Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

En cGMP-tillämplig Expansion Metod för aggregat av mänskliga neurala Stem och stamceller härledas från pluripotenta stamceller eller fosterhjärnvävnad

Published: June 15, 2014 doi: 10.3791/51219
Automatic Translation
1, 1, 1
1Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center

ERRATUM NOTICE

Summary

Detta protokoll beskriver en ny mekanisk hackmetod som tillåter att expansionen av sfäriska neurala stam-och stamfadercellaggregat utan dissociation till en enkelcellsuspension. Att upprätthålla cell / cell kontakt möjliggör snabb och stabil tillväxt i över 40 passager.

Abstract

En utbyggnad cell teknik för att samla ett stort antal celler från en provkropp för forskningsexperiment och kliniska prövningar skulle ha stor nytta av stamcells samhället. Många nuvarande expansionsmetoder är arbetskrävande och kostsamma, och de som involverar fullständig dissociation kan orsaka flera stam-och stamfader celltyper att genomgå differentiering eller tidigt åldrande. För att övervinna dessa problem har vi utvecklat en automatiserad mekanisk aging metod kallad "hackning", som är enkel och billig. Denna teknik undviker kemisk eller enzymatisk dissociation i enskilda celler och i stället möjliggör storskalig utbyggnad av suspenderade, sfäroida kulturer som upprätthåller konstant cell / cell kontakt. Den hack Metoden har främst använts för fetala hjärn-härledda neurala stamceller eller neurosfärer, och har nyligen publicerats för användning med neurala stamceller från foster och inducerade pluripotenta stamceller. Proceduren involverares sådd neurospheres på en vävnadsodling petriskål och därefter passera en skarp, steril blad genom cellerna effektivt automatisera den tråkiga processen att manuellt mekaniskt dissociera varje sfär. Att avbryta celler i odling ger en gynnsam ytarea-till-volymförhållande; som över 500.000 celler kan odlas i en enda neurosfär som är mindre än 0,5 mm i diameter. I en T175 kolv, kan över 50 miljoner celler växa i suspensionskulturer jämfört med endast 15 miljoner i vidhäftande kulturer. Huvudsakligen har det hugga förfarande använts enligt gällande god tillverkningssed (cGMP), som möjliggör massproduktion av cellprodukter klinisk kvalitet kvantitet.

Introduction

Det finns en lång historia av att expandera gnagare neurala stamceller i kultur som antingen en monolager 1-3 eller aggregerade neurospheres 4-7. Vidare har humana neurala stamceller (hNPCs) som isolerats från olika regioner i utvecklings centrala nervsystemet 8-17 expanderats in vitro. Dessa celler är bi-potenta, förmåga att differentiera till både astrocyter och nervceller och har varit ett mycket användbart verktyg för att studera neurala utveckling 18,19 och sjukdomsmekanism 20,21. hNPCs har också transplanterats in i flera olika djurmodeller av centrala nervsystemet med olika nivåer av integration, överlevnad och funktionella effekter 22-24.

Traditionellt är gnagare eller humana fetala härledda NPC exponeras för tillväxtfaktorer - ofta epidermal tillväxtfaktor (EGF) och / eller fibroblasttillväxtfaktor-2 (FGF-2) 25 till 28 - och både vidhäftande 29 och tre-Dimension sfäroida system typiskt passe använder enzymatisk dissociation i en encelliga suspension 30-34. Standardmetoden för att expandera celler för forskning eller klinisk användning är som anhängare monolager på grund av enkel hantering. Vi har dock visat att passaging monolager och neurosfär hNPCs med enzymatiska eller kemiska lösningar resulterade i tidiga åldrande 35. Dessutom kan enzymatisk dissociation leda till ökade nivåer av differentiering och karyotypic avvikelser baserade på data visade med embryonala stamceller 36-38. Även standardmetod aging hNPCs har producerat ström god tillverkningssed (cGMP) kvalitet produkter som har gått in i fas 1 kliniska prövningar (Stem Cells Inc., Neuralstem Inc.), tillåts metoden bara några rundor av cell förstärkning, vilket begränsar bank potential.

Uppenbarligen kan stora forskningsexperiment och framtida kliniska försök dra nytta av möjligheten attföröka celler i bulk och med fördröjd åldrande att tillåta storskalig tillväxt och cellbanker. För att möta detta behov har vi utvecklat en ny och automatiserad sätt att mekaniskt aging intakta neurospheres med "hugga" dem i små grupper för att upprätthålla cell-till-cell kontakt. Denna metod kraftigt ökat deras livslängd 39 och suspensionskultur medger en mer effektiv användning av inkubatorn utrymme jämfört med monolagerkulturer, som sett med en alternativ 3D bioreaktor odlingsmetoden 40. Den tillhandahålls hack protokollet medger produktion av stora banker från ett foster prov större än passage 10, en osannolik bedrift med vanliga passaging metoder. Även om denna metod för passaging hNPCs är okonventionell, är det växer i popularitet och har nyligen publicerade med andra celltyper, t.ex. neurala stamceller från mänskliga embryonala och inducerade pluripotenta stamceller, som möjliggör storskalig utbyggnad för olika tillämpningar, inklusive i vITRO sjukdom modellering 41-46. Huvudsakligen har en cGMP-grade hNPC cellbank som redan tagits fram med huggmetoden, vilket visar att tekniken kan användas mot framtida kliniska applikationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Etiska riktlinjer och säkerhet

  1. Detta förfarande innefattar användning av cellkulturprodukter som härrör från människor eller djur. Alla härledda vävnader måste godkännas före användning av lämplig Institutional Review Board (er) och / eller Institutional Animal Care och användning kommittén (s).
  2. Allt biologiskt farligt avfall skall tas om hand i enlighet med säkerhetsföreskrifter beslutas av respektive institution. Känna till och följa alla de träffande säkerhet och bortskaffande riktlinjer under hela detta förfarande.

