Summary
We beschrijven een experimenteel ontwerp aanpak die kan worden bepaald en modelleren invloed van transgene regulerende elementen plantengroei en ontwikkeling parameters en incubatieomstandigheden de tijdelijke expressie van monoklonale antilichamen en reporter eiwitten in planten.
Abstract
Planten bieden meerdere voordelen voor de productie van biofarmaceutische producten met lage kosten, schaalbaarheid en veiligheid. Tijdelijke expressie biedt het bijkomende voordeel van de korte ontwikkeling en productie tijden, maar expressie niveaus kunnen aanzienlijk verschillen tussen batches dus aanleiding geven tot regelgeving betreft in het kader van de goede praktijken bij het vervaardigen. We gebruikten een ontwerp van experimenten (DOE) benadering van het effect van de belangrijkste factoren als regulerende elementen in het expressieconstruct, plantengroei en ontwikkeling, alsook de incubatieomstandigheden tijdens expressie, de variabiliteit van expressie tussen partijen kan worden toegepast. We testten planten die een model anti-HIV-monoklonaal antilichaam (2G12) en een fluorescente merker proteïne (DsRed). We bespreken de reden voor het selecteren van bepaalde eigenschappen van het model en identificeren van de mogelijke beperkingen. De algemene aanpak kan gemakkelijk worden overgedragen aan andere problemen, omdat de beginselen van het model eenre breed toepasbaar: op kennis gebaseerde parameter selectie, complexiteit reductie door het splitsen van de initiële probleem in kleinere modules,-software stapsgewijze installatie van optimale experiment combinaties en stapsgewijze ontwerp augmentatie. Daarom is de methode is niet alleen nuttig voor het karakteriseren van eiwitexpressie in planten, maar ook voor het onderzoeken van andere complexe systemen ontbreekt een mechanistische beschrijving. De voorspellende vergelijkingen die de interconnectiviteit tussen parameters kunnen worden gebruikt om mechanistische modellen voor andere complexe systemen stellen.
Introduction
De productie van biofarmaceutische eiwitten in planten is gunstig omdat planten goedkoop te kweken, kan het platform worden opgeschaald door gewoon groeit planten en menselijke pathogenen niet kunnen repliceren 1,2. Tijdelijke expressie strategieën gebaseerd bijvoorbeeld op infiltratie van bladeren met Agrobacterium tumefaciens biedt extra voordelen omdat de tijd tussen het moment van levering van DNA en de levering van een gezuiverd product wordt verminderd van jaar tot minder dan 2 maanden 3. Tijdelijke expressie wordt ook gebruikt voor functionele analyse, bijvoorbeeld om genen te testen op hun vermogen om verlies-van-functie mutanten aanvulling of eiwitinteracties 4-6 onderzoeken. Echter, transiënte expressieniveaus vaak meer batch-to-batch variatie dan expressieniveaus in transgene planten 7-9 tonen. Dit vermindert de waarschijnlijkheid dat biofarmaceutische productieprocessen op basis van transiënte expressie wizal worden goedgekeurd in het kader van goede fabricagemethoden (GMP), omdat de reproduceerbaarheid is een kritische attribuut kwaliteit en is onderhevig aan risico-evaluatie 10. Dergelijke variatie kan ook maskeren alle interacties die onderzoekers willen onderzoeken. Daarom hebben we besloten om de belangrijkste factoren die transiënte expressie niveaus in planten beïnvloeden en een hoge-kwaliteit kwantitatief voorspellend model te bouwen identificeren.
De een-factor-per-tijd (OFAT) methode wordt vaak gebruikt om het effect (werking) van bepaalde parameters (factoren) van de resultaten (respons) van een experiment 11 karakteriseren. Maar dit is niet optimaal omdat de individuele tests (loopt) tijdens een onderzoek (experiment) zal worden aangepast als parels aan een koord door het potentieel gebied overspannen door de factoren die worden getest (ontwerp ruimte). De dekking van het ontwerp ruimte en daarmee de mate van informatie uit het experiment islaag, zoals getoond in figuur 1A 12. Bovendien kunnen onderlinge afhankelijkheden tussen verschillende factoren (factor interacties) blijven verborgen resulteert in slechte modellen en / of voorspelling van valse optima, zoals weergegeven in figuur 1B 13.
De hierboven beschreven nadelen kunnen worden vermeden door een ontwerp van experimenten (DOE) benadering waarbij de runs van een experiment meer gelijkmatig verspreid over de ontwerpruimte, betekent dat meer dan een factor wordt gevarieerd tussen twee punten 14. Er zijn gespecialiseerde ontwerpen voor mengsels, screening factoren (factoriële designs) en de kwantificering van factor effecten op reacties (respons oppervlak methoden, RSM en) 15. Bovendien kan RSMs worden gerealiseerd als centraal-composite ontwerpen, maar kan ook effectief worden bereikt met behulp van gespecialiseerde software die verschillende criteria van toepassing kan zijn voor de selectie van de pistes. Bijvoorbeeld, de zogenaamde D-optimality criterium zal runs selecteren, zodat om de fout te minimaliseren in de coëfficiënten van het resulterende model, terwijl de IV-optimalisatiecriterium selecteert runs die de laagste voorspelling variantie door het ontwerp ruimte 15,16 bereiken. De RSM we hier beschrijven kan de precieze kwantificering van voorbijgaande eiwit expressie in planten, maar het kan gemakkelijk worden overgedragen naar een systeem waarbij meerdere (~ 5-8) numerieke factoren (bijvoorbeeld temperatuur, tijd, concentratie) en een paar (~ 2 - 4) categorische factoren (bijv. promotor, kleur) waarin een mechanistische beschrijving is beschikbaar of te complex model.
De DoE benadering ontstaan in de landbouwwetenschappen maar heeft verspreid naar andere gebieden, omdat het overdraagbaar aan een situatie waarin het nuttig om het aantal runs moeten betrouwbare gegevens te verkrijgen verminderen en beschrijvende modellen voor complexe processen. Dit heeft geleid tot het opnemen van DoE in de "Leidraad voorIndustrie, Q8 (R2) Pharmaceutical Development ", gepubliceerd door de Internationale Conferentie voor Harmonisatie van de technische voorschriften voor de registratie van farmaceutische producten voor menselijk gebruik (ICH) 17. DoE wordt nu op grote schaal gebruikt in wetenschappelijk onderzoek en de industrie 18. Moet echter zorg tijdens worden genomen de planning en uitvoering van het experiment, omdat het selecteren van een onjuiste polynomiale graad voor de meervoudige lineaire-regressiemodel (basismodel) kan een behoefte aan extra punten voor alle factor effecten correct model te introduceren. Bovendien, beschadigde of ontbrekende gegevens te genereren onjuiste modellen en gebrekkig voorspellingen, en kan zelfs voorkomen dat modelbouw poging zoals beschreven in het protocol en discussie secties 18. In de sectie protocol, zullen we in eerste instantie de belangrijkste planning stappen voor een RSM-based experiment uiteengezet en vervolgens verklaren het ontwerp op basis van het DoE software DesignExpert v8.1. Maar gelijkaardige ontwerpen gebouwd kan worden met andere software including JMP, Modde, en STATISTICA. De experimentele procedures worden gevolgd door instructies voor data-analyse en evaluatie.
Figuur 1. Vergelijking van OFAT en DoE. A. Sequentiële variatie van een factor per keer (OFAT) in een experiment (zwart, rood en blauwe cirkels) realiseert een lage dekkingsgraad van het ontwerp ruimte (gearceerde gebieden). In tegenstelling, de variatie van meerdere factoren tegelijk met het experimenteel ontwerp (DOE) strategie (groene cirkels) verhoogt de dekking en daarmee de nauwkeurigheid van de resulterende modellen. B. De bevooroordeelde ontwerp ruimte dekking betekent dat OFAT experimenten (zwarte cirkels) ook kan falen om een optimale operationele gebieden (rood) identificeren en suboptimale oplossingen (grote zwarte cirkel) te voorspellen, terwijl DoE strategisches (zwarte sterren) hebben meer kans om de voorkeur omstandigheden (grote zwarte ster) te identificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Het plannen van een DoE strategie
- Identificeer relevante factoren en reacties voor opname in het ontwerp.
- Definieer een of meerdere antwoorden voor meting. Hier werden 2G12 en DsRed expressieniveaus gebruikt (ug / ml), zoals de minimale detecteerbare verschil geacht relevant (10 en 20 ug / ml) en een benaderende waarde voor de geschatte standaarddeviatie van het systeem (4 en 8 ug / ml) op basis van eerdere experimenten.
- Gebruik de beschikbare literatuur, gegevens uit eerdere experimenten of gespecialiseerde screening designs (bijvoorbeeld een factorieel ontwerp, zie de inleiding) om belangrijke factoren waarvan de invloed op de antwoorden zullen worden gekwantificeerd (tabel 1) 7,8,19,20 selecteren.
- Verdeel de factor types (numerieke of categorisch) en selecteer binnen welke de numerieke factoren tijdens het DoE onderzoek (tabel 1) zal worden gewijzigd.
- Identificeer Numeric factoren waarvoor continue variatie is moeilijk uit te voeren.
- Gebruik continue variatie van factoren die niet nauwkeurig kan worden ingesteld op een bepaald niveau. Bijv. incubatie temperatuur kan typisch alleen binnen ± 2 ° C gecontroleerd, dus continue variatie met waarden zoals 27.2 ° C, 25.9 ° C en 29.3 ° C must vermeden.
- In plaats daarvan selecteert een aantal discrete niveaus van deze factoren (tabel 1). Het aantal niveaus moet overeenkomen met de verwachte basismodel (stap 1.2). Dit is alleen van belang voor een optimale ontwerpen, omdat centrale samengestelde ontwerpen hebben altijd discrete factor niveaus.
- Toewijzen of een categorische factor is nominaal, dwz geen impliciete volgorde (bijv. verschillende fabrikanten), of ordinale en dus een discrete numerieke parameter (bv. verschillende bladeren op een plant).
- Selecteer het niveau voor beide soorten categorische factoren. </ Li>
- Selecteer een handige basismodel.
