Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

En cGMP-relevant Expansion Metode for Aggregater of Human Neural Stem og stamceller avledet fra pluripotent stamceller eller Fetal hjernevev

Published: June 15, 2014 doi: 10.3791/51219
Automatic Translation
1, 1, 1
1Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center

ERRATUM NOTICE

Summary

Denne protokollen beskriver en ny mekanisk hakking metode som tillater utvidelse av sfæriske nevrale stamceller og progenitor-celleaggregater uten dissosiasjon til en enkelt cellesuspensjon. Opprettholde celle / celle kontakt tillater rask og stabil vekst i over 40 passasjer.

Abstract

En celle utvidelse teknikk for å samle et stort antall celler fra et enkelt eksemplar for forskningseksperimenter og kliniske studier ville være til stor nytte for stamcelle samfunnet. Mange nåværende ekspansjons metoder er arbeidskrevende og kostbart, og de som involverer komplett dissosiasjon kan føre til flere stamceller og stamcelletyper å gjennomgå differensiering eller tidlig senescens. For å overvinne disse problemene, har vi utviklet en automatisert mekanisk aging fremgangsmåte referert til som "chopping" som er enkel og billig. Denne teknikken unngår kjemisk eller enzymatisk dissosiasjon til enkeltceller og i stedet gjør det mulig for den store utvidelse av suspenderte, sfæroide kulturer som opprettholder konstant celle / celle-kontakt. Den hakking metoden har først og fremst blitt brukt for fosterets hjerne-avledet nevrale stamceller eller neurospheres, og har nylig blitt publisert for bruk med nevrale stamceller hentet fra embryonale og induserte pluripotente stamceller. Prosedyren involves seeding neurospheres på en vev kultur petriskål og senere passerer en skarp, steril kniv gjennom cellene effektivt automatisere kjedelige prosessen manuelt mekanisk dissociating hver sfære. Susp celler i kultur gir et gunstig areal-til-volum-forhold; som over 500.000 celler kan dyrkes i et enkelt neurosphere på mindre enn 0,5 mm i diameter. I en T175 kolbe, kan over 50 millioner celler vokse i suspensjonskulturer sammenlignet med bare 15 millioner i heft kulturer. Viktigere, har hakking prosedyren blitt brukt i henhold til gjeldende Good Manufacturing Practice (cGMP), som tillater masse mengde produksjon av klinisk-grade celleprodukter.

Introduction

Det er en lang historie med å utvide gnager nevrale stamceller i kultur som enten en monolayer 1-3 eller aggregerte neurospheres 4-7. I tillegg har humane nevrale stamceller (hNPCs) isolert fra ulike regioner i utviklingssentralnervesystemet 8-17 blitt utvidet in vitro. Disse cellene er bi-potent, i stand til å differensiere i begge astrocytter og nevroner og har vært et svært nyttig verktøy i å studere nevrale utvikling 18,19 og sykdomsmekanisme 20,21. hNPCs har også blitt transplantert inn i mange forskjellige dyremodeller av sentralnervesystemet sykdom med varierende grad av integrering, overlevelse og funksjonelle effekter 22-24.

Tradisjonelt er gnager eller humane føtale-avledet NPC utsatt for vekstfaktorer - ofte epidermal vekstfaktor (EGF) og / eller fibroblast vekstfaktor-2 (FGF-2) 25-28 - og både vedheftende 29 og tre-Dimensjonale sfæroide systemer er vanligvis passaged ved hjelp av enzymatisk dissosiasjon til en enkelt-cellesuspensjon 30-34. Standardmetoden for å utvide celler for forskning eller klinisk bruk er som en tilhenger monolayer grunnet enkel manipulasjon. Vi har imidlertid vist at aging monolayer og neurosphere hNPCs med enzymatisk eller kjemiske løsninger resulterte i tidlig senescence 35. I tillegg kan det enzymatiske dissosiasjon resultere i økte nivåer av differensiering og karyotypic abnormiteter basert på data vist med embryonale stamceller 36-38. Selv om standard metode for passering hNPCs har produsert strøm Good Manufacturing Practice (cGMP) grade produkter som har gått inn i fase 1 kliniske studier (Stem Cells Inc., Neuralstem Inc.), metoden kun tillatt et par runder celle forsterkning, noe som begrenser banktjenester potensial.

Åpenbart, kan store forskningseksperimenter og fremtidige kliniske studier dra nytte av muligheten tilforplante celler i bulk og med forsinket senescence å tillate store vekst og cellebanken. For å møte dette behovet, har vi utviklet en ny og automatisert måte mekanisk aging intakte neurospheres med "hakking" dem i små klynger for å opprettholde celle-til-celle kontakt. Denne metoden i stor grad økt deres levetid 39 og suspensjonskultur muliggjør en mer effektiv bruk av inkubator plass i forhold til monolagskulturer, som vist med en alternativ 3D bioreaktor kulturmetode 40.. Den medfølgende hakking protokollen åpner for produksjon av store banker fra en fosterprøve større enn passasje 10, en usannsynlig prestasjon ved hjelp av standard aging metoder. Selv om denne metoden for passering hNPCs er ukonvensjonell, er det vokser i popularitet og ble nylig publisert med andre celletyper som nevrale stamceller hentet fra humane embryonale og induserte pluripotente stamceller, slik at storskala ekspansjon for ulike bruksområder, inkludert i vitro sykdom modellering 41-46. Viktigere, har en cGMP-grade hNPC cellen bank allerede produsert med hogges metoden, viser at teknikken kan brukes mot fremtidige kliniske applikasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Etisk erklæringen og sikkerhet

  1. Denne fremgangsmåten innebærer bruk av cellekulturprodukter avledet fra mennesker eller dyr. Alle avledet vev må godkjennes før bruk av den aktuelle Institutional Review Board (e) og / eller Institutional Animal Care og bruk Committee (s).
  2. Må kastes alle bio-farlig avfall i henhold til sikkerhetsforskrifter besluttet av den respektive institusjon. Kjenne og følge alle de treffende sikkerhets-og avhendings retningslinjer gjennom hele denne prosedyren.