2. Framställning av utrustning, tillbehör, reagenser och observationer

  1. Framställning
    1. Skaffa ett glas petriskål, 8,5 cm filterpapper cirklar och dubbelkant prep knivar.
    2. Placera en bit filterpapper i petriskålen och överföra flera unsheathed blad på filterpapper i petriskålen.
    3. Upprepade lager filterpapper och bladen så petriskålen är ungefär 75% fullt, täck kvickheth petriskålens lock och autoklav. Förvara i en steril eller sluten miljö för att bevara steriliteten.
    4. Autoklav 18 cm pincett och en autoklaverbar mutter-förare i en steriliseringspåse. För cGMP produktion, autoklav flera rostfria shims skivor i Steriliseringspåsar. För mer information om mellanläggsskivan, se steg 3.5.
    5. Desinficera biosäkerhet skåp (BSC) med 70% isopropylalkohol (IPA).
    6. Alla procedurer måste utföras i ett BSC för att bibehålla sterilitet. Överför aseptiskt följande i BSC:
      1. McIlwain Tissue Chopper (chopper). Torka av alla ytor med 70% IPA, speciellt helikoptern armen (Figur 1B). Hela chopper kan saneras med hjälp av etylenoxid vid behov.
      2. En autoklaveras nut-förare eller mutter-nyckel (medföljer helikoptern, figur 1I), en 18 cm tång, en uppsättning standardstorlek micro (20 pl-1, 000 l), en pipetaid och rör rack.
      3. Sterila engångs serologiska pipetter, barriär pipettspetsar, 15 ml koniska rör, 60 mm petriskålar, dubbelkant prep knivar och lämplig storlek T-kolvar. VARNING: Endast hantera vassa blad med en tång.
  2. Reagens
    1. Expandera hNPCs i underhålls Media (MM) som består av Neural Stem Cell Expansion Medium, EGF vid 100 ng / ml och leukemi hämmande faktor (LIF) på 10 ng / ml. Överför reagenser och filtreringsanordning (ar) som krävs för att förbereda material i BSC.
    2. Återsuspendera den lyofiliserade EGF med användning av neurala stamcellsexpansionsmedium och förbereda alikvoter vid 100 | ig / ml för att lagra vid -80 ° C i upp till 1 år. LIF lagras som köpt vid 4 ° C i upp till 6 månader eller utgångsdatum som anges av tillverkaren.
    3. Överför MM reagenser in i BSC. Kombinera alla reagenser i en lämplig storlek filtreringsenhet och filter med hjälp av en vakuumapparat. Förvaras vid 4 ° C i upp till 3 veckor.
    4. hNPC Iakttagelser
      1. De två viktigaste faktorerna för att ta itu med innan hackning är sfären diameter och media konditionering eller färg. Konditionerat medium (CM) definieras som medium som har metaboliseras av hNPCs i kultur under inkubatorbetingelser (37 ° C, 5% CO2, 95% fuktighet). Eftersom cellerna metaboliserar media fenolrött komponenten kommer att skifta från en rosa till gul färg betecknar en surare miljö (figur 5D).
      2. Håll kolven (er) av hNPCs upp mot ljuset för att hantera media färg (se diskussion för detaljer).
      3. Scan genom kolven med ett mikroskop för att observera cellerna. Använd ett riktmedel för att undersöka sfär storlek. Om många sfärerna ha en diameter av 300 um eller större, fortsätt med huggprocessen. Chop cellerna var 7-10 dagar.
      4. Om en hacka inte är motiverat, utbyte 25-75% av CM med färskt medium var 3-4 dagar beroende på hur snabbt cellerna metaboliserar media. Konfortsätta att utbyta media tills sfärerna är tillräckligt stor för att passagen.
      5. hNPCs vanligtvis hackas i förhållandet 1:2, från mindre kolvar till större kolvar. Använd Tabell 1 som en referens för kolv storlek och volym rekommendationer.
    2 T175s
    Flask Volymen av de totala medie Pre-Chop → Post-Chop
    En T12.5 5 ml En T12.5 → 1 T25
    1 T25 10 ml 1 T25 → 1 T75
    1 T75 20 ml 1 T75 → En T175
    En T175 40 ml En T175 → 2 T175s
    80 ml 2 T175s * → 4 T175s
    * 2 T175s är det maximala antalet kolvar som kan hackade i taget. Hacka i set om 2 T175s och hänvisar till steg 7.

    Tabell 1. HNPC expansionen paradigm. Beskrivning av en typisk expansionssystem för hNPCs. Det är standard att bygga ut två gånger volymetriskt var 7-10 dagar.

    3. Chopper Setup

    Figur 1
    Figur 1. McIlwain Tissue Chopper. A) Hacka tjocklek justering mikrometer, B) Chopper arm basen och fäst arm, C) Haka på hållare för petriskål, D) Bords frikopplingsvredet och fack, E) Klingkraft vredet, F) Reset switch, G) Plate hållare, H) Bultfäste för blad, lås och mutter, jag) Nut nyckel medföljer chopper, J) Blad / låsmuttern, K) Blade lås, L ) Automatiserad hackhastighetsreglaget, M) manuell hack arm drifts knopp, N) Strömbrytare.

    1. Anslut helikoptern till ett uttag i BSC och slå på strömbrytaren (figur 1N). Ställ huggavstånd till 200 ^ m (Figur 1A). Ställ bladkraften till 270 ° eller 09:00 om ratten var en klocka (figur 1E). Kontrollera att den automatiska hastighetsvredet vrids så långt moturs som möjligt. (Figur 1L).
    2. Flytta tabellen aren hela vägen till höger bekräftar hållare är stabil (Figur 1D).
    3. Rotera verkal arm manipulator medurs för att höja armen till sin högsta nivå (figur 1M). Den manuella armen manipulator får endast vridas medsols.
    4. Överför aseptiskt en steril, tveeggat hackbladet på chopper armen bulten med hjälp av en pincett (figur 1H).
    5. Utföra det här steget för cGMP aging, som petriskålen ensamt är tillräckligt för forskning-grade bearbetning. Som påpekas i steg 2.1.4, är mellanläggsskivor som placeras inne i petriskålen bas som krävs för cGMP. Den shims skiva förhindrar plastskärvor från införliva sfärerna under hackförfarandet. För varje planerad kotlett, överför en shim skiva i botten av varje petriskål och lock.
    6. Aseptiskt placera spännet (figur 1K) över bladet med hjälp av pincett. Den böjda delen av haken måste vara över den övre kanten av armen. Spännet kommer inte stanna på armen tills muttern är ordentligt fashioned. Använd pincett för att hålla de clasp på armen och säkra muttern (figur 1J) på bulten med den sterila mutter-förare. Lämna muttern ¼ varv lös.