- Op basis van de voorlopige experimenten en literatuur anticiperen op de relatie tussen elk element en zelf ook factor interacties en de respons. Bijvoorbeeld, lineair (hoe meer hoe beter), kwadratisch (enkel optimaal of niet-lineaire toename / afname) of kubieke (scheef optimaal).
- Zorg ervoor dat het aantal niveaus voor discrete numerieke factoren is n + 1, waarbij n de polynomiale graad van de relatie tussen de factor en reactie. Bijvoorbeeld, als de temperatuur wordt naar een kwadratisch effect op de reactie hebben, n = 2 en derhalve ten minste drie temperatuurniveaus moeten worden onderzocht om een fit aan de kwadratisch effect.
- Definieer de fractie van het ontwerp ruimte (FDS) waarvoor de voorspelling variantie moet onder een bepaalde drempel (alfa-niveau). De FDS moet> 0,95 (beslaan meer dan 95% van het ontwerp ruimte) om modellen die robuuste voorspellingen opleveren overal bereikenhet hele ontwerp ruimte 21-23.
Opmerking: Een drempel van 0,05 komt overeen met een 5% significantieniveau (type I fout) en een typische waarde. Het verhogen van deze waarde zal het aantal experimenten nodig voor een DoE strategie te verminderen, maar zal tegelijkertijd de kans vergroten dat significante effecten zullen worden gemist en dat de schattingen van hun impact op de reactie zal onjuist zijn.
Tabel 1. Factoren die van invloed voorbijgaande eiwitexpressie in tabak, waaronder de variatie varieert tijdens DoE. Factoren in het vet zijn alleen opgenomen in het ontwerp voor de onder "Een beschrijvend model voor DsRed accumulatie tijdens transiënte expressie met behulp van verschillende promotor / 5'UTRs" beschreven experimenten, terwijl factoren cursief werden alleen opgenomen in het ontwerp voor "Het optimaliseren van broen omstandigheden en oogsten's voor de productie van monoklonale antilichamen in planten met transiënte expressie ".
Figuur 2. DoE planningsproces. Factoren met een significant effect op de respons in onderzoek zijn geselecteerd op basis van beschikbare gegevens. Dan factor attributen (bijvoorbeeld numeriek), fornuizen en niveaus worden toegewezen. Voorkennis en de experimenten worden gebruikt om een geschikte base model definiëren. De voorspellende kracht eisen worden gedefinieerd op basis van de toepassing / doel van het uiteindelijke model. De verzamelde gegevens kunnen vervolgens worden overgebracht naar geschikte DoE software.
2. Het opzetten van een RSM in DesignExpert
- Start DesignExpert en selecteer "New Design". In het venster "Response Surface", kies &# 34; Optimaal "en voer het aantal numerieke en categorische factoren geselecteerd in paragraaf 1.1).
- Voer factor namen, eenheden, soorten, sub-soorten, aantal niveaus / niveau grenzen en waarden voor de niveaus voor alle factoren in de bijbehorende velden.
- Ga door naar de volgende pagina en bij "zoek" opties "Best", alsmede de gewenste "Optimaliteitstheorie" criterium, hier "D-optimale".
- In het menu "model Bewerken ...", selecteer het model dat de factoren en interacties verwacht in paragraaf 1.2) bevat. Bij twijfel selecteert u een volledig model dat alle factoren en interacties voor een bepaalde graad van de polynoom, hier "Quadratic" dekt. Merk op dat een volledig model (met alle interacties) selecteren van het aantal experimenten die voor de DOE kan verhogen.
- Selecteer het aantal "Blokken". Hier werd een blok gebruikt omdat alle planten werden uit dezelfde partij, alle bacteriën waren tegelijkertijd gekweekt enalle injecties werden uitgevoerd op dezelfde dag door dezelfde exploitant. Gebruik meer dan een blok als er meer dan een partij van planten wordt gebruikt of meerdere operators omgaan met de injecties.
- De balans van de ontwerp
- Enable "Forceer categorische balans" om de pistes van het experiment gelijkmatig te verdelen onder de categorische factor niveaus, bv. verschillende promoters die worden getest.
Let op: dit kan de optimaliteit van het ontwerp te reduceren in een mate die DesignExpert wordt gerapporteerd als een waarde% afhankelijk van de door de optimalisatiecriterium algoritme gekozen punten. - Herbereken het ontwerp meerdere malen waarbij uitgevoerd random seed algoritme om de vermindering optimaliteit minimaliseren.
Opmerking: verliezen in optimaliteit kan variëren van ~ 3-40% met dezelfde invoergegevens, maar het veranderen van het aantal herhalingen kan worden gebruikt om categorische evenwicht.
- Enable "Forceer categorische balans" om de pistes van het experiment gelijkmatig te verdelen onder de categorische factor niveaus, bv. verschillende promoters die worden getest.
- De software zal een waarde te suggereren voor het aantal "Model punten" op basis van het basismodel, Hier 70 runs. Pas het aantal runs voor "repliceert" en "Voor een schatting van het gebrek aan fit" om ervoor te zorgen het is> 5% van het aantal "Model punten" voor elk, hier 10 runs.
- Ga door naar de volgende pagina, selecteert u het nummer van de reacties en voer hun namen en eenheden. Extra reacties kunnen ook worden toegevoegd op elk moment tijdens de evaluatie van gegevens zonder negatieve invloed op het ontwerp.
- Doorgaan om het algoritme te starten, de berekening van de factor niveaus voor de punten van het DoE. Als de geselecteerde basismodel komt niet overeen met het aantal niveaus voor een bepaalde factor, wordt er een melding weergegeven en de berekening zal niet starten. In dit geval ofwel:
- Verhoog het aantal niveaus voor deze factor, of
- Hef de selectie van de voorwaarden in het basismodel die niet kan worden berekend op basis van het huidige aantal niveaus.
- Bijvoorbeeld, als er twee niveaus voor de factor "incubatietijd" t (dwz 2 d en 5 d) in thij huidige ontwerp en een kwadratisch basismodel met inbegrip van de term t 2 werd geselecteerd, ofwel voegt u een derde niveau voor t (dwz 8 d) of verwijder de factor t 2 uit het model.
- Sla de spreadsheet met de optimale factor combinaties die wordt weergegeven zodra de berekening is voltooid.
- In de "Design" knooppunt selecteer de "Evaluatie" sub-node en ga naar het tabblad "Grafieken".
- In de "Grafieken functie" selecteer "FDS" en in het vakje "FDS Graph" kies "Pred" als het fout. Voer vervolgens de minimum detecteerbare verschil evenals de geschatte waarde voor de schatting van de standaardafwijking van de in punt 1.1.1 systeem) als waarden voor "d" en "s" respectievelijk (hier 20 en 8 ug / ml voor DsRed). Voer ook de alfa-niveau (aanvaardbare% ontbreekt een significant effect) voor de toepassing geschikt, meestal 0,05 (5%).
- Indien dit niet het geval is (zoals hier te vinden, FDS was 1%, zoals aangegeven in figuur 3A), ga terug naar de "Design" knooppunt en in de taakbalk selecteer "Design Tools", dan "Augment Design ..." en kies " vergroten ".
- Selecteer dezelfde "Search" en "Optimality" criteria als voorheen. Ook koos hetzelfde "Edit model" en "Forceer categorische balans" instellingen. Als het ontwerp borstvergroting wordt uitgevoerd voordat een experiment (zoals hier gedaan), verander dan de "Put loopt in blok" op "Blok1".
- In de rubriek "Runs", voer het aantal extra "Model punten" en behoud van ten minste 5% "repliceert" en "To gebrek schattenvan fit "in het totale ontwerp. Hier werden 100 extra punten toegevoegd en geen" repliceert "en" gebrek aan fit te schatten "werden opgenomen.
- Nadat de berekening gestart, tijden de FDS grafiek zoals hierboven beschreven. Als de FDS nog steeds niet bevredigend, herhalen ontwerp augmentatie zoals hierboven beschreven. Hier was de FDS 100% na vergroting en dus geen verdere vergroting nodig was (Figuur 3B).
Figuur. Vergelijking van FDS plots 3. A. Een DOE bestaande uit 90 runs produceert onvoldoende FDS slechts 1% van de standaardfout van de voorspelling met behulp van een kwadratische basismodel in combinatie met de waarden voor de minimale detecteerbare verschil (20 ug / ml) en schattingengedekt standaardafwijking van het systeem (8 ug / ml). B. Vergroting van het DoE tot een totaal van 210 runs behaalde een 100% FDS en een vlakke curve aangeeft uniform nauwkeurigheid van het model door het ontwerp ruimte.
3. Klonering en analyse van expressiecassettes
- Ontwikkel Escherichia coli in 5 ml LB-medium (10 g / l trypton, 5 g / L gistextract, 170 mM NaCl, 50 mg / L ampicilline, LB-agarplaten onder 15 g / L agar) bij 37 ° C gedurende 6 -8 uur of 's nachts op een orbitale schudder bij 160 rpm. LET OP: ampicilline is een schadelijke stof. Inoculeren de LB-medium met ofwel 50 ul van vloeibare cultuur of overdracht cellen uit kolonies gegroeid op platen met behulp van een pipet tip.
- Voor de zuivering van pso plasmide-DNA en andere derivaten van PPAM (GenBank AY027531), uit E. coli K12 stam DH5a, volg de instructies in het DNA-zuivering kit handleiding 24. LET OP: de zuivering khet bevat schadelijke stoffen (zie hierboven handleiding voor meer informatie). Het plasmide sequentie wordt beschreven in figuur 4 en Koper et al.. 20.
- Bepaal de DNA-concentratie in het gezuiverde eluaat door meting van de absorptie van een 2 pl monster bij 260 nm in een NanoDrop apparaat.
- Bevestig de identiteit van het gezuiverde plasmide DNA door digestie met restrictie endonucleasen (RE).
- Selecteer de RI volgens de plasmide sequentie zodat uniek en onderscheiden fragment patronen worden gegenereerd. De aanbevelingen van de fabrikant voor de spijsvertering aandoeningen zoals reactievolume, tijd, temperatuur en concentratie van de stabilisator runderserumalbumine. Afhankelijk van de gevoeligheid van het analyseapparaat, gebruik 50-500 ng plasmide-DNA per digestie.