2. Utarbeidelse av utstyr, forsyninger, reagenser, og Observasjoner

  1. Forberedelse
    1. Skaff en glass petriskål, 8,5 cm filter papir sirkler og dobbelt-edge prep bladene.
    2. Legg et stykke filterpapir i petriskål og overføre flere unsheathed bladene på filterpapiret i petriskål.
    3. Gjentatte lag filterpapir og kniver til petriskål er omtrent 75% full, cover viddh petriskål lokket og autoklav. Oppbevar i en steril eller lukket miljø for å bevare steriliteten.
    4. Autoclave 18 cm pinsett og en autoklaver mutter-sjåfør i en sterilisering posen. For cGMP produksjon, autoklav flere rustfritt stål mellomleggsskiver i steriliseringsposer. For mer informasjon angående mellomlegg platen, se trinn 3.5.
    5. Rense bio-sikkerhetskabinett (BSC) med 70% isopropylalkohol (IPA).
    6. Alle arbeider skal utføres i en BSC for å opprettholde sterilitet. Overfør aseptisk følgende inn i BSC:
      1. McIlwain Tissue Chopper (helikopter). Tørk av alle flater med 70% IPA, spesielt helikopteret arm (Figur 1B). Hele helikopteret kan dekontamineres ved hjelp av etylen-oksyd ved behov.
      2. En autoklaveres mutter-driveren eller mutter-nøkkel (følger med helikopteret, Figur 1I), en 18 cm tang, ett sett med standard størrelse micropipettors (20 mL-1, 000 mL), ett pipetaid og tube racks.
      3. Sterile engangs serologiske pipetter barriere pipettespisser, 15 ml koniske rør, 60 mm petriskåler, double-edge prep kniver og riktig størrelse T kolber. FORSIKTIG: Bare håndtere skarpe kniver med en tang.
  2. Reagenser
    1. Utvid hNPCs i Vedlikehold Media (MM) som består av Neural Stem Cell Expansion Medium, EGF på 100 ng / ml og leukemi Inhibitory Factor (LIF) på 10 ng / ml. Overfør de reagenser og filtreringsenhet (er) som kreves for å lage mediet i BSC.
    2. Re-suspendere den frysetørrede EGF hjelp Neural Stem Cell Expansion Medium og forberede alikvoter på 100 mikrogram / ml til å lagre ved -80 ° C i inntil ett år. LIF er lagret som kjøpes ved 4 ° C i inntil seks måneder eller utløpsdatoen gitt av produsenten.
    3. Overfør MM reagenser inn i BSC. Kombiner alle reagenser i en passende dimensjonert filtreringsenheten og filter ved hjelp av et vakuumapparat. Oppbevar ved 4 ° C i opptil tre uker.
    4. hNPC Observasjoner
      1. De to viktigste faktorene for å løse før chopping er sfære diameter og media condition eller farge. Kondisjonert medium (CM) er definert som medium som er blitt metabolisert av hNPCs i kultur i henhold inkubatorbetingelser (37 ° C, 5% CO2, 95% luftfuktighet). Som cellene forbrenne media den fenolrødt komponenten vil skifte fra en rosa til gul farge som betegner et surere miljø (figur 5D).
      2. Hold flasken (e) av hNPCs opp mot lyset for å ta opp media farge (se diskusjon for detaljer).
      3. Scan gjennom kolben med et mikroskop for å observere cellene. Bruk en reticle å undersøke sfære størrelse. Ved mange kuler har en diameter på 300 um eller større, fortsette med hakkeprosessen. Hakk cellene hver 7-10 dager.
      4. Hvis en kotelett ikke er berettiget, utveksling 25-75% av CM med ferske media hver 3-4 dager, avhengig av hvor raskt cellene metabolizing media. Confortsette å utveksle media inntil kulene er stor nok til passasjen.
      5. hNPCs er vanligvis kappet i et forhold på 1:2, fra mindre til større kolber kolber. Bruk Tabell 1 som en referanse guide for kolbe størrelse og volum anbefalinger.
    2 T175s
    Flask Volum av totale media Pre-Chop → Post-Chop
    1 T12.5 5 ml 1 T12.5 → En T25
    En T25 10 ml En T25 → En T75
    En T75 20 ml En T75 → En T175
    En T175 40 ml En T175 → 2 T175s
    80 ml 2 T175s * → 4 T175s
    * 2 T175s er det maksimale antall kolber som kan hakket på en gang. Hakk i sett på 2 T175s og henviser til trinn 7.

    Tabell 1. HNPC utvidelse paradigme. Beskrivelse av en typisk utvidelse ordning for hNPCs. Det er vanlig å ekspandere to ganger volumetrisk hver 7-10 dager.

    Tre. Chopper Setup

    Figur 1
    Figur 1. McIlwain Tissue Chopper. A) Hakk tykkelse justering mikrometer, B) Chopper arm base og festet arm, C) Hekt på plate holder for petriskål, D) Tabell utløserknappen og brett, E) Blade kraft kontrollknappen, F) Reset bryteren, G) Plateholder, H) Bolt vedlegg for bladet, lås og mutter, jeg) Nut skiftenøkkel følger med chopper, J) Blad / lås mutter, K) Blade lås, L ) Automatisert hakking fartskontroll knott, M) manuell hakking arm drifts knott, N) Strømbryter.

    1. Plugg helikopteret inn i en stikkontakt i BSC og slå på strømbryteren (Figur 1N). Sett hogges avstanden til 200 mikrometer (Figur 1a). Sett bladet kraft til 270 ° eller 09:00 hvis knotten var en klokke (figur 1E). Bekrefte at den automatiske hastighetsknappen dreies så langt mot klokken som mulig. (Figur 1L).
    2. Beveg frigjøring tabell hele veien mot høyre bekrefte plateholderen er stabil (figur 1D).
    3. Roter manual arm manipulator klokken for å heve armen til sitt maksimale nivå (Figur 1M). Den manuelle arm manipulator må bare være rotert med klokken.
    4. Overfør aseptisk en steril, tveegget kniv for hakking på helikopteret arm bolten ved hjelp av en pinsett (figur 1H).
    5. Fylles trinnet for cGMP aging, som petriskål alene er tilstrekkelig for forsknings-grade-behandling. Som nevnt i punkt 2.1.4, er mellomleggsplater som er plassert på innsiden av petriskålen basen som kreves for cGMP. Mellomlegg plate hindrer plast skår fra innlemme i kulene under hakking prosedyren. For hver planlagt chop, overføre ett mellomlegg plate i bunnen av hver petriskål og deksel.
    6. Aseptisk plassere låsen (figur 1K) over bladet ved hjelp av tang. Det buede parti av låsen må være over den øvre kanten av armen. Låsen vil ikke bo på armen til mutteren har blitt sikkert formet. Bruk pinsett til å holde klasp inn på armen og fest mutteren (figur 1J) på bolten med steril mutter-driveren. La mutter en ¼ slå løs.