    4. Pre-chop Tillvägagångssätt

    1. För över den föreslagna volymen av MM i den nya kolven (er) enligt tabell 2, kolumn C.
    2. Överför aseptiskt cellerna från inkubatorn till BSC. Luta kolven (s) på en provrörsställ (Figur 2A) och låta de områden att bosätta sig i kolven (s).
    3. När bosatte sig, aspirera upp till 12 ml av supernatanten med en 5 ml eller 10 ml serologisk pipett och skölj alla löst vidhäftande sfärer från ytan av kolven (s). Upprepa vid behov och reglera sfärerna mellan sköljningar.
    4. För över den föreslagna volymen av CM i den nya kolven (er) enligt tabell 2, kolumn D. Om ympa om två eller flera T175 kolvar, se steg 7.1.
    5. För över allt återstående CM och sfärer i en ny 15 ml koniska rör. Låt sfärer settle och kasta begagnade kolv (ar).
    6. Kritiska steg: Långsamt överföra sfärerna från 15 ml koniskt rör på 60 mm petriskål eller shim skiva i lägsta möjliga volym; Från 0,1 till 0,5 ml rekommenderas (Figur 2B). Håll den återstående volymen av CM eftersom det kommer att användas för att skölja cellerna från skålen efter chop. Försök att minimera den yta som täcks av media och sfärer på skålen (figur 2C).

    Figur 2
    Figur 2. Sphere förberedelse för hackning. A) Luta kolven (s) mot ett provrörsställ eller dylikt för att reglera de områden i hörnet av kolven. B) Ta sfärerna så tätt som möjligt från den koniska röret till Petri maträtt. C) Pool sfärerna från den koniska röret ithan mitt i en petriskål. D) Avlägsna så mycket supernatant som möjligt från den övre delen av de poolade sfärer. E) Sprid sfärerna med användning av den sida av en plast mikropipettspets. F) Rör försiktigt sfärerna till en sida av poolen . G) Exempel på områden som har flyttats till ena sidan av poolen för att underlätta medie bort. H) kondenserad sfärer utspridda på petriskål, redo för att hugga. Klicka här för att visa en större bild.

    1. Härnäst sfärerna måste kondenseras genom avlägsnande av supernatanten överförs över i steg 4,6. Transfer tillbaka in i 15 ml koniska rör supernatanten med en aerosolbarriär spets mikropipett (Figur 2D), undvika att avlägsna sfärer. Börja med att ta bort så mycket material som möjligt från den övre delen av media / cellpoolen. När det inte är möjligtatt ta bort media utan sfärer, gå vidare till nästa steg.
    <td> 0 ml
    Kolumn A Kolumn B Kolumn C Kolumn D Kolumn E Kolumn F
    Pre-Chop Flask storlek → Post-Chop kolv (ar) Storlek Föreslagen volym av MM att överföra till ny kolv (ar) före chop Föreslagen volym av CM att överföra till ny kolv (ar) före chop Föreslagen volym sfärer / media för att överföra till ny kolv (s) efter chop Slutlig volym Seeded / Flask
    T12.5 → T25 5 ml 0 ml 5 ml 10 ml
    T25 → T75 10 ml 10 ml 20 ml
    T75 → T175 20 ml 10 ml 10 ml 40 ml
    En T175 → 2 T175s 20 ml per kolv 15 ml per kolv 5 ml per kolv 40 ml
    2 T75s → 4 T175s 20 ml per kolv 17,5 ml per kolv 2,5 ml per kolv 40 ml

    Tabell 2. Mediaöverföring guide pre / post-chop. Förslag på volymer att använda under den hackprocessen.

    1. Sprid poolen ut med sidan av pipettspetsen för att öka ytarean (Figur 2E).
    2. Kritiska steg: Tipsa petriskål något mot dig och använd sidan av pipettspetsen försiktigt slide alla av sfärerna till en sida av poolen (figur 2F, G).
    3. Kritiska steg: När alla celler har flyttats, långsamt tippa petriskål motsatt riktning. Under processen kommer enbart media rinna bort från sfärerna. Transfer tillbaka in i 15 ml koniska rör medierna. Minimal sfär avlägsnande är acceptabelt.
    4. Använd sidan av pipettspetsen för att försiktigt dra alla sfärer tillbaka till mitten av petriskålen så poolen har en diameter på 0,5-2,4 cm (Figur 2H). Det är viktigt att hålla djupet av sfären poolen ytlig. Om poolen är för djupt, kommer de områden helt enkelt skjutas åt sidan under hackning. OBS: Diametern för sfär poolen kan inte vara större än 2,5 cm eller bladet kommer i kontakt med kanterna av petriskålen, saknade cellerna.

    5. Chop Procedure

    1. Överför petriskål på plåthållarens (figur 1G) och se till att skålensäkras under platthållare krokar (Figur 1C).
    2. Bordet frikopplingsvredet har skåror där den passar in i växeln. Använd tabellen frikopplingsvredet att skjuta hållare till vänster så bladet är klart av sfärerna och låses i växel (figur 1D).
    3. Kritiska steg: Sänk chopper armen genom att vrida den manuella manipulator ratten (figur 1M) medurs tills kniven snäpper ner platt på petriskål. Använd en hand för att trycka ner armen fästet (Figur 1B) medan du drar åt muttern med nutdriver.
    4. Tryck på återställningsknappen en gång (Figur 1F). Stadig petriskål med en hand samtidigt som du vrider den automatiska armen manipulator ratten (figur 1L) medurs till 90 ° position eller 12:00 om ratten var en klocka. VARNING: Håll fingrarna borta från rörliga kniven hela tiden.
    5. Passera bladet helt igenom poolen av sfärer. Vrid på plåthållaren90 °.
    6. Lossa bulten och upprepa steg från 5,3 till 5,5.
    7. Överför aseptiskt petriskålen från plattan hållare på ett arbetsutrymme i BSC.

    6. Post-chop Tillvägagångssätt

    1. Prime en 10 ml serologisk pipett med CM i den koniska röret från steg 4.6 och sedan överföra 1 ml på de hackade sfärerna. Försiktigt återsuspendera och överför till en ny 15 ml koniska rör. Undvik bubblor och upprepa så många gånger som behövs för att samla in de hackade sfärerna.
      TIPS: Minimera skrapa skålen som plastfragment kan lyfta. Detta är inte ett problem om du använder de rostfria shims skivor. Se upp av celler som är förenade med insidan av plast serologisk pipett. Om detta inträffar, aspirera bubblor intermittent genom media i pipetten för att lösgöra cellerna.
    2. Mät volymen av CM och hackade sfärer. Tillsätt en lämplig mängd av MM för att uppnå den volym som anges i tabell 2, kolumn E.
    3. Denna fördelades ispheres 2-3x för att bryta upp några löst sammansmälta sfärer.
    4. Kritiska steg: Alikvotera klotet suspensionen i varje ny kolv. Endast överföra sfären suspensionen i en kolv i taget, och åter inställa sfärerna mellan överföringar. Alikvotering flera flaskor samtidigt resulterar i ett oproportionerligt antal områden i varje kolv. Den slutliga volymen i varje kolv bör motsvara de volymer i tabell 2, kolumn F. Se steg 7.2 vid sådd större än två T175 kolvar.
    5. Ta bort muttern med muttern-drivrutinen och sedan spännet med steril pincett. Sanera lämpligt sätt med 70% IPA eller motsvarande. VARNING: Avlägsna den använda hugga kniven endast med en pincett och kasta i en bio-hazard avfallsbehållare.
    6. Dekontaminera alla ytor av hack med 70% IPA.