- Bereid 0,8-2,0% gels voor de scheiding van DNA fragmenten door koken agarose in tris-boraat-EDTA (TBE) buffer (90 mM Tris, 90 mM boraat, 2 mM EDTA, pH 8,0). Thij groter de verwachte fragmenten, des te minder agarose worden in de gel.
- Voeg 5 ui vijfvoudige monsterbuffer (5x SABU, 0,1% (w / v) broomfenolblauw, 0,1% (w / v) xyleencyanol, 10% (w / v) glycerol opgelost in TBE) 50 ui van het RE-behandelde DNA monster en de fragmenten gescheiden door agarosegel elektroforese bij 100 V gedurende ~ 40 minuten of tot duidelijke scheiding van de fragmenten wordt verkregen. Op elke gel, onder andere een laan met DNA-ladder grootte markers voor vergelijking, bijv. 2-3 pi 1-kb ladder.
- Vervang de omega 5'UTR in PSO met een van de andere drie 5'UTRs.
- Laat de omega 5 'UTR sequentie van ~ 4 ug gezuiverd PSO DNA door behandeling met 20 eenheden EcoRI-HF en NcoI-HF RE in NEBuffer 4 bij 37 ° C voor ~ 60 minuten. Dan scheiden de fragmenten zoals beschreven in de paragrafen 3.4.2 en 3.4.3.
- Isoleer het grote fragment (pS "backbone") uit de agarosegel met een gel extractie kit volgens de fabrikant handleiding 25 en bepaal de concentratie van het gezuiverde DNA zoals beschreven in paragraaf 3.3). LET OP: de gelextractiekit bevat schadelijke stoffen, zie de handleiding voor meer informatie.
- Isoleer de CHS, CHS-LPH en TL 5'UTRs van geschikte donor vectoren door behandeling ~ 10 pg van elke vector met 20 eenheden EcoRI-HF en NcoI-HF RE in NEBuffer 4 bij 37 ° C voor ~ 60 minuten. Dan scheiden de fragmenten zoals beschreven in de paragrafen 3.4.2 en 3.4.3 en zuiveren de kleinere 5'UTR-bevattende fragment zoals beschreven in paragraaf 3.5.2.
- Ligeren van de geïsoleerde gezuiverde 5'UTRs in afzonderlijke porties aan de geïsoleerde gezuiverde lineaire pS vector bij 25 ° C gedurende 5 min volgens de aanbevelingen van de fabrikant 26. Gebruik ~ 50 ng vector DNA en een drie-voudige molaire overmaat van 5 'UTR DNA in een totaal volume van 20 pl.
- Transformatie van E. coli-cellen met ee recombinante plasmiden 26,27.
- Voeg ~ 10 ng (~ 4-5 pl) van ligeringsmengsel (zie paragraaf 3.5.4) tot 50 ul RbCl competente E. coli en meng voorzichtig, en vervolgens incubeer gedurende 30-60 minuten op ijs. Heat shock 1,5 min bij 42 ° C en chill op ijs gedurende 5-30 minuten.
- Voeg 950 ul van antibioticumvrij LB medium en incubeer 1 uur bij 37 ° C en 160 rpm. Voor de selectie van transformanten, verspreid 50 en 100 pl van de kweek op LB-agarplaten die ampicilline en incubeer ~ 16-20 uur bij 37 ° C.
- Inoculeren 5-10 aparte kolonies die elk promotor-5'UTR ligatie in paragraaf 3.1 beschreven in 5-ml porties van LB medium met ampicilline. Zuiveren vervolgens het plasmide-DNA en bevestigt zijn identiteit als beschreven in de punten 3.2 tot 3.4.
- Vervang de 35SS promoter met de nos promotor in elk van de vier 5'UTR plasmiden met AscI en EcoRI RE in NEBuffer 4 bij 37 ° C gedurende 1 uur, zoals beschreven in paragrafen 3.5 en 3.6.
- Breng elk van de acht resulterende plasmiden in A. tumefaciens stam GV3101: pMP90RK door elektroporatie 28.
- Voeg -500 ng gezuiverd plasmide-DNA 50 pl bevoegde A. tumefaciens cellen op ijs. Voorzichtig mengen en over in een voorgekoeld 0,2 cm elektroporatie cuvette. Zorg ervoor dat het mengsel op de bodem van de cuvet en geen luchtbellen bevat.
- Pulse cellen bij 2,5 kV voor 5 msec en bevestigen intensiteit en duur van de puls.
- Vermijdt verhoogde zoutconcentraties in het DNA-monster of onjuiste voorbereiding van de bevoegde A. tumefaciens cellen omdat deze kan leiden tot hoge ionenstromen veroorzaakt onmiddellijke verdamping van de celsuspensie, transformatie efficiëntie sterk verminderen.
- Voeg 950 ul van YEB medium zonder antibiotica (5 g / l vleesextract, 1 g / L gistextract, 5 g / L peptone, 5 g / L sucrose, 2 mM MgSO4, pH 7,0), meng onmiddellijk over in een steriele 1,5 ml reageerbuis. Incubeer 2-4 uur bij 26-28 ° C en 160 rpm.
- Spreid 1-2 pl op YEB agarplaten bevattende antibiotica (50 mg / L carbenicilline, 25 mg / L kanamycine, 25 mg / l rifampicine) voor de selectie van transformanten. LET OP: rifampicine is een giftige stof.
- Inoculeer drie 5-ml aliquots YEB medium met antibiotica met cellen van afzonderlijke kolonies die elk promoter 5 'UTR-ligatie en incubeer 48-72 uur bij 26-28 ° C en 160 rpm.
- Bevestigen het succes van A. tumefaciens transformatie.
- Transfer 2 pi van elke portie uit paragraaf 3.8.6 tot en met 48 pi fracties van PCR mastermix (2 pi van elk 10 uM primer voorraad (400 nM uiteindelijke concentratie van elke primer), scheiden1 pi 10 mM dNTP mix (200 uM uiteindelijke concentratie van elk deoxynucleoside trifosfaat), 5 pl 10-voudige Expand High Fidelity buffer met 15 mM MgCl2, 0,75 pi Expand High Fidelity enzym mix, en 39,25 pi steriel gedistilleerd water).
- Versterken de expressiecassette elk plasmide behulp van geschikte primers (FWD: 5'-CCT CAG GAA GAG CAA TAC-3 ', bindende 1026 nucleotiden stroomopwaarts van de promoter, REV: 5'-CCA AAG CGA GTA CAC AAC-3', bindende binnen de 35S polyadenyleringsplaats) onder geschikte PCR-condities. Hier, 94 ° C werd gebruikt voor initiële denaturatie gevolgd door 30 cycli van 94 ° C denaturatie gedurende 15 seconden, 51 ° C hybridisatie gedurende 30 seconden en 72 ° C gedurende 120 seconden elongatie, en een laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 8 min.
- Bepaal de grootte van de PCR producten met agarosegelelektroforese zoals beschreven in paragraaf 3.4.3.
- Bereid A. tumefaciens glycerol voorraden doormengen van 500 ui 50% (v / v) steriele glycerol met 500 ui A. tumefaciens culturen uit sectie 3.8.6 voor die transformatie is bevestigd (paragraaf 3.9.3). Bewaar de glycerol voorraden bij -80 ° C tot verder gebruik.
- Bereken het vouwen energieën van de verschillende mRNA's met de RNAfold webserver 29 en omvat de nucleotidesequentie van de transcriptionele startplaats tot de eerste 50 bp van het coderende gebied.
- In de sectie "Vouwen algoritmen en basisopties" selecteer de "minimale vrije energie (MFE) en partitie-functie" en "vermijden geïsoleerde basenparen" opties.
- In de "Advanced vouwopties" kies "bungelend energieën aan beide zijden van een helix in ieder geval", "RNA parameters (Turner model, 2004)" en verander "herschalen energie parameters om bepaalde temperatuur (C)" tot 25 ° C.
- In de sectie "Output opties" te selecteren alle opties.
Figuur 4. Promoter en 5 'UTR varianten. De expressiecassettes werden gegenereerd door de stapsgewijze uitwisseling van de 5' UTR, resulterend in vier combinaties met CaMV 35SS promoter, gevolgd door de vervanging van deze promotor de sequentie nos waardoor vier extra varianten totaal acht verschillende promotor / 5'UTR combinaties.
4. Plantenteelt
- Bereid een oplossing van de meststof 0,1% Ferty2 Mega in gedeïoniseerd water bij een pH van 5.9.
- Bereid 10 x 10 x 8 cm steenwol blokken door uitgebreid spoelen met gedemineraliseerd water om de resterende chemicaliën te verwijderen en uiteindelijk in evenwicht met kunstmest.
- Zaad tabaksplanten door het plaatsen van 1-2 tabak zaden op elk steenwol blok gevolgd door een korte lijn met kunstmest en voorzichtig om te voorkomen dat het wassen van de zaden weg.
- Ontkiemen en cultiveren de tabaksplanten voor 42 dagen in een kas bij 25/22 ° C dag / nacht temperatuur, 70% relatieve vochtigheid en een 16-uur lichtperiode (180 mmol sec -1 m -2; λ = 400-700 nm) . Tijdens deze lichtperiode, spoelen met een meststof voor 15 min elk uur in hydrocultuur.
5. Voorbijgaande eiwitexpressie
- Bereid A. tumefaciens voor injectie in bladeren.
- Inoculeren 5-50 ml YEB medium dat antibiotica met 1% A. tumefaciens cryo-voorraad cultuur en incubeer bij 27 ° C totdat de OD <sub> 600nm bereikt 5,0 (~ 48-72 uur afhankelijk van het volume en het type schip).
- Verdun de A. tumefaciens cultuur met water en 2-voudige infiltratie medium (4,3 g / l Murashige en Skoog zouten (pH 5,6), 5 g / L sucrose, 1,8 g / L glucose, 100 mM acetosyringon) aan de OD 600 nm vereist voor injectie passen. Bevestig de OD 600 nm net voor injectie. Opmerking: een OD 600 nm van 1,0 overeenkomt met ~ 1,43 ± 0,12 x 10 9 kolonievormende eenheden per ml.
