAGEL GmbH	740588.250	Plasmid DNA isolation kit
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up	MACHEREY-NAGEL GmbH	740609.250	Plasmid DNA purification kit
NanoDrop 2000	Thermo Scientific	n.a.	Spectrophotometer
NcoI	New England Biolabs Inc.	R3193L	Restrictionendonuclease
EcoRI	New England Biolabs Inc.	R3101L	Restrictionendonuclease
AscI	New England Biolabs Inc.	R0558L	Restrictionendonuclease
NEB 4	New England Biolabs Inc.	B7004S	Restrictionendonuclease buffer
TRIS	Carl Roth GmbH	4855.3	Media component
Disodium tetraborate	Carl Roth GmbH	4403.3	Media component
EDTA	Carl Roth GmbH	8040.2	Media component
Agarose	Carl Roth GmbH	6352.4	Media component
Bromophenol blue	Carl Roth GmbH	A512.1	Color indicator
Xylene cyanol	Carl Roth GmbH	A513.1	Color indicator
Glycerol	Carl Roth GmbH	7530.2	Media component
Mini-Sub Cell GT Cell	BioRad	170-4406	Gel electrophoresis chamber
Agrobacterium tumefaciens strain GV3101:pMP90RK	DSMZ	12365	Microorganism
Electroporator 2510	Eppendorf	4307000.658	Electroporator
Beef extract	Carl Roth GmbH	X975.2	Media component
Peptone	Carl Roth GmbH	2365.2	Media component
Sucrose	Carl Roth GmbH	4621.2	Media component
Magnesium sulfate	Carl Roth GmbH	0261.3	Media component
Carbenicillin	Carl Roth GmbH	6344.2	Antibiotic
Kanamycin	Carl Roth GmbH	T832.3	Antibiotic
Rifampicin	Carl Roth GmbH	4163.2	Antibiotic
FWD primer	Eurofins MWG Operon	n.a.	CCT CAG GAA GAG CAA TAC
REV primer	Eurofins MWG Operon	n.a.	CCA AAG CGA GTA CAC AAC
2720 Thermal cycler	Applied Biosystems	4359659	Thermocycler
RNAfold webserver	University of Vienna	n.a.	Software
Ferty 2 Mega	Kammlott	5.220072	Fertilizer
Grodan Rockwool Cubes 10 x10 cm	Grodan	n.a.	Rockwool block
Greenhouse	n.a.	n.a.	For plant cultivation
Phytotron	Ilka Zell	n.a.	For plant cultivation
Omnifix-F Solo	B. Braun	6064204	Syringe
Murashige and Skoog salts	Duchefa	M 0222.0010	Media component
Glucose	Carl Roth GmbH	6780.2	Media component
Acetosyringone	Sigma-Aldrich	D134406-5G	Phytohormon analogon
BioPhotometer plus	Eppendorf	6132 000.008	Photometer
Osram cool white 36 W	Osram	4930440	Light source
Disodium phosphate	Carl Roth GmbH	4984.3	Media component
Centrifuge 5415D	Eppendorf	5424 000.410	Centrifuge
Forma -86C ULT freezer	ThermoFisher	88400	Freezer
Synergy HT	BioTek	SIAFRT	Fluorescence plate reader
Biacore T200	GE Healthcare	n.a.	SPR device
Protein A	Life Technologies	10-1006	Antibody binding protein
HEPES	Carl Roth GmbH	9105.3	Media component
Tween-20	Carl Roth GmbH	9127.3	Media component
2G12 antibody	Polymun	AB002	Reference antibody