    . 7 Process Variations - Flera Kolvar

    Det finns flera skillnader när passage mer än två T175s. Stegets nedan är förändringar av den refererade steget.

    1. Hänvisningar till steg 4.4:
      1. När ympa om två T175s, kombinera alla media och sfärer i en T175 kolvar. Låt kulorna att bosätta sig och sedan Alikvotera lämplig volym av CM i var och en av de nya kolvar som anges i tabell 2, kolumn D. Gå vidare till steg 4,5.
      2. När ympa om mer än två T175s, skaffa en ny T175 kolv och etikett som CM kolven. Komplett steg 7.1.1 men överföra CM in CM kolven. Förvara kolven på sidan av BSC som skall användas för att samla in CM från alla kolvar tills samtliga kolvar har hackas. Då CM kommer att vara lika i lika delar i var och en av de nya kolvar.
    2. Referens steg 6,4 - När hack samma cellinje flera gånger, överför det hackade sfär suspension i märkta sfärer efter chop en ny T75-kolv och registrera den volym överförs. Fortsätt att kombinera cellerna i dennakolv efter varje chop och lagra kolven i inkubator vid 37 ° C, 5% CO2, 95% luftfuktighet. Efter att alla kotletter har avslutats, alikvoteras sfären suspensionen i volym till varje ny kolv. Gå vidare till steg 6,5.

    8. Frysförvaring

    Följande protokoll är för cryogenically bevara hNPCs.

    1. Tina cellfrysmedium i en ren vattenbad vid 37 ° C och sedan förvara på is. Cell frysmedium kan alikvoter och lagrades vid -80 ˚ C i upp till 6 månader.
    2. Brand polera glaspasteurpipetter genom att rotera öppningen av pipetten i en flamma. Bered minst två stora och två små bore brand-polerad pipetter (Figur 3). Sfärerna kommer skiljas genom att flytta från stora till små bore pipetter.
    3. Placera TrypLE Select i vattenbadet vid 37 ° C under 5 min. Ta bort och förvara i rumstemperatur tills produkten ska användas.


    Figur 3. Brand polering av glas Pasteur pipetter. A) Håll pipetten i den övre delen av lågan och snurra för att jämnt runt kanterna på glaset pipett. B) Exempel på en stor-borrning brand-polerat glas pipett. C) Exempel på en finkalibrig eld-polerat glas pipett.

    1. Överför aseptiskt neurospheres i BSC. Tillåt sfärerna sedimentera genom att luta flaskan (er) mot ett provrörsställ och skölj botten av kolven för att avlägsna eventuella löst vidhäftande sfärer. Låt sfärerna att åter bosätta.
    2. Överför alla utom 5-10 ml av CM i en steril flaska och mäta den totala volymen. Placera de återstående sfärer och media i en konisk tub.
    3. Efter att alla celler har bosatt sig, överföra alla utom en liten menisk av CM i flaskan och summera den volymume.
    4. Överför aseptiskt 5-10 ml värmdes TrypLE Select i den koniska röret och återsuspendera cellpelleten. Överför det koniska röret i 37 ° C vattenbad i 15 till 20 min. Efter 7,5-10 min, försiktigt skaka den koniska röret för att blanda.
    5. Använd den uppmätta CM volymen från steg 8,5 och förbereda en lika stor volym av MM. Kombinera och välja 50% CM och 50% MM-lösning (CM / MM lösning).
    6. Överför aseptiskt en 40 ìm sil i en 50 ml koniska rör.
    7. När inkubationen är fullständig, snurra 15 ml koniska rör om 15 sek vid 100 X g.
    8. Försiktigt aspirera och kasta TrypLE Välj och något trådiga substrat. Lämna en liten menisk. Försiktigt lägger 2 - 4 ml CM / MM för att späda ut de återstående TrypLE Select utan att störa pelleten. Låt någon rubbas celler åter bosätta sig innan du slänger tvätten.
    9. Lägg 2-5 ml CM / MM lösning på röret sfärer. Dissociera sfärer med en 5 ml pipett genom finfördelning högst 10x. Låt FNdissocierade sfärer nöja sig med 1-2 minuter. Överför dissocierade cellsuspension på 40 ìm sil för att ta bort helt odissocierad kluster.
    10. Upprepa steg 8,12 med en brand-polerat stora hålet glas pipett och sedan en liten-borrning glas pipett.
    11. Skölj filtret med 2-5 ml av CM / MM-lösning.
    12. Blanda cellsuspensionen och ta prover för viabilitet analys.
    13. Späd prover med trypanblått vid en lämplig spädningsfaktor och räkna. Använd standardekvationen nedan för att beräkna det genomsnittliga viabla cellkoncentrationen och beräkna de totala livsdugliga celler.
      Ekvation 1
    14. Beräkna den totala volymen av cellfrysmedia som krävs för att återsuspendera cellerna vid 5,0 x 10 6 celler / ml. 1 ml av celler seedas i varje cryovial. Överför cryovials i BSC.
    15. Centrifugera cellsuspensionen vid 200 xg under 5 min vid 4 ° C i 15 ml koniska rör för bästa avkastning. Om 50 ml koniska rör används för en storskalig frysa ned, öka hastigheten och tidsförloppet till 400 x g under 10 min.
    16. Återsuspendera cellpelleten med cellfrysmedium vid 5,0 x 10 6 celler / ml. Alikvot 1 ml cellsuspension i varje köldkärlet. För en jämn fördelning, aspirera 6 ml suspension och delprov 5 cryovials x 1 ml. Transfer tillbaka i poolen av celler resterande 1 ml suspension. Upprepa tills alla flaskor har fyllts.
    17. Aseptiskt täta alla ympade kryokärl och överföra dem på is under 5-10 min.
    18. Använd något av följande för frysförvaring strategier för att bevara hNPCs: Isopropylalkohol Chamber
      1. Fyll den erforderliga antalet kammare (er) med 100% IPA vid rumstemperatur.
      2. Överför de sådda kryokärl från isen i kammaren (n) och överför kammaren (s) i en -80 ° C frys över natten. Cellerna är stabil i upp till en vecka vid -80 ° C, menföreslås det att överföra flaskorna till långtidslagring flytande kväve följande dag.