- Injecteer de A. tumefaciens schorsing in bladeren.
- Selecteer en het etiket van de noncotyledon bladeren en posities daarop te worden behandeld (bijvoorbeeld volgens een DoE strategie).
- Niet injecteren verschillende A. tumefaciens oplossingen in dezelfde intercostale veld. In plaats daarvan tegengestelde gedeelten aan weerszijden van het midden-ader as. Indien meer dan twee verschillende oplossingen worden geïnjecteerd op dezelfde plaats gebruik een additional plant.
- Goed schudden A. tumefaciens oplossing voor alle cellen die kunnen zijn bewoond sinds de voorbereiding van de verdunning en zuig in een spuit van 1 ml resuspenderen.
- Zachtjes krassen op de epidermis op de plaats voor de injectie met een pipet tip of vergelijkbaar met de instroom van de A. vergemakkelijken tumefaciens oplossing. Vermijd scheuren het blad tijdens het doen.
- Houd de spuit loodrecht op het blad raakt het vat tegen de intercostale te behandelen veld en duw de uitlaat (zonder naald) op de onderzijde van het blad. Druk de bovenzijde van het blad zachtjes tegelijkertijd te voorkomen dat de bladschijf verschuiven of scheuren.
- Druk voorzichtig de spuit zuiger. De A. tumefaciens oplossing zal de intercellulaire ruimten in te voeren binnen de bladschijf, zoals aangegeven door de behandelde gebieden verschijnen donkerder groen en vochtig. Herhaal deze procedure op verschillende posities tot de gehele intercostal veld wordt geïnfiltreerd met A. tumefaciens. Ga dan verder met de volgende intercostale veld.
- Zorg ervoor dat de spuit blijft loodrecht op het blad. Kantelen van de spuit zal de bacteriële suspensie te spuiten onder hoge druk.
- Als er verschillende A. tumefaciens oplossingen worden gebruikt (bijv. verschillende promotors testen), verwijdert overtollige oplossing nog op de onderzijde van het blad van de eerste injectie met een papieren handdoek of dergelijke alvorens de volgende oplossing.
- Post-infiltratie incubatie van planten en bemonstering.
- Bereid een fytotron voor de behandelde planten ~ 24 uur voor injectie op temperatuur en vochtigheid equilibratie mogelijk op de voor het DoE niveaus.
- Na injectie, overdracht planten in de klimaatkast en plaats ze in trays groot genoeg voor irrigatie met water tot het einde van de incubatieperiode bepaald door de DOE.
- Opzetten van een 16 hr photoperiod met behulp van zes Osram koel wit 36 W TL-buizen per 0,7 m 2 (75 mmol sec -1 m -2; λ = 400-700 nm). Voorkomen dat de planten uit de schaduw elkaar door het beperken van het aantal planten tot zes per 0,7 m 2.
- Voordat een monster wordt, zorg ervoor dat de intercostale veld correcte werd geselecteerd door het label toegevoegd in paragraaf 5.2.1 en de DoE plannen vergelijken.
- Gebruik een kurkboor 4-5 blad schijven uit de behandelde intercostale velden bij de posities en tijden aangegeven door de DoE verwijderen. Heeft het hele blad niet uit de plant tijdens de bemonstering. Stabiliseren het blad met een hand-held papieren handdoek, terwijl de schijven verwijderen om scheuren te voorkomen.
- Bepaal de massa van elk monster en breng deze in een 1,5 ml plastic reageerbuisje label met naam en massa monster. Bewaar de monsters bij -20 ° C of -80 ° C voordat eiwitkwantificering. Het proces kan worden onderbroken in dit stadium voor enkele maanden, afhankelijk van monster stabiliteiten de opslagtemperatuur.
6. Eiwitkwantificering
- Uittreksel eiwitten uit de bladschijf monsters.
- Voeg 3 ml extractiebuffer (50 mM natriumfosfaat, 500 mM natriumchloride, pH 8,0) per mg Massa en maal bladschijven in de reactiebuis met een elektrische stamper totdat er geen grote fragmenten overblijven. Oververhitting van het monster.
- Verwijder gedispergeerde vaste stoffen met tweemaal centrifugeren van het monster bij 16.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Breng de bovenstaande in een schone 1,5 ml reageerbuisje na elke stap zonder de pellet te verstoren.
- Na centrifugatie kan de werkwijze worden onderbroken door bevriezing de plantenextracten bij -20 ° C of -80 ° C gedurende enkele maanden, afhankelijk van de stabiliteit monster en opslagtemperatuur. Controleer of een vries-dooi cyclus laat de concentratie van het doeleiwit (s).
- Meet de DsRed fluorescentie.
- Bereid drie technische herhalingen van elk monster in zwarte 96-well half-gebied platen (50 ul extract per well). Vermijd de vorming van bellen tijdens het pipetteren.
- Gebruik een set van zes verdunningen (0, 25, 75, 125, 175 en 225 ug / ml) van een DsRed standaard per 96-well plaat een liner referentie curve te genereren. Bereid de verdunningen in PBS en opgeslagen bij 4 ° C voor gebruik binnen 3 maanden.
- Meet de fluorescentie tweemaal achtereenvolgens in een 96-well plaatlezer uitgerust met 530/25 nm excitatie en 590/35 nm emissiefilters.
- Voor elk monster, de gemiddelde fluorescentie via twee leest en de drie technische replicaten en trek de waarde bij het blanco controlegroep met 0 ug / ml DsRed waarde. Ook trekt deze waarde uit de leest van de standaard verdunningen en gebruiken deze blanco-gecorrigeerde waarden voor een lineaire regressie waardoor een verwijzing curve (door de oorsprong van coördinaten).
- Gebruik de helling van de referentiecurve de f converterenluorescence gemeten voor de monsters in DsRed concentraties. Indien nodig verdunnen de monsters zodat de uitlezing in de concentratie-interval van de normen valt en beschouwen dit verdunningsfactor in de daaropvolgende berekeningen.
- Bepaal de concentratie van 2G12.
- Bereid een oppervlakte plasmon resonantie (SPR) inrichting voor het meten van antilichaamconcentratie door koppeling Proteïne A aan het geactiveerde oppervlak van een stroomcel. Gebruik een andere stroom cel als verwijzing door het inactiveren van het oppervlak zonder koppeling van proteïne A 30,31.
- Verdun plantenextracten 01:20 in SPR loopbuffer (10 mM HEPES pH 7,4, 3 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,05% v / v Tween-20) en de respons eenheden (RU) van antilichaambinding aan Proteïne A op drie technische replicaten van elk monster aan het einde van een 90 pl injectie (180 sec bij 30 ul / min). Trek de RU gemeten op de referentiestroom cel (geen Proteïne A) van de RU gemeten in de experimentele flow cel (Proteïne A oppervlak).
- Maatregel een 585 ng / ml 2G12 standaard na elke 10-15 monsters en aftrekken van de gemeten in de referentiestroom cellen zoals hierboven beschreven waarde. Gebruik de gemiddelde RU van deze normen aan een lineaire verwijzing curve te berekenen door de oorsprong van de coördinaten.
- Bereken de 2G12 concentraties in de monsters op basis van de 1:20 verdunning en de helling van de referentiecurve.
- Controleer voor sterke specifieke binding met de referentie cel, die de meting kan corrupt. Controleer ook of de 2G12 normen te handhaven ongeveer constante waarden (<5% variatie) de hele analyse, zoals grotere variatie weerspiegelt de vergrijzing van de Proteïne A oppervlak.
7. Data analyse en evaluatie
- (Ii) abnormale resultaten, bijv. factorcombinaties dat gen, de expressie waargenomen in de experimenten (i) extreme waarden (hoog of laag) aangeeft meetfouten antwoorden handmatig analyserenbeoordeel onverwachte reacties aangeeft gegevensuitwisseling, en (iii) de ontbrekende waarden.
NB: gebruik deze acties om modelbouw te voorkomen op basis van foutieve gegevens. - Breng de geanalyseerde respons gegevens (hier het eiwit concentraties) in de "Design" knooppunt van DesignExpert. Controleer of antwoordgegevens kunnen worden toegewezen aan de overeenkomstige factor instellingen. Er is een uitgebreide help-sectie in de DesignExpert software die betrekking heeft op de aspecten hieronder behandeld.
- In de "analyse" knooppunt, kies de respons te analyseren en kiest aanvankelijk "geen" in het tabblad transformatie.
Opmerking: een transformatie wordt aanbevolen min / max verhoudingen van de respons groter is dan 10. De meest nuttige transformatie kan worden verkregen bij de Box-Cox-plot in het tabblad "Diagnose" in het hoofdstuk "Diagnose" van de "Diagnostische functie" hieronder beschreven (paragraaf 7.8). Een Log 10 transformatie is vaak geschikt. - In de tab "model", is een eerste model voorgeselecteerd op basis van de "Fit samenvatting" resultaten. Gebruik de automatische modus om dit model te bewerken:
- Selecteer een "Process orde" dat is een order boven de voorgestelde model, bijvoorbeeld als het voorgestelde model is "2FI" (twee-factor interactie) en kies vervolgens "Quadratic".
- Kies "Backward" in het veld "Selectie", die iteratief zal verwijderen niet significante termen uit het model na te gaan tot het "ANOVA" tab op basis van de "Alpha out"-waarde die in eerste instantie zou moeten zijn 0.100.
- Als daarom gevraagd wordt door de software, altijd automatisch het model hiërarchie te corrigeren, want dit is necessary naar betrouwbare modellen 32,33 genereren.
- In het tabblad "ANOVA", onderzoeken de voorgestelde model en de opgenomen factoren. Indien nodig, handmatig welke factoren ook verwijderen met p-waarden boven een vooraf bepaalde drempelwaarde (hier 0,05, wat overeenkomt met een 5% significantie niveau) of die onwaarschijnlijk zijn gebaseerd op mechanistische beschouwing door over te schakelen naar de tab "model", het veranderen van "Selection" "Manual" en het elimineren van de relevante factoren uit het model.
- Terug in de tab "ANOVA" beoordeelt de vernieuwde model in termen van de p-waarde van de "Model" (een lage waarde wenselijk is, omdat dit aangeeft betekenis) en "Lack-of-fit" (een hoge waarde wenselijk omdat dit aangeeft betekenisarmoede) en de waarden voor "R-kwadraat", "Gecorrigeerde R-kwadraat" en "Voorspelde R-kwadraat" (waarden> 0,80 wenselijk voor drie waarden).
- Vergelijk deze waarden for verschillende modellen inclusief / exclusief factoren op verschillende niveaus betekenis.
Opmerking: het nuttig kan zijn de reactiekolom in "Design" knooppunt dupliceren en elke analyse uitvoeren afzonderlijk, of het volledige "ANOVA" tabel exporteren naar een ander programma zoals een spreadsheet.
- Vergelijk deze waarden for verschillende modellen inclusief / exclusief factoren op verschillende niveaus betekenis.
- Ga door naar het tabblad "Diagnose" om de kwaliteit van het model te bevestigen en op te sporen mogelijke uitschieters in de dataset die een sterke invloed op het model door het onderzoeken van alle tabbladen in het "Diagnostics Tool" (hoofdstuk "Invloed" "Diagnose" en) hebben .
- In het hoofdstuk "Diagnose" van de "Diagnostische functie", voert u de volgende acties:
- Zorg ervoor dat de punten worden willekeurig verspreid binnen de grenzen in de "Residuen vs Voorspelde" grafiek. Hier, een chevron-vormige verdeling wijst op een behoefte aan data-transformatie.
- Zorg ervoor dat de punten worden willekeurig verspreid binnen de grenzen in de"Residuen vs Voorspelde" grafiek. Hier, een chevron-vormige verdeling wijst op een behoefte aan data-transformatie.
- Onderzoeken of de punten in de "Residuen vs run" grafiek scatter willekeurig binnen de grenzen. Een patroon (bijv. "trappenhuis") geven een trend in de databank blok gebouw kan worden gebruikt om zijn invloed op het model tegen.
- Kijk voor een rechte diagonale lijn die het ideale model in de "Voorspelde versus feitelijke" plot. Hoe groter de verstrooiing van gegevens rond de diagonaal, hoe minder nauwkeurig model.
- Controleer of er een overlap van de blauwe (beste) en groen (werkelijke) verticale lijnen in de Box-Cox-plot met vermelding van de gegevens transformatie. Als de groene lijn komt niet overeen met de blauwe (buiten de aangegeven door de rode verticale lijnen interval) terug te vinden in hoofdstuk 7.3 en het verbeteren van de modelbouw ronde door het selecteren van de gegevens transformatie voorgesteld door de Box-Cox-plot. Opnieuw de duplicatie van de rerespons kolom kan handig zijn om verschillende modellen te vergelijken.
- Zorg ervoor dat de punten in de "Residuen vs Factor" charts (er is een grafiek voor elk model factor) verstrooien willekeurig binnen de grenzen. De kromming in de gegevensverspreiding een factor ontbreekt in het model geven.
- In de rubriek "Invloed" van de "Diagnostische functie", zorg ervoor dat er willekeurige verstrooiing van de gegevens binnen de grenzen van de "Extern studentized reststoffen", "Leverage", "DFFITS" en "DFBETAS" kavels en gelijkmatig laag distributie zonder extreme waarden in de "Cook's Distance" plot.
- In het hoofdstuk "Diagnose" van de "Diagnostische functie", voert u de volgende acties:
- In het tabblad "Model grafieken", visualiseren de geëvalueerde model. Voor een beperkt aantal numerieke factoren (bijv. 3) het reactie oppervlak ("3D surface") vertegenwoordiging nuttig optima / kenmerken handmatig evalueren.
Opmerking: respons oppervlakken alleen de invloed van twee factoren te illustrerenren op de respons in onderzoek. Het effect van een extra factor van de reactie wordt onthuld door zijn waarde (numerieke factoren) of niveau (categorische factoren) veranderen in het venster "Factors functie". Als alternatief kan factoren om het perceel as worden toegewezen door met de rechtermuisknop te klikken in het venster "Factoren functie" en het selecteren van de gewenste onafhankelijke variabele as.- Manipuleer de factor niveaus en deze toewijzen aan de grafiek coördinaten met behulp van de "Factoren functie".
- Export grafieken met behulp van de "Export grafiek naar bestand ..." commando in het tabblad "Bestand".
- Gebruik de "numerieke" sub-knooppunt in de "optimalisatie" knooppunt de respons numeriek optimaliseren (minimaliseren, maximaliseren, binnen bereik) afhankelijk van het model factoren, waarop weer bepaalde beperkingen worden toegepast (bv. limieten en gewichten) via de tabblad "Criteria".
- Berekenen en onderzoeken numerieke oplossingen in de "oplossingen"tabblad op basis van de input in het tabblad "Criteria".
- Deze oplossingen exporteren naar andere software (bijv. spreadsheets) voor verdere analyse (bijv. histogrammen) onthullen de factor instellingen geassocieerd met een hoge of lage respons waarden.
Let op: dit is handig als meer dan drie numerieke factoren worden onderzocht en 3D-weergave is moeilijk.
- Gebruik de "Point voorspelling" sub-knooppunt naar het antwoord voor specifieke factor instellingen voorspellen.
- Met deze voorspelling voor alle instellingen worden beoordeeld (hier alle promoter en 5 'UTR combinaties en alle bladeren en incubatietijden of blad posities en incubatie temperatuur).
- De voorspelde waarden exporteren en compileren van een data-array die kunnen worden gebruikt om tijdelijke expressie beschrijven tabaksplanten, bijvoorbeeld door berekening van de expressie van een specifieke promotor 5 'UTR-combinatie op een bepaald moment gemiddeld over alle blad posities of across alle bladeren van een plant.
- Normaliseren van de uitdrukking gegevens op basis van de massa's van de verschillende bladeren aan de specifieke expressie (ug g -1) of specifieke expressie-tarief (pg g -1 hr -1) opleveren.
- Alternatief uitvoer van de coëfficiënten van het "Final vergelijking" van de bodem van de tab "ANOVA" in een spreadsheet en vermenigvuldigen met een factor reeks instellingen dezelfde gegevensreeks opleveren.
Opmerking: deze array kan enige factor waarden bevatten vanuit het eerste ontwerp ruimte, omdat het aangepaste model vergelijking niet geschikt is voor extrapolatie.
- Voer een bevestiging experiment voor model punten die van groot belang zijn.
- Voer voorbijgaande eiwit expressie onder geselecteerd voor "Point voorspelling" (paragraaf 7.11) omstandigheden. Bv gebruiken dezelfde temperaturen en bladeren etc.
- Bepaal de eiwitconcentraties van deze tijdelijke expressie eXperiment zoals hierboven beschreven (paragraaf 6) en ze vergelijken met de waarden voorspeld door het model.
- Controleer of de gemiddelde eiwit concentratie in de bevestiging experiment binnen het oppervlak reactie model voorspellingsinterval verkregen bij punt voorspelling valt. Een wedstrijd bevestigt de voorspellende kracht van het model. Een mismatch duidt op een laag model kwaliteit en extra punten kan worden verlangd.
- Opmerking: plantaardige batch-to-batch variabiliteit verbreedt de voorspelling interval en kan bevestiging experimenten uitgevoerd met een andere partij planten devalueren. Evenwel monsters die niet werden gebruikt om het model te genereren, maar die afkomstig van dezelfde plant batch als de monsters in het model doeltreffende controles dienen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een beschrijvend model voor DsRed accumulatie tijdens transiënte expressie met behulp van verschillende promotors en 5'UTRs
DsRed fluorescentie in bladextracten werd gebruikt om het expressieniveau van het recombinante eiwit geven en aldus werd gebruikt als de reactie in de DOE strategie. De minimale detecteerbare verschil we relevant geacht was 20 ug / ml en de geschatte standaarddeviatie van het systeem 8 ug / ml gebaseerd op de initiële experimenten. Factoren opgenomen in de tijdelijke expressie model werden geselecteerd op basis van literatuurgegevens 7,8 en onze vorige resultaten 9. De onderzochte reeksen werden gekozen op basis van deze gegevens (tabel 1). Ten minste drie niveaus werden geselecteerd voor discrete numerieke factoren bij de berekening van een kwadratische basismodel mogelijk. Een D-optimale selectie algoritme werd gekozen voor de selectie van de hinde loopt naar de meest nauwkeurige schattingen te vindende coëfficiënten van het regressiemodel. Het ontwerp in eerste instantie voorgesteld door DesignExpert bestond uit 90 runs, maar de FDS onvoldoende om een 1%-norm fout van de voorspelling (figuur 3A) te bereiken was. D-optimale vergroting van het ontwerp om een totaal van 210 punten opgelost deze kwestie en resulteerde in een FDS 100% meer uniforme voorspelling nauwkeurigheid over de ontwerpruimte aangegeven door de vlakke curve (figuur 3B).
De DsRed concentraties werden bepaald voor alle 210 runs en de gegevens waren Log 10 getransformeerd. Model factoren werden gekozen door geautomatiseerde achteruit selectie uit een kubieke model met een alpha-niveau van 0.100. Dit resulteerde in een significant model (Tabel 2) met onbeduidend gebrek-of-fit en hoge waarden voor meerdere correlatiecoëfficiënten (Tabel 2). De p-waarde van modelfactoren was <0,05 en derhalve geen verdere handmatige manipulatie van het model vereist. Het model bevattedrie-factor interacties die niet tot de oorspronkelijke kwadratische basismodel waren (Tabel 2). Herevaluatie van de FDS grafiek met behulp van alle factoren opgenomen in de definitieve voorspellingsmodel is gebleken dat de FDS voor de standaard fout van de voorspelling niet significant was afgenomen door het opnemen van de extra drie-factor interacties (FDS = 0.99).
