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Neuroscience

ヒト神経の集合体のためのcGMP適用可能な展開法は、幹細胞および前駆細胞は、多能性幹細胞や胎児の脳組織由来

Published: June 15, 2014 doi: 10.3791/51219
Automatic Translation
1, 1, 1
1Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center

ERRATUM NOTICE

Summary

このプロトコルは、単一の細胞懸濁液に解離することなく、球状の神経幹細胞および前駆細胞集合体の拡大を可能にする新たな機械的なチョッピング方法が記載されている。細胞/細胞接触を維持することは、40以上の継代するための迅速かつ安定的な成長を可能にします。

Abstract

研究実験および臨床試験のための単一の試料から多数の細胞を蓄積するための細胞増殖技術が大幅に幹細胞のコミュニティに利益をもたらす。現在の多くの拡張方法は、労力を要し、高価であり、かつ完全な解離を伴うものは、いくつかの幹細胞および前駆細胞型の分化または早期老化を受ける可能性があります。これらの問題を克服するために、我々は、簡単かつ安価である「チョッピング」と呼ばれる自動化された機械的な継代方法を開発した。この手法は、単一の細胞に化学的または酵素的解離を回避し、代わりに一定の細胞/細胞接触を維持中断、スフェロイド培養の大規模な拡張が可能になります。チョッピング方式は、主に胎児脳由来の神経前駆細胞又はニューロスフィアのために使用されており、最近では、胚及び誘導多能性幹細胞由来の神経幹細胞で使用するために公開されている。プロシージャinvolvES組織培養ペトリ皿にニューロスフェアを播種し、その後効果的に手動で機械的に球を解離させる退屈なプロセスを自動化するセルを鋭い、無菌刃を通す。培養中で細胞を懸濁する良好な表面積対体積比を提供する。 50万の細胞は直径が0.5mm未満の単一神経球内で成長させることができるように。 1 T175フラスコ中に、5000万個以上の細胞でのみ1500万接着培養中に比べて懸濁培養で成長することができます。重要なのは、チョッピング手順は、臨床グレードの細胞産物の大量量産を可能とする、現在の適正製造基準（cGMP）の下で使用されています。

Introduction

単層1-3または集約ニューロスフェア4-7のいずれかとして、培養中のげっ歯類の神経幹細胞を増殖の長い歴史があります。また、現像8-17中枢神経系の種々の領域から単離されたヒト神経前駆細胞（hNPCs）をインビトロで増殖されている。これらの細胞は、双方向性、強力、星状細胞及び神経細胞の両方に分化することができると神経の発達18,19及び疾患メカニズム20,21を研究する上で非常に有用なツールとなっている。 hNPCsまた、統合、生存および機能的効果22〜24種々のレベルの中枢神経系疾患の多くの異なる動物モデルに移植されている。

多くの場合、上皮成長因子（EGF）および/ ​​または線維芽細胞増殖因子-2（FGF-2）25-28 - - 、付着29、三両方伝統的には、齧歯類またはヒト胎児由来のNPCは、増殖因子に暴露される次元スフェロイドシステムは、典型的には単一細胞懸濁液30-34に酵素的解離を使用して継代する。研究や臨床用細胞を拡大する標準的な方法は、容易な操作のために接着単層としてある。しかし、我々は、酵素的または化学的溶液で継代単層およびニューロスフェアhNPCs、早期老化35をもたらしたことを示した。加えて、酵素的解離は、胚性幹細胞36〜38で実証されたデータに基づいて、分化および核型異常のレベルの増加をもたらし得る。継代hNPCsの標準的な方法は、現在の適正製造基準相に1臨床試験（細胞株、Neuralstem社幹細胞）行っている（cGMP）のグレードの製品を生産しているが、この方法では限界、細胞増幅のほんの数ラウンドを許可銀行の可能性。

明らかに、大規模な研究の実験と今後の臨床試験では、能力から利益を得ることができる大規模な増殖および細胞バンキングを可能にするためにバルク及び遅延された老化で細胞を伝播する。この必要性に対処するために、我々は細胞間接触を維持する小さなクラスターにそれらを「チョッピング」によって、新規かつ機械的に継代無傷の神経球の自動化された方法を開発した。この方法は、大幅に代替3Dバイオリアクター培養方法40で見られるようなそれらの寿命39および懸濁培養物は、単層培養物と比較して、インキュベータ·スペースのより効率的な使用を可能にする増加した。チョッピング設けプロトコルは、通路10よりも1つ大きい胎児試料、標準継代方法を用いて難い偉業から大規模銀行の産生を可能にする。継代hNPCsためのこの方法は、型破りであるが、人気が高まっており、最近では、ヒト胚性及び誘導多能性幹細胞由来の神経幹細胞のような他の細胞型、V INを含む様々な用途のための大規模拡大を可能にしてパブリッシュされた病気のモデリング41-46 itro。重要なことに、cGMPのグレードHNPC細胞バンクは、既に技術は、将来の臨床応用に向けて適用することができることを実証し、チ​​ョッピング方法で製造されている。

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Protocol

1。倫理声明と安全

  1. この手順は、ヒトまたは動物由来の細胞培養物の使用を含む。すべての派生組織は、適切な治験審査委員会（S）および/または施設の動物実験委員会（S）で使用する前に承認されなければならない。
  2. すべてのバイオ有害廃棄物は、それぞれの機関が合意決定安全規則に従って廃棄しなければならない。この手順全体でしっくり来るの安全および廃棄に関するガイドラインのすべてを知っているとフォロー。

機器の2。準備、消耗品、試薬、および観測

  1. 準備
    1. ガラスシャーレ8.5センチ濾紙円、ダブルエッジプレップブレードを得た。
    2. ペトリ皿中の濾紙片を置き、ペトリ皿内の濾紙上にいくつかの非被覆ブレードを転送する。
    3. 繰り返し層ろ紙およびブレードペトリ皿はおよそ75パーセント満杯になるまで、カバーウィットHペトリ皿のふた、オートクレーブ。無菌性を維持するために、無菌または密閉環境で保管してください。
    4. オートクレーブ18センチメートル鉗子や滅菌袋内のオートクレーブナットドライバー。 cGMP産生のために、滅菌パウチ内のいくつかのステンレス鋼のシムディスクをオートクレーブ。シムディスクの詳細については、ステップ3.5を参照してください。
    5. 70％イソプロピルアルコール（IPA）でバイオ安全キャビネット（BSC）をサニタイズ。
    6. すべての手順は、無菌性を維持するために、BSCで実行する必要があります。無菌的にBSCに次のように転送します。
      1. マッキルウェーン組織チョッパー（チョッパー）。 70％のIPA、特にチョッパアーム（ 図1B）ですべての表面を拭いてください。全体チョッパーは、必要に応じて酸化エチレンを用いて汚染除去することができる。
      2. 一オートクレーブ処理ナットドライバまたはナットレンチ（チョッパー、 図1Iに含まれている）、1 18センチメートル鉗子、標準サイズのマイクロピペッター（20μL-1、000μL）、1 pipetaidとチューブラックの1セット。
      3. 無菌使い捨て血清学的ピペット、バリアピペットチップ、15ミリリットルコニカルチューブ、60ミリメートルペトリ皿、ダブルエッジ準備ブレードおよび適切なサイズのTフラスコ。注意：本ピンセットで鋭い刃を取り扱う。
  2. 試薬
    1. 100 10 ng / mlの時ng / mlの白血病阻害因子（LIF）での細胞増殖培地、EGF幹神経からなる保守メディア（MM）でのhNPCsを展開します。 BSCにメディアを準備するために必要な試薬および濾過装置（複数可）を転送する。
    2. 再懸濁神経が細胞増殖培地ステムと、最大1年間-80℃で保存するためには100μg/ mlで分量を準備し使用して凍結乾燥したEGFを。最大6ヶ月またはメーカーが指定した有効期限を4℃で購入したとして、LIFが格納されている。
    3. BSCへのMM試薬を転送します。真空装置を使用して適切なサイズのろ過装置、フィルター内のすべての試薬を組み合わせています。最長3週間、4℃で保存してください。
    4. HNPC観測
      1. チョッピングする前に対処するための2つの最も重要な要因は、球の直径とメディアのコンディショニングや色です。馴化培地（CM）を、インキュベーター条件（37℃、5％CO 2、湿度95％）下で培養中hNPCsによって代謝された培地と定義される。細胞がメディアを代謝等のフェノール赤色成分は、より酸性の環境（ 図5D）を意味する黄色にピンクからシフトします。
      2. （詳細については説明を参照）メディアの色に対応するために、光までhNPCsのフラスコ（複数可）を保持する。
      3. 細胞を観察する顕微鏡で、フラスコをスキャン。球体のサイズを調べるためにレチクルを使用してください。多くの球が300μm以上の直径を持っている場合は、チョッピングプロセスを進める。 7〜10日ごとに細胞をチョップ。
      4. チョップが保証されていない場合は、新鮮な培地を3〜4日ごとに、細胞がメディアを代謝しているどのように迅速に依存して、CMの交換25から75パーセント。コン球体が通過に十分な大きさになるまで、メディアを交換するtinue。
      5. hNPCsは、一般的に小さいフラスコから大きなフラスコに、1:2の割合で切り刻まれています。フラスコの大きさとボリュームの勧告のための参照ガイドとして表1を使用してください。
    2 T175s
    フラスコ 総メディアの容量 プレチョップ → ポストチョップ
    1 T12.5 5ミリリットル 1 T12.5 → 1 T25
    1 T25 10ミリリットル 1 T25 → 1 T75
    1 T75 20ミリリットル 1 T75 → 1 T175
    1 T175 40ミリリットル 1 T175 → 2 T175s
    80ミリリットル 2 T175s * → 4 T175s
    * 2 T175sは、一度にみじん切りすることができるのフラスコの最大数です。 2 T175sのセットでチョップし、手順7を参照してください。

    表1。HNPC拡張パラダイム 。 hNPCsの典型的な展開計画の説明。これは、7〜10日ごとに体積2倍に拡大して標準です。

    3。チョッパーのセットアップ

    図1
    図1。マッキルウェーン組織チョッパー。 A））ペトリ皿、D用のプレートホルダーのフック厚さ調整用マイクロメータ、B）のチョッパーアームベースと取り付けられたアーム、C）をみじん切りに表のリリース·ノブとトレーチョッパー、J）ブレード/袋ナット、K）は、ブレードクラスプ、Lに含まれている、E）は、ブレード力制御ノブ、F）リセットスイッチ、G）のプレートホルダー、ブレード、クラスプナット用H）ボルト結合、I）ナットレンチ）自動チョッピングスピードコントロールノブ、M）マニュアルチョッピングアーム操作ノブ、N）電源スイッチ。

    1. BSC内のコンセントにチョッパを接続し、電源スイッチ（ 図1N）をオンにします。 200ミクロン（ 図1A）にチョッピング距離を設定します。ノブはクロック（ 図1E）であった場合に270°または9時まで、ブレード力を設定。自動速度ノブは限り反時計できるだけ回転させていることを確認します。 （ 図1L）。
    2. 右への道のすべてのテーブルのリリースを移動するには、プレートホルダー（ 図1D）安定していることを確認します。
    3. MANUを回転させるら腕マニピュレータは最大レベル（ 図1M）に腕を上げるために時計回りに。手動の腕マニピュレータは時計回りに回転させなければならない。
    4. 無菌的に鉗子（ 図1H）を使用して、チョッパアームボルトに無菌、両刃チョッピングブレードを転送します。
    5. 単独のペトリ皿、研究グレードの処理のために十分であるように、唯一のcGMP継代のために、この手順を完了します。ステップ2.1.4で述べたように、ペトリ皿の基部の内部に配置されたシムディスクは、cGMPのために必要とされる。シムディスクはチョッピング手順中球組み込むからプラスチックの破片を防ぐことができます。各計画チョップのために、各ペトリ皿とカバーのベースに1シムディスクを転送します。
    6. 無菌的に鉗子を使用してブレード上で留めます（ 図1K）を配置します。留め具の湾曲部は、アームの上端の上にある必要があります。ナットがしっかりと作らされるまで留めは腕にとどまることはありません。 CLASを保持するために鉗子を使用して、Pアームにし、滅菌ナットドライバを使用したボルトにナット（ 図1J）を確保。緩い回し¼ナットAのままにしておきます。

    4プレチョップ手順

    1. 表2、C列に従って新しいフラスコ（S）へのMMの推奨量を転送します。
    2. 無菌的にBSCにインキュベーターから細胞を移す。チューブラック（ 図2A）にフラスコ（複数可）を無駄のない球がフラスコ（S）に定住することができます。
    3. かつて定住、5ミリリットルまたは10ミリリットルの血清学的ピペットで上清を12ミリリットルまで吸引し、フラスコ（S）の表面からすべての緩く付着球をすすぐ。必要に応じて繰り返しとリンスの間に球を解決する。
    4. 2つ以上のT175フラスコを継代した場合、 表2、D列に応じた新たなフラスコ（S）へのCMの推奨量を転送するステップ7.1を参照してください。
    5. 新しい15ミリリットルコニカルチューブに残っているすべてのCMおよび球を転送します。 SEに球を許可するttle使用済みフラスコ（複数可）を廃棄します。
    6. 重要なステップ ：ゆっくりと60ミリメートルペトリ皿または最低実現可能な量のシムディスクに15ミリリットルコニカルチューブから球を移す。 0.1〜0.5ミリリットル（ 図2B）をお勧めします。それは皿の後CHOPから細胞​​をリンスするために使用されるように、CMの残量を保管してください。ディッシュ（ 図2C）にメディアとの球で覆われた面積を最小限に抑えるようにしてください。

    図2
    図2。）をフラスコ。、Bの隅に球を解決するペトリコニカルチューブから高密度にできるだけ球を転送するために、チューブのラックまたは類似のアイテムに対してフラスコ（複数可）を傾けます。A）をチョッピングするための球の準備一品。C）プールT内の円錐管から球彼は、ペトリ皿の真ん中、D）をプール球体の上部から、できるだけ多くの上清を取り除きます。E）プラスチックピペット先端部の側面を利用して球を広げた。 女 ）静かにプールの片側に球を動かすメディアの取り外しを容易にするために、プールの片側に移動された球の。G）の例H）コンデンス球は、チョッピングの準備ができて、シャーレ上に広げ。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

    1. 次に、球体は、ステップ4.6でにわたって移し、上清を除去することによって凝縮される必要がある。エアロゾル障壁が先端に付いたマイクロピペッター（ 図2D）で逆15ミリリットルコニカルチューブに上清を移し、球体の除去を避ける。培地/細胞プールの上部からできるだけ多くの媒体を除去することによって開始する。それができない場合球せずにメディアを削除するには、次のステップに進みます。
    <TD> 0ミリリットル
    列A 列B C列 列D E列 F列
    プレチョップフラスコサイズ → ポストチョップフラスコ（S）サイズ新しいフラスコ（S）プレチョップに転送し、MMの推奨量新しいフラスコ（S）プレチョップに転送し、CMの推奨量新しいフラスコ（S）ポストCHOPに転送する球/メディアの推奨量最終容量シード/フラスコ
    T12.5 → T25 5ミリリットル 0ミリリットル 5ミリリットル 10ミリリットル
    T25 → T75 10ミリリットル 10ミリリットル 20ミリリットル
    T75 → T175 20ミリリットル 10ミリリットル 10ミリリットル 40ミリリットル
    1 T175 → 2 T175s フラスコあたり20ミリリットルフラスコ当たり15ミリリットルフラスコあたり5ミリリットル 40ミリリットル
    2 T75S → 4 T175s フラスコあたり20ミリリットルフラスコあたり17.5ミリリットルフラスコあたり2.5ミリリットル 40ミリリットル

    表2。メディア転送ガイドプリ/ポスト·チョップ 。発音ボリュームは、チョッピングプロセス中に使用する。

    1. 表面積（ 図2E）を大きくするピペットチップの側面を使用してプールを広げる。
    2. 重要なステップ ：あなたに向かってわずかにペトリ皿を先端と優しく SLにピペットチップの側面を使用するプール（ 図2F、G）の片側に球がすべてのIDE。
    3. 重要なステップ ：すべてのセルが再配置されると、 徐々に 、ペトリ皿の反対方向を傾ける。プロセス中に、一人でメディアが離れて球から流れます。バック15ミリリットルコニカルチューブにメディアを転送します。最小の球の除去が許容される。
    4. プールは0.5〜2.4センチメートル（ 図2H）の直径を有しているので、静かにペトリ皿の中央に球体のすべてをスライドさせてピペットチップの側面を使用してください。これは、球のプールの浅い深さを維持することが重要である。プールが深すぎる場合、球は単にチョッピング中に押しのけする。注：球プールの直径がより大きく2.5センチメートルすることはできませんまたはブレードは、細胞が不足して、ペトリ皿の縁にご連絡させていただきます。

    5。チョップ手順

    1. プレートホルダー（ 図1G）にシャーレを転送し、お皿を確保プレートホルダーフック（ 図1C）の下で固定されている。
    2. テーブルリリースノブは、ギアに収まる切り欠きがあります。その刃は球の明確で、ギア（ 図1D）にロックを左にプレートホルダーをスライドさせて、テーブルのリリースノブを使用してください。
    3. 重要なステップ ：ブレードはペトリ皿の上に平らに固定されるまで、手動マニピュレーターノブ（ 図1M）を時計回りに回転させることにより、チョッパアームを下ろします。ナットドライバでナットを締めながら、アームマウント（ 図1B）を押し下げ片手で行ってください。
    4. （ 図1F）を1回リセットボタンを押してください。ノブは時計だった場合90°の位置または12:00の自動腕マニピュレータノブ（ 図1L）を時計回りに回しながら片手でシャーレ堅調。注意：すべての回で、動翼をさわらないでください。
    5. 球のプールを通して完全にブレードを渡します。プレートホルダーを回転させる90°。
    6. ボルトを緩め、ステップ5.3から5.5を繰り返します。
    7. 無菌的に、BSCでの作業スペースの上にプレートホルダーからペトリ皿に移す。

    6。後チョップ手順

    1. 総理ステップ4.6からのコニカルチューブ中のCMと10ミリリットルの血清学的ピペットとみじん切りの球体上に1ミリリットルを転送します。静かに再懸濁し、新しい15ミリリットルコニカルチューブに移す。気泡を回避し、チョップ球を収集するために必要な回数だけ繰り返す。
      ヒント：プラスチック片が持ち上げ可能性がある料理をこする最小限に抑えます。これはステンレス鋼のシムディスクを使用している場合は問題になりません。プラスチックの血清学的ピペットの内側に付着している細胞に注意してください。このような場合は、吸引して細胞を分離するために、ピペットでメディアを通じて断続的に泡。
    2. CMとみじん切り球の体積を測定。 表2に列挙体積を達成するために、MMの適切なボリュームを追加し、列E。
    3. 粉砕する球2〜3倍の任意緩く融合した球を分割する。
    4. 重要なステップ ：それぞれの新しいフラスコに球浮遊液を分注し。一度に1フラスコ中に球体懸濁物を転送し、転送間の球を再懸濁。一度に複数のフラスコを小分けして各フラスコ中球の数が不均衡になる。各フラスコ内の最終容量は、 表2、F列のボリュームを同じにする必要があります。3つ以上のT175フラスコに播種する際のステップ7.2を参照してください。
    5. ナットドライバおよび滅菌ピンセットで留め具とナットを取り外します。 70％のIPAまたは同等品により適切に除染。注意：本ピンセットで使用されるチョッピングブレードを取り外し、バイオハザード鋭利物容器に廃棄します。
    6. 70％のIPAでチョッパーの全表面を除染。

    7プロセス変動 - 複数のフラスコ

    以上の2 T175sを継代いくつかの違いがあります。ステップ以下のSは、参照されたステップの変化がある。

    1. 4.4ステップへの参照 ：
      1. 2 T175sを継代すると、1 T175フラスコにメディアとの球のすべてを兼ね備えています。球が沈降した後、 表2、D列に記載されているように、新しいフラスコの各々に、CMの適切な量を分取することができます。ステップ4.5に進んでください。
      2. 3つ以上のT175sを継代すると、CMのフラスコなどの新しいT175フラスコとラベルを取得します。完全なステップ7.1.1が、CMのフラスコに、CMを移す。すべてのフラスコはみじん切りされるまで、すべてのフラスコからのCMを収集するために使用される、BSC側のフラスコに保管してください。その後、CMは均等に新しいフラスコのそれぞれに等分します。
    2. 参照ステップ6.4 -同じ細胞株を複数回チョッピングすると、新しいT75フラスコラベル球後チョップに細断球浮遊液を転送し、転送量を記録します。この中で細胞を結合し続ける37°C、5％CO 2、湿度95％のインキュベーター内フラスコ毎にチョップした後、フラスコおよび格納する。すべてのチョップが完了した後、それぞれの新しいフラスコに体積の球懸濁液を分取。 6.5に進んでください。

    8。凍結保存

    次のプロトコルは、極低温hNPCsを保存するためである。

    1. 37℃の清潔な水槽中で細胞凍結培地を解凍してから、氷上で保存する。細胞凍結培地は、最大6ヶ月間等分し、-80˚℃で保存することができる。
    2. 炎の中でピペットの開口部を回転させることによって、ポーランドのガラスパスツールピペットを発射。少なくとも2大と2小口径ファイアーポリッシュピペット（ 図3）を準備します。球は大から小口径ピペットに移動することで解離されます。
    3. 5分間37℃の水浴中でのTrypLEを選択して置きます。取り外し、使用するまで室温で保管してください。


    図3。火研磨ガラスパスツールピペット、A）順に均等にガラスピペットの端のラウンドで炎とスピンの上部にピペットを保持します。大口径ファイアーポリッシュガラスピペットのB）の例。 C）小口径熱加工したガラスピペットの例。

    1. 無菌的にBSCにニューロスフェアを移す。球は試験管ラックに対してフラスコ（複数可）を傾斜させて定着し、任意の緩く接着球を除去するためにフラスコの底を洗浄することができます。球は再定住することができます。
    2. 無菌ボトルに、CMの全てが、5〜10ミリリットルを転送して、総体積を測定。コニカルチューブに残った球やメディアを配置します。
    3. すべての細胞が安定した後、瓶に、CMの小さなメニスカスが、すべてを転送するとVOLを合計するUME。
    4. 無菌的に転送コニカルチューブに温めのTrypLEを選択し、5〜10 mlの再懸濁細胞ペレット。 15〜20分間37℃の水浴中にコニカルチューブに移す。 7.5-10分後、穏やかに混合するためにコニカルチューブを横に振る。
    5. ステップ8.5からの測定cm容量を使用して、MMの同体積を準備。 50％のCMと50％MM溶液（CM / MM溶液）を配合し、濾過する。
    6. 無菌的に50ミリリットルコニカルチューブに40μmのストレーナーを転送します。
    7. インキュベーションが完了したら、100×gで15秒間を15mlコニカルチューブをスピン。
    8. 慎重にのTrypLEを選択し、任意の糸基板を吸引し、廃棄します。小さなメニスカスを残す。ペレットを乱さずに残っているのTrypLE Select]を希釈するために、CM / MMの4ミリリットル - 優しく2を追加します。どんな外れ細胞は洗浄を捨てる前に再定住しましょう​​。
    9. チューブ球に2〜5ミリリットルのCM / mM溶液を加える。 10倍の最大値を粉砕することにより、5ミリリットルピペットで球を解離する。国連をしましょう解離した球は、1〜2分のために解決。完全に解離していないクラスタを削除するには40μmのストレーナーに解離した細胞懸濁液を転送します。
    10. ファイアーポリッシュ大口径ガラスピペット、次に小口径ガラスピペットでステップ8.12を繰り返します。
    11. CM / mM溶液2〜5 mlのストレーナーを洗浄します。
    12. 細胞懸濁液を混合し、実行可能性分析のためのサンプルを削除します。
    13. 適切な希釈率でトリパンブルーでサンプルを希釈してカウントされます。平均生存細胞濃度を算出し、総生存細胞を計算するには、以下の標準的な式を使用してください。
      式（1）
    14. 5.0×10 6細胞/ mlで再懸濁した細胞に必要な細胞凍結培地の総体積を計算する。細胞を1mlの各クライオバイアルに播種する。 BSCへクライオバイアルを移す。
    15. 15メートルで、4℃で5分間200×gで細胞懸濁液を遠心分離最高の収量はLコニカルチューブ。 50mlコニカルチューブを、ダウン大規模の凍結のために使用される場合、10分間、400×gでに速度および時間を増加させる。
    16. 5.0×10 6細胞/ mlで細胞凍結培地を用いて細胞ペレットを再サスペンド。各クライオバイアルへの細胞懸濁液のアリコートを1ミリ​​リットル。均等な分配のためのサスペンションや分量の、吸引6ミリリットル5クライオバイアルX 1ミリリットル。背中の細胞のプールにサスペンションの残りの1ミリリットルを転送します。すべてのバイアル充填されるまで繰り返します。
    17. 無菌的にすべてのシードされたクライオバイアルを密封し、5〜10分間氷の上に転送します。
    18. イソプロピルアルコール商工会議 ：hNPCsを保存するために凍結保存戦略については、次のいずれかを使用します。
      1. 室温での100％IPAでチャンバの必要数（複数可）を充填する。
      2. 室（S）に氷からシードされたクライオバイアルを転送し、一晩-80℃の冷凍庫に室（複数可）を転送します。しかし、細胞は、-80℃で最長1週間安定であるその翌日、長期の液体窒素貯蔵にバイアルを転送することが提案されている。

      制御された速度冷凍庫

      1. 速度制御フリーザーのソフトウェアに適切な凍結プログラムをアップロードします。プログラム例を表3に示している。 図4は hNPCsの典型的な凍結曲線を示しています。しかし、正確なプログラムは、各冷凍庫モデルごとに異なります。標準の全体的なサンプリングレートは、-40℃に到達するまでに-1℃/分近いはず、凍結率は、実質的に、少なくともまで増加させることができる場所-80℃
    ステップ レート（℃） 終了温度（℃） ホールド（分秒） トリガー
    1 </ TD> - - 5分0秒室
    2 - 1.3 - 5 - サンプル
    3 - - 1分0秒室
    4 - 45 - 58 - 室
    5 +10 - 26 - 室
    6 + 3 - 23 - 室
    7 - 0.8 - 40 - サンプル
    8 - 10 - 100 - 室
    9 - 35 - 160 - 室

    表3。制御RにhNPCsを凍結するための手順冷凍庫を食べた。制御された速度の冷凍庫にHNPCの凍結保存のためのプログラムを提案した。

    図4
    図4。サンプルの凍結曲線 。制御された速度の冷凍庫にhNPCsの典型的な凍結曲線。

      1. 制御率の冷凍庫に関連したバスケットに氷の凍結バイアルを転送します。試料温度プローブで使用するメディアを凍結するだけのセルと1クライオバイアルをロードしてください。冷凍室にバスケットを移し、プローブバイアルにサンプルプローブを配置します。プログラムを起動します。
      2. プロトコルが完了すると、長期の液体窒素貯蔵バイアル中に移す。

    9。解凍手順

    次のプロトコルは、極低温にP解凍用です予約済みhNPCs。

    1. 直ちにドライアイス上に液体窒素貯蔵からクライオバイアルを移す。注意：バイアルは液体窒素がバイアルに入ることを可能に亀裂や緩い蓋を持つことができます。 Deep Freezeの条件から削除すると、液体がすぐにバイアル爆発、沸騰することができます。バイアルを取り外すときに適切なPPEを使用してください。
    2. 時間の前に、以下の試薬および消耗品のすべてを準備します。解凍プロセスが開始されると、それは効率的にフォロースルーをすることが重要です。
      1. 神経が細胞増殖培地、MMは、15ミリリットルコニカルチューブ、1 2ミリリットルと1 10ミリリットルのBSCへの各クライオバイアル用の血清学的ピペットを幹に転送します。
      2. 神経の9ミリリットルの最小は細胞増殖培地およびMMの5ミリリットル幹各バイアルに必要です。必要に応じて各メディアの詳細を準備します。
    3. 一度にhNPCsの1バイアルを解凍する。きれいな37℃の水浴中にドライアイスからの凍結細胞を移し、連続的に水浴中でバイアルを撹拌する。の量を監視溶けた氷。バイアルに残った氷約0.5cm片がある場合には、噴霧及び70％イソプロピルアルコールで拭いてBSCに移す。
    4. 2ミリリットルの血清学的ピペットを用いて15ミリリットルコニカルチューブにクライオバイアルの内容を転送します。空のクライオバイアルへの細胞増殖培地幹神経の1ミリリットルを追加してから、ゆっくりとでは解凍された細胞に細胞増殖中幹神経の8ミリリットルを転送、静かにチューブを振りながら、賢明な方法をドロップします。これは浸透圧ショックのリスクを軽減するために行われます。
    5. 細胞懸濁液の9ミリリットルにクライオバイアルからリンスを転送します。氷の上に円錐管を転送し、残り​​のすべてのバイアル9.4から9.5を繰り返します。
    6. 4℃で5分間200×gでコニカルチューブを遠心分離遠心分離中に、 表4に基づいて播種用のフラスコの適切な数を用意しております。
    バイアルの＃ 総播種容量（ml） フラスコ
    1 5 T12.5
    2 10 T25
    3 15 T75
    4 20 T75
    5 25 T75
    6 30 T175
    7 35 T175
    8 40 T175
    8 + - フラスコの組み合わせ

    表4に解凍クライオバイアルの数に基づいてサイズをフラスコ 。 hNPCs解凍後にシードを提案し、ボリューム、フラスコサイズ。

    1. 再懸 ​​濁し、表4に基づいてMMの適切なボリューム内のすべてのチューブを兼ね備えています。よく混ぜて再生存率の計数のためのサンプルを移動します。詳細をカウントするための手順は8.15から8.16を参照してください。標準播種範囲は160,000-320,000細胞/ cm 2の間である。
    2. よく細胞を混合し、フラスコに細胞を分取。 5％CO 2/37℃C/95％湿度のインキュベーターにフラスコを転送します。優しく均等に細胞を分配するために、前後に振ることにより、フラスコを混ぜる。
    3. 細胞は、24〜48時間以内に球体を形成する。時折、細胞がプラスチック表面に付着し、ハニカム状のコロニー分布を形成する。この問題が発生した場合、球の形成を助ける、緩い細胞を洗浄する前に、3日間、細胞を残す。全く接着細胞がなくなるまで1〜3日毎に洗浄します。必要に応じて新しいフラスコに細胞を移す。
    4. 為替のMMとのメディアの25から75パーセント、3〜4日ごとに細胞がチョップする準備ができるまで、通常7〜14日後に解凍。

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Representative Results

図5
図5。代表的なデータ。A）は、チョッピングメソッドを介して継代したニューロスフェアに比べて酵素的解離を使用して接着単層として解凍し、拡大し、P19で凍結hNPCsの細胞数を予測した。細胞はP20で解凍したとき、0日目に表しています。B）は球の代表的な画像を事前にチョップ、球後CHOP、10X、D）色見本は、メディアのコンディショニングの範囲を記述するために使用されるのcGMPの10倍。C）代表的な画像比較可能なプロトコルをサポートします。E）1日のためにプレーティングし、ネスチン（赤）の発現について染色した解凍されたP29のhNPCsの免疫細胞。ヘキスト核対比染色（青）、F）7日間と汚れのためにプレーティングした解凍されたP29のhNPCsの免疫細胞化学GFAP（赤）とβ-IIIチューブリン（緑）のED。 拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

図5Aは、P20（0日）で解凍し、ラミニン被覆組織培養フラスコまたはチョッピングメソッドを介して継代し、非接着ニューロスフェアとして付着性を維持hNPCsを表しています。付着細胞を酵素的に毎週選びのTrypLE用いて解離し、培養液中の70日間（7月10日継代）の後に老化した。これとは対照的に、チョッピング技術を介して通路20で解凍し、拡張されたニューロスフェアは、老化の前に40を超える継代の成長した。 （ 図5B）をチョッピングする前に、典型的なhNPCsは主に直径≥300程度にする必要があります。一度みじん切り、球は一般的に大部分が約200ミクロン、直径（ 図5C）、可変サイズのセクションに四等分される。それはhNPCsがchoppin経由で​​拡大していることに留意することが重要であるグラムHNPC方法は、マーカーの発現を維持し、両方の星状細胞およびニューロン分化後に生産することができる。後期継代hNPCsは、解離つまたは七日の期間、ラミニン被覆カバースリップ上に播種し、続いて4％パラホルムアルデヒドで固定した。 hNPCsは1日に前駆細胞のマーカーであるネスチン（ミリポア、1:1,000）を発現hNPCs（図5E）だけでなく、分化した神経マーカーグリア線維性酸性タンパク質（GFAP、1:500）およびβ-IIIチューブリン（1メッキ：それぞれ7日間メッキhNPCs（ 図5F）、星状細胞および未成熟な神経細胞のマーカー、上2000）。

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Discussion

図6
図6。チョッピング回路図 。機械的なチョッピング法を用いて、培養中の回転楕円体幹/前駆細胞を拡大する。

重要なステップ

チョッピング膨張パラダイムの概要を図6に示す。HNPC球サイズがニューロスフェアを継代前に観察するための重要な基準の1つである。球体サイズの大きな分散があるが、球体の少なくとも30％が300ミクロンよりも大きい直径を有するべきである。球が通路に小さすぎると1-4日後に、単に新鮮なMM（25％-50％）でCMを交換し、再評価する。球体は直径が小さすぎるで継代したとき悪い膨張率が発生します。

HNPC膨張率も球密度及びcのメディアに依存している原因分泌される因子47にonditioning。メディアが過度に代謝され、重要な成長因子が減少している場合は、細胞は、細胞48の核型異常な集団を取得してもよい。そのため、交換する栄養素や成長因子は分泌された栄養因子とバランスをとらなければならない。 hNPCs後CHOPまたは解凍後に播種すると、メディアの1cm 3当たりの神経球の数は可変である。しかしながら、一般的なルールは、密度も大きい、高速メディアは調整され、より高い膨張率は、必要なときにメディアが交換された。メディアが完全に代謝されたときに黄色に、未代謝ときピンクの範囲であるメディア·コンディショニングカラースペクトル（ 図5D）を使用します。対数増殖のための理想的なメディアの色が赤みがかったオレンジ色、色見本の＃3です。これは、分泌されたtrophの適切な濃度を維持しながら、媒体に十分な栄養素および成長因子が含まれていることを示しICの要因。メディアは、色見本、過去＃4を条件付けるべきではありません。あるいは、細胞は（色見本の＃1）すぐにメディアを代謝していないとき、hNPCsが遅く成長し、7〜10日ごととは対照的に、すべての10-20日チョップを必要とする。それは、順番に伸張率を改善するコンディショニングを高めるために培養密度を高めることが重要である。

チョッピング手順の間に、次の重要なステップに注意してください。ブレードはチョッパアームと平行に設置されていることを確認してください。ブレードは、ペトリ皿またはシムディスクの表面上に平らになっていない場合は、多くの球体を細断しなくてもよい。ステップ4.11で説明した細胞の広がりに注意してください。球はすべての球がみじん切りされた前壁に接触しますペトリ皿またはブレードの中央に残しておく必要があります。最後に、細断処理中に長時間hNPCsを乾燥避けることが重要である。皿に球を置いた後、みじん切りにし、できるだけ早く新しい培地でそれらをあふれさせる可能。

この技術は複数の機器を必要とするように、文化の無菌性へのリスクがある場合もあります。このリスクを考えると、適切な無菌技術が手順全体で使用されている必要があります。基礎研究レベルの生産のために、70％のIPAまたは同等のすべての機器を下にふくと、15分の最小のオプションの紫外線インキュベーションと一緒に十分なものである。無菌BSCの内部のすべての手順を実行します。製造元が推奨するようにcGMP量の生産のために、チョッパーはエチレンオキサイドで滅菌されなければならない。他のすべての電源は、滅菌購入またはオートクレーブ処理することができます。

将来の応用

枕元にベンチからの基礎研究療法の移行は、挑戦することができます。チョッピング手順は、この点を考慮して移行して設計されました。手順は既にウィスコンシン大学Waismanセンターバイオ製造設備においてcGMPに準拠HNPCバンクを作製するために使用されている。 T帽子HNPCバンクは、連邦医薬品局（FDA）の承認は、次の新しい前の治験薬の研究およびフェーズ1臨床試験のために使用される医薬品グレードHNPC細胞ロットの拡大のために調達した。拡張のため、この手順を使用し、他の細胞の種類があります。例えば、多能性幹細胞41から発生する神経幹細胞EZ球である。この技術は、膨張の間、一定の細胞間接触を必要とする他のタイプの組織で使用するための大きな可能性を秘めている。

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Disclosures

著者らは、開示することは何もありません。

Acknowledgments

我々は、この報告書の重要なレビューと編集のために博士Soshanaスベンセンに感謝します。この作品は、NIH / NINDS 1U24NS078370-01とCIRM DR2A-05320によって寄贈されました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beaker, 50 ml Fisherbrand FB-100-50 multiple manufacturers/suppliers
Bio-Safety Cabinet, class II Baker SG-603A 4 ft. or 6 ft. model.  6 ft. model recommended; multiple manufacturers/suppliers
Blades, Double-edge Prep Personna 74-0002 multiple manufacturers/suppliers.  CAUTION: Sharp
Cell Freezing Media Sigma-Aldrich C6295-50ML DMSO, serum-free
Centrifuge, swing-bucket with 15 ml inserts Eppendorf 5810 R multiple manufacturers/suppliers
Conical Tubes, 15 ml Fisherbrand S50712 multiple manufacturers/suppliers
Conical Tubes, 50 ml BD Falcon 352074 multiple manufacturers/suppliers
Controlled Rate Freezer Planer Kryo 750 multiple manufacturers/suppliers
Cryovials, 2 ml Corning 430488 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T12.5 BD Falcon 353107 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T25 BD Falcon 353081 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T175 BD Falcon 353045 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T75  BD Falcon 353110 multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 1 L Millipore SCGPU11RE multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 150 ml Millipore SCGVU01RE multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 500 ml Millipore SCGPU05RE multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 50 ml Millipore SCGP00525 multiple manufacturers/suppliers
Filter Paper, 8.5 cm circles Whatman/GE 1001-085
Forceps, Standard Pattern - Serrated/Curved/18 cm Fine Science Tools 11001-18
Freezing Chamber, Isopropyl Alcohol Nalgene 5100-0001 "Mr. Frosty"
Incubator, 37 °C/5% CO2 Forma 370 series multiple manufacturers/suppliers
Hemacytometer, Phase Hausser Scientific 1475 multiple manufacturers/suppliers
McIlwain Tissue Chopper Lafayette Instruments TC752-PD  Petri dish modification required.   CAUTION:  Moving, sharp blade.
Micropipettor, 1-10 μl Gilson F144562 multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 100-1,000 μl (starter kit) Gilson F167700 multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 2-20 μl (starter kit) Gilson F167700 multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 20-200 μl (starter kit) Gilson F167700 multiple manufacturers/suppliers
Nutdriver, Autoclavable, 5/16" Steritool 10302
Pasteur Pipets, cotton-plugged Fisherbrand 13-678-8B multiple manufacturers/suppliers
Petri Dish, Glass, Autoclavable Corning 3160-100
Pipet Aid Drummond 4-000-101 multiple manufacturers/suppliers
Shim disc McMaster-Carr VARIABLE multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 10 μl AvantGuard AV10R-H multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 1,000 μl AvantGuard AV1000 multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 20 μl AvantGuard AV20-H multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 200 μl AvantGuard AV200-H multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 10 ml Fisherbrand 13-676-10J multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 2 ml Fisherbrand 13-675-3C multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 25 ml Fisherbrand 13-676-10K multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 5 ml Fisherbrand 13-676-10H multiple manufacturers/suppliers
Sterilization Pouches, 19 x 33 cm Crosstex SCL multiple manufacturers/suppliers
Strainer, 40 µm BD Falcon 352340
Tissue Culture Dishes, 60 mm BD Falcon 351007
Tube Racks, Interlocking Four-Way Fisherbrand 03-448-17
Water Bath Fisherbrand S52602Q multiple manufacturers/suppliers
Neural Progenitor Cell-Specific Processing Reagents
Neural Stem Cell Expansion Medium (Stemline) Sigma-Aldrich S3194-500ML Important to use the Stemline brand
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) Millipore GF316 multiple manufacturers/suppliers
Recombinant Human Leukemia Inhibitory Factor (LIF) Millipore LIF1010 multiple manufacturers/suppliers
Trypan Blue (0.4%) Sigma-Aldrich T8154-100ML multiple manufacturers/suppliers
TrypLE Select (1x) Life Technologies 12563-011

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神経科学、発行88、神経前駆細胞、神経前駆細胞、神経幹細胞、継代、ニューロスフェア、チョッピング、幹細胞、神経科学、浮遊培養、適正製造基準、GMP

Erratum

Formal Correction: Erratum: A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue
Posted by JoVE Editors on 09/01/2014. Citeable Link.

A correction was made to A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue. The corresponding author was changed from:

Brandon C. Shelley

to:

Clive Svendsen

ヒト神経の集合体のためのcGMP適用可能な展開法は、幹細胞および前駆細胞は、多能性幹細胞や胎児の脳組織由来
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Shelley, B. C., Gowing, G., Svendsen, C. N. A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue. J. Vis. Exp. (88), e51219, doi:10.3791/51219 (2014).

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