      Kontrollerad Rate Frys

      1. Ladda upp en lämplig frysprogram till kontrollerad takt frys programvara. Ett exempel programmet listas i tabell 3. Figur 4 visar en typisk fryskurva för hNPCs. Emellertid kommer det exakta programmet varierar för varje frys modell. Standarden totala samplingshastighet ska vara nära till -1 ° C / min tills den når -40 ° C, där graden av frysning kan vara väsentligt ökat till minst -80 ° C.
    Steg Rate (° C) Sluttemperatur (° C) Hold (min sek) Trigger
    1 </ Td> - - 5 min 0 sek Avdelningen
    2 - 1,3 - 5 - Prov
    3 - - 1 min 0 sek Avdelningen
    4 - 45 - 58 - Avdelningen
    5 + 10 - 26 - Avdelningen
    6 + 3 - 23 - Avdelningen
    7 - 0,8 - 40 - Prov
    8 - 10 - 100 - Avdelningen
    9 - 35 - 160 - Avdelningen

    Tabell 3. Steg för frysning hNPCs i en kontrollerad råt frys. Förslag på program för hNPC frysförvaring i en kontrollerad takt frys.

    Figur 4
    Figur 4. Exempel fryskurva. Typisk fryskurva för hNPCs på en kontrollerad takt frys.

      1. Överför cryovials från isen i korgarna i samband med kontrollfrekvens frysen. Glöm inte att ladda en cryovial med endast cell frysning media att använda för provtemperaturgivare. Överför korgarna i fryskammaren och placera provsonden i sondflaskan. Starta programmet.
      2. När protokollet är klar överför flaskorna i långtidsförvaring flytande kväve.

    9. Upptining Procedure

    Följande protokoll är för upptining kryogeniskt preserverade hNPCs.

    1. Överför cryovials från lagret flytande kväve omedelbart på torris. VARNING: Flaskorna kan ha sprickor eller lösa lock möjliggör flytande kväve för att komma in i flaskan. När bort från djupfrysförhållanden kan vätskan koka omedelbart exploderande flaskan. Använd lämplig skyddsutrustning när du tar bort flaskorna.
    2. Förbered alla reagenser och tillbehör nedan förväg. När upptiningsprocessen har påbörjats, är det viktigt att följa upp på ett effektivt sätt.
      1. Överför Neural Stem Cell Expansion Medium, MM, ett 15 ml koniskt rör, en 2 ml och en 10 ml serologisk pipett för varje cryovial in i BSC.
      2. Ett minimum av 9 ml av neurala stamcellsexpansionsmedium och 5 ml av MM krävs för varje flaska. Förbered mer av varje media om det behövs.
    3. Endast tina en flaska med hNPCs åt gången. Överför de frusna celler från torr is i en ren 37 ° C vattenbad och omrör flaskan i vattenbadet kontinuerligt. Övervaka volymenis som har smält. När det finns en bit av is ca 0,5 cm kvar i flaskan, spraya och torka av med 70% isopropylalkohol och överför till BSC.
    4. Överför innehållet i köldkärlet till ett 15 ml koniskt rör med en 2 ml serologisk pipett. Tillsätt 1 ml Neural Stem Cell Expansion Medium till den tomma cryovial och sedan överföra 8 ml Neural Stem Cell Expansion Medium på de upptinade celler i en långsam, droppe klokt sätt samtidigt försiktigt skaka röret. Detta görs för att minska risken för osmotisk chock.
    5. Överför vätskan från den cryovial till 9 ml av cellsuspension. Överför koniska röret på is och upprepa steg 9,4-9,5 för alla återstående ampuller.
    6. Centrifugera de koniska rören vid 200 xg under 5 min vid 4 ° C. Under centrifugeringen, förbereda rätt antal flaskor för sådd ningarna i tabell 4.
    # Antal vialer Totalt Seedning Volym (ml) Flask
    1 5 T12.5
    2 10 T25
    3 15 T75
    4 20 T75
    5 25 T75
    6 30 T175
    7 35 T175
    8 40 T175
    8 + - Kombination av Kolvar

    Tabell 4. Flask storlekar som baseras på antalet cryovials tinade. Förslag på volym och kolv storlek till utsäde hNPCs efter upptining.

    1. Återuppslamma och kombinera alla rör i lämplig volym av MM utifrån tabell 4. Blanda väl och reflytta ett prov för viabilitet räkning. Se steg från 8,15 till 8,16 för att räkna detaljer. Standard sådd intervallet är mellan 160,000-320,000 celler / cm 2.
    2. Blanda cellerna väl och delprov cellerna i kolvar. Överför kolvarna till en 5% CO 2/37 ° C/95% luftfuktighet inkubator. Blanda flaskan genom att försiktigt skaka fram och tillbaka för att jämnt fördela cellerna.
    3. Cellerna kommer att bilda sfärer inom 24-48 timmar. Ibland kommer cellerna att vidhäfta till plastytan och bildar en honeycomb-liknande koloni fördelning. Om detta inträffar, lämna cellerna i 3 dagar före sköljning cellerna lös, medhjälp i sfär bildning. Skölj var 1-3 dagar tills det inte finns några vidhäftande celler. Om så är nödvändigt överföra cellerna till en ny kolv.
    4. Utbyte 25-75% av media med MM var 3-4 dagar tills cellerna är redo att hugga, vanligen 7-14 dagar efter upptining.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 5
Figur 5. Representativa uppgifter. A) Beräknat cell nummer av hNPCs frysts till p19, sedan tinas och expand som anhängare monolager med hjälp av enzymatisk dissociation jämfört med neurosfärer passe via hackmetoden. Dag 0 representerar när cellerna tinades vid p20. B) Representativa bilder av sfärer pre-chop, 10X. C) Bilderna av sfärer efter chop, 10X. D) färgruta som används för att beskriva omfattningen av mediekonditioneringen i cGMP- jämförbara protokoll. E) Immuncytokemi av upptinade M29 hNPCs som ströks i 1 dag och färgade för nestin (röd) uttryck. Hoechst nukleär motverka fläcken (blå). F) Immuncytokemi av upptinade M29 hNPCs som ströks i 7 dagar och betsed för GFAP (Röd) och β-III-tubulin (grön). Klicka här för att visa en större bild.