De modelkwaliteit hulpmiddelen in DesignExpert aangegeven dat de gegevens transformatie was nuttig en er geen ontbrekende factoren in het model aangezien de normale plot van residuen bleek lineair gedrag en geen specifiek patroon werd waargenomen in de residuen versus voorspelde plot (Figuren 5A en 5B ). Er was geen trend gedurende het verloop van het experiment met een verborgen tijdsafhankelijke variabele (figuur 5C) geven. In plaats daarvan, de model voorspellingen waren in zeer goede overeenstemming met de waargenomen DsRed fluorescentie (Figuur 5D). We therefore aangenomen dat het gekozen model was nuttig om de tijdelijke expressie van DsRed in niet-cotyledon tabaksbladeren gedreven door verschillende promotor / 5'UTR combinaties tijdens een post-infiltratie incubatieperiode bedraagt 8 dagen te voorspellen. We hebben ook een kunstmatige lineaire regressiemodel geselecteerd zonder datatransformatie de gevolgen van verkeerd factor Selectie en transformatie illustreert (figuur 6). Is duidelijk dat de normale plot van residuen afwijkt van de verwachte lineaire gedrag (Figuur 6A) en er is een "V"-vormig patroon in de residuen versus voorspelde plot plaats van een willekeurige verstrooiing (figuur 6B). Bovendien, de residuen vs run plot belicht twee extreme waarden (figuur 6C), terwijl de voorspellingen zijn slecht voor zowel kleine en hoge waarden, die afwijkt van het optimale model (diagonaal) (Figuur 6D).
De 5 'UTR combinatie met de CaMV 35SS promoter resulteerde in sterkere DsRed expressie dan combinatie met de nos promoter (Figuren 5A en 5B) zoals eerder beschreven 34 en de bijbehorende factoren bleken significant de DOE model (Tabel 2) zijn. Het model voorspelde ook dat blad leeftijd was een belangrijke factor (Tabel 2) met expressieniveaus getoond hoger in jonge bladeren (figuren 7B en 7D) die in goede overeenstemming met onze eerdere bevindingen 19 en die van anderen 7,8. De progressie van DsRed accumulatie in bladeren was niet lineair of exponentieel maar volgde een sigmoïdale curve tijdens de 8 dagen van de post-infiltratie incubatie volgens het model. Interessant was er geen vaste volgorde de 5'UTRs qua overeenkomstige DsRed expressie. Vandaar de "kracht" van een 5 'UTR afhankelijk was van de bijbehorende promotor. Het is onwaarschijnlijk dat ditonderlinge afhankelijkheid tussen de promotor en 5 'UTR zou zijn geopenbaard via een OFAT experiment. Het voorspellend model ook aangegeven dat bepaalde paren van promotor / 5'UTR combinaties (bv.. CaMV 35SS/CHS en nos / CHS (Afbeelding 7A en 7B), CaMV 35SS/omega en nos / CHS of CaMV 35SS/CHS en CaMV 35SS / TL) in een gebalanceerde expressie niveaus, die minder dan 30% van een bepaalde verhouding voor alle bladeren en incubatietijden> 2 dagen (bijv.. voor 35SS/omega CaMV en nos / CHS de verhouding ~ 8,0) 20. Deze gebalanceerde expressie zou nuttig zijn voor de expressie van multimere eiwitten, zoals IgA met een gedefinieerde stoichiometrie 35,36 zijn.
Figuur 5. Graphical evaluatie van model kwaliteit. Een. De normale probability plot van de intern studentized residuen geeft een normale verdeling, omdat de residuen volgen een lijn. B. Intern studentized residuen verstrooien rond de waarde nul voor alle reeksen van de voorspelde respons (fluorescentie) met de bijbehorende gegevens transformatie. C. Intern studentized residuen verstrooien rond de nul gedurende het hele verloop van het experiment met de ontbreken van stille werking in. D. Voorspelde en werkelijke waarden van de respons zijn in goede overeenstemming in alle punten liggen dicht bij de diagonaal (ideaal model).
Figuur 6. Diagnostics aangeeft lage model kwaliteit. A B. Intern studentized residuen tonen een "v"-vormige verdeling aangeeft een ongepaste gegevenstransformatie. C. Intern studentized residuen verstrooien niet rond de waarde nul tijdens het hele verloop van het experiment, maar vertonen een tendens naar positieve waarden. Daarnaast kunnen twee extreme waarden worden gevonden. D. Voorspelde en werkelijke waarden van de respons in een slechte overeenkomst als de meeste punten afwijken van de diagonaal (ideaal model).
Figuur 7. Response oppervlakken voor transiënte DsRed expressie in tabaksbladeren. A . trong> nos / CHS in blad 2; B. CaMV 35SS/CHS in blad 2; C. CaMV 35SS/TL in blad 6; D. CaMV 35SS/CHS in blad 6. DsRed concentraties verhoogd in een sigmoidale wijze tijdens de incubatieperiode. Expressie niveaus lager in oude bladeren (bijvoorbeeld blad 2 in A en B) in vergelijking met jonge bladeren (bijvoorbeeld blad 6 in C en D) en voor nos (A) ten opzichte van de CaMV 35SS promotor (B). De 5 'UTR had ook een significante invloed op DsRed expressie (bijv. TL (C) tegen CHS (D)) maar de uitdrukking was sterk afhankelijk van de bijbehorende promotor.
| Bron | Som van de kwadraten | "> DfMean square | F-waarde | p-waarde | |
| Model | 174,85 | 95 | 1.84 | 182,12 | <0,0001 |
| Positie op blad (A) | 0.16 | 1 | 0.16 | 16.06 | 0.0001 |
| Incubatietijd (B) | 112.46 | 1 | 112.46 | 11.128,22 | <0,0001 |
| Blad leeftijd (C) | 15.24 | 7 | 2.18 | 215,39 | <0,0001 |
| Promotor (D) | 23.49 | 1 | 23.49 | 2324.29 | <0,0001 |
| 5 'UTR (E) | 0.93 | 3 | 0.31 | 30.61 | <0,0001 |
| AC | 0.24 | 7 | 0.034 | 3.38 | 0.0026 |
| BC | 1.46 | 7 | 0.21 | 20.64 | <0,0001 |
| BD | 2.27 | 1 | 2.27 | 224,51 | <0,0001 |
| BE | 0.87 | 3 | 0.29 | 28.74 | <0,0001 |
| CD | 0.29 | 7 | 0.042 | 4.11 | 0.0005 |
| CE | 0,43 | 21 | 0.021 | 2.04 | 0,0093 |
| DE | 0.48 | 3 | 0.16 | 15.73 | <0,0001 |
| B2 | 6.34 | 1 | 6.34 | 627,29 | <0,0001 |
| BCD | 0.95 | 7 | 0.14 | 13.42 | <0,0001 |
| BCE | 0.39 | 21 | 0.019 | | 0,0230 | |
| BDE | 0.16 | 3 | 0.054 | 5.37 | 0.0017 |
| B2D | 1.49 | 1 | 1.49 | 147,93 | <0,0001 |
| Rest | 1.15 | 114 | 0.010 | ||
| Gebrek-of-fit | 1.08 | 104 | 0.010 | 1.45 | 0,2669 |
| Pure fout | 0.072 | 10 | 7.153E-003 | ||
| Correlatie totaal | 176,01 | 209 | |||
| Correlatiecoëfficiënten | Waarde | ||||
| R-kwadraat | 0,9935 | ||||
| Adjusted R-kwadraat | 0,9880 | ||||
| Voorspelde R-kwadraat | 0,9770 |
Tabel 2. Factoren bij de voorspellendemodel voor transiënte DsRed expressie in tabaksbladeren met verschillende promotor / 5 'UTR combinaties. Drie-factor interacties worden in vet gemarkeerd.
Optimaliseren incubatieomstandigheden en oogsten's voor de productie van monoklonale antilichamen in planten door voorbijgaande expressie
De DoE benadering werd ook gebruikt om de incubatietemperatuur, bacteriële OD600 nm voor blad infiltratie vaste leeftijd en oogsten regelingen voor de gelijktijdige productie van monoklonale HIV-neutraliserende antilichaam 2G12 en DsRed tabak 19 optimaliseren. De oogst regeling bepaald welke bladeren werden gebruikt voor eiwitextractie, bijvoorbeeld de zes bovenste bladeren. Daarom werd een voorspellend model voor de expressie van elk eiwit (2G12 en DsRed) in planten op verschillende leeftijden (jong = vroeg knopstadium = oogst 40 dagen na het zaaien; oud = volwassen knopstadium = oogst 47 dagen na het ziending). Deze vier modellen werden geëvalueerd en consensus model vastgesteld dat elke factor opgenomen significant bevonden in de verschillende modellen. Vervolgens bevestigden dat de consensusmodel nog een goede representatie van alle initiële data sets (Tabel 3). De consensus model werd vervolgens gebruikt om optimale incubatie temperatuur (~ 22 ° C 2G12 en ~ 25 ° C gedurende DsRed) en bacteriële OD 600 nm (-1,0) bepalen voor beide eiwitten. Deze optimale omstandigheden werden vervolgens gebruikt om eiwitconcentraties alle bladeren (1-8) en blad posities (1-4) bij jonge en oude planten voorspellen. De concentratie profielen werden geïntegreerd met biomassa data 19 tot de absolute hoeveelheid van target eiwitten verkregen uit verschillende bladeren en planten leeftijden (Figuur 8A) opleveren. Absolute eiwit bedragen werden vervolgens gecorreleerd met bijbehorende downstream kosten waardoor we een kosten-batenanalyse uit te voeren voor de verwerking van elk blad / plant leeftijd. Hieruit bleek datjonge planten waren voordelig voor tijdelijke expressie, omdat de eiwitten bereikt hogere concentraties gedurende kortere periodes groei ondanks de lagere totale biomassa ten opzichte van oude installaties (figuren 8B en 8C). We vonden ook dat het verwerken van alle blaadjes van oude planten was duurder dan weggooien bladeren 1-3 en het verhogen van het aantal planten per partij plaats (Figuur 8D). Daarom doe-gebaseerde modellen zijn niet alleen geschikt voor de laatste stap van een experiment markeren, maar ook voor combinatie met andere voor complexere aspecten van procesanalyse vergemakkelijken. Een reeks verbonden modellen die het hele productieproces voor een biofarmaceutisch eiwit kon het uiteindelijke doel.
Figuur 8. Integrat ion van biomassa en eiwitconcentratie gegevens resulteert in absolute eiwitrendement en proceskosten. Een. Blad biomassa en doelwit eiwit concentratie niet ontwikkelen in een collineair wijze resulteert in een bevooroordeelde accumulatie van 2G12 in jonge bladeren. B. Dezelfde hoeveelheid DsRed en ~ 65% van de 2G12 werd gevonden in jonge planten in vergelijking met oude ondanks een ~ 50% lagere gemiddelde biomassa. C. Dit weerspiegelde de hogere eiwitexpressie bij jonge planten. D. De verhoogde specifieke expressie vertaald in lagere productiekosten voor beide eiwitten omdat er minder biomassa moest worden verwerkt die minder broeikasgassen ruimte, minder verbruiksgoederen (bijv.. Filters), en minder apparatuur stroomafwaarts.
| 40 | 47 | |||||||
| Doeleiwit [-] | DsRed | 2G12 | DsRed | 2G12 | ||||
| Model [-] | Eerste | Overeenstemming | Eerste | Overeenstemming | Eerste | Overeenstemming | Eerste | Overeenstemming | R-kwadraat [-] | 0,9829 | 0,9577 | 0,9321 | 0,9099 | 0,9436 | 0,9403 | 0,8826 | 0,8782 |
| Adjusted R-kwadraat [-] | 0,9711 | 0,9480 | 0,9059 | 0,8893 | 0,9362 | 0,9350 | 0,8716 | 0,8674 |
| Voorspelde R-kwadraat [-] | 0,9510 | 0,9336 | 0,8272 | 0,8587 | 0,9254 | 0,9282 | 0,8554 | 0,8516 |
Tabel 3. Vergelijking van de correlatiecoëfficiënten voor de eerste RSM-modellen en de uiteindelijke consensus model van DsRed en 2G12 expressie in tabaksplanten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Elk experiment vereist een zorgvuldige planning omdat de middelen zijn vaak schaars en duur. Dit geldt met name voor DoE strategieën omdat fouten tijdens de planningsfase (bijvoorbeeld het selecteren van een basismodel dat geen betrekking heeft op alle belangrijke factor interacties) aanzienlijk de voorspellende kracht van de resulterende modellen kunnen verminderen en dus devalueren het hele experiment. Toch kunnen deze fouten gemakkelijk vermeden worden door het volgen van elementaire procedures.
Overwegingen tijdens DoE planning
Ten eerste is het belangrijk om een reactie die geschikt is voor het resultaat (positief of negatief) per Doe Run evalueren selecteren. Bijvoorbeeld: de concentratie van een doeleiwit bepaald door UV-absorptie 37 is nuttig om de werkzaamheid van een bepaalde promoter / 5'UTR combinatie beoordelen. Echter, functionele evaluatie van een eiwit (bijvoorbeeld. Door fluorescentie bij DsRed of binding aan Proteïne A in de case van 2G12) is nog beter, want het bevat ook een eiwit kwaliteitsaspect. Antwoorden kunnen ook waarden berekend uit twee of meer afzonderlijke parameters, zoals de kracht nummer NP gistende experimenten (berekend uit vermogen, toerental en roerder diameter). De reactie moet waarden opleveren met een hoge precisie (dwz lage standaard deviatie) en nauwkeurigheid (dwz geen of weinig storende parameters) om het model te verbeteren. Geschikte detectie-apparaten en-methoden moeten daarom vooraf worden geoptimaliseerd het experiment indien nodig.
Factoren die de respons moet worden bepaald voordat de DoE wordt uitgevoerd omdat de RSM wordt gebruikt om het precieze effect van de factoren bepalen en niet om ze te selecteren. De selectie van factoren met een invloed op de reactie kan worden verkregen door bestudering literatuurgegevens maar volledige of fractionele factoriële DOE effectiever zijn. Deze screening experimenten moetenook worden gebruikt om een reeks voor elke factor waarbinnen zinvolle effect kan worden bereikt bijvoorbeeld in biologische systemen de factor "temperatuur" wordt vaak beperkt tot het bereik 10-40 ° C te bepalen Discrete niveaus moeten dan worden bepaald binnen deze bereiken voor numerieke factoren die technisch moeilijk te controleren, bijv. fytotron temperaturen een tolerantie van ± 2,0 ° C, zodat het niet aangaat temperatuurverschillen van ± 1,0 ° C onderzocht Praktische beperkingen kunnen ook een rol spelen, bijv. gebruikmakend> 25 verschillende concentraties van een bepaalde verbinding. Wel moet het aantal niveaus ten minste een groter is dan de verwachte polynoom volgorde van deze factor in het basismodel, bijvoorbeeld als de polynoom orde van temperatuur n = 2, dan tenminste drie temperatuurniveaus moeten worden onderzocht zijn. Met behulp van basismodellen van hoge orde polynoom (kubieke of hoger) is een optie als de polynoom orde van een factor is onzeker.Dit kan echter een aanzienlijke verhoging van het aantal runs nodig voor de DoE.
Voor complexe systemen met veel factoren en hoge polynoom orders kan dit tot ontwerpen die niet effectief kunnen worden berekend. In dergelijke gevallen kan het wenselijk zijn om het probleem op te splitsen in twee of meer ontwerpen onderzoek verschillende subsets factoren. Wel moet de belangrijke factoren weggelaten uit dergelijke "split-ontwerpen" zorgvuldig worden aangepast aan vaste waarden aan een vertekening van de resultaten te voorkomen. Elke split-ontwerp moet worden herhaald bij verschillende instellingen voor de weggelaten factoren interactie tussen deze en de factoren opgenomen in de patroon te onthullen. Het is gunstig voor de factoren identificeren met de grootste invloed op de respons en ze in alle uitvoeringen.
Kritische aspecten tijdens DoE evaluatie
De FDS moet de eerste parameter beoordeeld in een nieuw berekende DoE zijn. De exploitant moet dat e bevestigene DoE de nodige dekking van de ontwerpruimte voor de gewenste minimale detecteerbare verschil en schatting van de standaardafwijking van de respons. Indien dit niet het geval is, moet het ontwerp worden uitgebreid met een geschikte aantal runs en herhalingen totdat aan de vereisten wordt voldaan. De procedure voor het DoE runs berekenen kan meerdere keren worden geïnitialiseerd te ontwerpen met een minimaal verlies van optimaliteit selecteren als het evenwicht tussen categorische factoren is ingeschakeld.
Datatransformatie moet worden uitgevoerd als reactie waarden omvatten meer dan een orde van grootte. Een Log 10 transformatie is vaak geschikt, maar de Box-Cox plot zal de transformatie die de meest stabiele model zal opleveren suggereren. De transformatie voorgesteld in dit perceel kan veranderen zodra de definitieve model is gekozen en moet daarom opnieuw worden geëvalueerd. Slechts belangrijke factoren (p-waarde <0,05) moet worden opgenomen in het oppervlak respons model om de voorspellende p garanderenower. Uitzonderingsgevallen kan het model hiërarchie 32,33 handhaven of factoren waarvan bekend is dat een effect op basis van eerdere resultaten omvatten. In het laatste geval is het raadzaam onderzoeken waarom deze belangrijke factoren bleken significant in de huidige DoE zijn. De parameter gebrek-of-fit kunnen worden gebruikt in combinatie met R-kwadraat (tabellen 2 en 3) voor de snelle detectie van slechte modellen / past, terwijl de gecorrigeerde R-kwadraat aangeeft of teveel / onbelangrijke factoren zijn geselecteerd en de voorspelde R-kwadraat is een indicator voor de voorspellende kracht van het model. Echter, de resterende kavels in het gedeelte diagnostiek van DesignExpert zijn nog belangrijker om het model kwaliteit beoordelen, omdat zij toestaan dat de detectie van trends in de dataset waaruit de aanwezigheid van verborgen factoren, alsook de identificatie van extreme waarden. Deze laatste hebben een bovengemiddelde impact op de pasvorm en het model vervormen. Die waarden kunnen afkomstig zijn van gebrekkige gegevens (bijv. gepermuteerde waarden) dat moet worden gecorrigeerd, of uit mislukte experimenten die moeten worden herhaald. Indien een extreme waarde gevonden om "echt" in deze herhaling experimenten is het raadzaam om verscheidene scoren in de nabijheid van deze waarde de modelkwaliteit binnen dit gebied van de ontwerpruimte verbeteren.
Correcties op ontwerpen die onvolmaakte of te klein zijn
Ongeacht waarom extra punten worden aangepast (bv. ontbrekende gegevens, mislukte runs, echte extreme waarden en regio's, onverwachte hoge orde factor interacties), deze runs moeten worden aan het bestaande ontwerp op een geordende wijze met behulp van de "Design augmentation" tool toegevoegd de nieuwe punten in een afzonderlijk introduceren. Hierdoor zal het gebruik van de vorige dataset te vergemakkelijken, terwijl het selecteren van de meest zinvolle extra punten. Het resultaat is een model dat past bij de gegevens en maakt het betrouwbaarvoorspelling van toekomstige resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De publicatie vergoeding werd gedeeltelijk gesponsord door de bedrijven Statease, Inc (USA) en Statcon (Duitsland), die niet betrokken waren bij het betrokken bij de voorbereiding van het manuscript of verantwoordelijk voor de inhoud ervan.
Acknowledgments
De auteurs zijn dank aan Dr Thomas Rademacher voor het verstrekken van de PPAM plantenexpressievector en Ibrahim Al Amedi voor het kweken van de tabaksplanten gebruikt in deze studie. We willen graag Dr Richard M. Twyman bedanken voor zijn hulp bij het bewerken van het manuscript. Dit werk werd deels gefinancierd door de European Research Council Advanced Grant "Future-Pharma", voorstel nummer 269110 en het Fraunhofer Zukunftsstiftung (Fraunhofer Future Foundation).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Design-Expert(R) 8 | Stat-Ease, Inc. | n.a. | DoE software |
| Tryptone | Carl Roth GmbH | 8952.2 | Media component |
| Yeast extract | Carl Roth GmbH | 2363.2 | Media component |
| Sodium chloride | Carl Roth GmbH | P029.2 | Media component |
| Ampicillin | Carl Roth GmbH | K029.2 | Antibiotic |
| Agar-Agar | Carl Roth GmbH | 5210.2 | Media component |
| Escherichia coli K12 DH5a | Life Technologies | 18263-012 | Microorganism |
| pPAM | GenBank | AY027531 | Cloning/expression vector; |
| NucleoSpin Plasmid | MACHEREY-NAGEL GmbH | 740588.250 | Plasmid DNA isolation kit |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | MACHEREY-NAGEL GmbH | 740609.250 | Plasmid DNA purification kit |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | n.a. | Spectrophotometer |
| NcoI | New England Biolabs Inc. | R3193L | Restrictionendonuclease |
| EcoRI | New England Biolabs Inc. | R3101L | Restrictionendonuclease |
| AscI | New England Biolabs Inc. | R0558L | Restrictionendonuclease |
| NEB 4 | New England Biolabs Inc. | B7004S | Restrictionendonuclease buffer |
| TRIS | Carl Roth GmbH | 4855.3 | Media component |
| Disodium tetraborate | Carl Roth GmbH | 4403.3 | Media component |
| EDTA | Carl Roth GmbH | 8040.2 | Media component |
| Agarose | Carl Roth GmbH | 6352.4 | Media component |
| Bromophenol blue | Carl Roth GmbH | A512.1 | Color indicator |
| Xylene cyanol | Carl Roth GmbH | A513.1 | Color indicator |
| Glycerol | Carl Roth GmbH | 7530.2 | Media component |
| Mini-Sub Cell GT Cell | BioRad | 170-4406 | Gel electrophoresis chamber |
| Agrobacterium tumefaciens strain GV3101:pMP90RK | DSMZ | 12365 | Microorganism |
| Electroporator 2510 | Eppendorf | 4307000.658 | Electroporator |
| Beef extract | Carl Roth GmbH | X975.2 | Media component |
| Peptone | Carl Roth GmbH | 2365.2 | Media component |
| Sucrose | Carl Roth GmbH | 4621.2 | Media component |
| Magnesium sulfate | Carl Roth GmbH | 0261.3 | Media component |
| Carbenicillin | Carl Roth GmbH | 6344.2 | Antibiotic |
| Kanamycin | Carl Roth GmbH | T832.3 | Antibiotic |
| Rifampicin | Carl Roth GmbH | 4163.2 | Antibiotic |
| FWD primer | Eurofins MWG Operon | n.a. | CCT CAG GAA GAG CAA TAC |
| REV primer | Eurofins MWG Operon | n.a. | CCA AAG CGA GTA CAC AAC |
| 2720 Thermal cycler | Applied Biosystems | 4359659 | Thermocycler |
| RNAfold webserver | University of Vienna | n.a. | Software |
| Ferty 2 Mega | Kammlott | 5.220072 | Fertilizer |
| Grodan Rockwool Cubes 10 x10 cm | Grodan | n.a. | Rockwool block |
| Greenhouse | n.a. | n.a. | For plant cultivation |
| Phytotron | Ilka Zell | n.a. | For plant cultivation |
| Omnifix-F Solo | B. Braun | 6064204 | Syringe |
| Murashige and Skoog salts | Duchefa | M 0222.0010 | Media component |
| Glucose | Carl Roth GmbH | 6780.2 | Media component |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406-5G | Phytohormon analogon |
| BioPhotometer plus | Eppendorf | 6132 000.008 | Photometer |
| Osram cool white 36 W | Osram | 4930440 | Light source |
| Disodium phosphate | Carl Roth GmbH | 4984.3 | Media component |
| Centrifuge 5415D | Eppendorf | 5424 000.410 | Centrifuge |
| Forma -86C ULT freezer | ThermoFisher | 88400 | Freezer |
| Synergy HT | BioTek | SIAFRT | Fluorescence plate reader |
| Biacore T200 | GE Healthcare | n.a. | SPR device |
| Protein A | Life Technologies | 10-1006 | Antibody binding protein |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 9105.3 | Media component |
| Tween-20 | Carl Roth GmbH | 9127.3 | Media component |
| 2G12 antibody | Polymun | AB002 | Reference antibody |
References
- Fischer, R., Emans, N. Molecular farming of pharmaceutical proteins. Transgenic research. 9, 277-299 (2000).
- Commandeur, U., Twyman, R. M., Fischer, R. The biosafety of molecular farming in plants. AgBiotechNet. 5, 9 (2003).
- Shoji, Y., et al. A plant-based system for rapid production of influenza vaccine antigens. Influenza Other Resp. 6, 204-210 (2012).
- Goodin, M. M., Zaitlin, D., Naidu, R. A., Lommel, S. A. Nicotiana benthamiana: Its history and future as a model for plant-pathogen interactions. Mol Plant Microbe In. 21, 1015-1026 (2008).
- Berg, R. H., Beachy, R. N. Fluorescent protein applications in plants. Method Cell Biol. 85, 153 (2008).
- Chung, S. M., Vaidya, M., Tzfira, T. Agrobacterium is not alone: gene transfer to plants by viruses and other bacteria. Trends in plant science. 11, 1-4 (2006).
- Sheludko, Y. V., Sindarovska, Y. R., Gerasymenko, I. M., Bannikova, M. A., Kuchuk, N. V. Comparison of several Nicotiana species as hosts for high-scale Agrobacterium-mediated transient expression. Biotechnology and Bioengineering. 96, 608-614 (2007).
- Wydro, M., Kozubek, E., Lehmann, P. Optimization of transient Agrobacterium-mediated gene expression system in leaves of Nicotiana benthamiana. Acta Biochimica Polonica. 53, 289-298 (2006).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Processing heterogeneous biomass: Overcoming the hurdles in model building. Bioengineered. 4, (2013).
- Fischer, R., Schillberg, S., Hellwig, S., Twyman, R. M., Drossard, J. GMP issues for recombinant plant-derived pharmaceutical proteins. Biotechnol Adv. 30, 434-439 (2012).
- Daniel, C. One-at-a-time plans. Journal of the American Statistical Association. 68, 353-360 (1973).
- Czitrom, V. One-Factor-at-a-Time versus Designed Experiments The American Statistician. 53, 6 (1999).
- Anderson, M. J., Kraber, S. L. Keys to successful designed experiments. ASQ - The global voice of quality. 6, 6 (1999).
- Montgomery, D. C. Design and Analysis of Experiments. , John Wiley & Sons Inc. (2007).
- Myers, R. H., Montgomery, D. C., Anderson-Cook, C. M. Response Surface Methodology: Process and Product Optimization Using Designed Experiments. , Wiley. (2009).
- Piepel, G. F. Programs for generating extreme vertices and centroids of linearly constrained experimental regions. J Qual Technol. 20, 15 (1988).
- FDA. , U.S. Department of Health and Human Services. Rockville, MD, USA. (2009).
- Shivhare, M., McCreath, G. Practical Considerations for DoE Implementation in Quality By Design. BioProcess International. 8, 9 (2010).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Predictive models for transient protein expression in tobacco (Nicotiana tabacum L.) can optimize process time, yield, and downstream costs. Biotechnology and bioengineering. 109, 2575-2588 (2012).
- Buyel, J. F., Kaever, T., Buyel, J. J., Fischer, R. Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5'UTR combination. Biotechnology and bioengineering. 110, 471-482 (2013).
- Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. DOE Simplified: Practical Tools for Effective Experimentation. , Productivity Inc. (2000).
- Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. Response Surface Methods Simplified. , Productivity Press. (2005).
- De Gryze, S., Langhans, I., Vandebroek, M. Using the correct intervals for prediction: A tutorial on tolerance intervals for ordinary least-squares regression. Chemometr Intell Lab. 87, 147-154 (2007).
- Plasmid DNA purification User manual. , MACHEREY-NAGEL. Düren. (2012).
- PCR clean-up Gel extraction User manual. , MACHEREY-NAGEL. Düren. (2012).
- Quick Ligation Protocol. 4, NewEnglandBiolabs. Ipswich. (2009).
- Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High-Efficiency Transformation of Escherichia-Coli with Plasmids. Gene. 96, 23-28 (1990).
- Main, G. D., Reynolds, S., Gartland, J. S. Electroporation protocols for Agrobacterium. Methods in Molecular Biology. 44, 405-412 (1995).
- Gruber, A. R., Lorenz, R., Bernhart, S. H., Neubock, R., Hofacker, I. L. The Vienna RNA websuite. Nucleic acids research. 36, 70-74 (2008).
- Howell, S., Kenmore, M., Kirkland, M., Badley, R. A. High-density immobilization of an antibody fragment to a carboxymethylated dextran-linked biosensor surface. J Mol Recognit. 11, 200-203 (1998).
- Newcombe, A. R., et al. Evaluation of a biosensor assay to quantify polyclonal IgG in ovine serum used for the production of biotherapeutic antibody fragments. Process Biochem. 41, 842-847 (2006).
- Peixoto, J. L. Hierarchical Variable Selection in Polynomial Regression-Models. Am Stat. 41, 311-313 (1987).
- Peixoto, J. L. A Property of Well-Formulated Polynomial Regression-Models. Am Stat. 44, 26-30 (1990).
- Sanders, P. R., Winter, J. A., Barnason, A. R., Rogers, S. G., Fraley, R. T. Comparison of cauliflower mosaic virus 35S and nopaline synthase promoters in transgenic plants. Nucleic acids research. 15, 1543-1558 (1987).
- Ma, J. K. C., et al. Generation and Assembly of Secretory Antibodies in Plants. Science. 268, 716-719 (1995).
- Wycoff, K. L. Secretory IgA antibodies from plants. Curr Pharm Design. 11, 2429-2437 (2005).
- Pace, C. N., Vajdos, F., Fee, L., Grimsley, G., Gray, T. How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein. Protein Sci. 4, 2411-2423 (1995).