    4. Pre-chop Prosedyre

    1. Overfør den foreslåtte volum av MM i den nye kolben (s) i henhold til tabell 2, kolonne C.
    2. Aseptisk overføring av celler fra inkubatoren inn i BSC. Lean kolben (e) på et rør stativ (Figur 2A) og la kulene til å bosette seg i flasken (e).
    3. Når avgjort, suge opp til 12 ml av supernatanten med en 5 ml eller 10 ml serologisk pipette og skyll alle løst heftende kuler fra overflaten av kolben (s). Gjenta etter behov og bosette kulene mellom skyllinger.
    4. Overfør den foreslåtte volum CM i den nye kolben (s) i henhold til tabell 2, kolonne D. Hvis passering to eller flere T175 kolber, se trinn 7.1.
    5. Overfør all gjenværende CM og kuler inn i et nytt 15 ml konisk rør. La kulene til settle og kast den brukte kolben (s).
    6. Kritisk Step: Sakte overføre kulene fra 15 ml konisk rør på 60 mm petriskål eller mellomlegg plate i lavest mulig volum; 0,1-0,5 ml anbefales (figur 2B). Hold de resterende volum av CM som det vil bli brukt til å skylle cellene fra fatet post-chop. Prøv å redusere arealet dekket av media og kuler på fatet (figur 2C).

    Fig. 2
    Figur 2. Sphere forberedelse til hakking. A) Len kolbe (r) mot en tube stativ eller lignende element for å bosette kulene i hjørnet av kolben. B) Overfør kulene så tett som mulig fra den koniske røret til Petri parabolen. C) Pool kulene fra den koniske rør i tHan midten av petriskålen. D) fjerne så mye som mulig supernatant fra toppen av de sammenslåtte kuler. E) Spre kulene ut med siden av et plast mikropipette spiss. F) forsiktig bevege kulene til den ene siden av bassenget . G) Eksempel på kuler som har blitt flyttet til den ene siden av bassenget til rette for media fjerning. H) Kondensert kuler spredt ut på petriskål, klar for hakking. Klikk her for å se større bilde.

    1. Deretter kulene trenger å bli kondensert ved fjerning av supernatanten overført i trinn 4.6. Overfør supernatanten tilbake inn i 15 ml konisk rør med en aerosol-barriere-tippet mikropipette (figur 2D), unngå fjerning av kuler. Start med å fjerne så mye media som mulig fra toppen av media / celle bassenget. Når det ikke er muligå fjerne media uten kuler, fortsette til neste trinn.
    <td> 0 ml
    Kolonne A Kolonne B Kolonne C Kolonne D Kolonne E Kolonne F
    Pre-Chop Flask Size → Post-Chop Flask (s) Størrelse Forslag til volum av MM å overføre til ny kolbe (r) pre-chop Forslag til volum av CM å overføre til ny kolbe (r) pre-chop Forslag til volum av kuler / media å overføre til ny kolbe (r) etter chop Endelig Volume Seeded / Flask
    T12.5 → T25 5 ml 0 ml 5 ml 10 ml
    T25 → T75 10 ml 10 ml 20 ml
    T75 → T175 20 ml 10 ml 10 ml 40 ml
    En T175 → 2 T175s 20 ml per kolbe 15 ml per flaske 5 ml per flaske 40 ml
    2 T75s → 4 T175s 20 ml per kolbe 17,5 ml per flaske 2,5 ml per flaske 40 ml

    Tabell 2. Medieoverføring guide pre / post-chop. Foreslåtte volumer å bruke under hogges prosessen.

    1. Spre bassenget ved hjelp av på siden av pipettespiss for å øke overflatearealet (figur 2E).
    2. Kritisk Step: Tips petriskål litt mot deg og bruke den siden av pipette tips til forsiktig slide alle kulene til en side av bassenget (fig. 2F, G).
    3. Kritisk trinn: Når alle cellene er blitt flyttet, langsomt vippe petriskål motsatt retning. I løpet av prosessen, blir mediene alene strømme bort fra kulene. Overfør mediet i 15 ml konisk rør. Minimal sfære fjerning er akseptabelt.
    4. Bruk side av pipettespiss til skyv alle kulene tilbake til midten av petriskålen, slik at bassenget har en diameter på 0,5 til 2,4 cm (figur 2H). Det er viktig å holde dybden av kulen bassenget grunt. Hvis bassenget er for dypt, vil kulene bare bli skjøvet til side under hakking. MERK: Diameteren på kulen pool kan ikke være større enn 2,5 cm eller bladet vil kontakte kantene av petriskålen, manglende celler.

    5. Chop Prosedyre

    1. Overfør petriskål på tallerkenen holderen (Figur 1G) og sikre fateter sikret under plate holder kroker (figur 1C).
    2. Tabellen utløserknappen har hakk hvor det vil passe inn i gear. Bruk tabellen utløserknappen for å skyve plate holder til venstre slik at bladet er klar av kuler og låst i gir (figur 1D).
    3. Kritisk Step: Senk chopper arm ved å rotere den manuelle manipulator knotten (figur 1M) med urviseren til bladet smetter ned flatt på petriskål. Bruk en hånd til å trykke ned på armen mount (Figur 1B) mens du strammer mutteren med nutdriver.
    4. Trykk på reset-knappen én gang (figur 1F). Stabilpetriskål med en hånd mens du slår den automatiske arm manipulator knott (Figur 1L) med urviseren til 90 ° posisjon eller 12:00 hvis knotten var en klokke. FORSIKTIG: Hold fingrene vekk fra den bevegelige kniven til alle tider.
    5. Pass bladet fullt gjennom pool av kuler. Roter plateholderen90 °.
    6. Løsne bolten og gjenta trinn 05.03 til 05.05.
    7. Overfør aseptisk petriskål fra plateholderen på en arbeidsplass i BSC.