Figur 5A representerar hNPCs tinades vid p20 (dag 0) och hölls vidhäftande till laminin-belagda vävnadsodlingskolvar eller såsom icke vidhäftande neurosfärer passe via huggmetoden. De vidhäftande cellerna enzymatiskt dissocierade använda TrypLE Välj vecka och senesced efter 70 dagar (7-10 passager) i kultur. Däremot neurosfärerna tinade vid passage 20 och expanderade via hugg teknik växte under mer än 40 passager före åldrande. Typiska hNPCs innan hugga (Figur 5B) bör vara mestadels ≥ 300 nm i diameter. När hackad sfärerna allmänhet fyrdelning in variabelt dimensionerade sektioner, mestadels omkring 200 nm i diameter (figur 5C). Det är viktigt att notera att hNPCs utökas via Chopping metod bibehålla uttrycket av hNPC markörer och kan producera både astrocyter och neuroner efter differentiering. Sena passage hNPCs dissocierades, ströks ut på laminin-belagda täckglas under en tidsperiod av en till sju dagar och därefter fixeras med 4% paraformaldehyd. De hNPCs uttrycker stamceller markören nestin (Millipore, 1:1000) på en dag pläterade hNPCs (Figur 5e), liksom de differentierade neurala markörer glia fibrillärt surt protein (GFAP, 1:500) och β-III-tubulin (1: 2000) på sju dags pläterade hNPCs (figur 5F), markörer för astrocyter och omogna nervceller, respektive.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Figur 6
Figur 6. Hack Schematic. Expanderande sfäroid stam / progenitorceller i kultur med hjälp av den mekaniska hackmetoden.

Kritiska steg

En översikt av hackexpansions paradigmet visas i Figur 6. HNPC sfär storlek är ett av de viktigaste kriterierna för att observera innan ympa om de neurosfärer. Även om det finns en stor varians i sfär storlek, ska minst 30% av sfärerna har en diameter som är större än 300 nm. Om sfärerna är för små för passage, helt enkelt byta ut CM med färsk MM (25% -50%) och en ny bedömning efter 1-4 dagar. Dålig expansionsgrad uppstår när sfärerna har passe vid för litet av en diameter.

hNPC expansions priser är också beroende av sfär täthet och media conditioning grund av utsöndrade faktorer 47. Men om media är alltför metaboliseras och viktiga tillväxtfaktorer är sämre, får cellerna förvärva en karyotypiskt onormal population av celler 48. Därför måste ersätta näringsämnen och tillväxtfaktorer balanseras med utsöndrade trofiska faktorer. När sådd hNPCs efter chop eller efter upptining, är antalet neurosfärer per cm 3 av media variabel. Emellertid är den allmänna regeln ju större densitet, desto snabbare medier kommer att påverka och den högre expansionstakten, under förutsättning att materialet är utbytt när det behövs. Använd media konditionefärgspektrum (figur 5D), som sträcker sig från rosa när un-metaboliseras, till gult när medierna har helt metaboliseras. Den idealiska medier färg för logaritmisk tillväxt är en röd-orange färg, # 3 på färgrutan. Detta tyder på att medierna innehåller tillräckligt med näringsämnen och tillväxtfaktorer samtidigt som en tillräcklig koncentration av utsöndrat trophic faktorer. Medierna bör inte påverka förbi # 4 på färgrutan. Alternativt, när cellerna inte metaboliserande media snabbt (# 1 på färgrutan), kommer hNPCs växer långsammare och kräver en hacka var 10-20 dagar till skillnad från varje 7-10 dagar. Det är viktigt att öka kulturtätheten att öka konditionering, vilket i sin tur kommer att förbättra expansionsgrad.

Under hackförfarandet notera följande kritiska steg. Se till bladet är installerad parallellt med chopperarmen. Om kniven är inte platt på ytan av petriskålen eller mellanlägg skiva, kanske många områden inte hackad. Notera spridningen av celler som diskuteras i steg 4.11. Sfärerna måste vara kvar i mitten av petriskålen eller bladet kommer i kontakt med väggen innan alla områden har huggits. Slutligen är det viktigt att undvika torkning av hNPCs för en utsträckt tidsperiod under hackning process. Efter att ha placerat sfärer i skålen, hacka och översvämma dem med färskt medium så snartmöjligt.

Eftersom denna teknik kräver flera delar av utrustning, kan det finnas risk att steriliteten av kulturen. Med tanke på denna risk, måste ordentlig steril teknik användas under hela proceduren. För grundläggande produktionsforskningsnivå, torka ner all utrustning med 70% IPA eller motsvarande räcker tillsammans med valfri ultraviolett inkubation i minst 15 minuter. Utför alla stegen inne i en steril BSC. För produktion cGMP-nivå måste choppern steriliseras med etylenoxid såsom föreslagits av tillverkaren. Alla andra förnödenheter kan köpas steril eller autoklaveras.

Framtida Applikationer

Övergången någon grundforskning terapi från bänken till sängen kan vara en utmaning. Den hack förfarande har utformats med denna övergång i åtanke. Förfarandet har redan använts för att framställa en cGMP-kompatibel hNPC bank vid University of Wisconsin Waisman Center Bio-fabrik. Thatt hNPC bank var anskaffas för utbyggnad av ett läkemedels-grade hNPC cell mycket som kommer att användas för nya pre-prövningsläkemedelsstudier och en klinisk prövning fas 1 efter Federal Drug Administration godkännande. Det finns andra celltyper som använder denna procedur för expansion. Ett exempel är EZ sfärer, neurala stamceller genereras från pluripotenta stamceller 41. Denna teknik har en stor potential för användning med andra typer av vävnad som kräver konstant cell-till-cell-kontakt under expansion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingenting att lämna ut.

Acknowledgments

Vi tackar Dr Soshana Svendsen för kritisk granskning och redigering av denna rapport. Detta arbete har bidragit till att av NIH / NINDS 1U24NS078370-01 och CIRM DR2A-05320.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Beaker, 50 ml Fisherbrand FB-100-50 multiple manufacturers/suppliers
Bio-Safety Cabinet, class II Baker SG-603A 4 ft. or 6 ft. model.  6 ft. model recommended; multiple manufacturers/suppliers
Blades, Double-edge Prep Personna 74-0002 multiple manufacturers/suppliers.  CAUTION: Sharp
Cell Freezing Media Sigma-Aldrich C6295-50ML DMSO, serum-free
Centrifuge, swing-bucket with 15 ml inserts Eppendorf 5810 R multiple manufacturers/suppliers
Conical Tubes, 15 ml Fisherbrand S50712 multiple manufacturers/suppliers
Conical Tubes, 50 ml BD Falcon 352074 multiple manufacturers/suppliers
Controlled Rate Freezer Planer Kryo 750 multiple manufacturers/suppliers
Cryovials, 2 ml Corning 430488 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T12.5 BD Falcon 353107 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T25 BD Falcon 353081 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T175 BD Falcon 353045 multiple manufacturers/suppliers
Culture Flask, Vented, T75  BD Falcon 353110 multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 1 L Millipore SCGPU11RE multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 150 ml Millipore SCGVU01RE multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 500 ml Millipore SCGPU05RE multiple manufacturers/suppliers
Filter, 0.22 µm, attached cup, 50 ml Millipore SCGP00525 multiple manufacturers/suppliers
Filter Paper, 8.5 cm circles Whatman/GE 1001-085
Forceps, Standard Pattern - Serrated/Curved/18 cm Fine Science Tools 11001-18
Freezing Chamber, Isopropyl Alcohol Nalgene 5100-0001 "Mr. Frosty"
Incubator, 37 °C/5% CO2 Forma 370 series multiple manufacturers/suppliers
Hemacytometer, Phase Hausser Scientific 1475 multiple manufacturers/suppliers
McIlwain Tissue Chopper Lafayette Instruments TC752-PD  Petri dish modification required.   CAUTION:  Moving, sharp blade.
Micropipettor, 1-10 μl Gilson F144562 multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 100-1,000 μl (starter kit) Gilson F167700 multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 2-20 μl (starter kit) Gilson F167700 multiple manufacturers/suppliers
Micropipettor, 20-200 μl (starter kit) Gilson F167700 multiple manufacturers/suppliers
Nutdriver, Autoclavable, 5/16" Steritool 10302
Pasteur Pipets, cotton-plugged Fisherbrand 13-678-8B multiple manufacturers/suppliers
Petri Dish, Glass, Autoclavable Corning 3160-100
Pipet Aid Drummond 4-000-101 multiple manufacturers/suppliers
Shim disc McMaster-Carr VARIABLE multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 10 μl AvantGuard AV10R-H multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 1,000 μl AvantGuard AV1000 multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 20 μl AvantGuard AV20-H multiple manufacturers/suppliers
Sterile barrier pipet tips, 200 μl AvantGuard AV200-H multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 10 ml Fisherbrand 13-676-10J multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 2 ml Fisherbrand 13-675-3C multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 25 ml Fisherbrand 13-676-10K multiple manufacturers/suppliers
Sterile Disposable pipettes, all-plastic wrap, 5 ml Fisherbrand 13-676-10H multiple manufacturers/suppliers
Sterilization Pouches, 19 x 33 cm Crosstex SCL multiple manufacturers/suppliers
Strainer, 40 µm BD Falcon 352340
Tissue Culture Dishes, 60 mm BD Falcon 351007
Tube Racks, Interlocking Four-Way Fisherbrand 03-448-17
Water Bath Fisherbrand S52602Q multiple manufacturers/suppliers
Neural Progenitor Cell-Specific Processing Reagents
Neural Stem Cell Expansion Medium (Stemline) Sigma-Aldrich S3194-500ML Important to use the Stemline brand
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) Millipore GF316 multiple manufacturers/suppliers
Recombinant Human Leukemia Inhibitory Factor (LIF) Millipore LIF1010 multiple manufacturers/suppliers
Trypan Blue (0.4%) Sigma-Aldrich T8154-100ML multiple manufacturers/suppliers
TrypLE Select (1x) Life Technologies 12563-011

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cattaneo, E., McKay, R. Proliferation and differentiation of neuronal stem cells regulated by nerve growth factor. Nature. 347, 762-765 (1990).
  2. Palmer, T. D., Takahashi, J., Gage, F. H. The adult rat hippocampus contains primordial neural stem cells. Molecular and cellular neurosciences. 8, 389-404 (1997).
  3. Wu, Y., Liu, Y., Chesnut, J. D., Rao, M. S. Isolation of neural stem and precursor cells from rodent tissue. Methods in molecular biology. , 438-4339 (2008).
  4. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  5. Svendsen, C. N., Fawcett, J. W., Bentlage, C., Dunnett, S. B. Increased survival of rat EGF-generated CNS precursor cells using B27 supplemented medium. Experimental brain research. Experimentelle Hirnforschung. Experimentation cerebrale. , 102-407 (1995).
  6. Laywell, E. D., Kukekov, V. G., Steindler, D. A. Multipotent neurospheres can be derived from forebrain subependymal zone and spinal cord of adult mice after protracted postmortem intervals. Experimental neurology. , 156-430 (1999).
  7. Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. 45 (45), (2010).
  8. Temple, S. Division and differentiation of isolated CNS blast cells in microculture. Nature. 340, 471-473 (1989).
  9. Chalmers-Redman, R. M., Priestley, T., Kemp, J. A., Fine, A. In vitro propagation and inducible differentiation of multipotential progenitor cells from human fetal brain. Neuroscience. 76, 1121-1128 (1997).
  10. Ostenfeld, T., et al. Regional specification of rodent and human neurospheres. Brain research. Developmental brain research. 134, 43-55 (2002).
  11. Carpenter, M. K., et al. et al. In vitro expansion of a multipotent population of human neural progenitor cells. Experimental neurology. 158, 265-278 (1999).
  12. Nunes, M. C., et al. Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain. Nature. 9, 439-447 (2003).
  13. Piao, J. H., et al. Cellular composition of long-term human spinal cord- and forebrain-derived neurosphere cultures. Journal of neuroscience research. 84, 471-482 (2006).
  14. Barami, K., Zhao, J., Diaz, F. G., Lyman, W. D. Comparison of neural precursor cell fate in second trimester human brain and spinal cord. Neurological research. 23, 260-266 (2001).
  15. Walder, S., Ferretti, P. Distinct neural precursors in the developing human spinal cord. The International journal of developmental biology. 48, 671-674 (2004).
  16. Buc-Caron, M. H. Neuroepithelial progenitor cells explanted from human fetal brain proliferate and differentiate in vitro. Neurobiology of. 2, 37-47 (1995).
  17. Becq, H., Jorquera, I., Ben-Ari, Y., Weiss, S., Represa, A. Differential properties of dentate gyrus and CA1 neural precursors. Journal of. 62, 243-261 (2005).
  18. Keenan, T. M., Nelson, A. D., Grinager, J. R., Thelen, J. C., Svendsen, C. N. Real time imaging of human progenitor neurogenesis. PloS one. 5, (2010).
  19. Kim, H. J., McMillan, E., Han, F., Svendsen, C. N. Regionally specified human neural progenitor cells derived from the mesencephalon and forebrain undergo increased neurogenesis following overexpression of ASCL1. Stem cells. 27, 390-398 (2009).
  20. Windrem, M. S., et al. Neonatal chimerization with human glial progenitor cells can both remyelinate and rescue the otherwise lethally hypomyelinated shiverer mouse. Cell stem cell. 2, 553-565 (2008).
  21. Kitiyanant, N., Kitiyanant, Y., Svendsen, C. N., Thangnipon, W. B. D. N. F. - IGF-1- and GDNF-secreting human neural progenitor cells rescue amyloid beta-induced toxicity in cultured rat septal neurons. Neurochemical research. 37, 143-152 (2012).
  22. Dutta, S., et al. Cell therapy: the final frontier for treatment of neurological diseases. CNS neuroscience & therapeutics. 19, 5-11 (2013).
  23. Lindvall, O., Barker, R. A., Brustle, O., Isacson, O., Svendsen, C. N. Clinical translation of stem cells in neurodegenerative disorders. Cell stem cell. 10, 151-155 (2012).
  24. Wang, S., et al. Long-term vision rescue by human neural progenitors in a rat model of photoreceptor degeneration. Investigative ophthalmology & visual science. 49, 3201-3206 (2008).
  25. Kitchens, D. L., Snyder, E. Y., Gottlieb, D. I. FGF and EGF are mitogens for immortalized neural progenitors. Journal of. 25, 797-807 (1994).
  26. Craig, C. G., et al. In vivo growth factor expansion of endogenous subependymal neural precursor cell populations in the adult mouse brain. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 2649-2658 (1996).
  27. Ciccolini, F., Svendsen, C. N. Fibroblast growth factor 2 (FGF-2) promotes acquisition of epidermal growth factor (EGF) responsiveness in mouse striatal precursor cells: identification of neural precursors responding to both EGF and FGF-2. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 18, 7869-7880 (1998).
  28. Kelly, C. M., et al. EGF and FGF-2 responsiveness of rat and mouse neural precursors derived from the embryonic CNS. Brain research bulletin. 68, 83-94 (2005).
  29. Sun, Y., et al. Long-term tripotent differentiation capacity of human neural stem (NS) cells in adherent culture. Molecular and cellular neurosciences. 38, 245-258 (2008).
  30. Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells. Neuron. 11, 951-966 (1993).
  31. Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 1091-1100 (1996).
  32. Chojnacki, A., Weiss, S. Production of neurons, astrocytes and oligodendrocytes from mammalian CNS stem cells. Nature. 3, 935-940 (2008).
  33. Ferrari, D., Binda, E., De Filippis, L., Vescovi, A. L. Isolation of neural stem cells from neural tissues using the neurosphere technique. Current protocols in stem cell biology. Chapter. 2, 10-1002 (2010).
  34. Ebert, A. D., McMillan, E. L., Svendsen, C. N. Isolating, expanding, and infecting human and rodent fetal neural progenitor cells. Current protocols in stem cell biology. Chapter 2, Unit 2D 2, doi:10.1002/9780470151808.sc02d02s6. , (2008).
  35. Svendsen, C. N., et al. Long-term survival of human central nervous system progenitor cells transplanted into a rat model of Parkinson's disease. Experimental neurology. 148, 135-146 (1997).
  36. Draper, J. S., et al. Recurrent gain of chromosomes 17q and 12 in cultured human embryonic stem cells. Nature. 22, 53-54 (2004).
  37. Buzzard, J. J., Gough, N. M., Crook, J. M., Colman, A. Karyotype of human ES cells during extended culture. Nature biotechnology. 22, 381-382; author reply 382. , 10-1038 (2004).
  38. Mitalipova, M. M., et al. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nature. 23, 10-1038 Forthcoming.
  39. Svendsen, C. N., et al. A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells. Journal of neuroscience. 85, 141-152 (1998).
  40. Baghbaderani, B. A., Mukhida, K., Hong, M., Mendez, I., Behie, L. A. A review of bioreactor protocols for human neural precursor cell expansion in preparation for clinical trials. Current stem cell research & therapy. 6, 229-254 (2011).
  41. Ebert, A. D., et al. EZ spheres: A stable and expandable culture system for the generation of pre-rosette multipotent stem cells from human ESCs and iPSCs. Stem cell research. 10, 417-427 (2013).
  42. Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
  43. Consortium, H. D. iP. S. C. Induced pluripotent stem cells from patients with Huntington's disease show CAG-repeat-expansion-associated phenotypes. Cell stem cell. 11, 264-278 (2012).
  44. Gamm, D. M., Nelson, A. D., Svendsen, C. N. Human retinal progenitor cells grown as neurospheres demonstrate time-dependent changes in neuronal and glial cell fate potential. Annals of the New York Academy of Sciences. , 1049-10107 (2005).
  45. Hosoyama, T., Meyer, M. G., Krakora, D., Suzuki, M. Isolation and in vitro propagation of human skeletal muscle progenitor cells from fetal muscle. Cell biology international. 37, 191-196 (2013).
  46. Sareen, D., et al. Inhibition of apoptosis blocks human motor neuron cell death in a stem cell model of spinal muscular atrophy. PloS one. 7, (2012).
  47. Chang, M. Y., Park, C. H., Lee, S. H. Embryonic cortical stem cells secrete diffusible factors to enhance their survival. Neuroreport. 14, 1191-1195 (2003).
  48. Sareen, D., et al. Chromosome 7 and 19 trisomy in cultured human neural progenitor cells. PloS one. 4, (2009).

Tags

Neurovetenskap neurala stamceller neurala föregångare celler neurala stamceller passaging neurosphere hugga stamceller neurovetenskap suspensionskultur god tillverkningssed GMP

Erratum

Formal Correction: Erratum: A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue
Posted by JoVE Editors on 09/01/2014. Citeable Link.

A correction was made to A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue. The corresponding author was changed from:

Brandon C. Shelley

to:

Clive Svendsen

En cGMP-tillämplig Expansion Metod för aggregat av mänskliga neurala Stem och stamceller härledas från pluripotenta stamceller eller fosterhjärnvävnad
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shelley, B. C., Gowing, G.,… More

Shelley, B. C., Gowing, G., Svendsen, C. N. A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue. J. Vis. Exp. (88), e51219, doi:10.3791/51219 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter