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Neuroscience

Une méthode d'extension cGMP applicable pour les agrégats de neurones humains des cellules souches et progénitrices dérivées de cellules souches pluripotentes ou fœtale tissu cérébral

doi: 10.3791/51219 Published: June 15, 2014

ERRATUM NOTICE

Summary

Ce protocole décrit un procédé de découpage mécanique nouvelle qui permet l'expansion de souches et de cellules progénitrices neurales agrégats sphériques sans dissociation d'une suspension cellulaire unique. Maintenir le contact cellule / cellule permet une croissance rapide et stable depuis plus de 40 passages.

Abstract

Une technique d'expansion cellulaire d'amasser un grand nombre de cellules à partir d'un seul échantillon pour des expériences de recherche et d'essais cliniques bénéficierait grandement de la communauté sur les cellules souches. De nombreuses méthodes d'expansion actuels sont laborieuses et coûteuses, et ceux qui impliquent la dissociation complète peuvent provoquer plusieurs types de souches et de cellules progénitrices à subir une différenciation ou la sénescence précoce. Pour surmonter ces problèmes, nous avons mis au point une méthode de repiquage mécanique automatisé dénommé "hachage" qui est simple et peu coûteux. Cette technique évite la dissociation chimique ou enzymatique dans les cellules simples et place permet l'expansion à grande échelle de suspension, cultures sphéroïde qui maintiennent le contact cellule / cellule constante. Le procédé de hachage a été utilisée principalement pour les cellules cérébrales fœtales dérivé progénitrices neurales ou des neurosphères, et a été récemment publiée pour une utilisation avec des cellules souches neurales dérivées de cellules souches embryonnaires pluripotentes et induits. La procédure impliquantes semis neurosphères sur une culture de tissu boîte de Pétri, puis en passant une lame tranchante, stérile à travers les cellules automatiser efficacement le processus fastidieux de la main dissocier mécaniquement chaque sphère. Mise en suspension des cellules en culture fournit une surface rapport favorable surface sur volume; que plus de 500 000 cellules peuvent être cultivées dans un seul neurosphères de moins de 0,5 mm de diamètre. Dans un flacon T175, plus de 50 millions de cellules peuvent se développer dans des cultures en suspension contre seulement 15 millions en cultures adhérentes. Surtout, la procédure de hachage a été utilisé dans les bonnes pratiques de fabrication (cGMP), permettant la production de la quantité de masse de produits de cellules de qualité clinique.

Introduction

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Il ya une longue histoire de l'expansion des cellules souches neurales rongeurs en culture soit une monocouche 1-3 ou 4-7 neurosphères globales. En outre, les cellules progénitrices neurales humaines (hNPCs) isolés à partir de différentes régions du développement du système nerveux central 8-17 ont été élargies in vitro. Ces cellules sont bi-puissant, capable de se différencier en astrocytes et les neurones les deux et ont été un outil très utile pour étudier le développement neural 18,19 et 20,21 mécanisme maladie. hNPCs ont également été transplantées dans de nombreux modèles de la maladie du système nerveux central des animaux différents avec différents niveaux d'intégration, à la survie et les effets fonctionnels 22-24.

Traditionnellement, les rongeurs ou NPC foetales humaines dérivées sont exposés à des facteurs de croissance épidermique - souvent facteur de croissance (EGF) et / ou le facteur de croissance des fibroblastes-2 (FGF-2) et 25 à 28 - 29 à la fois adhérent et troisSystèmes de sphéroïdes dimensions sont généralement soumises à des passages en utilisant la dissociation enzymatique dans une suspension à cellule unique 30-34. La méthode standard pour développer des cellules pour la recherche ou l'utilisation clinique est comme une monocouche adhérente raison d'une manipulation facile. Cependant, nous avons montré que des passages monocouches et neurosphères hNPCs avec des solutions chimiques ou enzymatiques ont donné lieu à la sénescence précoce 35. En outre, la dissociation enzymatique peut entraîner une augmentation des niveaux de différenciation et des anomalies caryotypiques d'après les données démontré avec des cellules souches embryonnaires de 36 à 38. Bien que la méthode standard de hNPCs de passages a produit les bonnes pratiques de fabrication (BPF) des produits de qualité qui sont passés en phase 1 des essais cliniques (cellules souches Inc., Neuralstem Inc.), la méthode autorisée seulement quelques cycles d'amplification cellulaire, ce qui limite la potentiel bancaire.

De toute évidence, les grandes expériences de recherche et d'essais cliniques futurs pourraient bénéficier de la capacité depropager des cellules en vrac et à la sénescence retardée pour permettre la croissance à grande échelle et de banques de cellules. Pour répondre à ce besoin, nous avons développé une façon nouvelle et automatisé de neurosphères intactes mécaniquement passages par "couper" en petits groupes pour maintenir le contact de cellule à cellule. Ce procédé augmente considérablement leur durée de vie et la culture en suspension 39 permet une utilisation plus efficace de l'espace de l'incubateur par rapport aux cultures en monocouche, comme on le voit avec une méthode de culture 3D de bioréacteur alternatif 40. Le protocole permet de hachage prévu pour la production de banques à grande échelle d'un échantillon foetal supérieur passage 10, un exploit peu probable en utilisant des procédés standards de repiquage. Bien que cette méthode pour hNPCs de repiquage n'est pas conventionnelle, il est de plus en plus en popularité et a été récemment publié avec d'autres types tels que les cellules souches neurales dérivées de l'embryon humain et les cellules souches pluripotentes induites cellulaires, permettant l'expansion à grande échelle pour diverses applications, notamment dans vITRO modélisation de la maladie 41-46. Surtout, un hNPC banque de cellules cGMP de qualité a déjà été produit avec le procédé de hachage, ce qui démontre que la technique peut être appliquée à de futures applications cliniques.

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Protocol

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1. Déclaration et de la sécurité éthique

  1. Cette procédure implique l'utilisation de produits de la culture de cellules dérivées d'êtres humains ou d'animaux. Tous les tissus dérivés doivent être approuvées avant l'utilisation par le Conseil d'examen institutionnel approprié (s) et / ou le soin et l'utilisation des animaux Comité (s) institutionnelle.
  2. Tous les déchets biologiques dangereux doivent être éliminés conformément à la réglementation en matière de sécurité décidées par l'institution concernée. Connaître et suivre toutes les consignes de sécurité et d'élimination Apposite tout au long de cette procédure.

2. Préparation du matériel, des fournitures, réactifs, et observations

  1. Préparation
    1. Obtenir une boîte de Pétri en verre, des cercles de papier filtre de 8,5 cm et lames de préparation à double tranchant.
    2. Placez un morceau de papier filtre dans la boîte de Pétri et transférer plusieurs lames dégainées sur le papier filtre dans la boîte de Pétri.
    3. Plusieurs reprises papier et lames de filtre couche jusqu'à ce que la boîte de Petri est à peu près 75% de la pleine, la couverture d'esprith boîte de Pétri couvercle et autoclave. Stocker dans un environnement stérile ou clos pour préserver la stérilité.
    4. Autoclave 18 cm pince et un écrou-pilote autoclave dans un sachet de stérilisation. Pour la production cGMP, autoclave plusieurs disques de calage en acier inoxydable dans des sachets de stérilisation. Pour plus d'informations concernant le disque de cale, voir l'étape 3.5.
    5. Désinfectez le cabinet de sécurité biologique (BSC) avec 70% d'alcool isopropylique (IPA).
    6. Toutes les procédures doivent être effectuées dans un BSC pour maintenir la stérilité. Aseptique transférer le suivant dans le BSC:
      1. McIlwain Tissue Chopper (chopper). Essuyez toutes les surfaces avec 70% d'IPA, notamment le bras de hacheur (figure 1B). L'ensemble hacheur peut être décontaminée avec de l'oxyde d'éthylène, si nécessaire.
      2. Un écrou-pilote autoclave ou écrou-clé (inclus avec le hachoir, figure 1I), un 18 cm pince, un jeu de micropipettes de taille standard (20 pi-1, 000 pi), un pipetaid et supports de tubes.
      3. Stériles pipettes sérologiques jetables, des conseils barrière de pipettes, tubes de 15 ml coniques, 60 mm boîtes de Pétri, lames de préparation à double tranchant et flacons T de taille appropriée. ATTENTION: Ne manipulez les lames tranchantes avec une pince.
  2. Réactifs
    1. Développer hNPCs en Maintenance des médias (MM), comprenant des souches neurales moyen d'expansion cellulaire, FEM à 100 ng / ml et facteur inhibiteur de leucémie (LIF) à 10 ng / ml. Transférer les réactifs et dispositif (s) de filtration nécessaires pour préparer les médias dans le BSC.
    2. Re-suspendre le FEM lyophilisée en utilisant Neural expansion des cellules souches à moyen et préparer aliquotes à 100 pg / ml pour stocker à -80 ° C pendant 1 an. FRV est stocké comme achetés à 4 ° C pendant jusqu'à 6 mois ou la date de péremption indiquée par le fabricant.
    3. Transfert réactifs MM dans le BSC. Mélanger tous les réactifs dans un dispositif de filtration de dimensions appropriées et un filtre en utilisant un appareil à vide. Stocker à 4 ° C pendant 3 semaines.
    4. hNPC Observations
      1. Les deux facteurs les plus importants à traiter avant de les hacher est diamètre sphère et le conditionnement des médias ou de la couleur. Le milieu conditionné (CM) est définie en tant que milieu qui a été métabolisé par les hNPCs en culture dans des conditions d'incubateur (37 ° C, 5% CO 2, 95% d'humidité). Comme les cellules métabolisent les médias la composante rouge de phénol se passer d'une rose de couleur jaune signifie un environnement plus acide (figure 5D).
      2. Tenez le flacon (s) de hNPCs à la lumière pour traiter la couleur du support (voir la discussion pour plus de détails).
      3. Parcourez le ballon avec un microscope pour observer les cellules. Utilisez un réticule à examiner taille sphère. Si de nombreuses sphères ont un diamètre de 300 um ou plus, poursuivre le processus de découpage. Hacher les cellules tous les 7-10 jours.
      4. Si une côtelette n'est pas justifiée, l'échange 25-75% de la CM du milieu frais tous les 3-4 jours en fonction de la rapidité avec laquelle les cellules métabolisent les médias. Concontinuer à échanger des médias jusqu'à ce que les sphères sont assez grand pour passage.
      5. hNPCs sont généralement coupés en un rapport de 1:2, à partir de petits flacons à des flacons plus grands. Utilisez le tableau 1 comme un guide de référence pour la taille et de volume ballon recommandations.
    2 T175s
    Ballon Volume total des médias Pré-Chop Post-Chop
    1 T12.5 5 ml 1 T12.5 1 T25
    1 T25 10 ml 1 T25 1 T75
    1 T75 20 ml 1 T75 1 T175
    1 T175 40 ml 1 T175 2 T175s
    80 ml 2 T175s * 4 T175s
    * 2 T175s est le nombre maximum de flacons qui peuvent être hachées à la fois. Hacher en ensembles de 2 T175s et se référer à l'étape 7.

    Tableau 1. HNPC dilatation paradigme. Description d'un schéma typique d'expansion pour hNPCs. La norme est de développer deux fois volumétrique tous les 7-10 jours.

    3. Configuration Chopper

    Figure 1
    Figure 1. Chopper tissu McIlwain. A) Hacher épaisseur micrométrique d'ajustement, B) Chopper base de bras et bras attaché, C) Accrocher le support de plaque pour boîte de Pétri, D) Tableau relâchez le bouton et plateau, E) Bouton de commande de la force de la lame, F) Interrupteur de réinitialisation, G) Support de plaque, l'attachement H) Bolt pour la lame, agrafe et écrou, I) clé écrou inclus avec le découpeur, J) écrou de lame / fermoir, K) Lame fermoir, L ) bouton de réglage de la vitesse de coupe automatique, M) bouton de commande du bras de coupe manuelle, N) Interrupteur d'alimentation.

    1. Branchez le couperet dans une prise dans le BSC et allumez l'interrupteur d'alimentation (Figure 1 N). Réglez la distance de coupe de 200 um (figure 1A). Réglez la pression de la lame à 270 ° ou 09h00 si le bouton était une horloge (figure 1E). Assurez-vous que le bouton de vitesse automatique est tourné autant que possible dans le sens antihoraire. (Figure 1L).
    2. Déplacez la table de presse tout le chemin vers la droite confirmer le support de plaque est stable (figure 1D).
    3. Tournez le fabricantal bras manipulateur dans le sens horaire pour augmenter le bras à son niveau maximum (figure 1M). Le bras manipulateur manuel ne doit être tourné dans le sens horaire.
    4. Aseptique transférer, une lame à hacher double tranchant stérile sur le boulon de bras de découpage à l'aide d'une paire de pinces (figure 1H).
    5. Effectuer cette étape que pour le GMPc passages, comme la boîte de Pétri seule est suffisante pour le traitement de recherche de qualité. Comme il est indiqué dans l'étape 2.1.4, les disques de calage placés à l'intérieur de la base de boîte de Pétri sont nécessaires pour le GMPc. Le disque de la cale empêche les fragments de matière plastique à partir de l'incorporation dans les sphères au cours de la procédure de découpage. Pour chaque côtelette prévu, transférer un disque de cale dans le fond de chaque boîte de Pétri et le couvercle.
    6. Aseptique placer le fermoir (figure 1K) sur la lame à l'aide des pinces. La partie incurvée de l'agrafe doit être au-dessus de l'arête supérieure du bras. Le fermoir ne restera pas sur le bras jusqu'à ce que l'écrou a été correctement façonné. Utilisez la pince pour tenir les clasp sur le bras et fixer l'écrou (figure 1J) sur le boulon de l'écrou-pilote stérile. Laisser l'écrou d'un quart de tour lâche.

    4. Procédure de pré-chop

    1. Transférer le volume proposé de MM dans le nouveau flacon (s) selon le tableau 2, colonne C.
    2. Aseptique transférer les cellules de l'incubateur dans le BSC. Incliner le flacon (s) sur un support de tube (figure 2A) et permettent aux sphères de s'installer dans le flacon (s).
    3. Une fois installés, aspirer jusqu'à 12 ml de surnageant avec 5 ml ou 10 ml de pipettes sérologiques et rincer toutes les sphères faiblement adhérentes à la surface du flacon (s). Répéter au besoin et de régler les domaines entre les rinçages.
    4. Transférer le volume proposé de CM dans le nouveau flacon (s) selon le tableau 2, colonne D. Si repiquage deux ou plusieurs flacons T175, voir l'étape 7.1.
    5. Transférer tout en restant CM et sphères dans un nouveau tube de 15 ml conique. Autoriser les sphères de soiTTLE et jeter le flacon (s) utilisé.
    6. Étape: transférer lentement les sphères du tube de 15 ml conique sur la boîte de Pétri de 60 mm ou d'un disque de cale dans le volume le plus faible possible; 0,1-0,5 ml est recommandée (figure 2B). Gardez le volume restant de CM car elle sera utilisée pour rincer les cellules de la boîte de post-chop. Essayez de minimiser la surface couverte par les médias et des sphères sur le plat (figure 2C).

    Figure 2
    Figure 2. Préparation Sphère pour hacher. A) Incliner le flacon (s) contre un support de tube ou un objet similaire pour régler les sphères dans le coin de la fiole. B) Transférer les sphères aussi dense que possible du tube conique au Petri plat. C) Réunir les sphères de tube conique en til milieu de la boîte de Pétri. D) Retirer le maximum de surnageant que possible du haut des sphères communs. E) Répartir les sphères à l'aide du côté de la pointe de micropipette plastique. F) déplacer délicatement les sphères d'un côté de la piscine sphères. G) Exemple de domaines qui ont été déplacés d'un côté de la piscine pour faciliter l'enlèvement des médias. H) condensés étalés sur la boîte de Pétri, prêt à découper. Cliquez ici pour agrandir l'image.

    1. Ensuite, les sphères ont besoin d'être condensé en éliminant le surnageant a été transféré au cours de l'étape 4.6. Transférer le surnageant dans le tube conique de 15 ml avec une barrière à pointe micropipette d'aérosol (Figure 2D), d'éviter le retrait de sphères. Commencez par enlever autant les médias que possible du haut de la piscine médias / cellulaire. Quand il n'est pas possibleenlever le support sans sphères, passez à l'étape suivante.
    <td> 0 ml
    La colonne A Colonne B Colonne C La colonne D Colonne E Colonne F
    Pré-Chop Flacon Taille Poster Chop-Flacon (s) Taille Le volume proposé de MM transférer à nouveau flacon (s) pré-chop Le volume proposé de CM de transférer à nouveau flacon (s) pré-chop Le volume proposé de sphères / médias de transférer dans un nouveau flacon (s) post-chop Volume final ensemencée / Flacon
    T12.5 T25 5 ml 0 ml 5 ml 10 ml
    T25 T75 10 ml 10 ml 20 ml
    T75 T175 20 ml 10 ml 10 ml 40 ml
    1 T175 2 T175s 20 ml par fiole 15 ml par fiole 5 ml par fiole 40 ml
    2 T75s 4 T175s 20 ml par fiole 17,5 ml par fiole 2,5 ml par fiole 40 ml

    Tableau 2. Guide de transfert des médias pré / post-chop. Volumes suggérés à utiliser pendant le processus de découpage.

    1. Étaler la piscine à l'aide du côté de la pointe de la pipette pour augmenter la surface (figure 2E).
    2. Étape: Astuce de la boîte de Pétri légèrement vers vous et utilisez le côté de la pointe de la pipette à doucement slide toutes les sphères d'un côté de la piscine (figure 2F, G).
    3. Étape: Lorsque toutes les cellules ont été déplacés, basculer lentement la boîte de Pétri la direction opposée. Au cours du processus, les seuls médias iront loin des sphères. Transférer les médias dans le tube conique de 15 ml. Retrait minimal de la sphère est acceptable.
    4. Utilisez le côté de la pointe de la pipette à glisser doucement toutes les sphères de nouveau au centre de la boîte de Pétri, la piscine a un diamètre de 0,5 à 2,4 cm (de la figure 2H). Il est important de garder la profondeur de la piscine peu profonde de la sphère. Si la piscine est trop profonde, les sphères seront simplement mises de côté lors de la coupe. REMARQUE: Le diamètre de la piscine de la sphère ne peut pas être supérieure à 2,5 cm ou la lame en contact avec les bords de la boîte de Pétri, manquant les cellules.

    5. Procédure Chop

    1. Transférer la boîte de Pétri sur le support de plaque (figure 1G) et assurer le platest fixé sous le support de plaque crochets (figure 1C).
    2. Le bouton table de presse comporte des encoches où il s'adaptera à la vitesse. Utilisez le bouton table de presse pour faire glisser le support de plaque à la gauche de sorte que la lame est claire des sphères et verrouillé à la vitesse (figure 1D).
    3. Étape: Abaissez le bras de chopper en tournant le bouton de manipulation manuelle (figure 1M) dans le sens horaire jusqu'à ce que la lame se mette à plat sur ​​la boîte de Pétri. Utilisez une main pour appuyer sur la monture de bras (figure 1B) tout en resserrant l'écrou avec la clé à douille.
    4. Appuyez sur le bouton de remise à zéro une fois (figure 1F). Stabiliser la boîte de Pétri avec une main tout en tournant le bras manipulateur automatique bouton (figure 1L) dans le sens horaire à la position 90 ° ou 12h00 si le bouton était une horloge. ATTENTION: Ne pas toucher la lame mobile à tout moment.
    5. Passez la lame entièrement par la piscine de sphères. Faites pivoter le support de plaque90 °.
    6. Desserrer le boulon et répétez l'étape 5.3 à 5.5.
    7. Aseptique transférer la boîte de Pétri du support de plaque sur un espace de travail dans le BSC.

    6. Post-chop procédure

    1. Premier d'une pipette 10 ml sérologique avec le CM dans le tube conique de l'étape 4.6, puis transférer 1 ml sur les sphères hachées. Doucement remettre en suspension et transférer dans un nouveau tube de 15 ml conique. Éviter les bulles et répéter autant de fois que nécessaire pour collecter les sphères hachées.
      ASTUCE: Réduire grattant le plat comme fragments de plastique peuvent soulever. Ce n'est pas un problème si vous utilisez les disques de cales en acier inoxydable. Méfiez-vous des cellules de fixation à l'intérieur de la pipette sérologique plastique. Si cela se produit, les bulles aspirer par intermittence par les médias dans la pipette pour détacher les cellules.
    2. Mesurez le volume de CM et sphères hachées. Ajouter le volume approprié de MM pour atteindre le volume indiqué dans le tableau 2, colonne E.
    3. Triturer l'sphères 2-3x pour briser les sphères lâche fusionnés.
    4. Étape: Aliquoter la suspension de la sphère dans chaque nouveau flacon. Seulement transférer la suspension de la sphère dans un flacon à la fois, et re-suspendre les domaines entre les transferts. Aliquotage plusieurs flacons à la fois en résulte un nombre disproportionné de sphères dans chaque flacon. Le volume final dans chaque flacon doit être égale les volumes dans le tableau 2, colonne F. Voir étape 7.2 lorsque l'ensemencement de plus de deux flacons T175.
    5. Retirer l'écrou avec l'écrou-pilote et le fermoir avec les pinces stériles. Décontaminer appropriée avec 70% d'IPA ou l'équivalent. ATTENTION: Retirer le couteau utilisé uniquement avec une pince et jeter dans un contenant pour objets pointus bio-risque.
    6. Décontaminer toutes les surfaces de l'hélicoptère avec 70% d'IPA.

    . 7 Variations de process - Ballons multiples

    Il existe plusieurs différences quand passages plus de deux T175s. L'étapes ci-dessous sont des altérations de l'étape référencée.

    1. Références à l'étape 4.4:
      1. Quand repiquer deux T175s, combiner tous les médias et des sphères en des flacons T175. Laissez les sphères de s'installer puis aliquote le volume approprié de CM dans chacun des nouveaux flacons comme indiqué dans le tableau 2, colonne D. Passez à l'étape 4.5.
      2. Quand repiquer plus de deux T175s, obtenir un nouveau flacon et l'étiquette T175 comme le ballon de CM. Étape complète 7.1.1 mais transférer le CM dans le ballon de CM. Stocker le récipient sur le côté de la BSC à être utilisé pour recueillir le CM de tous les flacons jusqu'à ce que tous les flacons ont été haché. Ensuite, le CM sera également répartie dans chacun des nouveaux flacons.
    2. Référence étape 6.4 - Pour hacher la même lignée de cellules à plusieurs reprises, de transférer la suspension de la sphère haché dans un nouveau flacon T75 sphères marquées post-chop et enregistrer le volume transféré. Continuer à combiner les cellules de cetteflacon après chaque côtelette et stocker le flacon dans l'incubateur à 37 ° C, 5% de CO 2, 95% d'humidité. Après tous les côtelettes ont été achevés, aliquoter la suspension de la sphère de volume dans chaque nouveau flacon. Passez à l'étape 6.5.

    8. Cryoconservation

    Le protocole suivant est pour la préservation cryogénique hNPCs.

    1. Décongeler cellule milieu de congélation dans un bain d'eau propre à 37 ° C et ensuite le stocker sur la glace. Cellule milieu de congélation peut être aliquote et stocké à -80 ˚ C pendant 6 mois.
    2. Feu verre poli pipettes Pasteur en tournant l'ouverture de la pipette dans une flamme. Préparer au moins deux grandes et deux pipettes poli au feu petit calibre (figure 3). Les sphères seront dissociées par le déplacement de grand à petit pipettes de forage.
    3. Placer TrypLE Select dans le bain d'eau à 37 ° C pendant 5 min. Retirer et conserver à la température ambiante jusqu'à utilisation.


    Figure 3. Verre incendie polissage pipettes Pasteur. A) Tenir la pipette dans la partie supérieure de la flamme et de spin pour uniformément sur ​​les bords de la pipette de verre. B) Exemple d'une poli-feu pipette en verre de gros calibre. C) Exemple d'une poli-feu pipette de verre de petit calibre.

    1. Transférer de manière aseptique les neurosphères dans le BSC. Laissez les sphères de s'installer en s'appuyant le flacon (s) contre un support de tube et rincer le fond du flacon pour éliminer toutes les sphères faiblement adhérentes. Autoriser les sphères à se réinstaller.
    2. Transférer tous mais 5-10 ml de CM dans un flacon stérile et mesurer le volume total. Placez les sphères restantes et les médias dans un tube conique.
    3. Après toutes les cellules sont installés, transférer tout mais un petit ménisque de CM dans la bouteille et sommer le volume.
    4. Transfert aseptique 5-10 ml de réchauffé TrypLE Sélectionnez dans le tube conique et remettre en suspension le culot cellulaire. Transférer le tube conique dans le bain d'eau à 37 ° C pendant de 15 à 20 min. Après 7,5-10 min, secouer doucement le tube conique pour mélanger.
    5. Utiliser le volume de la CM mesurée à partir de l'étape 8.5 et de préparer un volume égal de MM. Combiner et filtrer le CM et 50% MM solution à 50% (solution CM / MM).
    6. Transférer de manière aseptique un tamis de 40 um dans un tube conique de 50 ml.
    7. Lorsque l'incubation est terminée, tourner les tubes 15 ml coniques pendant 15 secondes à 100 x g.
    8. Aspirer délicatement et jeter le TrypLE Sélectionner tout substrat filandreuse. Laisser un petit ménisque. Ajouter délicatement 2 - 4 ml de CM / MM pour diluer le restant TrypLE Sélectionnez sans perturber le culot. Laissez toutes les cellules délogées re-régler avant de jeter le lavage.
    9. Ajouter 2-5 ml CM / MM solution aux sphères du tube. Dissocier les sphères avec une pipette de 5 ml en triturant un maximum de 10x. Laissez le nonsphères dissociées s'installent pendant 1-2 min. Transférer la suspension cellulaire dissociée sur le tamis de 40 pm pour éliminer les grappes entièrement non dissociées.
    10. Répétez l'étape 8.12 avec un gros calibre pipette en verre poli au feu et une pipette en verre de petit calibre.
    11. Rincer la crépine avec 2-5 ml de solution CM / MM.
    12. Mélanger la suspension de cellules et de prélever des échantillons pour l'analyse de la viabilité.
    13. Diluer les échantillons avec du bleu trypan à un facteur de dilution approprié et compter. Utiliser l'équation ci-dessous norme pour calculer la concentration moyenne des cellules viables et de calculer les cellules viables totales.
      Equation 1
    14. Calculer le volume total de congélation de cellules support requis pour remettre en suspension les cellules à 5,0 x 10 6 cellules / ml. 1 ml de cellules seront ensemencées dans chaque tube cryogénique. Transférer les tubes cryogéniques dans le BSC.
    15. Centrifuger la suspension de cellules à 200 xg pendant 5 min à 4 ° C à 15 mtubes l coniques pour le meilleur rendement. Si 50 ml tubes coniques sont utilisés pour un gel à grande échelle vers le bas, augmenter le taux et l'heure à 400 g pendant 10 min.
    16. Re-suspendre le culot de cellules en utilisant le milieu de congélation de cellules à 5,0 x 10 6 cellules / ml. Aliquote de 1 ml de suspension cellulaire dans chaque tube cryogénique. Pour une même distribution aspiration 6 ml de suspension et aliquotes 5 cryotubes x 1 ml. Transférer les 1 ml restants de suspension dans la piscine de cellules. Répétez jusqu'à ce que tous les flacons ont été remplis.
    17. Sceller de façon aseptique tous les tubes cryogéniques graines et de les transférer sur de la glace pendant 5-10 min.
    18. Utilisez l'une des options suivantes pour les stratégies de cryoconservation pour préserver les hNPCs: isopropylique Chambre alcool
      1. Remplir le nombre requis de chambre (s) avec 100% d'IPA à la température ambiante.
      2. Transférer les tubes cryogéniques graines de glace dans la chambre (s) et transférer la chambre (s) en un congélateur à -80 ° C pendant la nuit. Les cellules sont stables pendant jusqu'à une semaine à -80 ° C, cependantil est suggéré de transférer les flacons de stockage d'azote liquide à long terme le jour suivant.

      Congélateur vitesse contrôlée

      1. Envoyez un programme de congélation approprié pour le logiciel du congélateur à vitesse contrôlée. Un exemple de programme est répertorié dans le tableau 3. Figure 4 montre une courbe typique de congélation pour hNPCs. Toutefois, le programme exact variera pour chaque modèle de congélateur. Le taux d'échantillonnage global norme devrait être proche de -1 ° C / min jusqu'à atteindre -40 ° C, où le taux de gel peut être sensiblement augmenté à au moins 80 ° C.
    Étape Taux (° C) Fin Température (° C) Hold (min sec) Trigger
    1 </ Td> - - 5 min 0 sec Chambre
    2 - 1.3 - 5 - Échantillon
    3 - - 1 min 0 sec Chambre
    4 - 45 - 58 - Chambre
    5 + 10 - 26 - Chambre
    6 3 + - 23 - Chambre
    7 - 0,8 - 40 - Échantillon
    8 - 10 - 100 - Chambre
    9 - 35 - 160 - Chambre

    Tableau 3. Étapes de congélation hNPCs dans un r contrôléemangé congélateur. Programme proposé pour hNPC cryoconservation sur un congélateur à vitesse contrôlée.

    Figure 4
    Figure 4. Courbe de congélation de l'échantillon. Courbe de congélation typique pour hNPCs sur un congélateur à vitesse contrôlée.

      1. Transférer les tubes cryogéniques de la glace dans les paniers liés à la congélation de taux de contrôle. Assurez-vous de charger un cryovial avec seulement la cellule de congélation médias à utiliser pour la sonde de température de l'échantillon. Transférer les paniers dans la chambre de congélation et placer la sonde de prélèvement dans le flacon de la sonde. Démarrez le programme.
      2. Lorsque le protocole s'est terminé, transférer les flacons dans de l'azote liquide stockage à long terme.

    9. Procédure de décongélation

    Le protocole suivant est pour la décongélation cryogénique phNPCs réservés.

    1. Transférer les tubes cryogéniques de stockage d'azote liquide immédiatement sur de la glace sèche. ATTENTION: Les flacons peuvent avoir des fissures ou des couvercles en vrac permettant l'azote liquide pour entrer dans le flacon. Lorsqu'ils sont retirés de conditions de surgélation, le liquide peut bouillir, explosant immédiatement le flacon. Utilisez EPI approprié lors du retrait des flacons.
    2. Préparer tous les réactifs et les livraisons inférieures à l'avance. Une fois le processus de décongélation a commencé, il est essentiel de suivre à travers efficacement.
      1. Transfert Neural expansion des cellules souches moyen, MM, un tube de 15 ml conique, un 2 ml et 10 ml d'une pipette sérologique de chaque tube cryogénique dans le BSC.
      2. Un minimum de 9 ml de Neural Stem Cell Expansion moyenne et 5 ml de MM est nécessaire pour chaque flacon. Préparez plus de chaque support si nécessaire.
    3. Seulement décongeler un flacon de hNPCs à la fois. Transférer les cellules congelées de glace sèche dans un endroit propre 37 ° C bain d'eau et agiter le flacon dans le bain d'eau en permanence. Contrôler le volume desglace qui a fondu. Quand il ya un morceau de glace d'environ 0,5 cm à gauche dans le flacon, pulvériser et essuyer avec 70% d'alcool isopropylique et transférer dans le BSC.
    4. Transférer le contenu du tube cryogénique dans un tube conique de 15 ml avec une pipette sérologique de 2 ml. Ajouter 1 ml de Neural expansion des cellules souches moyen à la cryovial vide et ensuite transférer 8 ml de Neural expansion des cellules souches moyenne sur les cellules décongelées dans un lent, déposer manière sage en agitant doucement le tube. Ceci est fait pour réduire le risque de choc osmotique.
    5. Transférer le liquide de rinçage à partir du tube cryogénique à 9 ml de suspension cellulaire. Transférer le tube conique sur de la glace et répétez les étapes 9.4 à 9.5 pour tous les flacons restants.
    6. Centrifuger les tubes coniques à 200 xg pendant 5 min à 4 ° C. Pendant la centrifugation, préparer le nombre approprié de flacons pour semis basés sur le tableau 4.
    Nombre de flacons Volume total d'amorçage (ml) Ballon
    1 5 T12.5
    2 10 T25
    3 15 T75
    4 20 T75
    5 25 T75
    6 30 T175
    7 35 T175
    8 40 T175
    8 + - Combinaison de flacons

    Tableau 4. Tailles de ballons en fonction du nombre de tubes cryogéniques décongelés. Le volume proposé et la taille de flacon pour ensemencer hNPCs post-dégel.

    1. Re-suspendre et de combiner tous les tubes dans le volume approprié de MM basé sur le tableau 4. Bien mélanger et redéplacer un échantillon de viabilité comptage. Voir les étapes 8.15 à 8.16 pour compter plus de détails. La gamme de semis norme est entre 160,000-320,000 cellules / cm 2.
    2. Mélanger les cellules bien et aliquoter les cellules dans des flacons. Transférer les flacons à un CO de 5% 2/37 ° C/95% d'humidité incubateur. Mélanger le ballon en agitant doucement d'avant en arrière pour répartir uniformément les cellules.
    3. Les cellules forment des sphères en 24-48 heures. Parfois, les cellules adhèrent à la surface de la matière plastique et former une distribution de colonie nid d'abeilles. Si cela se produit, laissez les cellules pendant 3 jours avant de rincer les cellules lâche, contribuant à la formation de la sphère. Rincez tous les 1-3 jours jusqu'à ce qu'il n'y a pas de cellules adhérentes. Si nécessaire, le transfert des cellules dans un nouveau flacon.
    4. Bourse 25-75% des médias avec MM tous les 3-4 jours jusqu'à ce que les cellules sont prêts à hacher, habituellement 7-14 jours après le dégel.

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Representative Results

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Figure 5
Le nombre de cellules Figure 5. Des données représentatives. A) prévues de hNPCs congelés à p19, puis décongelés et élargis comme monocouche adhérente utilisant dissociation enzymatique par rapport à neurosphères à des passages par la méthode de hachage. Jour 0 représente lorsque les cellules ont été décongelées à p20. B) Des images représentatives de sphères pré-chop, 10X. C) des images représentatives des sphères post-chop, 10X. D) Échantillon de couleur utilisé pour décrire l'ampleur de médias conditionné dans cGMP protocoles comparables. E) Immunocytochemistry de hNPCs de p29 décongelés qui ont été étalées pour 1 jour et colorées pour la nestine (rouge) expression. Hoechst contre nucléaire tache (bleu). F) Immunocytochemistry de hNPCs de p29 décongelés qui ont été étalées pendant 7 jours et tacheed pour GFAP (rouge) et la tubuline β-III (vert). Cliquez ici pour agrandir l'image.

La figure 5A représente hNPCs décongelés à p20 (jour 0) et maintenus adhérents aux flacons de culture tissulaire revêtues de laminine ou comme neurosphères non adhérentes à des passages par l'intermédiaire de la méthode de hachage. Les cellules adhérentes ont été dissociées par voie enzymatique en utilisant TrypLE Sélectionnez hebdomadaire et sénescence après 70 jours (7-10) passages en culture. En revanche, les neurosphères décongelés au passage 20 et élargis par l'intermédiaire de la technique de hachage ont augmenté pendant plus de 40 passages avant la sénescence. HNPCs typiques avant de les hacher (figure 5B) devraient être principalement ≥ 300 m de diamètre. Une fois coupé, les sphères sont généralement logés dans des sections de taille variable, le plus souvent autour de 200 m de diamètre (figure 5C). Il est important de noter que hNPCs élargi par la choppinProcédé de g maintenir l'expression des marqueurs hNPC et peut produire à la fois les astrocytes et les neurones post-différenciation. HNPCs de passage fin ont été dissociées, étalées sur des lamelles de laminine pour une période de un ou sept jours et ensuite fixées avec du paraformaldéhyde 4%. Les hNPCs expriment le marqueur de cellules progénitrices de la nestine (Millipore, 1:1000) sur hNPCs 1 jour plaqués (Figure 5E) ainsi que les marqueurs de neurones différenciés fibrillaire gliale de protéine acide (GFAP, 1:500) et la tubuline β-III (1: 2000) sur les sept jours plaqué hNPCs (figure 5F), des marqueurs pour les astrocytes et les neurones immatures, respectivement.

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Discussion

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Figure 6
Figure 6. Schéma découper. L'expansion des cellules souches du sphéroïde / progénitrices en culture selon la méthode de découpage mécanique.

Étapes critiques

Un aperçu du paradigme de l'expansion de coupe est représentée sur la figure 6. HNPC taille de la sphère est l'un des critères importants à observer avant repiquage les neurosphères. Bien qu'il existe une grande variation dans la taille de la sphère, au moins 30% des sphères doivent avoir un diamètre supérieur à 300 um. Si les sphères sont trop petites pour le passage, échanger simplement le CM avec MM frais (25% -50%) et ré-évaluer après 1-4 jours. Taux d'expansion pauvres se produisent lorsque les sphères sont des passages à trop petite d'un diamètre.

hNPC taux d'expansion sont également tributaires de la densité et de la sphère des médias conditioning en raison de facteurs sécrétés 47. Toutefois, si le support est trop métabolisé et des facteurs de croissance importants sont diminuées, les cellules peuvent acquérir une population caryotype anormal des cellules 48. Par conséquent, le remplacement des nutriments et des facteurs de croissance doivent être compensées par des facteurs trophiques sécrétés. Lorsque l'ensemencement hNPCs post-chop ou post-dégel, le nombre de neurosphères par cm 3 de médias est variable. Toutefois, la règle générale est la plus grande de la densité, plus les médias vont conditionner et plus le taux d'expansion, à condition que le milieu est changé en cas de besoin. Utiliser les médias conditionné spectre de couleur (figure 5D), qui varie de rose quand non métabolisé, au jaune lorsque le support a été entièrement métabolisée. La couleur du support idéal pour la croissance logarithmique est une couleur rouge-orange, # 3 sur l'échantillon de couleur. Ceci indique que le support contient des nutriments suffisants et facteurs de croissance, tout en maintenant une concentration adéquate de troph sécrétéefacteurs ic. Les médias ne devraient pas conditionner passé n ° 4 sur l'échantillon de couleur. Sinon, lorsque les cellules ne sont pas métabolisent rapidement médias (n ° 1 sur l'échantillon de couleur), les hNPCs va croître plus lentement et exigent une côtelette tous les 10-20 jours, par opposition à tous les 7-10 jours. Il est important d'augmenter la densité de la culture pour stimuler la climatisation, qui permettra d'améliorer le taux d'expansion.

Au cours de la procédure de hachage noter les étapes essentielles suivantes. S'assurer que le disque est installé parallèlement au bras de découpage. Si la lame n'est pas à plat sur la surface de la boîte de Pétri ou d'un disque de calage, de nombreux domaines peuvent pas être coupés. Notez la propagation des cellules examinées à l'étape 4.11. Les sphères doivent rester au centre de la boîte de Pétri ou la lame entre en contact avec la paroi avant tous les domaines ont été haché. Enfin, il est important d'éviter le séchage des hNPCs pour une période de temps prolongée au cours du processus de hachage. Après avoir placé les sphères dans le plat, hacher et les inonder avec les médias frais dès quepossible.

Comme cette technique nécessite plusieurs pièces d'équipement, il peut y avoir des risques pour la stérilité de la culture. Compte tenu de ce risque, une technique stérile appropriée doit être utilisé tout au long de la procédure. Pour la production de base niveau de la recherche, essuyer le matériel avec 70% d'IPA ou l'équivalent est suffisant avec incubation ultraviolet en option pour un minimum de 15 min. Effectuez toutes les étapes à l'intérieur d'un BSC stérile. Pour la production de cGMP niveau, le hacheur doit être stérilisé avec de l'oxyde d'éthylène comme il est suggéré par le fabricant. Tous les autres fournitures peuvent être achetés stérile ou autoclave.

Futures applications

La transition d'une thérapie de recherche fondamentale du laboratoire à la clinique peut être un défi. La procédure de hachage a été conçu avec cette transition à l'esprit. La procédure a déjà été utilisée pour produire une banque hNPC cGMP conforme à l'Université du Wisconsin Waisman Centre Bio-usine de fabrication. Tbanque chapeau de hNPC a été adjugé pour l'agrandissement d'une qualité pharmaceutique hNPC beaucoup de cellules qui sera utilisé pour de nouvelles études sur les médicaments pré-investigation et un essai clinique de phase 1 après l'approbation Federal Drug Administration. Il existe d'autres types de cellules qui utilisent cette procédure pour l'expansion. Un exemple sont des sphères EZ, les cellules souches neurales produites à partir de cellules souches pluripotentes 41. Cette technique présente un grand potentiel pour une utilisation avec d'autres types de tissus qui nécessitent un contact constant de cellule à cellule au cours de l'expansion.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Nous remercions le Dr Soshana Svendsen à la critique et l'édition de ce rapport. Ce travail a été fourni par le NIH / NINDS 1U24NS078370-01 et le CIRM DR2A-05320.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beaker, 50 ml Fisherbrand FB-100-50 multiple manufacturers/suppliers
Bio-Safety Cabinet, class II Baker SG-603A 4 ft. or 6 ft. model.  6 ft. model recommended; multiple manufacturers/suppliers
Blades, Double-edge Prep Personna 74-0002 multiple manufacturers/suppliers.  CAUTION: Sharp
Cell Freezing Media Sigma-Aldrich C6295-50ML DMSO, serum-free
Centrifuge, swing-bucket with 15 ml inserts Eppendorf 5810 R multiple manufacturers/suppliers
Conical Tubes, 15 ml Fisherbrand S50712 multiple manufacturers/suppliers
Conical Tubes, 50 ml BD Falcon 352074 multiple manufacturers/suppliers
Controlled Rate Freezer Planer Kryo 750 multiple manufacturers/suppliers
Cryovials, 2 ml Corning 430488 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T12.5 BD Falcon 353107 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T25 BD Falcon 353081 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T175 BD Falcon 353045 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T75  BD Falcon 353110 multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 1 L Millipore SCGPU11RE multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 150 ml Millipore SCGVU01RE multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 500 ml Millipore SCGPU05RE multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 50 ml Millipore SCGP00525 multiple manufacturers/suppliers
Filter Paper, 8.5 cm circles Whatman/GE 1001-085
Forceps, Standard Pattern - Serrated/Curved/18 cm Fine Science Tools 11001-18
Freezing Chamber, Isopropyl Alcohol Nalgene 5100-0001 "Mr. Frosty"
Incubator, 37 °C/5% CO2 Forma 370 series multiple manufacturers/suppliers
Hemacytometer, Phase Hausser Scientific 1475 multiple manufacturers/suppliers
McIlwain Tissue Chopper Lafayette Instruments TC752-PD  Petri dish modification required.   CAUTION:  Moving, sharp blade.
Micropipettor, 1-10 μl Gilson F144562 multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 100-1,000 μl (starter kit) Gilson F167700 multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 2-20 μl (starter kit) Gilson F167700 multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 20-200 μl (starter kit) Gilson F167700 multiple manufacturers/suppliers
Nutdriver, Autoclavable, 5/16" Steritool 10302
Pasteur Pipets, cotton-plugged Fisherbrand 13-678-8B multiple manufacturers/suppliers
Petri Dish, Glass, Autoclavable Corning 3160-100
Pipet Aid Drummond 4-000-101 multiple manufacturers/suppliers
Shim disc McMaster-Carr VARIABLE multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 10 μl AvantGuard AV10R-H multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 1,000 μl AvantGuard AV1000 multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 20 μl AvantGuard AV20-H multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 200 μl AvantGuard AV200-H multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 10 ml Fisherbrand 13-676-10J multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 2 ml Fisherbrand 13-675-3C multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 25 ml Fisherbrand 13-676-10K multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 5 ml Fisherbrand 13-676-10H multiple manufacturers/suppliers
Sterilization Pouches, 19 x 33 cm Crosstex SCL multiple manufacturers/suppliers
Strainer, 40 µm BD Falcon 352340
Tissue Culture Dishes, 60 mm BD Falcon 351007
Tube Racks, Interlocking Four-Way Fisherbrand 03-448-17
Water Bath Fisherbrand S52602Q multiple manufacturers/suppliers
Neural Progenitor Cell-Specific Processing Reagents
Neural Stem Cell Expansion Medium (Stemline) Sigma-Aldrich S3194-500ML Important to use the Stemline brand
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) Millipore GF316 multiple manufacturers/suppliers
Recombinant Human Leukemia Inhibitory Factor (LIF) Millipore LIF1010 multiple manufacturers/suppliers
Trypan Blue (0.4%) Sigma-Aldrich T8154-100ML multiple manufacturers/suppliers
TrypLE Select (1x) Life Technologies 12563-011

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Erratum

Formal Correction: Erratum: A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue
Posted by JoVE Editors on 09/01/2014. Citeable Link.

A correction was made to A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue. The corresponding author was changed from:

Brandon C. Shelley

to:

Clive Svendsen

Une méthode d&#39;extension cGMP applicable pour les agrégats de neurones humains des cellules souches et progénitrices dérivées de cellules souches pluripotentes ou fœtale tissu cérébral
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Shelley, B. C., Gowing, G., Svendsen, C. N. A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue. J. Vis. Exp. (88), e51219, doi:10.3791/51219 (2014).More

Shelley, B. C., Gowing, G., Svendsen, C. N. A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue. J. Vis. Exp. (88), e51219, doi:10.3791/51219 (2014).

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