    6. Post-chop Prosedyre

    1. Prime en 10 ml serologisk pipette med CM i den koniske røret fra trinn 4,6 og deretter overføre en ml på de hakkede sfærer. Forsiktig re-suspendere og overføre til en ny 15 ml konisk tube. Unngå bobler og gjenta så mange ganger som nødvendig for å samle inn de hakkede sfærer.
      TIPS: Minimer skraping fatet som plast fragmenter kan løfte av. Dette er ikke et problem hvis du bruker rustfritt stål mellomleggsskiver. Pass av celler som knytter seg til innsiden av plast serologisk pipette. Hvis dette skjer, aspirer bobler periodevis gjennom media i pipetten til å løsne cellene.
    2. Måle volumet av CM og hakkede kuler. Tilsett passende mengde MM for å oppnå det volum som er oppført i tabell 2, kolonne E.
    3. Triturerkuler 2-3x for å bryte opp eventuelle løst kondenserte sfærer.
    4. Kritisk Step: delmengde sfæren suspensjonen i hver ny kolbe. Bare overføre sfæren suspensjonen i en kolbe i en tid, og re-suspendere kulene mellom overføringer. Aliquoting flere kolber i en tid resulterer i et uforholdsmessig stort antall kuler i hver kolbe. Det endelige volum i hver kolbe bør tilsvare volumene i tabell 2, kolonne F. Se trinn 7.2 ved såing av frø som er større enn to T175 kolber.
    5. Fjern mutteren med mutter-driveren og deretter låsen med steril pinsett. Dekontaminer hensiktsmessig med 70% IPA eller tilsvarende. FORSIKTIG: Fjern den brukte kniv for hakking bare med en tang og kast i en bio-fare beholder for skarpe gjenstander.
    6. Dekontaminér alle overflater av helikopteret med 70% IPA.

    . 7 Prosess Variations - Flere Parfyme

    Det er flere forskjeller når aging mer enn to T175s. Trinnets nedenfor er endringer i den refererte trinn.

    1. Referanser til trinn 4.4:
      1. Når passering to T175s, kombinere alle media og kuler i en T175 kolber. Tillate kulene å sedimentere, og deretter målt andel passende volum av CM i hver av de nye kolber som angitt i tabell 2, kolonne D. Fortsett til trinn 4.5.
      2. Når passering større enn to T175s, skaffe en ny T175 kolbe og etiketten som CM kolbe. Komplett steg 7.1.1 men overføre CM inn i CM kolbe. Oppbevar kolben på siden av den BSC som skal brukes til å samle CM fra alle kolbene inntil alle kolber er blitt kappet. Deretter CM bli likt alikvotert inn i hver av de nye kolber.
    2. Referanse steg 6,4 - Når hakking samme cellelinje flere ganger, overføre hakket sfære suspensjonen i en ny T75 kolbe merket kuler post-chop, og ta opp volumet overført. Fortsett å kombinere cellene i dennekolbe etter hvert kutt og lagre kolben i inkubatoren ved 37 ° C, 5% CO2, 95% luftfuktighet. Etter alle koteletter har blitt fullført, delmengde sfæren suspensjon i volum i hver ny kolbe. Gå videre til trinn 6.5.

    8. Kryopreservering

    Følgende protokoll er for cryogenically bevare hNPCs.

    1. Tin celle frysemedium i en ren vann-bad ved 37 ° C, og deretter lagres på is. Cell frysing medium kan alikvoteres og oppbevares ved -80 ˚ C i opp til seks måneder.
    2. Fyr polish glass Pasteur pipets ved å rotere åpningen av pipette i en flamme. Forbered minst to store og to små bore brann-polert pipets (figur 3). Kulene vil være skilt ved å flytte fra stor til liten diameter pipets.
    3. Plasser TrypLE Select i vannbad ved 37 ° C i 5 min. Ta ut og holde ved romtemperatur til den er klar til bruk.


    Brann-polering glass Figur 3. Pasteur pipets. A) Hold pipetten i den øverste delen av flammen og spinn for å jevnt rundt kantene på glass pipette. B) Eksempel på en grov brann-polert glass pipette. C) Eksempel på en liten bar brann-polert glass pipette.

    1. Overfør aseptisk de neurospheres inn i BSC. Tillate kulene å slå seg ved å lene kolben (s) mot et rør stativ og skyll bunnen av kolben for å fjerne eventuelle løst heftende kuler. La kulene til re-oppgjør.
    2. Overfør all men 5 til 10 ml av CM i en steril flaske og måle det totale volum. Plasser de resterende sfærer og medier i en konisk tube.
    3. Etter at alle cellene har avgjort, overføre alt, men en liten menisk av CM inn i flasken og summere den volume.
    4. Aseptisk overføring 5-10 ml varmet TrypLE Select inn i konisk rør og re-suspendere cellen pellet. Overfør konisk rør inn i 37 ° C vannbad i 15 til 20 min. Etter 7.5-10 min, rist forsiktig på konisk tube for å blande.
    5. Bruk målt CM volumet fra trinn 8.5 og forberede et likt volum av MM. Kombiner og filtrere 50% CM og 50% MM-løsning (CM / MM-løsning).
    6. Overfør aseptisk en 40 mikrometer sil inn i en 50 ml konisk tube.
    7. Når inkuberingen er fullført, spinne 15 ml koniske rør på 15 sekunder ved 100 x g.
    8. Nøye aspirer og kast TrypLE Velg og noen trevlet underlaget. Legg igjen en liten menisk. Tilsett 2 - 4 ml av CM / MM å fortynne de rester TrypLE Select mens ikke forstyrre pelleten. La noen løsnede celler som ble re-bosette før du kaster vask.
    9. Legg 2-5 ml CM / MM løsning på tube sfærer. Dissosiere kulene med en 5 ml pipette ved triturering av maksimalt 10x. La undissosiert kuler takke med 1-2 min. Overfør dissociated cellesuspensjonen på 40 mikrometer sil for å fjerne fullt undissociated klynger.
    10. Gjenta trinn 8.12 med en brann-polert grov glass pipette og deretter en liten bar glass pipette.
    11. Skyll silen med 2-5 ml av CM / MM løsning.
    12. Bland cellesuspensjonen og fjerne prøver for levedyktighet analyse.
    13. Fortynn prøvene med trypan blå ved en passende fortynningsfaktoren og telle. Bruk standard ligningen nedenfor for å beregne den gjennomsnittlige levedyktige cellekonsentrasjon og beregne den totale levedyktige celler.
      Ligning 1
    14. Beregn det totale volum av cellefrysemedier som kreves for å re-suspendere cellene på 5,0 x 10 6 celler / ml. 1 ml av cellene blir sådd i hver cryovial. Overfør cryovials inn i BSC.
    15. Sentrifuger cellesuspensjonen ved 200 xg i 5 min ved 4 ° C i 15 ml koniske rør for beste avkastning. Dersom 50 ml koniske rør blir brukt i en stor skala fryse ned, øker hastigheten og tiden til 400 xg i 10 min.
    16. Re-suspen cellepelleten ved hjelp av celle iskaldt medium ved 5,0 x 10 6 celler / ml. Delmengde 1 ml av cellesuspensjonen i hver cryovial. For en jevn fordeling, aspirer 6 ml av suspensjon og alikvot 5 cryovials x 1 ml. Overfør de resterende 1 ml av suspensjonen tilbake i bassenget av celler. Gjenta til alle ampuller har blitt fylt.
    17. Aseptisk forsegle alle seeded cryovials og overføre dem på is for 5-10 min.
    18. Bruk ett av følgende for nedfrysing strategier for å bevare hNPCs: Isopropanol Chamber
      1. Fyll det nødvendige antall kammer (e) med 100% IPA ved romtemperatur.
      2. Overfør seeded cryovials fra is inn i kammeret (er) og overfører den kammer (e) i en -80 ° C fryser over natten. Cellene er stabile i opp til en uke ved -80 ° C, mendet er foreslått å overføre ampullene til langsiktig flytende nitrogen oppbevaring neste dag.

