Summary
Wir beschreiben eine Anordnung von Experimenten Ansatz, der verwendet werden kann, um festzustellen und das Modell des Einflusses der Transregulationselemente, Pflanzenwachstum und Entwicklung Parameter und Inkubationsbedingungen für die vorübergehende Expression von monoklonalen Antikörpern und Reporter-Proteine in Pflanzen auf.
Abstract
Pflanzen bieten mehrere Vorteile für die Produktion von Biopharmazeutika mit niedrigen Kosten, Skalierbarkeit und Sicherheit. Die transiente Expression bietet den zusätzlichen Vorteil der kurzen Entwicklungs-und Produktionszeiten, sondern Expressionsniveaus erheblich zwischen den Chargen so was zu rechtlichen Bedenken im Rahmen der guten Herstellungspraxis variieren. Wir verwendeten eine Versuchsplanung (DOE) Ansatz, die Auswirkungen der wichtigsten Faktoren wie regulatorische Elemente in dem Expressionskonstrukt, das Pflanzenwachstum und Entwicklung Parametern und den Inkubationsbedingungen während der Expression, auf die Variabilität der Expression zwischen den Chargen zu bestimmen. Wir untersuchten Pflanzen ein Modell Anti-HIV-Antikörper (2G12) und einen fluoreszierenden Marker-Protein (DsRed) ausdrückt. Wir diskutieren die Gründe für die Auswahl bestimmter Eigenschaften des Modells zu identifizieren und ihr Potenzial Einschränkungen. Das allgemeine Konzept kann leicht auf andere Probleme übertragen werden, da die Prinzipien des Modells einwieder breit anwendbar: wissensbasierte Parameterauswahl, Komplexitätsreduktion durch Aufteilung der anfängliche Problem in kleinere Module, Software-geführte Installation der optimalen Experiment Kombinationen und schrittweise Design Augmentation. Daher ist die Methode nicht nur nützlich für die Charakterisierung der Proteinexpression in Pflanzen, sondern auch für die Untersuchung von anderen komplexen Systemen fehlt eine mechanistische Beschreibung. Die Vorhersagegleichungen zur Beschreibung der Interkonnektivität zwischen Parameter können verwendet werden, um mechanistische Modelle für andere komplexe Systeme aufgebaut werden.
Introduction
Die Produktion von biopharmazeutischen Proteinen in Pflanzen ist vorteilhaft, da Pflanzen kostengünstig zu wachsen, kann die Plattform sich nur durch den Anbau von Pflanzen mehr skaliert werden, und menschliche Krankheitserreger sind nicht in der Lage zu 1,2 replizieren. Transiente Expressionsstrategien zum Beispiel auf Basis der Infiltration von Blättern mit Agrobacterium tumefaciens bietet zusätzliche Vorteile, da die Zeit zwischen dem Punkt der DNA-Zufuhr und die Abgabe eines gereinigten Produktes von Jahren auf weniger als 2 Monate 3 reduziert. Transiente Expression ist auch für die funktionelle Analyse, z. B. verwendet werden, um Gene, die für ihre Fähigkeit zur Ergänzung Verlust-Funktion Mutanten oder Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen 4-6 testen. Allerdings neigen transiente Expressionsniveaus größere Charge zu Charge Variation als Expressionsniveaus in transgenen Pflanzen 7-9 zeigen. Dies verringert die Wahrscheinlichkeit, dass biopharmazeutische Fertigungsprozesse basierend auf transiente Expression wiwerde im Rahmen der guten Herstellungspraxis (GMP) genehmigt werden, weil die Reproduzierbarkeit ist ein kritischer Qualitätsmerkmal und unterliegt Risikobewertung 10. Solche Variation können auch alle Interaktionen, die Forscher wollen untersuchen, zu maskieren. Deshalb machten wir uns auf die wichtigsten Faktoren, die transiente Expression in Pflanzen zu beeinflussen und eine hochwertige quantitative Vorhersagemodell zu bauen identifizieren.
Das Ein-Faktor-at-a-time (OFAT)-Ansatz wird oft verwendet, um die Auswirkungen (Wirkung) bestimmter Parameter (Faktoren) auf das Ergebnis (Antwort) eines Experiments 11 charakterisieren. Aber das ist nicht optimal, weil die einzelnen Tests (läuft) während einer Untersuchung (Experiment) werden wie Perlen auf einer Schnur durch die Potentialfläche durch die Faktoren, die getestet (design space) werden aufgespannt ausgerichtet werden. Die Abdeckung des Bauraums und somit den Grad der Informationen aus dem Experiment abgeleitetenniedrig, wie in Fig. 1A 12 gezeigt. Ferner können Abhängigkeiten zwischen verschiedenen Faktoren (Faktor-Wechselwirkungen) verborgen bleiben, was zu schlechter Modelle und / oder der Vorhersage falsch Optima, wie in 1B 13 gezeigt.
Die oben beschriebenen Nachteile können durch Verwendung eines Versuchsplanung (DOE) Methode, bei der die Durchläufe eines Experiments sind mehr gleichmäßig über den Entwurfsraum verstreut, was bedeutet, dass mehr als ein Faktor zwischen zwei Läufen 14 variiert vermieden werden. Es gibt spezielle Ausführungen für Mischungen, Screening Faktoren (Faktoren-Modelle) und die Quantifizierung der Auswirkungen auf Faktor Antworten (Response Surface Methoden, RSM s) 15. Weiterhin kann RSMs als zentrale Verbund Designs realisiert werden, sondern kann auch wirksam durch Verwendung spezieller Software, die Kriterien für die Auswahl der Läufe gelten erzielt werden. Beispielsweise die sogenannten D-optimality Kriterium läuft so zu wählen, um den Fehler in den Koeffizienten des resultierenden Modells zu minimieren, während die IV-Optimalitätskriterium wählt Läufe, die die niedrigste Vorhersage Varianz in der gesamten Entwurfsraum 15,16 zu erreichen. Der RSM beschreiben wir hier ermöglicht die genaue Quantifizierung von transienten Proteinexpression in Pflanzen, aber es kann problemlos an jedes System mit mehreren (~ 5-8) übertragen werden numerische Faktoren (zB Temperatur, Zeit, Konzentration) und ein paar (~ 2 - 4) categoric Faktoren (z. B. Promotor, Farbe), in dem eine mechanistische Beschreibung ist nicht verfügbar oder zu komplex, zu modellieren.
Die DoE-Ansatz entstand in den Agrarwissenschaften, hat aber auf andere Bereiche ausgebreitet, weil es zu jeder Situation, wo es sinnvoll ist, die Anzahl der Durchläufe notwendig, um verlässliche Daten zu erhalten, verringern und Beschreibungsmodelle für komplexe Prozesse übertragbar. Dies wiederum hat zur Aufnahme von DoE in der "Anleitung für LED-Industrie, Q8 (R2) Pharmaceutical Development "von der Internationalen Konferenz zur Harmonisierung der technischen Anforderungen an die für die Registrierung von Humanarzneimitteln (ICH) 17 veröffentlicht. DoE wird heute weitgehend in der wissenschaftlichen Forschung und der Industrie 18 verwendet. Allerdings muss darauf während genommen werden die Planung und Durchführung des Experiments, weil die Auswahl eines falschen Polynomgrad für die Multiple-linearen Regressionsmodell (Basismodell) eine Notwendigkeit für zusätzliche Fahrten, um alle Effekte richtig zu modellieren Faktor einzuführen. Außerdem beschädigte oder fehlende Daten zu erzeugen falsche Modelle und fehlerhaft Vorhersagen, und kann sogar verhindern, dass Modellbildung Versuch wie in den Protokoll-und Diskussionsabschnitte 18 beschrieben. In der Protokollabschnitt, werden wir zunächst die wichtigsten Planungsschritte für eine RSM-basierten Versuchs und dann erklären, das Design auf der Grundlage des DoE Software DesignExpert v8.1. Aber ähnliche Designs lassen sich mit anderen Software-includi gebaut werdenng JMP, Modde und STATISTICA. Die experimentellen Verfahren werden von Anweisungen für die Datenanalyse und Auswertung folgt.
Fig. 1 ist. Vergleich von OFAT und DoE. A. Sequential Variation eines Faktors zu einer Zeit (OFAT) in einem Experiment (schwarz, rot und blau Kreise) erreicht eine geringe Abdeckung der Designraum (schraffierte Regionen). Im Gegensatz dazu die Variation von mehr als einem Faktor zu einem Zeitpunkt unter Verwendung der Versuchsplanung (DOE) Strategie (grüne Kreise) erhöht die Reichweite und damit die Genauigkeit der resultierenden Modelle. B. Das vorgespannte Design Raumabdeckung bedeutet, dass OFAT Experimente (schwarze Kreise) kann auch fehlschlagen, um optimale Betriebsbereiche (rot) zu erkennen und vorherzusagen, suboptimale Lösungen (großer schwarzer Kreis), während DoE strategisches (schwarze Sterne) sind eher zu bevorzugten Bedingungen (große schwarze Sterne) zu identifizieren.
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Protocol
1. Planen Sie eine DoE-Strategie
- Identifizieren relevanten Faktoren und Antworten für die Aufnahme in den Entwurf.
- Definieren Sie eine oder mehrere Antworten für die Messung. Hier wurden 2G12 und DsRed-Expressionsniveaus verwendet (ug / ml), einschließlich der minimalen nachweisbaren Unterschied als relevant (10 und 20 ug / ml) betrachtet und ein Näherungswert für die geschätzte Standardabweichung des Systems (4 und 8 ug / ml) auf der Grundlage früherer Experimente.
- Verwenden Sie die verfügbaren Literatur, Daten aus früheren Experimenten oder Fach Screening-Designs (z. B. einem faktoriellen Design finden Sie in der Einleitung), um signifikante Faktoren, deren Einfluss auf die Antworten quantifiziert werden (Tabelle 1) 7,8,19,20 auswählen.
- Ordnen Sie die Faktor-Typen (numerisch oder kategorische) und wählen Sie Bereiche, innerhalb derer die numerischen Faktoren werden während des DoE Untersuchung (Tabelle 1) variiert werden.
- Identifizieren numeric Faktoren für die kontinuierliche Änderung ist schwierig zu implementieren.
- Vermeiden, mit kontinuierlicher Variation für Faktoren, die nicht exakt auf einen bestimmten Wert eingestellt werden kann. Z. B. Inkubationstemperatur kann in der Regel nur innerhalb von ± 2 ° C gesteuert werden, damit eine kontinuierliche Variation unter Verwendung von Werten wie beispielsweise 27,2 ° C, 25,9 ° C und 29,3 ° C darf vermieden werden.
- Wählen Sie stattdessen eine Reihe von diskreten Niveaus für diese Faktoren (Tabelle 1). Die Anzahl der Ebenen sollten den erwarteten Basismodell (Schritt 1.2) entsprechen. Dies ist nur für optimale Designs wichtig, weil zentrale Verbund Designs haben immer diskreten Faktorstufen.
- Weisen Sie, ob eine kategorische Faktor ist nominal, dh keine stillschweigende Bestellung (zB verschiedener Hersteller) oder Ordnungs und damit einen diskreten numerischen Parameter (z. B. verschiedene Blätter an einer Pflanze).
- Wählen Sie die Ebenen für beide Arten von kategorischen Faktoren. </ Li>
- Wählen Sie eine nützliche Basis-Modell.
- Auf Basis der vorläufigen Experimente und Literatur, rechnen die Beziehung zwischen einzelnen Faktoren und der Reaktion sowie die Wechselwirkungen zwischen Faktoren und der Antwort. Zum Beispiel, linear (je mehr, desto besser), quadratisch (Einzel optimale oder nichtlineare Zunahme / Abnahme) oder kubische (verzerrt Optimum).
- Stellen Sie sicher, dass die Anzahl der Ebenen für diskrete numerische Faktoren ist n + 1, wobei n das Polynom Grad der Beziehung zwischen Faktor und Reaktion. Zum Beispiel wird, wenn die Temperatur erwartet, dass eine quadratische Wirkung auf die Reaktion haben, n = 2 und damit mindestens drei Temperaturniveaus sollten untersucht, um eine Anpassung an die quadratischen Effekt zu erzielen.
- Definieren Sie den Anteil der Designraum (FDS), für die die Vorhersage Varianz sollte unter einem bestimmten Schwellenwert (Alpha-Ebene) sein. Die FDS sollte> 0,95 sein (decken mehr als 95% der Design-Raum), um Modelle, die robust Vorhersagen in ganz ergeben zu erreichender gesamte Design-Raum 21-23.
Hinweis: Ein Schwellenwert von 0,05 entspricht einem Signifikanzniveau von 5% (Typ-I-Fehler) und ist ein typischer Wert. Eine Erhöhung dieses Wertes wird die Anzahl der Versuche für eine DoE-Strategie zu reduzieren, aber gleichzeitig die Wahrscheinlichkeit erhöhen, dass signifikante Effekte werden verfehlt werden und dass die Schätzungen ihrer Auswirkungen auf die Antwort falsch sein.
Tabelle 1. Faktoren transiente Proteinexpression in Tabak einschließlich der Veränderung beeinflussen reicht während DoE. Faktoren fett wurden nur im Design für die als "Ein beschreibe Modell für DsRed Akkumulation während transiente Expression mit verschiedenen Promotor / 5'UTRs" beschriebenen Experimente enthalten wohin Faktoren in Kursivschrift wurden nur in der Ausführung für "Optimierung incubatio enthaltenn Bedingungen und Erntesysteme für die Herstellung von monoklonalen Antikörpern in Pflanzen mit transiente Expression ".
2. DoE Planungsprozesses. Faktoren, die erhebliche Auswirkungen auf die Reaktion untersucht werden auf der Grundlage der verfügbaren Daten ausgewählt. Dann Faktor Attribute (zB numerisch), Bereiche und Ebenen zugeordnet sind. Vorkenntnisse und Experimente verwendet werden, um eine geeignete Basis-Modell zu definieren. Die Vorhersagekraft Anforderungen werden auf der Grundlage der Anwendung / Zweck des endgültigen Modells definiert. Die erhobenen Daten können dann in entsprechende DoE-Software übertragen werden.
2. Einrichten einer RSM in DesignExpert
- Starten DesignExpert und wählen Sie "New Design". Im Fenster "Response Surface", wählen Sie &# 34; Optimal "und geben Sie die Anzahl der numerischen und kategorischen Faktoren in Abschnitt 1.1 ausgewählt).
- Geben Sie Faktor Namen, Einheiten, Typen, Untertypen, Anzahl der Ebenen / Niveau Grenzen und Werte für die Stufen für alle Faktoren in die entsprechenden Felder ein.
- Weiter zur nächsten Seite und unter "Suchen" Optionen "Best" sowie die gewünschte "Optimalität"-Kriterium, hier "D-optimal".
- Im Menü "Bearbeiten ... Modell", wählen Sie das Modell, das die Faktoren und Wechselwirkungen in Abschnitt 1.2 voraussichtlich) enthält. Wenn Sie nicht sicher, wählen Sie eine vollständige Modell, das alle Faktoren und Wechselwirkungen für eine bestimmte Polynomgrad, hier "Quadratisch" umfasst. Beachten Sie, dass die Auswahl eines voll-Modell (mit allen Interaktionen) können die Anzahl der Versuche für die DoE erforderlich erhöhen.
- Wählen Sie die Anzahl der "Bausteine". Hier wurde ein einzelner Block verwendet, da alle Pflanzen wurden aus der gleichen Charge, alle Bakterien gleichzeitig kultiviert worden war, undAlle Injektionen wurden am selben Tag vom selben Betreiber durchgeführt. Verwenden Sie mehr als einen Block, wenn mehr als eine Charge von Pflanzen verwendet wird oder mehrere Betreiber die Injektionen zu behandeln.
- Balance das Design
- Aktivieren Sie "Force kategorisch Balance", um die Läufe des Experiments gleichmäßig unter den kategorischen Faktorstufen zu verteilen, z. B. verschiedene Promotoren, die getestet werden.
Hinweis: Dies kann die Optimalität der Konstruktion zu einem Grad, DesignExpert wird als%-Wert je nach den von der Optimalität Algorithmus ausgewählt Punkte berichten reduzieren. - Neuberechnung der Design mehrmals mit Hilfe der implementierten Zufallsgenerator Algorithmus, um die Reduzierung der Optimalität zu minimieren.
Hinweis: Verluste in Optima kann von ~ 3-40% unter Verwendung derselben Eingangsdaten, aber die Änderung der Anzahl von Wiederholungen verwendet werden, um categoric Gleichgewicht zu halten.
- Aktivieren Sie "Force kategorisch Balance", um die Läufe des Experiments gleichmäßig unter den kategorischen Faktorstufen zu verteilen, z. B. verschiedene Promotoren, die getestet werden.
- Die Software wird ein Wert für die Anzahl der "Model-Punkte" auf der Grundlage der Basis-Modell vorschlagen, Hier 70 läuft. Stellen Sie die Anzahl der Durchläufe für "Replikate" und "Um den Mangel an Passform zu schätzen", um sicherzustellen, dass es> 5% der Anzahl der "Model-Punkte" für jeden, hier jeweils 10 läuft.
- Weiter zur nächsten Seite wählen Sie die Anzahl der Antworten und geben ihre Namen und Einheiten. Weitere Antworten kann auch jederzeit während der Datenauswertung ohne negative Auswirkungen auf das Design hinzugefügt werden.
- Weiter, um den Algorithmus zu starten, die Berechnung der Faktorstufen für die Läufe des DoE. Wenn das ausgewählte Basismodell ist die Anzahl der Ebenen für einen bestimmten Faktor nicht übereinstimmen, wird eine Benachrichtigung angezeigt, und die Berechnung wird nicht gestartet. In diesem Fall entweder:
- Erhöhen Sie die Anzahl der Ebenen für diesen Faktor, oder
- Deaktivieren Sie die Bedingungen im Basismodell, das nicht auf der Grundlage der aktuellen Anzahl der Ebenen berechnet werden kann.
- Beispielsweise wenn es zwei Ebenen für den Faktor "Inkubationszeit" t (dh 2 d und 5 d) in ter aktuelle Design und eine quadratische Basismodell mit der Bezeichnung t 2 gewählt wurde, fügen Sie entweder eine dritte Ebene für t (dh 8 d) oder entfernen Sie den Faktor t 2 aus dem Modell.
- Speichern Sie die Tabelle, die optimalen Faktorkombinationen, die angezeigt wird, wenn die Berechnung abgeschlossen ist enthalten.
- In der "Design"-Knoten wählen Sie die "Auswertung" Unterknoten und gehen Sie auf die Registerkarte "Diagramme".
- Im "Graphs Werkzeug" Auswahl "FDS" und in der "FDS Graph"-Box wählen Sie "Pred" als Fehlertyp. Geben Sie dann die Mindest nachweisbaren Unterschied sowie den ungefähren Wert für die geschätzte Standardabweichung der in Abschnitt 1.1.1 definiert System) als Werte für "d" und "s" bzw. (hier 20 und 8 pg / ml für DsRed). Geben Sie außerdem das Alpha-Niveau (akzeptable% fehlt eine signifikante Wirkung) geeignet für die Anwendung, in der Regel 0,05 (5%).
- Wenn dies nicht der Fall (wie hier, war FDS 1%, wie in 3A gezeigt), gehen Sie zurück zu den "Design"-Knoten und in der Taskleiste "Design Tools", dann "Augment Entwurf ..." und wählen Sie " Ergänzen ".
- Wählen Sie die gleichen "Suche" und "Optimalität" Kriterien wie zuvor. Außerdem wählte die gleiche "Edit-Modell" und Einstellungen "Force kategorisch balance". Wenn das Design Vergrößerung wird vor jedem Experiment (wie hier geschehen) durchgeführt wird, dann ändern Sie das "Setzen Sie läuft in den Block" auf "Block1".
- In der Rubrik "Runs" geben Sie die Anzahl der zusätzlichen "Model-Punkte", die Aufrechterhaltung von mindestens 5% "Replikate" und "To Mangel schätzenvon fit "in der Gesamtdesign. Dabei wurden 100 zusätzliche Fahrten aufgenommen und keine" Replikate "und" fehlender Passform schätzen "enthalten waren.
- Sobald die Berechnung abgeschlossen ist, überdenken die FDS Graphen wie oben beschrieben. Wenn der FDS ist immer noch nicht zufriedenstellend ist, wiederholen Sie den Entwurf Vergrößerung wie oben beschrieben. Hier war die FDS 100% nach Vergrößerung und damit keine weitere Verstärkung erforderlich war (3B).
Abbildung 3. Vergleich FDS Parzellen. A. A DoE, bestehend aus 90 Läufen produziert eine unzureichende FDS von nur 1% für die Standardfehler der Vorhersage, unter Verwendung einer quadratischen Basis-Modell in Kombination mit den Werten für die Mindest nachweisbaren Unterschied (20 ug / ml) und Schätzungengepaart Standardabweichung des Systems (8 &mgr; g / ml). B. Augmentation des DoE zu insgesamt 210 Pisten erreicht eine 100% FDS und einen Flach Kurve, die gleichbleibende Präzision des Modells in der gesamten Design-Raum.
3. Klonierung und Analyse der Expressionskassetten
- Kultivieren von Escherichia coli in 5 ml LB-Medium (10 g / l Trypton, 5 g / l Hefeextrakt, 170 mM NaCl, 50 mg / l Ampicillin, für LB-Agar-Platten wurden um 15 g / l Agar) bei 37 ° C für 6 -8 Stunden oder über Nacht auf einem Schüttler bei 160 Umdrehungen pro Minute. ACHTUNG: Ampicillin ist eine schädliche Substanz. Impfen der LB-Medium mit entweder 50 ul Flüssigkultur oder die Übertragung von Zellen Kolonien auf Platten mit einer Pipettenspitze gewachsen.
- Für die Reinigung von Plasmid-DNA PSO und andere Derivate von pPAM (GenBank AY027531) aus E. coli K12 Stamm DH5a, folgen Sie den Anweisungen in der DNA-Reinigung-Kit Handbuch 24. ACHTUNG: die Reinigung kes enthält schädliche Chemikalien (siehe oben Handbuch). Die Plasmid-Sequenz ist in Fig. 4 und 20 abgeschlossene et al. Beschrieben.
- Bestimmung der DNA-Konzentration in dem Eluat durch Messung der Extinktion einer 2 ul Probe bei 260 nm in einem ND-Gerät.
- Bestätigen der Identität der gereinigten Plasmid-DNA durch Verdauung mit Restriktionsendonukleasen (RE).
- Wählen Sie die REs nach der Plasmid-Sequenz, so dass einzigartige und unterscheidbare Fragmentmuster erzeugt werden. Die Empfehlungen des Herstellers für den Aufschlußbedingungen, wie Reaktionsvolumen, Zeit, Temperatur und Konzentration der Stabilisator Rinderserumalbumin. Je nach Empfindlichkeit der Analyseeinrichtung verwenden 50-500 ng der Plasmid-DNA pro Verdauung.
- Vorbereitung 0,8-2,0% Gele für die Trennung von DNA-Fragmenten durch Agarose in kochendem Tris-Borat-EDTA (TBE)-Puffer (90 mM Tris, 90 mM Borat, 2 mM EDTA, pH 8,0). Ter größer die erwarteten Fragmente sollten weniger Agarose in dem Gel verwendet werden.
- Werden 5 ul fünffache Probenpuffer (5x SABU, 0,1% (w / v) Bromphenolblau, 0,1% (G / V) Xylolcyanol, 10% (w / v) Glycerin in TBE gelöst) und 50 ul der RE-behandelten DNA-Probe zu trennen und die Fragmente durch Agarose-Gel-Elektrophorese bei 100 V für ~ 40 min, oder bis eine klare Trennung der Fragmente erreicht wird. Auf jedem Gel, gehören eine Spur, die DNA-Leiter Größenmarker für den Vergleich, z. B. 2-3 ul 1-kb-Leiter.
- Ersetzen Sie die Omega-5'-UTR in PSO mit einem der anderen drei 5'UTRs.
- Lassen Sie die Omega-5'-UTR-Sequenz von ~ 4 ug gereinigte PSO DNA durch Behandlung mit 20 Einheiten EcoRI-HF-und NcoI-HF REs in NEBuffer 4 bei 37 ° C ~ 60 min. Dann trennen Sie die Fragmente wie in den Abschnitten 3.4.2 und 3.4.3 beschrieben.
- Das größere Fragment zu isolieren (PS "Rückgrat") aus dem Agarosegel unter Verwendung eines Gels Extraction Kit nach der Anleitung des Herstellers 25 und bestimmen die Konzentration der, wie in Abschnitt 3.3 beschrieben gereinigten DNA). ACHTUNG: die Gel-Extraktions-Kit enthält schädliche Chemikalien finden Sie im Handbuch.
- Isolieren Sie die CHS CHS-LPH und TL 5'UTRs von geeigneten Spender-Vektoren durch die Behandlung ~ 10 ug jeden Vektor mit 20 Einheiten Eco RI-HF-und NcoI-HF REs in NEBuffer 4 bei 37 ° C ~ 60 min. Dann trennen Sie die Fragmente wie in den Abschnitten 3.4.2 und 3.4.3 beschrieben und reinigen die kleineren 5'-UTR-haltigen Fragment, wie in Abschnitt 3.5.2 beschrieben.
- Ligieren des isolierten gereinigten 5'UTRs in separaten Aliquots des isolierten gereinigten linearen pS Vektor bei 25 ° C für 5 min nach Angaben des Herstellers 26. Verwenden ~ 50 ng Vektor-DNA und ein dreifacher molarer Überschuss an 5'-UTR-DNA in einem Gesamtvolumen von 20 ul.
- Transformation E. coli-Zellen mit thE rekombinanten Plasmide 26,27.
- In ~ 10 ng (~ 4-5 ul) Ligationsansatz (siehe Abschnitt 3.5.4) auf 50 ul RbCI kompetente E. coli und vorsichtig mischen und dann für 30-60 Minuten auf Eis inkubiert. Hitzeschock für 1,5 min bei 42 ° C und kalt auf Eis für 5-30 min.
- Add 950 ul antibiotikafreien LB-Medium und Inkubation für 1 h bei 37 ° C und 160 Upm. Für die Selektion von Transformanten, verteilt 50 und 100 &mgr; l der Kultur auf LB-Agarplatten, die Ampicillin enthalten und Inkubation für ~ 16-20 Stunden bei 37 ° C.
- Impfen 10.05 einzelnen Kolonien, die jeden in Abschnitt 3.1 in 5-ml-Aliquots von LB-Medium Ampicillin enthält beschriebenen Promotor-5'-UTR-Ligation. Dann reinigen die Plasmid-DNA und bestätigen ihre Identität wie in den Abschnitten 3.2 bis 3.4 beschrieben.
- Ersetzen Sie die 35SS-Promotors mit dem nos-Promotor in jeder der vier 5'-UTR-Plasmide mit Asc I und Eco RI REs in NEBuffER 4 bei 37 ° C für 1 h, wie in den Abschnitten 3.5 und 3.6 beschrieben.
- Einführung jedes der acht erhaltenen Plasmide in A. GV3101: pMP90RK durch Elektroporation 28.
- In ~ 500 ng gereinigte Plasmid-DNA zu 50 ul zuständigen A. tumefaciens-Zellen auf Eis. Vorsichtig mischen und in ein vorgekühltes übertragen 0,2 cm Elektroporationsküvette. Stellen Sie sicher, dass das Gemisch am Boden der Küvette und keine Luftblasen enthalten.
- Impuls Zellen bei 2,5 kV für 5 ms und bestätigen die Intensität und Dauer des Impulses.
- Vermeiden Sie erhöhten Salzkonzentrationen in der DNA-Probe oder falsche Vorbereitung des zuständigen A. tumefaciens-Zellen, da diese bei hohen Ionenströme verursacht sofortigen Verdampfung der Zellsuspension führen Transformationseffizienz stark verringert.
- In 950 ul YEB-Medium ohne Antibiotika (5 g / L Rindfleischextrakt, 1 g / l Hefeextrakt, 5 g / l Peptone, 5 g / l Saccharose, 2 mM MgSO4, pH 7,0), vorsichtig mischen und sofort übertragen, in ein steriles 1,5 ml Reaktionsgefäß. Inkubation für 2-4 h bei 26-28 ° C und 160 Upm.
- Verbreiten Sie 1-2 ul YEB auf Agar-Platten mit Antibiotika (50 mg / L Carbenicillin, 25 mg / l Kanamycin, 25 mg / l Rifampicin) für die Selektion von Transformanten. VORSICHT: Rifampicin ist eine toxische Substanz ist.
- Impfen drei 5-ml-Aliquots YEB Medium mit Antibiotika mit Zellen aus einzelnen Kolonien, die jeden Promoter-5'-UTR-Ligation und Inkubation für 48-72 Stunden bei 26-28 ° C und 160 Umdrehungen pro Minute.
- Bestätigen Sie den Erfolg von A. tumefaciens-Transformation.
- Transfer 2 ul jedes Aliquot von Abschnitt 3.8.6 zu 48 ul Aliquots der PCR-Mastermix (2 ul jeder 10 uM Primer Lager (400 nM Endkonzentration von jedem Primer), trennen1 ul 10 mM dNTP-Mix (200 uM Endkonzentration jedes Desoxynucleosidtriphosphat), 5 ul 10-fach Expand High Fidelity-Puffer mit 15 mM MgCl 2, 0,75 ul Expand High Fidelity Enzym-Mix und 39.25 ul sterilem destilliertem Wasser).
- Amplifikation der Expressionskassette von jedem Plasmid unter Verwendung von geeigneten Primern (FWD: 5'-CCT CAG GAA GAG CAA TAC-3 ', Bindungs 1026 Nukleotide stromaufwärts des Promotors, REV: 5'-CCA AAG CGA GTA CAC AAC-3', Bindungs innerhalb der 35S Polyadenylierungssignal) unter geeigneten PCR-Bedingungen. Hier 94 ° C wurde für die anfängliche Denaturierung, gefolgt von 30 Zyklen von 94 ° C Denaturierung für 15 Sekunden verwendet wird, 51 ° C Annealing für 30 sec und 72 ° C Elongation für 120 sec und einer abschließenden Verlängerungsschritt bei 72 ° C für 8 Minute
- Bestimmung der Größe der PCR-Produkte mittels Agarose-Gelelektrophorese, wie in Abschnitt 3.4.3 beschrieben.
- Bereiten A. tumefaciens Glycerin Aktien vonMischen von 500 &mgr; l 50% (v / v) steriles Glycerin mit 500 ul A. tumefaciens Kulturen aus Abschnitt 3.8.6, für die Transformation wurde (Abschnitt 3.9.3) bestätigt. Speichern die Glycerinstammkulturen bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung.
- Berechnung der Faltungsenergien der verschiedenen mRNAs mit der RNAfold Webserver 29 und umfassen die Nukleotidsequenz von der Transkriptionsstartstelle bis zu den ersten 50 bp der codierenden Region.
- In der Rubrik "Fold Algorithmen und grundlegende Optionen" wählen Sie die "minimale freie Energie (MFE) und Partitionsfunktion" und "Vermeidung von isolierten Basenpaare"-Optionen.
- In der "Advanced Klapp-Optionen" wählen Sie "baumelt Energien auf beiden Seiten einer Helix in jedem Fall", "RNA-Parameter (Turner-Modell, 2004)" und ändern "neu skalieren Energieparameter zu bestimmten Temperatur (C)" bis 25 ° C
- In der Rubrik "Ausgabeoptionen" wählen Sie alle Optionen.
4. Promotor und 5'-UTR-Varianten. Die Expressionskassetten wurden durch stufenweise Austausch der 5'-UTR erzeugt, was vier Kombinationen mit 35SS CaMV-Promotor, gefolgt von dem Austausch des Promotors mit dem nos-Sequenz ergab vier weitere Varianten und insgesamt acht unterschiedliche Promotor / 5'UTR Kombinationen.
4. Pflanzenbau
- Vorbereitung einer 0,1% igen Lösung des Düngemittels Ferty2 Mega in deionisiertem Wasser bei pH 5,9.
- Bereiten 10 x 10 x 8 cm Steinwollblöcke durch umfangreiche Spülung mit VE-Wasser, um restliche Chemikalien zu entfernen und schließlich ins Gleichgewicht mit Dünger.
- Seed Tabakpflanzen, indem 1-2 Tabaksamen auf jeder Wollblock, gefolgt von einem kurzen bündig mit Dünger vorsichtig, um zu vermeiden Waschen der Samen entfernt.
- Keimen und pflegen die Tabakpflanzen 42 Tage im Gewächshaus bei 25/22 ° C Tag / Nachttemperatur, 70% relativer Luftfeuchtigkeit und einem 16-Stunden-Photoperiode (180 mmol m -2 s -1; λ = 400-700 nm) . Während dieser Photoperiode, bewässern mit Dünger für 15 Minuten jede Stunde in Hydrokultur.
5. Transient Protein Expression
- Bereiten A. tumefaciens für die Injektion in Blättern.
- Impfen 5-50 ml YEB Medium mit Antibiotika mit 1% A. tumefaciens Kryo-Stammkultur und Inkubation bei 27 ° C, bis die OD <sub> 600 nm erreicht 5,0 (~ 48-72 h je nach Volumen und Schiffstyp).
- Verdünnen Sie die A. tumefaciens-Kultur mit Wasser und 2-fach Infiltrationsmedium (4,3 g / l Murashige-Skoog-Salzen (pH 5,6), 5 g / l Saccharose, 1,8 g / l Glucose, 100 mM Acetosyringon), um die OD 600 nm für die Injektion erforderlichen entsprechen. Bestätigen Sie die OD 600nm kurz vor der Injektion. Hinweis: Ein OD 600 nm von 1,0 entspricht ~ 1,43 ± 0,12 x 10 9 koloniebildenden Einheiten pro ml.
- Spritzen Sie die A. tumefaciens-Suspension in Blättern.
- Wählen und beschriften Sie die noncotyledon Blätter und Positionen darauf zu (z. B. nach einer Strategie DoE) behandelt werden.
- Sie verschiedene A. injizieren tumefaciens-Lösungen in der gleichen Zwischenrippenfeld. Verwenden Sie stattdessen gegenüberliegenden Abschnitten auf jeder Seite der Mittelnerv-Achse. Wenn mehr als zwei unterschiedliche Lösungen müssen an der gleichen Position eingespritzt werden verwendet eine additional Anlage.
- A. gründlich schütteln tumefaciens-Lösung, um alle Zellen, die seit der Herstellung der Verdünnung und saugen in eine 1-ml-Spritze abgelagert haben resuspendieren.
- Leicht zerkratzen die Epidermis an der Stelle für die Injektion mit einer Pipettenspitze oder ähnliches, um den Zustrom der A. erleichtern soll tumefaciens Lösung. Vermeiden Zerreißen der Blattspreite während dies zu tun.
- Halten Sie die Spritze senkrecht zur Blatt Klinge berühren den Lauf gegen die Zwischenrippenfeld behandelt werden und schieben den Auslass (ohne Nadel befestigt) auf der Unterseite des Blattes. Drücken Sie die Oberseite des Blattes sanft zugleich die Blattspreite Verschieben oder Brechen zu verhindern.
- Drücken Sie vorsichtig den Spritzenkolben. Die A. tumefaciens-Lösung wird die interzellulären Räume innerhalb der Blattspreite eingeben, wie durch die behandelten Bereiche dunkler grün und feucht erscheinen angezeigt. Wiederholen Sie diesen Vorgang an mehreren Positionen, bis die ganze intercostal Feld mit A. infiltriert tumefaciens. Dann mit dem nächsten Zwischenrippen Bereich fortzusetzen.
- Stellen Sie sicher, dass die Spritze senkrecht zur Blatt bleibt. Kippen Sie die Spritze bewirkt, dass der Bakteriensuspension unter hohem Druck herausspritzen.
- Wenn verschiedene A. tumefaciens-Lösungen verwendet werden (z. B. auf verschiedene Promotoren zu testen), entfernen Sie alle verbleibenden auf der Unterseite des Blattes von der ersten Injektion mit einem Papiertuch oder ähnliches, bevor die nächste Lösung überschüssige Lösung.
- Post-Infiltration Inkubation von Pflanzen und Probenahme.
- Bereiten Sie eine Phytotron für den behandelten Pflanzen ~ 24 Stunden vor der Injektion auf Temperatur-und Feuchtigkeitsausgleich bei den für die DoE erforderliche Niveau zu ermöglichen.
- Nach der Injektion in die Pflanzen übertragen Phytotron und legen Sie sie in Schalen groß genug für die Bewässerung mit Wasser, bis zum Ende der Inkubationszeit von der DoE bestimmt.
- Stellen Sie eine 16 Stunden photoperiod mit sechs Osram cool white 36 W Leuchtstoffröhren je 0,7 m 2 (75 mmol m -2 s -1; λ = 400-700 nm). Verhindern, dass die Pflanzen aus einander Beschattung durch die Begrenzung der Anzahl der Pflanzen auf sechs pro 0,7 m 2.
- Vor der Probenahme, sicherzustellen, dass die richtigen Zwischenrippenfeld wurde durch Vergleich der Label in Abschnitt 5.2.1 und der DoE-Plan aufgenommen ausgewählt.
- Verwenden Sie einen Korkbohrer auf 4-5 Blattscheiben von den behandelten Zwischenrippenfelder an den von der DoE angegebenen Positionen und Zeiten, zu entfernen. Sie das ganze Blatt von der Pflanze während der Probenahme nicht entfernen. Stabilisierung des Blattes mit einer Handpapierhandtuch beim Entfernen der Scheiben zu Bruch zu verhindern.
- Bestimmen Sie die Masse von jeder Probe und legen Sie sie in einem 1,5 ml Reaktionskunststoffrohr mit Beispielnamen und Masse gekennzeichnet. Lagern Sie die Proben bei -20 ° C oder -80 ° C vor der Proteinquantifizierung. Das Verfahren kann an dieser Stelle für mehrere Monate abhängig von der Probenstabilität pausiertund die Lagertemperatur.
6. Proteinquantifizierung
- Extrahieren von Proteinen aus den Blattscheibenproben.
- 3 ml Extraktionspuffer (50 mM Natriumphosphat, 500 mM Natriumchlorid, pH 8,0) pro mg Probenmasse und Schleifblattscheiben im Reaktionsrohr mit einer elektrischen Stößel, bis keine großen Fragmente bleiben. Überhitzung der Probe zu vermeiden.
- Entfernen dispergierten Feststoffe zweimal Zentrifugieren der Probe bei 16.000 × g für 20 min bei 4 ° C. Den Überstand in ein sauberes 1,5 ml Reaktionsgefäß nach jedem Schritt, ohne das Pellet zu stören.
- Nach der Zentrifugation kann der Prozess durch Einfrieren in Abhängigkeit von der Probenstabilität und Lagertemperatur die Pflanzenextrakte bei -20 ° C oder -80 ° C für mehrere Monate pausiert. Zu bestätigen, daß ein Gefrier-Auftau-Zyklus beeinträchtigt nicht die Konzentration des Zielprotein (en).
- Messen Sie die DsRed-Fluoreszenz.
- Bereiten Sie drei technische Replikate jeder Probe in schwarzen 96-Well-Halbplatten Bereich (50 ul Extrakt pro Vertiefung). Vermeiden Sie die Bildung von Blasen beim Pipettieren.
- Verwenden Sie einen Satz von sechs Verdünnungen (0, 25, 75, 125, 175 und 225 pg / ml) einer DsRed-Standard pro 96-Well-Platte, eine Auskleidung Referenzkurve zu erzeugen. Bereiten Sie die Verdünnungen in PBS und speichern sie bei 4 ° C für den Einsatz innerhalb von 3 Monaten.
- Messung der Fluoreszenz zweimal nacheinander in einer 96-Well Plattenlesegerät mit 530/25 nm-Anregungs-und 590/35 nm-Emissionsfiltern ausgestattet.
- Für jede Probe, die Fluoreszenz im Durchschnitt über die zwei liest und die drei technischen Wiederholungen und subtrahieren den Wert für die Blindkontrolle mit 0 pg / ml DsRed aufgezeichnet. Auch subtrahieren diesen Wert aus der liest der Standardverdünnungen und diese leer korrigierten Werte für eine lineare Regression was eine Referenzkurve (durch den Ursprung des Koordinaten).
- Verwenden Sie die Steigung der Referenzkurve, die f konvertierenluorescence für die Proben in DsRed-Konzentrationen gemessen. Falls erforderlich, die Proben zu verdünnen, so dass die Anzeige innerhalb des Konzentrationsintervall der Standards fällt und betrachten diesen Verdünnungsfaktor in nachfolgenden Berechnungen.
- Bestimmen Sie die Konzentration von 2G12.
- Vorbereitung einer Oberflächenplasmonresonanz (SPR)-Vorrichtung für die Messung der Antikörperkonzentration durch Kuppeln von Protein A an die aktivierte Oberfläche einer Durchflusszelle. Verwenden Sie ein anderes Flusszelle durch Inaktivierung des Referenzoberfläche ohne Kopplung von Protein A 30,31.
- Verdünnte Pflanzenextrakte 1:20 SPR-Laufpuffer (10 mM HEPES pH 7,4, 3 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,05% v / v Tween-20) und messen die Antworteinheiten (RU) der Antikörperbindung an Protein A in drei technische Wiederholungen jeder Probe am Ende einer 90 ul-Injektion (180 sec bei 30 ul / min). Subtrahieren Sie die RU gemessen am Referenzflusszelle (kein Protein A) von der RU in der experimentellen fl gemessenow Zelle (Protein A-Oberfläche).
- Messen Sie 585 ng / ml 2G12 Standard nach jeweils 10 bis 15 Proben und subtrahieren die in den Referenzdurchflusszellen, wie oben beschrieben gemessen wird. Verwenden Sie die durchschnittliche RU dieser Standards, um eine lineare Bezugskurve durch den Ursprung des Koordinaten zu berechnen.
- Berechnung der 2G12-Konzentrationen in den Proben auf der Basis der 1:20-Verdünnung und der Steigung der Referenzkurve.
- Überprüfen Sie für eine starke unspezifische Bindung an die Referenzzelle, die korrupten kann die Messung. Überprüfen Sie auch, ob die Standards zu halten 2G12 etwa konstante Werte (<5% Abweichung) während Analyse, wie größere Variation spiegelt Alterung der Protein-A-Oberfläche.
7. Datenanalyse und Auswertung
- Manuell zu analysieren, die in den Expressionsversuche für (i) Extremwerte (hoch oder niedrig), die Messfehler beobachteten Reaktionen, (ii) ungewöhnliche Ergebnisse, z. B. Faktorkombinationen, die Gen-bewerten unerwartete Antworten anzeigt Datenaustausch, und (iii) fehlende Werte.
Hinweis: Verwenden Sie diese Aktionen auf Modellbildung zu verhindern, basierend auf fehlerhaften Daten. - Übertragen Sie die Antwortdaten analysiert (hier werden die Proteinkonzentrationen) in das "Design"-Knoten DesignExpert. Stellen Sie sicher, dass die Antwortdaten korrekt zu den entsprechenden Faktor Einstellungen zugewiesen. Es gibt eine umfangreiche Hilfe-Sektion in der DesignExpert Software, die angesprochenen Aspekte unter Cover vorhanden.
- In der "Analyse"-Knoten, wählen Sie die Antwort zu analysieren und wählen Sie zunächst "keine" in der Registerkarte Transformation.
Hinweis: eine Transformation für Min / max-Verhältnisse der Reaktion größer als 10 empfohlen. Die nützlichsten Transformation kann aus der Box-Cox-Plot in der Registerkarte "Diagnose" im Abschnitt "Diagnose" der "Diagnose-Tool" beschrieben (Abschnitt 7.8) erhalten werden. Ein Log 10 Transformation ist oft sinnvoll. - In der Registerkarte "Modell" wird ein erstes Modell auf der Basis der "Fit Sicht" Ergebnisse vorgewählt. Verwenden Sie den automatischen Modus, um dieses Modell zu bearbeiten:
- Wählen Sie eine "Prozessordnung", die eine Bestellung über das vorgeschlagene Modell ist, z. B. wenn das vorgeschlagene Modell ist "2FI" (Zwei-Faktor-Interaktion) und wählen Sie dann "Quadratisch".
- Wählen Sie "Rückwärts" im Feld "Auswahl", die iterativ zu entfernen wird nicht signifikante Begriffe aus dem Modell nach hend auf die "ANOVA"-Reiter auf der Grundlage der "Alpha out" Wert, der sollte sich zunächst 0.100 sein.
- Wenn von der Software aufgefordert, immer automatisch korrigieren Sie die Modellhierarchie, denn dies ist notwendigerweisey, zuverlässige Modelle 32,33 generieren.
- In der Registerkarte "ANOVA", untersuchen die vorgeschlagene Modell und die enthaltenen Faktoren. Wenn nötig, alle Faktoren mit p-Werte über einer vorgegebenen Schwelle manuell entfernen (hier 0,05, was einer 5%-Niveau) oder solche, die wahrscheinlich auf mechanistische Überlegung, durch Zurückschalten auf der Registerkarte "Modell" ändern "Auswahl" auf "Manuell" und die Beseitigung der entsprechenden Faktoren aus dem Modell.
- Zurück in der Registerkarte "ANOVA" bewerten aktualisiert Modell in Bezug auf die p-Wert der "Model" (ein niedriger Wert ist wünschenswert, da dies zeigt Bedeutung) und dem "Lack-of-fit" (ein hoher Wert ist wünschenswert weil dies zeigt Mangel an Bedeutung) sowie die Werte für "R-Quadrat", "Bereinigt R-squared" und "Vorhergesagte R-Quadrat" (Werte> 0,80 sind wünschenswert für alle drei Werte).
- Vergleichen Sie diese Werte for verschiedene Modelle mit / ohne an mehreren Faktoren Signifikanzniveaus.
Hinweis: Es kann hilfreich sein, um die Reaktion Spalte in der "Design"-Knoten duplizieren und individuell durchführen jede Analyse oder die ganze "ANOVA"-Tabelle in ein anderes Programm zu exportieren, wie eine Tabellenkalkulation.
- Vergleichen Sie diese Werte for verschiedene Modelle mit / ohne an mehreren Faktoren Signifikanzniveaus.
- Fahren Sie auf die Registerkarte "Diagnose", um die Qualität des Modells zu bestätigen und erkennen potentielle Ausreißer in der Datenmenge, die einen starken Einfluss auf das Modell durch die Untersuchung alle Registerkarten in der "Diagnose Tool" (Abschnitt "Einfluss", "Diagnose" und) haben .
- In der Rubrik "Diagnose" der "Diagnose-Tool", die folgenden Aktionen:
- Achten Sie darauf, die Punkte werden zufällig innerhalb der Grenzen in der Streu "Residuen gegen vorhergesagte" Diagramm. Hier wird eine winkelförmige Verteilung auf eine erforderliche Datenumwandlung.
- Achten Sie darauf, die Punkte werden zufällig innerhalb der Grenzen in die Streu"Residuen gegen vorhergesagte" Diagramm. Hier wird eine winkelförmige Verteilung auf eine erforderliche Datenumwandlung.
- Untersuchen Sie, ob die Punkte in der "Residuen vs run" Streudiagramm zufällig innerhalb der Grenzen. Ein Muster (zB "Treppe") gibt einen Trend in der Daten-und Gebäudeblock kann verwendet werden, um ihren Einfluss auf das Modell entgegenzuwirken.
- Suchen Sie nach einer gerade diagonale Linie, die die ideale Modell in der "Vorhergesagte und tatsächliche" Handlung. Desto größer ist die Streuung der Daten auf der Diagonalen, desto ungenauer die Modell.
- Prüfen Sie, ob eine Überlappung der blauen (am besten) und Grün (Ist) vertikale Linien in der Box-Cox-Plot, der die Datentransformation. Wenn die grüne Linie ist die blaue (außerhalb des Intervalls durch die roten vertikalen Linien) nicht überein gehen Sie zurück zu Abschnitt 7.3 sowie Modellbildung Runde verbessern, indem die Auswahl der Datentransformation von der Box-Cox-Plot vorgeschlagen. Auch die Verdoppelung der WiederReaktion Spalte kann sinnvoll sein, verschiedene Modelle zu vergleichen.
- Stellen Sie sicher, dass die Punkte in den "Residuen vs Factor"-Charts (es gibt ein Diagramm für jedes Modell Faktor) streuen zufällig innerhalb der Grenzen. Krümmung in der Datenverteilung kann ein Faktor fehlt im Modell zeigen.
- In dem Abschnitt "Einfluss" der "Diagnose-Tool", stellen Sie sicher, dass zufällige Streuung der Daten innerhalb der Grenzen in den "Student-Residuen Äußerlich", "Leverage", "DFFITS" und "DfBetas" Grundstücke und gleichmäßig niedrige Verteilung ohne Extremwerte in der "Cooks Distance" Handlung.
- In der Rubrik "Diagnose" der "Diagnose-Tool", die folgenden Aktionen:
- In der Registerkarte "Modellgraphen", visualisieren die ausgewertet Modell. Für eine begrenzte Anzahl von numerischen Faktoren (z. B. 3) die Antwortoberfläche ("3D-Oberfläche") Darstellung ist nützlich, um optima / Merkmale manuell zu beurteilen.
Hinweis: Antwortflächen nur die Auswirkungen der beiden Faktoren zu veranschaulichentoren auf die Reaktion untersucht. Die Auswirkungen von zusätzlichen Faktor auf die Reaktion wird durch die Änderung seines Wertes (numerische Faktoren) oder Ebene (kategorische Faktoren) im Fenster "Werkzeug Factors" enthüllt. Alternativ können Faktoren für die Handlung Achse durch Rechtsklick in das Fenster "Faktoren Tool" und wählen Sie die gewünschte unabhängige Variable Achse zugeordnet werden.- Bearbeiten Sie die Faktorstufen und weisen Sie auf die Grafik mit Hilfe der Koordinaten "Faktoren-Tool".
- Export Graphen mit der "Export Graph in Datei ..." in der Registerkarte "Datei"-Befehl.
- Verwenden Sie die "Numerical" Unterknoten in der "Optimierung" Knoten, um die Antwort numerisch über die Optimierung (minimieren, maximieren, in-Bereich) in Abhängigkeit von den Faktoren-Modell, an dem wiederum bestimmte Einschränkungen angewendet werden können (z. B. Grenzen und Gewichte) Registerkarte "Kriterien".
- Berechnen und untersuchen numerische Lösungen in den "Solutions"Registerkarte basierend auf der Eingabe in der Registerkarte "Kriterien" zur Verfügung gestellt.
- Exportieren Sie diese Lösungen auf andere Software (z. B. Tabellen) für weitere Analysen (zB Histogramme) enthüllt die Faktoreinstellungen mit hoher oder niedriger Antwortwerte verbunden.
Hinweis: Dies ist hilfreich, wenn mehr als drei numerischen Faktoren untersucht und 3D-Darstellung ist schwierig.
- Verwenden Sie den "Point Vorhersage" Unterknoten, die Antwort für bestimmte Faktor-Einstellungen vorherzusagen.
- Mit dieser Vorhersage für alle Einstellungen ausgewertet werden (hier alle Promotor und 5'-UTR-Kombinationen sowie alle Blätter und Inkubationszeiten oder Blattpositionen und Inkubation Temperaturen).
- Exportieren der vorhergesagten Werte und kompiliert sie an eine Datenreihe, die verwendet werden können, um die transiente Expression in Tabakpflanzen beschrieben, beispielsweise durch Berechnen des Ausdrucks für eine spezifische Promotor-5'-UTR-Kombination zu einem bestimmten Zeitpunkt gemittelt über alle Lamellen-Positionen oder across alle Blätter einer Pflanze.
- Normalisieren der Expressionsdaten, basierend auf den Massen der verschiedenen Blättern, um die spezifische Expressionsniveau (g g -1) oder spezifische Expressionsrate (g g -1 h -1) zu erhalten.
- Alternativ exportieren Sie die Koeffizienten der "Final Gleichung" aus dem unteren Bereich der Registerkarte "ANOVA" in eine Tabellenkalkulation und multiplizieren Sie sie mit einer Reihe von Einstellungen Faktor, um die gleiche Datenfeld ergeben.
Hinweis: Dieses Feld kann nur Werte enthalten Faktor innerhalb der ersten Design-Raum, weil das angepasste Modell Gleichung nicht zur Extrapolation geeignet.
- Führen Sie eine Bestätigungsexperiment für Modell Punkte, die von großem Interesse sind.
- Führen transiente Proteinexpression unter Bedingungen für die "Point Vorhersage" (Abschnitt 7.11) ausgewählt. ZB die gleichen Temperaturen und Blätter usw.
- Bestimmen Sie die Proteinkonzentrationen für diese vorübergehende Expression eXperiment wie oben beschrieben (Abschnitt 6) und vergleichen sie mit den Werten, die durch das Modell vorhergesagt.
- Prüfen Sie, ob der durchschnittliche Proteinkonzentration in der Bestätigungs-Experiment innerhalb der Response-Surface-Modell der Vorhersageintervall während Punkt erhalten Vorhersage fällt. Eine Übereinstimmung bestätigt die Vorhersagekraft des Modells. Eine Abweichung zeigt eine geringe Modellqualität und zusätzliche Fahrten erforderlich werden kann.
- Hinweis: Anlage von Charge zu Charge Variabilität erweitert das Vorhersageintervall und Bestätigung können Experimente mit einer anderen Charge von Pflanzen durchgeführt abzuwerten. Allerdings können Proben, die nicht verwendet wurden, um das Modell zu generieren, aber das aus der gleichen Pflanze Batch entstand als die Proben im Modell enthalten sind, wie wirksame Kontrollen zu dienen.
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Representative Results
Ein Beschreibungsmodell für DsRed Akkumulation während transiente Expression mit verschiedenen Promotoren und 5'UTRs
DsRed-Fluoreszenz in Blattextrakten wurde verwendet, um das Expressionsniveau des rekombinanten Proteins zu zeigen und damit als Antwort auf das SVM-Strategie verwendet. Die minimale nachweisbare Differenz wir als relevant war 20 ug / ml und die geschätzte Standardabweichung des Systems war 8 ug / ml bezogen auf den anfänglichen Experimenten. Faktoren, die in die vorübergehende Expression Modell aufgenommen wurden basierend auf Daten aus der Literatur 7,8 und unsere bisherigen Ergebnisse 9 ausgewählt. Die untersuchten Bereiche wurden ebenfalls nach diesen Daten ausgewählt (Tabelle 1). Mindestens drei Ebenen wurden für alle diskreten numerischen Faktoren, um die Berechnung einer quadratischen Basismodell erlauben ausgewählt. Ein D-optimale Auswahl-Algorithmus wurde für die Auswahl des DOE ausgewählt läuft die genaueste Schätzung für zu erhaltendie Koeffizienten des Regressionsmodells. Das Design ursprünglich von DesignExpert vorgeschlagen bestand aus 90 läuft, aber die FDS war nicht ausreichend, um eine 1% ige Standardfehler der Vorhersage (3A) zu erreichen. D-optimale Vermehrung des Design auf insgesamt 210 Läufe dieses Problem gelöst und zu einer FDS 100% mit gleichmäßiger Vorhersagegenauigkeit über den Design-Raum durch die flache Kurve (3B) angegeben.
Die DsRed-Konzentrationen wurden für alle 210 Läufe bestimmt und die Daten wurden log 10 umgewandelt. Modell Faktoren wurden durch automatisierte Rückwärtsselektion von einer kubischen Modell mit einem Alpha-Niveau von 0,100 gewählt. Dies führte zu einer signifikanten Modell (Tabelle 2) mit geringfügigen Mangel der Anpassung und hohe Werte für die multiplen Korrelationskoeffizienten (Tabelle 2). Der p-Wert aller Modell Faktoren war <0,05 und somit keine weitere manuelle Manipulation des Modells erforderlich war. Das Modell enthaltenDrei-Faktoren-Wechselwirkungen, die nicht Teil der ursprünglichen quadratischen Basismodell waren (Tabelle 2). Re-Evaluierung des FDS Diagramm mit allen Faktoren in der letzten Vorhersagemodell enthalten ergab, dass die FDS für den Standardfehler der Vorhersage war nicht signifikant durch das die zusätzlichen Drei-Faktoren-Wechselwirkungen (FDS = 0,99) reduziert.
Die Modellqualität Diagnosewerkzeuge in DesignExpert angegeben, dass die Datentransformation nützlich war, und es gab keine fehlenden Faktoren in das Modell, weil die normalen Plot der Residuen zeigte lineare Verhalten und keine spezifische Muster wurde in den Residuen gegen vorhergesagt Grundstück beobachtet (5A und 5B ). Es gab auch keinen Trend über den Verlauf des Experiments eine versteckte zeitabhängige Variable (Fig. 5C) zeigen. Stattdessen waren die Modellvorhersagen in sehr guter Übereinstimmung mit der beobachteten DsRed-Fluoreszenz (5D). Wir therefore angenommen, dass das gewählte Modell war nützlich, um die transiente Expression von DsRed in nicht-Keimblatttabakblätter von verschiedenen Promotor / 5'UTR Kombinationen während einer nach der Infiltration Inkubationszeit von 8 Tage gefahren vorherzusagen. Wir haben auch eine künstliche ausgewählt linearen Regressionsmodells ohne Datentransformation, die Folgen der falschen Faktor Selektion und Transformation veranschaulichen (Abbildung 6). Klar, die normalen Plot der Residuen weicht von der erwarteten linearen Verhalten (6A) und es gibt ein "v"-förmiges Muster in den Residuen gegen vorhergesagt Grundstück statt einer Zufallsstreuung (6B). Darüber hinaus unterstreicht die Residuen vs Lauf Grundstück zwei Extremwerte (6C), während die Prognosen sind schlecht für beide, klein und hohe Werte, von der optimalen Modell (Diagonale) (6D) abweicht.
5'UTR Kombinationen mit dem CaMV 35SS-Promotor führte zu stärkeren Ausdruck DsRed als Kombinationen mit der nos-Promotor (5A und 5B), wie bereits berichtet, 34 und die entsprechenden Faktoren wurden gefunden in der DoE-Modell (Tabelle 2) signifikant. Das Modell sagte auch, dass die Blattalter ein wichtiger Faktor (Tabelle 2) mit Expressionsniveaus gezeigt, um höher in jungen Blättern sein (7B und 7D), die in guter Übereinstimmung mit unseren früheren Befunden 19 und die der anderen 7,8 war. Das Fortschreiten der DsRed Akkumulation in Blättern nicht linear oder exponentiell, sondern folgte einer S-förmigen Kurve während der 8 Tage nach der Infiltration Inkubation nach dem Modell. Interessanterweise gab es keine feste Reihenfolge der 5'UTRs in Bezug auf die entsprechenden DsRed Ausdruck. Daher ist die "Stärke" einer 5'UTR war abhängig von der zugehörigen Promotor. Es ist unwahrscheinlich, dass dieseWechselbeziehung zwischen dem Promotor und 5'UTR würde unter Verwendung eines OFAT Experiment offenbart worden. Das Vorhersagemodell auch an, dass bestimmte Paare von Promotor / 5'UTR Kombinationen (zB. CaMV 35SS/CHS und nos / CHS (7A und 7B), CaMV 35SS/omega und nos / CHS oder CaMV 35SS/CHS und CaMV 35SS / TL) resultierte in einer ausgewogenen Expressionsniveaus, die um weniger als 30% von einem bestimmten Verhältnis in allen Blättern und Inkubationszeiten> 2 Tage (zB. für CaMV 35SS/omega und nos / CHS war das Verhältnis ~ 8,0) 20. Solche ausgewogene Expression nützlich für die Expression von multimeren Proteinen, wie IgA mit einer definierten Stöchiometrie 35,36 sein.
Abbildung 5. Graphical Bewertung der Modellqualität. A. Die normale Wahrscheinlichkeitsdarstellung der Student-Residuen intern zeigt Normalverteilung, weil die Residuen folgen einer Linie B.. Intern Student-Residuen streuen um den Wert Null für alle Bereiche der vorhergesagte Antwort (Fluoreszenz), die eine entsprechende Datentransformation. C. Intern Student-Residuen streuen um den Wert Null während der ganzen Dauer des Versuchs, die die Abwesenheit von versteckten zeitlichen Wirkungen. D. Vorhergesagten und tatsächlichen Werte der Antwort sind in guter Übereinstimmung an allen Punkten, liegen in der Nähe der Diagonalen (ideal-Modell).
Abbildung 6. Diagnose anzeigt niedrigen Modellqualität. A B. Intern Student-Residuen zeigen ein "v"-förmige Verteilung zeigt eine unangemessene Datentransformation. C. Intern Student-Residuen streuen nicht um den Wert Null während der gesamten Verlauf des Experiments, zeigen aber eine Tendenz zu positiven Werten. Zusätzlich können zwei Extremwerten gefunden werden. D. Vorhergesagten und tatsächlichen Werte der Antwort sind in einem schlechten Vertrag, da die meisten Punkte weichen von der Diagonale (ideal-Modell).
Abbildung 7. Antwortflächen für transiente DsRed-Expression in Tabakblättern. A . trong> nos / CHS in Blatt 2, B. CaMV 35SS/CHS in Blatt 2, C. CaMV 35SS/TL in Blatt 6; D. CaMV 35SS/CHS in 6 Blatt. DsRed Konzentrationen erhöht in einer S-förmigen Weise während der Inkubationszeit. Expressionsniveaus waren niedriger in alten Blättern (z. B. Blatt 2 in A und B) im Vergleich zu jungen Blättern (z. B. Blatt 6 in C und D) und Nr. (A) im Vergleich zum CaMV-Promotor 35SS (B). Die 5'UTR hatte auch einen signifikanten Einfluss auf DsRed-Expression (z. B. TL (C) gegen die CHS (D)), aber die Expressionsstärke war abhängig von der zugehörigen Promotor.
| Quelle | Summe der Quadrate | "> DfMean Square | F-Wert | p-Wert | |
| Modell | 174,85 | 95 | 1,84 | 182,12 | <0.0001 |
| Position auf dem Blatt (A) | 0,16 | 1 | 0,16 | 16.06 | 0,0001 |
| Die Inkubationszeit (B) | 112,46 | 1 | 112,46 | 11.128,22 | <0.0001 |
| Blattalter (C) | 15,24 | 7 | 2.18 | 215,39 | <0.0001 |
| Promoter (D) | 23.49 | 1 | 23.49 | 2324.29 | <0.0001 |
| 5'UTR (E) | 0,93 | 3 | 0,31 | 30.61 | <0.0001 |
| AC | 0,24 | 7 | 0,034 | 3,38 | 0,0026 |
| BC | 1,46 | 7 | 0,21 | 20,64 | <0.0001 |
| BD | 2,27 | 1 | 2,27 | 224,51 | <0.0001 |
| BE | 0,87 | 3 | 0,29 | 28,74 | <0.0001 |
| CD | 0,29 | 7 | 0,042 | 4.11 | 0,0005 |
| CE | 0,43 | 21 | 0,021 | 2,04 | 0,0093 |
| DE | 0,48 | 3 | 0,16 | 15,73 | <0.0001 |
| B2 | 6,34 | 1 | 6,34 | 627,29 | <0.0001 |
| BCD | 0,95 | 7 | 0,14 | 13.42 | <0.0001 |
| BCE | 0,39 | 21 | 0,019 | | 0,0230 | |
| BDE | 0,16 | 3 | 0,054 | 5,37 | 0,0017 |
| B2D | 1,49 | 1 | 1,49 | 147,93 | <0.0001 |
| Rest | 1,15 | 114 | 0,010 | ||
| Lack-of-fit | 1,08 | 104 | 0,010 | 1,45 | 0,2669 |
| Reine Fehler | 0.072 | 10 | 7.153E-003 | ||
| Korrelation Gesamt | 176,01 | 209 | |||
| Die Korrelationskoeffizienten | Wert | ||||
| R-Quadrat | 0,9935 | ||||
| Adjusted R-Squared | 0,9880 | ||||
| Vorhergesagte R-Squared | 0,9770 |
Tabelle 2. Faktoren, die in der vorausschau enthaltenModell für transiente DsRed-Expression in Tabakblättern mit unterschiedlichen Promotor / 5'-UTR-Kombinationen. Drei-Faktor-Wechselwirkungen sind fett hervorgehoben.
Optimierung der Inkubationsbedingungen und Ernte Schemata für die Herstellung von monoklonalen Antikörpern in Pflanzen durch transiente Expression
Die DoE-Ansatz wurde auch verwendet, um die Bruttemperatur, bakterielle OD600nm für Blatt Infiltration, Pflanzenalter und Erntesysteme, für die gleichzeitige Produktion von monoklonalen HIV-neutralisierenden Antikörper 2G12 und DsRed in Tabak 19 zu optimieren. Die Ernte Schema bestimmt, die Blätter wurden zur Proteinextraktion, z. B. die sechs obersten Blätter. Deshalb wurde ein Vorhersagemodell für die Expression von jedem Protein (DsRed und 2G12) in Pflanzen in verschiedenen Altersstufen (= junge frühen Knospenstadium = Ernte 40 Tage nach der Aussaat; alt = reifen Knospenstadium = Ernte 47 Tage nach sehending). Diese vier Modelle wurden dann ausgewertet und ein Konsensmodell etabliert, die jeden Faktor enthalten fand in den einzelnen Modellen signifikant. Wir haben dann bestätigt, dass das Konsensmodell war immer noch eine gute Darstellung aller anfänglichen Datensätze (Tabelle 3). Die Konsensus-Modell wurde dann verwendet, um eine optimale Inkubationstemperaturen (~ 22 ° C für 2G12 und ~ 25 ° C für DsRed) und bakterielle OD 600nm (~ 1,0) für beide Proteine zu identifizieren. Diese optimalen Bedingungen wurden dann verwendet, um die Proteinkonzentrationen in den Blättern (1-8) und die Blattlagen (1-4) in den jungen und alten Pflanzen vorherzusagen. Die Konzentrationsprofile wurden mit Biomasse Daten 19 integriert, um die absolute Menge des Zielproteins aus verschiedenen Blätter und Pflanzenalter (8A) Ausbeute erhalten. Absolute Proteinmengen wurden dann mit verbundenen Folgekosten ermöglicht es uns, eine Kosten-Nutzen-Analyse für die Verarbeitung von jedem Blatt / Pflanzenalter korreliert. Dies zeigte, dassJungpflanzen waren für transiente Expression von Vorteil, weil die Proteine trotz der geringeren Gesamt Biomasse im Vergleich zu alten Anlagen (8B und 8C) erreichte höheren Konzentrationen während der kürzeren Wachstumsperioden. Wir fanden auch, dass die Verarbeitung aller Blätter von alten Pflanzen war teurer als Verwerfen Blätter 1-3 und die Anzahl der Pflanzen pro Charge statt (Fig. 8D). Daher sind SVM-basierten Modellen geeignet, nicht nur den letzten Schritt eines Versuchs kennzeichnen, sondern auch zur Kombination mit anderen Daten, um komplexere Aspekte der Prozessanalyse erleichtern. Eine Reihe von miteinander verbundenen Modelle, die den gesamten Produktionsprozess für ein biopharmazeutisches Protein konnte das ultimative Ziel sein.
Abbildung 8. Integrated ion von Biomasse und Proteinkonzentration Daten, die sich in absoluten Proteinausbeute und Prozesskosten. A. Blatt Biomasse und Zielproteinkonzentration nicht kollinear, was zu einer Anhäufung von voreingenommen 2G12 in jungen Blättern. B zu entwickeln. Die gleiche Menge an DsRed und ~ 65% der 2G12 wurde in jungen Pflanzen trotz einer ~ 50% geringeren durchschnittlichen Biomasse. C fand im Vergleich zu alten. Hier wirkte sich die höhere spezifische Protein-Expression in jungen Pflanzen. D. Die erhöhte spezifische Expression in reduzierten Produktionskosten für beide Proteine übersetzt, weil weniger Biomasse weniger Gewächshausfläche, weniger Verbrauchsmaterialien (z. B.. Filter) und weniger Nachfolgeeinrichtungen erfordern verarbeitet werden mussten.
| 40 | 47 | |||||||
| Zielprotein [-] | DsRed | 2G12 | DsRed | 2G12 | ||||
| Modell [-] | Anfangs- | Konsens | Anfangs- | Konsens | Anfangs- | Konsens | Anfangs- | Konsens | R-Quadrat [-] | 0,9829 | 0,9577 | 0,9321 | 0,9099 | 0,9436 | 0,9403 | 0,8826 | 0,8782 |
| Adjusted R-squared [-] | 0,9711 | 0,9480 | 0,9059 | 0,8893 | 0,9362 | 0,9350 | 0,8716 | 0,8674 |
| Vorhergesagte R-Quadrat [-] | 0,9510 | 0,9336 | 0,8272 | 0,8587 | 0,9254 | 0,9282 | 0,8554 | 0,8516 |
Tabelle 3. Vergleich der Korrelationskoeffizienten für die erste RSM-Modelle und die endgültige Konsensmodell von DsRed und 2G12-Expression in Tabakpflanzen.
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Discussion
Jedes Experiment erfordert eine sorgfältige Planung, da die Ressourcen sind oft knapp und teuer. Dies gilt insbesondere für DoE Strategien, weil Fehler in der Planungsphase (z. B. Auswahl eines Basismodell, die nicht alle wesentlichen Faktor Wechselwirkungen einschließen) im wesentlichen die Vorhersagekraft der resultierenden Modelle verringern und damit entwerten das gesamte Experiment. Allerdings können diese Fehler leicht durch folgenden grundlegenden Verfahren vermieden werden.
Überlegungen bei der Planung DoE
Erstens ist es wichtig, eine Reaktion, die geeignet sind, das Ergebnis (positiv oder negativ) für jede Doe Run auszuwerten ist ausgewählt. Zum Beispiel: Die Konzentration eines durch UV-Absorption 37 bestimmt Zielprotein ist nützlich, um die Aktivität einer bestimmten Promotor / 5'UTR Kombination beurteilen. Jedoch funktionelle Bewertung eines Proteins (z. B. oder. Durch Fluoreszenz im Falle DsRed Bindung an Protein A in dem case 2G12) ist sogar besser, weil sie auch eine Proteinqualität Aspekt. Antworten können auch von zwei oder mehr getrennte Parameter, wie zB das Netznummer NP in Fermentationsexperimente (von Eingangsleistung berechnet, Drehzahl und Rührer Durchmesser) berechneten Werte sein. Die Antwort sollte Werte mit hoher Genauigkeit (dh geringe Standardabweichung) und Genauigkeit (dh keine oder nur wenige störende Parameter), um die Modellqualität zu verbessern ergeben. Geeignete Nachweisvorrichtungen und Verfahren sollte daher vor dem Experiment zu optimieren, falls erforderlich.
Faktoren, die die Antwort muss identifiziert werden, bevor das DoE implementiert, weil die RSM wird verwendet, um die genauen Auswirkungen der Faktoren, die bestimmen, und nicht, um sie auszuwählen. Die Auswahl der Faktoren, die einen erheblichen Einfluss auf die Reaktion kann durch das Studium der Literaturdaten erreicht werden, sondern ganz oder teilfaktoriellen DoE Strategien effektiver sind. Diese Screening-Experimenten sollteauch verwendet werden, um einen Bereich für jeden Faktor, in dem sinnvolle Ergebnisse erzielt werden können, z. B. in biologischen Systemen der Faktor "Temperatur" wird oft auf den Bereich 10 bis 40 ° C beschränkt, festzustellen, Diskrete Ebenen sollten dann innerhalb dieser Bereiche für numerische Faktoren, die technisch schwierig zu kontrollieren sind definiert werden, haben zB Phytotron Temperaturen eine Toleranz von ± 2,0 ° C so dass es unangemessen ist, Temperaturunterschiede von ± 1,0 ° C zu untersuchen Praktische Einschränkungen können auch unter Verwendung von> 25 verschiedenen Konzentrationen einer bestimmten Verbindung ins Spiel, z. B.. Jedoch muß die Anzahl der Stufen mindestens eins größer als die erwartete Polynomordnung dieses Faktors in dem Basismodell, zB wenn die Polynom-Ordnung der Temperatur ist n = 2 ist, dann mindestens drei Temperaturniveaus untersucht werden können. Mit Basis-Modelle von hoher Polynom-Ordnung (kubische oder oben) ist eine Option, wenn das Polynom um einen Faktor, ist ungewiss.Dies kann jedoch deutlich die Anzahl der Durchläufe für die DoE erforderlich erhöhen.
Bei komplexen Systemen mit vielen Faktoren und hohe Polynom Aufträge kann dies in Designs, die nicht effektiv berechnet werden kann führen. In solchen Fällen kann es sinnvoll sein, um das Problem in zwei oder mehr Designs Untersuchung verschiedener Teilmengen von Faktoren aufgeteilt. Allerdings müssen die wesentlichen Faktoren, die von solchen "Split-Designs" weggelassen sorgfältig auf feste Werte eingestellt werden, um eine Verzerrung der Ergebnisse zu vermeiden. Jeder Split-Design sollte bei verschiedenen Einstellungen für die ausgelassenen Faktoren, um Wechselwirkungen zwischen ihnen und den Faktoren in die Gestaltung einbezogen zeigen wiederholt werden. Es ist vorteilhaft, die Faktoren mit dem größten Einfluss auf die Antwort zu identifizieren und sie in allen Ausführungen.
Kritische Aspekte bei DoE Bewertung
Die FDS sollte der erste Parameter in einem neu berechnet DoE bewertet werden. Der Betreiber muss bestätigen, dass the DoE die notwendige Abdeckung der Bauraum für die erforderliche minimale nachweisbare Differenz und geschätzte Standardabweichung der Antwort. Ist dies nicht der Fall ist, sollte das Design mit einer geeigneten Anzahl von Läufen und Wiederholungen erweitert, bis die Forderungen erfüllt sind. Das Verfahren, das DoE Läufe berechnen kann mehrmals initialisiert werden, um Entwürfe mit einem minimalen Verlust von Optimalität wählen, wenn das Gleichgewicht zwischen kategorischen Faktoren aktiviert ist.
Datentransformation durchgeführt werden soll, wenn Antwortwerte über mehr als eine Größenordnung. Ein Log 10 Transformation ist oft sinnvoll, aber die Box-Cox-Plot wird die Umwandlung, die das stabilste Modell ergeben wird vorschlagen. Die Transformation in diesem Grundstück vorgeschlagen kann sich ändern, sobald das endgültige Modell ausgewählt worden und sollte daher neu bewertet werden. Nur signifikante Faktoren (p-Wert <0,05) sollte in der Antwort-Oberflächenmodell, um seine Vorhersage p garantieren aufgenommen werdenower. Ausnahmen sind die Modellhierarchie 32,33 aufrechtzuerhalten oder Faktoren, die bekanntermaßen eine Auswirkung auf früheren Ergebnissen führen werden, umfassen werden. Im letzteren Fall ist es ratsam, zu untersuchen, warum die wesentlichen Faktoren wurden nicht gefunden in der SVM signifikant. Der Parameter Lack-of-fit kann in Kombination mit dem R-Quadrat-Wert verwendet werden (Tabellen 2 und 3) für die schnelle Erkennung von schlechten Modelle / passt, während die bereinigte R-Quadrat zeigt an, ob zu viele / unbedeutende Faktoren ausgewählt wurden und die vorhergesagten R-Quadrat ist ein Indikator für die Vorhersagekraft des Modells. Allerdings sind die Reststücke in der Diagnostik Abschnitt DesignExpert vorgesehen noch wichtiger, um die Modellqualität zu beurteilen, weil sie die Erkennung von Trends in der Datenmenge, die das Vorhandensein von versteckten Faktoren sowie die Identifikation von Extremwerten zu ermöglichen. Letztere haben einen überdurchschnittlichen Einfluss auf die Passform und verzerren das Modell. Solche Werte können von fehlerhaften Daten (zB vertauscht Werte), die korrigiert werden müssen, oder durch fehlgeschlagene Experimente, die wiederholt werden müssen, stammen. Wenn ein Extremwert gefunden wird "real" zu sein, in einem solchen Wiederholungsversuche ist es ratsam, mehrere Läufe in der Nähe dieser Wert hinzufügen, um die Modellqualität in diesem Bereich der Design-Raum zu verbessern.
Korrekturen an Designs, die unvollkommen oder zu klein sind
Unabhängig davon, warum zusätzliche Fahrten erforderlich sein (z. B. fehlende Daten, scheiterte läuft, echte Extremwerte und Regionen, unvorhergesehene Wechselwirkungen zwischen Faktoren höherer Ordnung), sollten diese Läufe zum bestehenden Design in einer geordneten Art und Weise mit dem "Design-Augmentation"-Werkzeug hinzugefügt werden , um die neuen läuft in einem separaten Block einzuführen. Dadurch wird die Verwendung der vorherigen Datensatzes zu erleichtern, während die Auswahl der sinnvolle zusätzliche Auflagen. Das Ergebnis ist ein Modell, das auf den Daten passt und ermöglicht zuverlässigVorhersage zukünftiger Ergebnisse.
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Disclosures
Die Veröffentlichungsgebühr wurde teilweise von den Unternehmen Statease, Inc. (USA) und Statcon (Deutschland), die bei der Herstellung des Manuskripts oder für ihren Inhalt verantwortlich nicht in den beteiligten beteiligt waren gesponsert.
Acknowledgments
Die Autoren danken Herrn Dr. Thomas Rademacher für die Bereitstellung der pPAM Pflanzenexpressionsvektor und Ibrahim Al Amedi zur Kultivierung der Tabakpflanzen in dieser Studie verwendet. Wir möchten Dr. Richard M. Twyman für seine Unterstützung bei der Bearbeitung des Manuskripts danken. Diese Arbeit wurde zum Teil durch den European Research Council Advanced Grant "Future-Pharma" gefördert, Vorschlagsnummer 269110 und der Fraunhofer-Zukunftsstiftung (Fraunhofer-Zukunftsstiftung).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Design-Expert(R) 8 | Stat-Ease, Inc. | n.a. | DoE software |
| Tryptone | Carl Roth GmbH | 8952.2 | Media component |
| Yeast extract | Carl Roth GmbH | 2363.2 | Media component |
| Sodium chloride | Carl Roth GmbH | P029.2 | Media component |
| Ampicillin | Carl Roth GmbH | K029.2 | Antibiotic |
| Agar-Agar | Carl Roth GmbH | 5210.2 | Media component |
| Escherichia coli K12 DH5a | Life Technologies | 18263-012 | Microorganism |
| pPAM | GenBank | AY027531 | Cloning/expression vector; |
| NucleoSpin Plasmid | MACHEREY-NAGEL GmbH | 740588.250 | Plasmid DNA isolation kit |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | MACHEREY-NAGEL GmbH | 740609.250 | Plasmid DNA purification kit |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | n.a. | Spectrophotometer |
| NcoI | New England Biolabs Inc. | R3193L | Restrictionendonuclease |
| EcoRI | New England Biolabs Inc. | R3101L | Restrictionendonuclease |
| AscI | New England Biolabs Inc. | R0558L | Restrictionendonuclease |
| NEB 4 | New England Biolabs Inc. | B7004S | Restrictionendonuclease buffer |
| TRIS | Carl Roth GmbH | 4855.3 | Media component |
| Disodium tetraborate | Carl Roth GmbH | 4403.3 | Media component |
| EDTA | Carl Roth GmbH | 8040.2 | Media component |
| Agarose | Carl Roth GmbH | 6352.4 | Media component |
| Bromophenol blue | Carl Roth GmbH | A512.1 | Color indicator |
| Xylene cyanol | Carl Roth GmbH | A513.1 | Color indicator |
| Glycerol | Carl Roth GmbH | 7530.2 | Media component |
| Mini-Sub Cell GT Cell | BioRad | 170-4406 | Gel electrophoresis chamber |
| Agrobacterium tumefaciens strain GV3101:pMP90RK | DSMZ | 12365 | Microorganism |
| Electroporator 2510 | Eppendorf | 4307000.658 | Electroporator |
| Beef extract | Carl Roth GmbH | X975.2 | Media component |
| Peptone | Carl Roth GmbH | 2365.2 | Media component |
| Sucrose | Carl Roth GmbH | 4621.2 | Media component |
| Magnesium sulfate | Carl Roth GmbH | 0261.3 | Media component |
| Carbenicillin | Carl Roth GmbH | 6344.2 | Antibiotic |
| Kanamycin | Carl Roth GmbH | T832.3 | Antibiotic |
| Rifampicin | Carl Roth GmbH | 4163.2 | Antibiotic |
| FWD primer | Eurofins MWG Operon | n.a. | CCT CAG GAA GAG CAA TAC |
| REV primer | Eurofins MWG Operon | n.a. | CCA AAG CGA GTA CAC AAC |
| 2720 Thermal cycler | Applied Biosystems | 4359659 | Thermocycler |
| RNAfold webserver | University of Vienna | n.a. | Software |
| Ferty 2 Mega | Kammlott | 5.220072 | Fertilizer |
| Grodan Rockwool Cubes 10 x10 cm | Grodan | n.a. | Rockwool block |
| Greenhouse | n.a. | n.a. | For plant cultivation |
| Phytotron | Ilka Zell | n.a. | For plant cultivation |
| Omnifix-F Solo | B. Braun | 6064204 | Syringe |
| Murashige and Skoog salts | Duchefa | M 0222.0010 | Media component |
| Glucose | Carl Roth GmbH | 6780.2 | Media component |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406-5G | Phytohormon analogon |
| BioPhotometer plus | Eppendorf | 6132 000.008 | Photometer |
| Osram cool white 36 W | Osram | 4930440 | Light source |
| Disodium phosphate | Carl Roth GmbH | 4984.3 | Media component |
| Centrifuge 5415D | Eppendorf | 5424 000.410 | Centrifuge |
| Forma -86C ULT freezer | ThermoFisher | 88400 | Freezer |
| Synergy HT | BioTek | SIAFRT | Fluorescence plate reader |
| Biacore T200 | GE Healthcare | n.a. | SPR device |
| Protein A | Life Technologies | 10-1006 | Antibody binding protein |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 9105.3 | Media component |
| Tween-20 | Carl Roth GmbH | 9127.3 | Media component |
| 2G12 antibody | Polymun | AB002 | Reference antibody |
References
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