      Kontrollert Rate Fryser

      1. Last et passende fryse program til kontrollert hastighet fryserens programvare. Et eksempel på program er angitt i tabell 3.. Figur 4 viser en typisk kurve for frysing hNPCs. Imidlertid vil den nøyaktige program variere for hver frysemodell. Standarden totale samplingsfrekvens bør være nær 1 ° C / min til n -40 ° C, hvor graden av frysing kan være vesentlig økt til minst -80 ° C.
    Trinn Rate (° C) Slutt Temperatur (° C) Hold (min sek) Trigger
    1 </ Td> - - 5 min 0 sek Kammer
    2 - 1,3 - 5 - Sample
    3 - - 1 min 0 sek Kammer
    4 - 45 - 58 - Kammer
    5 + 10 - 26 - Kammer
    6 + 3 - 23 - Kammer
    7 - 0,8 - 40 - Sample
    8 - 10 - 100 - Kammer
    9 - 35 - 160 - Kammer

    Tabell 3. Trinn for frysing hNPCs på en kontrollert rspiste fryser. Forslag til program for hNPC nedfrysing på en kontrollert hastighet fryser.

    Figur 4
    Figur 4. Sample frysekurve. Typisk frysekurve for hNPCs på en kontrollert hastighet fryser.

      1. Overfør cryovials fra isen i kurver forbundet med kontrollfrekvensen fryser. Sørg for å legge en cryovial med bare celle frysing media til bruk for prøven temperatursonde. Overfør kurvene inn i frysekammeret og plasser prøven sonde inn sonden hetteglasset. Start programmet.
      2. Når protokollen er ferdig, overfører de hetteglassene opp langsiktig flytende nitrogen oppbevaring.

    9. Tining Prosedyre

    Den følgende protokoll er for tining cryogenically preservert hNPCs.

    1. Overfør cryovials fra flytende nitrogen oppbevaring umiddelbart på tørris. FORSIKTIG: Glassflasker kan ha sprekker eller løse lokk slik at flytende nitrogen for å gå inn i hetteglasset. Når fjernes fra dypfrysingsemballasje forhold, kan væsken koker, umiddelbart eksploderende ampullen. Bruk riktig verneutstyr når du fjerner ampullene.
    2. Forbered alle reagenser og forbruksmateriell under forut for sin tid. Når tineprosessen har begynt, er det avgjørende å følge gjennom effektivt.
      1. Overfør Neural Stem Cell Expansion Medium, MM, en 15 ml konisk tube, en 2 ml og en 10 ml serologisk pipette for hver cryovial inn i BSC.
      2. Et minimum på 9 ml Neural stamcelleEkspansjons medium og 5 ml av MM kreves for hver ampulle. Forbered mer av hvert medium etter behov.
    3. Bare tine ett hetteglass med hNPCs om gangen. Overfør de frosne celler fra tørris i en ren 37 ° C vannbad og omrør i hetteglasset i vannbadet kontinuerlig. Overvåk volumet avis som har smeltet. Når det er et stykke is ca 0,5 cm igjen i hetteglasset, spray og tørk av med 70% isopropyl alkohol og overføre inn i BSC.
    4. Overfør innholdet i cryovial til et 15 ml konisk rør med en 2 ml serologisk pipette. Tilsett 1 ml av Neural Stem Cell Expansion Middels til den tomme cryovial og deretter overføre 8 ml av Neural Stem Cell Expansion Medium på de tinte celler i en langsom, slipp klok måte mens forsiktig risting røret. Dette gjøres for å minske risikoen for osmotisk sjokk.
    5. Overfør skylle fra cryovial til 9 ml av cellesuspensjon. Overfør den koniske rør på is og gjenta trinn 09.04 til 09.05 for alle gjenværende ampuller.
    6. Sentrifuger koniske rør ved 200 xg i 5 min ved 4 ° C. Under sentrifugering, forberede passende antall flasker for seeding basert på tabell 4.
    # Hetteglass Total Seeding Volum (ml) Flask
    1 5 T12.5
    2 10 T25
    3 15 T75
    4 20 T75
    5 25 T75
    6 30 T175
    7 35 T175
    8 40 T175
    8 + - Kombinasjon av Kolber

    Tabell 4.. Kolbe størrelser basert på antall cryovials tint. Forslag til volum og kolbe størrelse til frø hNPCs post-tine.

    1. Re-suspendere og kombinere alle rør på riktig volum av MM basert på Tabell 4. Bland godt og reflytte en prøve for levedyktighet telling. Se trinn 08.15 til 08.16 for å telle detaljer. Standarden seeding er mellom 160,000-320,000 celler / cm 2.
    2. Bland cellene godt og delmengde cellene i kolber. Overfør flaskene til en 5% CO 2/37 ° C/95% luftfuktighet inkubator. Bland kolben ved forsiktig risting fram og tilbake for å fordele cellene.
    3. Cellene vil danne kuler i løpet av 24-48 timer. Av og til cellene vil følge den plastoverflaten og danner en honeycomb-lignende koloni distribusjon. Hvis dette skjer, la cellene for tre dager før skylling cellene løs, hjelpe til sfære formasjon. Skyll hver 1-3 dager, inntil det ikke adherente celler. Om nødvendig kan overføre cellene til en ny kolbe.
    4. Utveksling 25-75% av media med MM hver 3-4 dager før cellene er klar til å hogge, vanligvis 7-14 dager etter tining.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 5
Figur 5. Representative data. A) Estimerte celletallet fra hNPCs frosset på p19, deretter tint og utvidet som en tilhenger monolayer hjelp enzymatisk dissosiasjon sammenlignet neurospheres passaged via hogges metoden. Dag 0 representerer når cellene ble tint ved p20. B) Representative bilder av kuler pre-chop, 10X. C) Representative bilder av kuler post-chop, 10X. D) Color swatch brukt for å beskrive omfanget av medie condition i cGMP- sammenlign protokoller. E) Immunocytochemistry av tinte P29 hNPCs som ble belagt for en dag og farget for nestin (rød) uttrykk. Hoechst atom teller flekken (blå). F) Immunocytochemistry av tinte P29 hNPCs som ble belagt for 7 dager og beised for GFAP (Red) og β-III tubulin (grønn). Klikk her for å se større bilde.

Figur 5A representerer hNPCs tint på p20 (dag 0) og vedlikeholdt tilhenger til Laminin belagt vevskulturflasker eller som ikke-heft neurospheres passaged via hogges metoden. De heftende celler ble enzymatisk dissosiert ved hjelp TrypLE Velg ukentlig og senesced etter 70 dager (7-10 passasjer) i kultur. I kontrast til neurospheres tint ved passering 20 og utvidede via hogges teknikk vokste i mer enn 40 passeringer før senescence. Typiske hNPCs før hakking (Figur 5B) bør være mest ≥ 300 mikrometer i diameter. Når hakket, er kulene som regel partert i variabelt størrelse seksjoner, for det meste ca 200 pm i diameter (figur 5C). Det er viktig å merke seg at hNPCs ekspandert via Chopping metode opprettholde uttrykk for hNPC markører og kan produsere både astrocytter og nevroner post-differensiering. Sene passasje hNPCs ble dissosiert, platet ut på laminin-belagte dekkglass i et tidsrom på en eller syv dager og deretter fiksert med 4% paraformaldehyd. De hNPCs uttrykker stamcelle markør nestin (Millipore, 1:1.000) på en dag belagt hNPCs (figur 5E) samt differensierte nevrale markører glial fibrillary surt protein (GFAP, 1:500) og β-III tubulin (1: 2000) på de syv dagsbelagt hNPCs (figur 5F), markører for astrocytter og umodne nerveceller, henholdsvis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Figur 6
Figur 6. Skjære Skjematisk. Utvide spheroid stilk / stamceller i kultur ved hjelp av den mekaniske hakking metoden.

Kritiske Steps

En oversikt over hogges utvidelse paradigmet er vist i figur 6. HNPC sfære størrelse er en av de viktigste kriteriene for å observere før passering de neurospheres. Selv om det er en stor variasjon i sfære størrelse, bør minst 30% av kulene ha en diameter som er større enn 300 um. Hvis kulene er for små til passasje, er det bare utveksle CM med frisk MM (25% -50%) og re-evaluere etter 1-4 dager. Dårlig ekspansjon priser oppstå når kulene passeres ved for liten i diameter.

hNPC ekspansjons priser er også avhengig sfære tetthet og medie conditioning grunn utskilt faktorer 47. Men hvis media er altfor metaboliseres og viktige vekstfaktorer er redusert, kan cellene få en karyotypically unormal cellepopulasjon 48. Derfor må erstatte næringsstoffer og vekstfaktorer balanseres med utskilling trofiske faktorer. Når seeding hNPCs post-chop eller post-tine, er antall neurospheres per cm 3 av media variabel. Imidlertid er generelt den høyere tettheten er, jo raskere mediet vil tilstanden og jo høyere ekspansjonshastighet, forutsatt at mediet utveksles når det er nødvendig. Bruk media-condition fargespekteret (figur 5D), som spenner fra rosa når un-metabolisert, til gul når media har blitt fullstendig metabolisert. Den ideelle media farge for logaritmisk vekst er en rødoransje farge, nr. 3 på fargeprøven. Dette indikerer media inneholder tilstrekkelig næringsstoffer og vekstfaktorer og samtidig opprettholde en tilstrekkelig konsentrasjon av utskilt trophic faktorer. Mediene bør ikke tilstanden forbi # 4 på fargeprøven. Alternativt, når cellene ikke er metabolizing media raskt (# 1 på fargekartet), vil de hNPCs vokse tregere og krever en kotelett hver 10-20 dager i motsetning til hver 7-10 dager. Det er viktig å øke kultur tetthet å øke condition, noe som igjen vil øke ekspansjon priser.

Under hakking prosedyren være oppmerksom på følgende kritiske trinn. Kontroller at skiven er installert parallelt med helikopteret arm. Hvis skiven ikke er flat på overflaten av petriskålen eller mellomleggsplaten, kan mange kuler ikke hakket. Merk spredning av celler diskutert i trinn 4.11. Kulene må forbli i midten av petriskålen, eller bladet vil kontakte veggen før alle kulene er blitt kappet. Til slutt er det viktig å unngå tørking av hNPCs for en lengre tidsperiode i løpet av hakkeprosessen. Etter å plassere kuler i fatet, hogge og flom dem med fersk media så snartmulig.

Da denne teknikk krever flere deler av utstyret, kan det være risiko for sterilitet av kulturen. Gitt denne risikoen, må riktig steril teknikk brukes gjennom hele prosedyren. For grunnleggende forskning produksjonsnivå, tørke ned alt utstyr med 70% IPA eller tilsvarende er tilstrekkelig sammen med valgfrie ultrafiolett inkubering i minst 15 min. Utføre alle trinn inne i en steril BSC. For cGMP produksjonsnivå, må kutteren steriliseres med etylenoksid som foreslått av produsenten. Alle andre forsyninger kan kjøpes steril eller autoklaveres.

Fremtidige Applications

Overgangen av noen grunnleggende forskning terapi fra benken til sengen kan være en utfordring. Den hakking prosedyren ble designet med denne overgangen i tankene. Prosedyren har allerede blitt brukt til å produsere en cGMP-kompatibel hNPC bank ved University of Wisconsin Waisman senter Bio-produksjonsanlegg. That hNPC bank ble hentet for utvidelse av et farmasøytisk-grade hNPC celle mye som vil bli brukt til nye pre-utforsk narkotika studier og en fase 1 klinisk studie etter Federal Drug Administration godkjenning. Det finnes andre celler typer som bruker denne fremgangsmåten for ekspansjon. Et eksempel er EZ sfærer, nevrale stamceller generert fra pluripotent stamceller 41. Denne teknikken har et stort potensiale for bruk med andre typer vev som krever konstant celle-til-celle-kontakt under ekspansjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Soshana Svendsen for kritisk gjennomgang og redigering av denne rapporten. Dette arbeidet ble bidratt til av NIH / ninds 1U24NS078370-01 og CIRM DR2A-05320.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beaker, 50 ml Fisherbrand FB-100-50 multiple manufacturers/suppliers
Bio-Safety Cabinet, class II Baker SG-603A 4 ft. or 6 ft. model.  6 ft. model recommended; multiple manufacturers/suppliers
Blades, Double-edge Prep Personna 74-0002 multiple manufacturers/suppliers.  CAUTION: Sharp
Cell Freezing Media Sigma-Aldrich C6295-50ML DMSO, serum-free
Centrifuge, swing-bucket with 15 ml inserts Eppendorf 5810 R multiple manufacturers/suppliers
Conical Tubes, 15 ml Fisherbrand S50712 multiple manufacturers/suppliers
Conical Tubes, 50 ml BD Falcon 352074 multiple manufacturers/suppliers
Controlled Rate Freezer Planer Kryo 750 multiple manufacturers/suppliers
Cryovials, 2 ml Corning 430488 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T12.5 BD Falcon 353107 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T25 BD Falcon 353081 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T175 BD Falcon 353045 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T75  BD Falcon 353110 multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 1 L Millipore SCGPU11RE multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 150 ml Millipore SCGVU01RE multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 500 ml Millipore SCGPU05RE multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 50 ml Millipore SCGP00525 multiple manufacturers/suppliers
Filter Paper, 8.5 cm circles Whatman/GE 1001-085
Forceps, Standard Pattern - Serrated/Curved/18 cm Fine Science Tools 11001-18
Freezing Chamber, Isopropyl Alcohol Nalgene 5100-0001 "Mr. Frosty"
Incubator, 37 °C/5% CO2 Forma 370 series multiple manufacturers/suppliers
Hemacytometer, Phase Hausser Scientific 1475 multiple manufacturers/suppliers
McIlwain Tissue Chopper Lafayette Instruments TC752-PD  Petri dish modification required.   CAUTION:  Moving, sharp blade.
Micropipettor, 1-10 μl Gilson F144562 multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 100-1,000 μl (starter kit) Gilson F167700 multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 2-20 μl (starter kit) Gilson F167700 multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 20-200 μl (starter kit) Gilson F167700 multiple manufacturers/suppliers
Nutdriver, Autoclavable, 5/16" Steritool 10302
Pasteur Pipets, cotton-plugged Fisherbrand 13-678-8B multiple manufacturers/suppliers
Petri Dish, Glass, Autoclavable Corning 3160-100
Pipet Aid Drummond 4-000-101 multiple manufacturers/suppliers
Shim disc McMaster-Carr VARIABLE multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 10 μl AvantGuard AV10R-H multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 1,000 μl AvantGuard AV1000 multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 20 μl AvantGuard AV20-H multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 200 μl AvantGuard AV200-H multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 10 ml Fisherbrand 13-676-10J multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 2 ml Fisherbrand 13-675-3C multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 25 ml Fisherbrand 13-676-10K multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 5 ml Fisherbrand 13-676-10H multiple manufacturers/suppliers
Sterilization Pouches, 19 x 33 cm Crosstex SCL multiple manufacturers/suppliers
Strainer, 40 µm BD Falcon 352340
Tissue Culture Dishes, 60 mm BD Falcon 351007
Tube Racks, Interlocking Four-Way Fisherbrand 03-448-17
Water Bath Fisherbrand S52602Q multiple manufacturers/suppliers
Neural Progenitor Cell-Specific Processing Reagents
Neural Stem Cell Expansion Medium (Stemline) Sigma-Aldrich S3194-500ML Important to use the Stemline brand
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) Millipore GF316 multiple manufacturers/suppliers
Recombinant Human Leukemia Inhibitory Factor (LIF) Millipore LIF1010 multiple manufacturers/suppliers
Trypan Blue (0.4%) Sigma-Aldrich T8154-100ML multiple manufacturers/suppliers
TrypLE Select (1x) Life Technologies 12563-011

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cattaneo, E., McKay, R. Proliferation and differentiation of neuronal stem cells regulated by nerve growth factor. Nature. 347, 762-765 (1990).
  2. Palmer, T. D., Takahashi, J., Gage, F. H. The adult rat hippocampus contains primordial neural stem cells. Molecular and cellular neurosciences. 8, 389-404 (1997).
  3. Wu, Y., Liu, Y., Chesnut, J. D., Rao, M. S. Isolation of neural stem and precursor cells from rodent tissue. Methods in molecular biology. , 438-4339 (2008).
  4. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  5. Svendsen, C. N., Fawcett, J. W., Bentlage, C., Dunnett, S. B. Increased survival of rat EGF-generated CNS precursor cells using B27 supplemented medium. Experimental brain research. Experimentelle Hirnforschung. Experimentation cerebrale. , 102-407 (1995).
  6. Laywell, E. D., Kukekov, V. G., Steindler, D. A. Multipotent neurospheres can be derived from forebrain subependymal zone and spinal cord of adult mice after protracted postmortem intervals. Experimental neurology. , 156-430 (1999).
  7. Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. 45 (45), (2010).
  8. Temple, S. Division and differentiation of isolated CNS blast cells in microculture. Nature. 340, 471-473 (1989).
  9. Chalmers-Redman, R. M., Priestley, T., Kemp, J. A., Fine, A. In vitro propagation and inducible differentiation of multipotential progenitor cells from human fetal brain. Neuroscience. 76, 1121-1128 (1997).
  10. Ostenfeld, T., et al. Regional specification of rodent and human neurospheres. Brain research. Developmental brain research. 134, 43-55 (2002).
  11. Carpenter, M. K., et al. et al. In vitro expansion of a multipotent population of human neural progenitor cells. Experimental neurology. 158, 265-278 (1999).
  12. Nunes, M. C., et al. Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain. Nature. 9, 439-447 (2003).
  13. Piao, J. H., et al. Cellular composition of long-term human spinal cord- and forebrain-derived neurosphere cultures. Journal of neuroscience research. 84, 471-482 (2006).
  14. Barami, K., Zhao, J., Diaz, F. G., Lyman, W. D. Comparison of neural precursor cell fate in second trimester human brain and spinal cord. Neurological research. 23, 260-266 (2001).
  15. Walder, S., Ferretti, P. Distinct neural precursors in the developing human spinal cord. The International journal of developmental biology. 48, 671-674 (2004).
  16. Buc-Caron, M. H. Neuroepithelial progenitor cells explanted from human fetal brain proliferate and differentiate in vitro. Neurobiology of. 2, 37-47 (1995).
  17. Becq, H., Jorquera, I., Ben-Ari, Y., Weiss, S., Represa, A. Differential properties of dentate gyrus and CA1 neural precursors. Journal of. 62, 243-261 (2005).
  18. Keenan, T. M., Nelson, A. D., Grinager, J. R., Thelen, J. C., Svendsen, C. N. Real time imaging of human progenitor neurogenesis. PloS one. 5, (2010).
  19. Kim, H. J., McMillan, E., Han, F., Svendsen, C. N. Regionally specified human neural progenitor cells derived from the mesencephalon and forebrain undergo increased neurogenesis following overexpression of ASCL1. Stem cells. 27, 390-398 (2009).
  20. Windrem, M. S., et al. Neonatal chimerization with human glial progenitor cells can both remyelinate and rescue the otherwise lethally hypomyelinated shiverer mouse. Cell stem cell. 2, 553-565 (2008).
  21. Kitiyanant, N., Kitiyanant, Y., Svendsen, C. N., Thangnipon, W. B. D. N. F. - IGF-1- and GDNF-secreting human neural progenitor cells rescue amyloid beta-induced toxicity in cultured rat septal neurons. Neurochemical research. 37, 143-152 (2012).
  22. Dutta, S., et al. Cell therapy: the final frontier for treatment of neurological diseases. CNS neuroscience & therapeutics. 19, 5-11 (2013).
  23. Lindvall, O., Barker, R. A., Brustle, O., Isacson, O., Svendsen, C. N. Clinical translation of stem cells in neurodegenerative disorders. Cell stem cell. 10, 151-155 (2012).
  24. Wang, S., et al. Long-term vision rescue by human neural progenitors in a rat model of photoreceptor degeneration. Investigative ophthalmology & visual science. 49, 3201-3206 (2008).
  25. Kitchens, D. L., Snyder, E. Y., Gottlieb, D. I. FGF and EGF are mitogens for immortalized neural progenitors. Journal of. 25, 797-807 (1994).
  26. Craig, C. G., et al. In vivo growth factor expansion of endogenous subependymal neural precursor cell populations in the adult mouse brain. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 2649-2658 (1996).
  27. Ciccolini, F., Svendsen, C. N. Fibroblast growth factor 2 (FGF-2) promotes acquisition of epidermal growth factor (EGF) responsiveness in mouse striatal precursor cells: identification of neural precursors responding to both EGF and FGF-2. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 18, 7869-7880 (1998).
  28. Kelly, C. M., et al. EGF and FGF-2 responsiveness of rat and mouse neural precursors derived from the embryonic CNS. Brain research bulletin. 68, 83-94 (2005).
  29. Sun, Y., et al. Long-term tripotent differentiation capacity of human neural stem (NS) cells in adherent culture. Molecular and cellular neurosciences. 38, 245-258 (2008).
  30. Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells. Neuron. 11, 951-966 (1993).
  31. Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 1091-1100 (1996).
  32. Chojnacki, A., Weiss, S. Production of neurons, astrocytes and oligodendrocytes from mammalian CNS stem cells. Nature. 3, 935-940 (2008).
  33. Ferrari, D., Binda, E., De Filippis, L., Vescovi, A. L. Isolation of neural stem cells from neural tissues using the neurosphere technique. Current protocols in stem cell biology. Chapter. 2, 10-1002 (2010).
  34. Ebert, A. D., McMillan, E. L., Svendsen, C. N. Isolating, expanding, and infecting human and rodent fetal neural progenitor cells. Current protocols in stem cell biology. Chapter 2, Unit 2D 2, doi:10.1002/9780470151808.sc02d02s6. , (2008).
  35. Svendsen, C. N., et al. Long-term survival of human central nervous system progenitor cells transplanted into a rat model of Parkinson's disease. Experimental neurology. 148, 135-146 (1997).
  36. Draper, J. S., et al. Recurrent gain of chromosomes 17q and 12 in cultured human embryonic stem cells. Nature. 22, 53-54 (2004).
  37. Buzzard, J. J., Gough, N. M., Crook, J. M., Colman, A. Karyotype of human ES cells during extended culture. Nature biotechnology. 22, 381-382; author reply 382. , 10-1038 (2004).
  38. Mitalipova, M. M., et al. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nature. 23, 10-1038 Forthcoming.
  39. Svendsen, C. N., et al. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. Journal of neuroscience. 85, 141-152 (1998).
  40. Baghbaderani, B. A., Mukhida, K., Hong, M., Mendez, I., Behie, L. A. A review of bioreactor protocols for human neural precursor cell expansion in preparation for clinical trials. Current stem cell research & therapy. 6, 229-254 (2011).
  41. Ebert, A. D., et al. EZ spheres: A stable and expandable culture system for the generation of pre-rosette multipotent stem cells from human ESCs and iPSCs. Stem cell research. 10, 417-427 (2013).
  42. Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
  43. Consortium, H. D. iP. S. C. Induced pluripotent stem cells from patients with Huntington's disease show CAG-repeat-expansion-associated phenotypes. Cell stem cell. 11, 264-278 (2012).
  44. Gamm, D. M., Nelson, A. D., Svendsen, C. N. Human retinal progenitor cells grown as neurospheres demonstrate time-dependent changes in neuronal and glial cell fate potential. Annals of the New York Academy of Sciences. , 1049-10107 (2005).
  45. Hosoyama, T., Meyer, M. G., Krakora, D., Suzuki, M. Isolation and in vitro propagation of human skeletal muscle progenitor cells from fetal muscle. Cell biology international. 37, 191-196 (2013).
  46. Sareen, D., et al. Inhibition of apoptosis blocks human motor neuron cell death in a stem cell model of spinal muscular atrophy. PloS one. 7, (2012).
  47. Chang, M. Y., Park, C. H., Lee, S. H. Embryonic cortical stem cells secrete diffusible factors to enhance their survival. Neuroreport. 14, 1191-1195 (2003).
  48. Sareen, D., et al. Chromosome 7 and 19 trisomy in cultured human neural progenitor cells. PloS one. 4, (2009).

Tags

Neuroscience nevrale stamceller nevrale forløper celle nevrale stamceller aging neurosphere hakking stamcelle nevrovitenskap suspensjon kultur god tilvirkningspraksis GMP

Erratum

Formal Correction: Erratum: A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue
Posted by JoVE Editors on 09/01/2014. Citeable Link.

A correction was made to A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue. The corresponding author was changed from:

Brandon C. Shelley

to:

Clive Svendsen

En cGMP-relevant Expansion Metode for Aggregater of Human Neural Stem og stamceller avledet fra pluripotent stamceller eller Fetal hjernevev
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shelley, B. C., Gowing, G.,… More

Shelley, B. C., Gowing, G., Svendsen, C. N. A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue. J. Vis. Exp. (88), e51219, doi:10.3791/51219 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter