Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

النهج ChroP يجمع بين الشذرة والطيف الكتلي لتشريح المناظر الطبيعية البروتيومية الحالة رقم محدد من الكروماتين

Published: April 11, 2014 doi: 10.3791/51220
Automatic Translation
1, 1
1Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology

Summary

من خلال الجمع بين الأم ويشابك مناعي لونين مع عالية الدقة الطيف الكتلي، نهج ChroP تمكن من تشريح بنية البروتين المركب من التعديلات هيستون، المتغيرات والبروتينات غير histonic التآزر في المجالات ونين متميزة وظيفيا.

Abstract

الكروماتين هو مجمع البروتين النووي ديناميكية للغاية مصنوعة من الحمض النووي والبروتينات التي تتحكم في العمليات التي تعتمد على الحمض النووي المختلفة. وينظم هيكل لونين وظيفة في مناطق معينة من التخصيب المحلي للهيستون بعد متعدية التعديلات (hPTMs) والمتغيرات، والبروتينات ملزمة لونين، بما في ذلك عوامل النسخ، والحامض النووي. توصيف البروتين من تكوين لونين في مناطق وظيفية متميزة أعاق حتى الآن بسبب عدم وجود بروتوكولات فعالة لإثراء هذه المجالات في النقاء وكمية مناسبة لاحقة لتحليل متعمق من قبل الطيف الكتلي (MS). نحن هنا وصف استراتيجية البروتينات لونين المصممة حديثا، واسمه ChroP (CHRO ماتان P roteomics)، حيث تم استخدام لونين مناعي التحضيرية لعزل المناطق التي لونين متميزة الميزات، من حيث hPTMs، وشارك المتغيرات المرتبطة البروتينات غير histonic، هي تحليلها من قبل MS. نحن لتوضيح انهإعادة المنطقة لاقامة ChroP لإثراء وتحليل المناطق heterochromatic الصمت transcriptionally، والتي تمثلت في وجود ثلاثي مثيلة ليسين 9 على هيستون H3. النتائج التي تحققت بيان إمكانيات ChroP في وصف بدقة بروتيوم المغاير واثبات ذلك باعتبارها استراتيجية تحليلية قوية لفهم كيفية محددات البروتين متميزة من لونين تفاعل وتضافر لإنشاء تكوينات الهيكلية والوظيفية مكان محدد.

Introduction

الكروماتين هو مجمع البروتين النووي ديناميكية للغاية التي تشارك كقالب الأساسي لكافة العمليات بوساطة الحمض النووي. النيوكليوسومات هي الوحدة الأساسية المتكررة من لونين وتتكون من نواة octameric البروتينية التي تحتوي على جزيئين من كل H2A هيستون الكنسي، H2B، H3 H4 و، وتجمع حولها 147 سنة مضت من الحمض النووي يتم تغليف 1،2. وتنظم كل histones الأساسية كمجال كروي ومرنة N-محطة "ذيل" أن يبرز خارج جسيم نووي. ويستند إحدى الآليات الرئيسية لتنظيم بنية الكروماتين وديناميكية على التساهمية التعديلات بعد متعدية (PTMs)، والتي تحدث أساسا على N-تيرميني من الهستونات 3،4. يمكن التعديلات هيستون تعمل إما عن طريق تغيير بنية النظام أعلى لونين، من خلال تغيير الاتصالات بين الهستونات-DNA أو بين Nucleosomes لل، وبالتالي السيطرة على إمكانية الحصول على البروتينات ملزمة الحمض النووي (آليات رابطة الدول المستقلة)، أو عن طريق العمل كمركز dockinز مواقع للبروتينات التنظيمية، إما وحدة واحدة، أو جزءا لا يتجزأ من المجمعات multimeric. ويمكن لهذه البروتينات التي تنظم ممارسة وظيفتها في طرق مختلفة: عن طريق تحوير مباشرة التعبير الجيني (أي البروتينات TAF)، أو عن طريق تغيير وضع النيوكليوسومات (أي لونين إعادة عرض المجمعات) أو عن طريق تعديل بقايا هيستون الأخرى (أي البروتينات مع ميثيل ترانسفيراز أو أسيتيل النشاط ترانسفيراز) (الآليات العابرة) 5. ملاحظة أن أنماط متميزة PTM العنقودية في مواضع محددة لونين أدى إلى وضع فرضية أن تعديلات مختلفة في مواقع متميزة قد تضافر لتوليد رمز الجزيئية التوسط في حالة وظيفية من الحمض النووي الأساسي. اكتسب "فرضية كود هيستون" توافق كبير في السنوات ولكن تم التحقق التجريبي الذي عقد قبل الظهر القيود التقنية 6،7.

وقد برزت البروتيوميات مطياف الكتلة (MS) على النحو الوارد فيأداة قوية لرسم أنماط تعديل هيستون وتميز ملزم لونين البروتينات 8. MS بالكشف عن التعديل باعتباره Δmass محددة بين كتلة التجريبية والنظرية من الببتيد. على مستوى الهستونات الفردية، MS يوفر وسيلة غير متحيزة وشاملة لخريطة PTMs، والسماح للكشف عن تعديلات جديدة وinterplays كاشفة بينهم 9-14.

في السنوات الأخيرة، تم وضع عدد من الاستراتيجيات لتشريح تكوين البروتين لونين، بما في ذلك توصيف الكروموسومات سليمة الإنقسامية 15، وتحديد للذوبان في ملزمة hPTM البروتينات 16-18 وعزل وتحليل مناطق محددة لونين (أي التيلوميرات) 19،20. ومع ذلك، والتحقيق في أوجه التآزر موضع محددة بين PTMs هيستون، المتغيرات، والبروتينات المرتبطة ونين لا تزال غير مكتملة. هنا، نحن تصف نهجا جديدا، واسمه ChroP (الاستشراب roteomics ماتان P) 21، وأننا قد وضعت لتميز بكفاءة متميزة وظيفيا المجالات لونين. هذا النهج يتكيف مناعي لونين (رقاقة)، ​​وبروتوكول راسخة المستخدمة في البحوث جينية، لتحليل البروتين كفاءة يستند إلى MS-من العينة المخصب. وضعنا اثنين من بروتوكولات مختلفة، اعتمادا على نوع من لونين تستخدم كمدخل ومسألة تتناولها MS؛ على وجه الخصوص: يعمل 1) الشذرة من لونين الأم غير المثبتة يتفاعل مع MNase لتنقية أحادية Nucleosomes للوتشريح hPTMs شارك في ربط (N-ChroP)؛ 2) يستخدم الشذرة من لونين crosslinked مجزأة بواسطة صوتنة في تركيبة مع استراتيجية interactomics القائم على SILAC لتوصيف جميع المشاركين في إثراء البروتينات لونين (X-ChroP) ملزمة. نحن هنا توضيح مزيج من N-X-وChroP لإثراء ودراسة المغاير، وذلك باستخدام H3K9me3 كطعم للخطوات مناعي. استخدام ChroP يمكن تمديدهاإما لدراسة مناطق مختلفة على لونين، أو تغييرات في تركيبة لونين داخل المنطقة نفسها خلال الفترة الانتقالية إلى حالة وظيفية مختلفة، مما يمهد الطريق لتطبيقات مختلفة في علم التخلق.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. خلية ثقافة

  1. متوسطة القياسية لرقاقة الأصلي
    1. تنمو خلايا هيلا في تعديل متوسطة Dulbecco والنسر (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، 1٪ الجلوتامين، 1٪ القلم / بكتيريا و 10 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7.5.
  2. وضع العلامات SILAC ليشابك الشذرة
    1. تنمو خلايا هيلا في SILAC DMEM المتوسطة، المنضب من ليسين وأرجينين، على أن تستكمل مع FBS 10٪ مدال، 1٪ الجلوتامين، 1٪ القلم / بكتيريا، 10 ملي HEPES 7.5 درجة الحموضة وإما ضوء L-يسين (ليز 0) وL- أرجينين (الارجنتين 0) أو نظرائهم الثقيلة، L-يسين (ليز 8) وL-أرجينين (الارجنتين 10) (مواد الجدول)، في تركيزات النهائي من 73 ملغم / لتر و 42 ملغم / لتر، على التوالي.
    2. تنمو الخلايا لمدة تصل إلى ثمانية أجيال في SILAC المتوسطة لضمان استكمال الأحماض الأمينية تلوينها النظائر التأسيس. تمر الخلايا كل يومين، عندما تصل كثافة 1.0-1.5 × 10 6 خلية / مل، بذر منهم في ميلانoncentration من 3 × 10 5 خلية / مل.
    3. تقييم نمو الخلايا وقدرتها على البقاء في SILAC متوسطة إلى individuate أي تغيير ممكن من علم وظائف الأعضاء التي قد تنجم عن تكوين الأفقر من SILAC المتوسطة؛ للقيام بذلك:
      1. تفقد البصر الخلايا التشكل في المجهر كل يوم خلال وضع العلامات.
      2. عد الخلايا ومنحنيات النمو مؤامرة الخلايا نموا في SILAC مقابل المتوسطة القياسية.

2. الأصلية مناعي لونين (N-رقاقة)

  1. إعداد نواة من الخلايا المستزرعة
    1. استخدام 1-2 × 10 8 خلايا HeLaS3 غير المسماة في التجربة. خلايا الحصاد، وجعل قسامة من 50 × 10 6 خلايا في 50 مل أنابيب الطرد المركزي في 340 وx ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية، وغسلها مع برنامج تلفزيوني الجليد الباردة.
    2. في resuspend كل بيليه خلية في 8 مل الاحتياطي تحلل (الجدول 1)، واحتضان لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية على عجلة دوارة. صب كاليفورنياrefully كل المحللة الخلوية على وسادة السكروز (الجدول 1) وأجهزة الطرد المركزي في الدوار سوينغ التدريجي في 3،270 x ج لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية، لفصل النوى من السيتوبلازم.
    3. تجاهل supernatants، والحفاظ على الكريات النووية وغسلها مرتين في برنامج تلفزيوني الجليد الباردة بواسطة الطرد المركزي، وتجاهل طاف في كل غسل.
  2. Micrococcal نوكلياز (MNase) الهضم (الصغيرة) ومراقبة الجودة لونين بعد الهضم
    1. resuspend الكرية النووي غسلها في 1 مل العازلة الهضم (الجدول 1)؛ تقسيم في اثنين aliquots من 500 ميكرولتر والحفاظ على الجليد.
    2. قياس الكثافة الضوئية (OD) في 260 نيوتن متر من قسامة، المخفف 1:200 في 0.2٪ كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS) ملاحظة: OD = 1 يعادل حوالي 50 ميكروغرام / مل من الحمض النووي لونين. عادة، بدءا من 2 × 10 8 خلايا، والتطوير التنظيمي هو في حدود 40-60.
    3. تأخذ 1٪ من النوى، إضافة MNase انزيم إلى تركيز النهائي من 0.005 U انزيم / ميكرولتر من النوى واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة هفوات مختلفة الوقت (0، 10، 20، 40، 60 دقيقة).
    4. في كل نقطة زمنية، وجمع 4 ميكرولتر من نوى هضمها وإضافة 1 ملم EDTA لوقف رد الفعل MNase. الحفاظ على الجليد.
    5. استخراج عينات من الحمض النووي من قبل PCR عدة تنقية وأزل لهم في 50 ميكرولتر TE العازلة (الجدول 1).
    6. يستغرق 20 ميكرولتر من كل عينة الحمض النووي، وإضافة 10 ميكرولتر تحميل العازلة (الجدول 1) وتحميل العينات على 1٪ (ث / ت) التي تحتوي على هلام الاغاروز إيثيديوم الميثيل، مع PCR علامة كعنصر تحكم الحجم.
    7. تحقق عملية الهضم تقييم سلم النيوكليوسومات لونين تنتجها MNase الحضانة.
    8. اختيار الوقت الأمثل لعملية الهضم، استنادا إلى انتشار أحادية Nucleosomes للفي التحضير. . عادة ل0.005 U انزيم / ميكرولتر من نوى الوقت الأمثل للMNase الهضم هو 60 دقيقة (الشكل 1B، اللوحة اليسرى) ملاحظة: تركيز / الوقت الأمثل للMNase digestiويمكن تعديل على هذا يتوقف على نوع من الخلايا المطلوبة وعلى حجم Nucleosomes للامتداد.
  3. Large-scale/preparative MNase الهضم والتعافي من كسور لونين للذوبان
    1. إضافة إلى كل قسامة (انظر 2.2.1) 5 ميكرولتر MNase الموافق تركيز النهائي من 0.005 U انزيم / ميكرولتر من النوى؛ المزيج بلطف واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة (أو بشكل عام عن الفاصل الزمني الأمثل، استنادا إلى اختبار على نطاق صغير).
    2. إضافة 1 ملم EDTA لوقف رد الفعل والحفاظ على الجليد. بيليه نوى هضمها بواسطة الطرد المركزي في 7،800 XG في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. نقل supernatants (جزء S1) في أنبوب جديد وتخزينها في 4 درجات مئوية. ملاحظة: يحتوي S1 أول جزء للذوبان من لونين تضم أحادية Nucleosomes لل. إضافة مثبطات الأنزيم البروتيني (الجدول 1).
    3. Resuspend الكريات بعناية في 1 مل العازلة غسيل الكلى (الجدول 1) وdialyze بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية (جحزب التحرير الخروج من أنبوب غسيل الكلى هو 3.5 كيلو دالتون)، في 3 L غسيل الكلى العازلة، مع التحريك المستمر خفيفة. جمع المواد مدال وأجهزة الطرد المركزي في 7،800 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. نقل طاف (S2 جزء) في أنبوب إيبندورف جديدة وتخزينها في 4 درجات مئوية. ملاحظة: S2 يتألف دي لEPTA-Nucleosomes لل، اعتمادا على مدى MNase الهضم.
  4. مراقبة الجودة من لونين قبل مناعي
    1. اتخاذ قسامة الموافق 5 ميكروغرام من S1 و S2 الكسور لونين (كميا عن طريق قياس OD في 260 نانومتر في نظام معمل NanoDrop). استخراج الحمض النووي عن طريق PCR عدة تنقية وأزل في 50 ميكرولتر TE العازلة (الجدول 1).
    2. يستغرق 20 ميكرولتر من الحمض النووي S2 S1 و، مع مزيج 10 ميكرولتر تحميل العازلة (الجدول 1) وتحميلها على 1٪ (ث / ت) agarose هلام. تحقق من جودة وكفاءة MNase الهضم عن طريق التفتيش البصري للسلم Nucleosomes للملاحظة: جزء S1 هو غايةالمخصب في أحادية Nucleosomes لل، في حين كسر S2 يحتوي أساسا بولي Nucleosomes لل(1B الشكل، لوحة على اليمين).
  5. حضانة لونين مع الأجسام المضادة
    1. تخزينها في -20 درجة مئوية 50 ميكرولتر من S1 جزء لاحقة تحليل الطيف الكتلي.
    2. إضافة 1 حجم رقاقة التخفيف العازلة (الجدول 1) إلى جزء S1.
    3. إضافة الأجسام المضادة ضد hPTM (أو البروتين) في المصالح؛ احتضان بين عشية وضحاها على عجلة دوارة في 4 درجات مئوية. ملاحظة: عادة، استخدام 10 ميكروغرام إلى 20 ميكروغرام من الأجسام المضادة ل2 × 10 8 خلايا. النسبة المثلى بين كمية الأجسام المضادة وخلايا بدءا رقم يجب تعيين بعناية كل حالة على حدة، اعتمادا على وفرة من hPTM / بروتين يستخدم كطعم ضمن العينة وعلى كفاءة الجسم المضاد. الأمثل هو التجريبية، استنادا إلى الاختبارات التالية:
      1. مقارنة كمية hPTM / البروتين في المصالح بين المدخلات والتدفق من خلال (FT،انظر 2.7.2) من قبل لطخة غربية أو MS للتحقق من أن مناعي يثري نسبة كبيرة من المنطقة لونين محددة ملاحظة: ويتم ذلك عادة عندما يتم استنفاد 50٪ على الأقل من الطعم hPTM / البروتين في FT (الشكل 1C) .
      2. تأكد من أن البروتين immunoprecipitated من الفائدة هو ظاهرة على هلام SDS-PAGE، والتي تضمن أن كمية كافية من المواد متاحة للتحليل MS ملاحظة: إن وجود على هلام من عصابات المقابلة لhistones الأساسية الأربعة في العناصر المتفاعلة الصحيح يشير إلى أن النيوكليوسومات سليمة وقد immunoprecipitated التي كتبها N-ChroP (1D الشكل). عدم وجود العناصر المتفاعلة الصحيح هو في الواقع يدل على التقويض الجزئي / تتكشف من النيوكليوسومات.
    4. في موازاة ذلك، يعد البروتين يقترن G حبات المغناطيسي (انظر 2.6).
  6. موازنة وحجب البروتين يقترن G حبات المغناطيسي
  7. تتوازن 100 ميكرولتر من البروتين حبات مغناطيسية G-جانب الطين في عرقلة الحل (الجدول 1)، وغسل ثلاث مرات وتفرخ لهم بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على عجلة دوارة ملاحظة: بعد القدرة ملزم من الخرز، واستخدام 100 ميكرولتر من الطين ل 2-20 ميكروغرام من الأجسام المضادة.
  8. تغسل حبات منعت مرة واحدة مع عرقلة الحل ثم مرتين مع الشذرة التخفيف العازلة (الجدول 1).
  • عزل لونين باستخدام الخرز المغناطيسي
    1. إضافة 100 ميكرولتر من الخرز منعت لونين العينة S1 واحتضان لهم على عجلة دوارة في 4 درجات مئوية لمدة 3 ساعة. أجهزة الطرد المركزي في 340 x ج لمدة 1 دقيقة لتدور باستمرار عينة من غطاء من النصائح. وضعها في رف المغناطيسي لتكوير الخرز.
    2. نقل طاف لأنبوب إيبندورف جديدة. هذا هو تدفق من خلال (FT)، وهي جزء من لونين التي لم ربط الأجسام المضادة.
    3. تغسل حبات أربعةمرات في غسل العازلة (الجدول 1) زيادة تركيز الملح في كل غسل (75، 125 و 175 ملي مول كلوريد الصوديوم).
    4. لأزل لونين immunoprecipitated، واحتضان حبات في 30 ميكرولتر من عينة LDS العازلة، على أن تستكمل مع 50 ملي dithiothreitol (DTT) لمدة 5 دقائق عند 70 درجة مئوية. فصل البروتينات مزال على 4-12٪ مكرر تريس الأكريلاميد SDS-PAGE مسبقة الصب التدرج جل وصمة عار الجل مع صمغي Coomassie عدة تلطيخ (الشكل 1D).

    • 3. يشابك مناعي لونين (X-الشذرة)

    1. يشابك من الخلايا مع الفورمالديهايد
      1. إضافة 0.75٪ الفورمالديهايد إلى الخلايا المسمى SILAC، مزيج لفترة وجيزة واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إخماد الفورمالديهايد بإضافة 125 ملي الجلايسين واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      2. تقسيم الخلايا في 5 × 10 7 مأخوذة؛ شطف لهم ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني الجليد الباردة بواسطة الطرد المركزي في 430x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، والتخلص من supernatants بعد كل غسل. في غسل الماضي، وتجاهل طاف والحفاظ على بيليه. ملاحظة: بمجرد crosslinked الخلايا، ويمكن تخزينها في -80 درجة مئوية، إذا لم يتم استخدامها على الفور.
    2. إعداد نوى
      1. في resuspend كل بيليه خلية في 10 مل الاحتياطي تحلل (الجدول 1). احتضان لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية مع التناوب. أجهزة الطرد المركزي في 430 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل supernatants؛ تبقي الكريات النووية.
      2. في resuspend كل بيليه في 10 مل النووية غسل العازلة (الجدول 1). يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة على عجلة دوارة.
      3. أجهزة الطرد المركزي في 430 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل supernatants وجمع الكريات.
      4. في resuspend كل الكريات النووية في 3 مل الشذرة الحضانة العازلة (الجدول 1). الحفاظ على الجليد.
    3. صوتنة لونين ومراقبة الجودة
      1. يصوتن الفصل. romatin في 200 W (دورات 30 ثانية "على" و1 دقيقة "قبالة")، في Bioruptor تبريد، لتفتيت لونين ملاحظة: يعتمد على عدد من الدورات وفترات صوتنة على نوع من الخلايا ومتوسط ​​طول النووي nucleosomal تمتد المطلوب. عادة، و 30 دقيقة من صوتنة ضرورية لتوليد شظايا الحمض النووي من 300-500 سنة مضت في أطوال الموافق ثنائي وثلاثي Nucleosomes لل. اختيار حجم شظايا يعتمد على نوع المجال لونين قيد التحقيق.
      2. تأخذ 2٪ من مجموع المدخلات، عكس يشابك قبل الحضانة عند 65 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 1 ساعة في الحضانة الشذرة العازلة. استخراج الحمض النووي عن طريق PCR عدة تنقية، أزل في 50 ميكرولتر TE العازلة وتحميل DNA على هلام الاغاروز للتحقق تجزئة لونين.
    4. حضانة لونين مع الأجسام المضادة
      1. إضافة حجم 1/10 من 10٪ تريتون X-100 لونين و sonicated. أجهزة الطرد المركزي في 12،000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية لتكوير ديخسارتك.
      2. انقاذ 50 ميكرولتر من المدخلات لونين من خلايا الثقيلة لاختبار مستوى إدماج الأحماض الأمينية SILAC في الخلايا المسمى وللبروتين التنميط.
      3. إضافة الضد من اختيار لونين المتبقية المسمى الثقيلة والخفيفة واحتضان بين عشية وضحاها و sonicated في 4 درجات مئوية على عجلة دوارة. في القناة الخفيفة، إضافة أيضا أضعاف الزيادة في الببتيد القابلة للذوبان. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على عجلة دوارة ملاحظات: يتم اختيار الشرط الأمثل بين ميكروغرام من الأجسام المضادة والمواد بدءا من الخلايا كل حالة على حدة، كما نوقش في 2.5.3. الأمثل المولية أضعاف الزيادة في الببتيد القابلة للذوبان في يتعلق الضد يجب معاير بعناية كل حالة على حدة.
    5. عزل لونين باستخدام الخرز المغناطيسي
      1. تتوازن ومنع البروتين يقترن G حبات مغناطيسية وذلك باتباع الخطوات الموضحة في 2.6 واستخدام رقاقة العازلة الحضانة.
      2. إضافة 100 ميكرولتر من سدت بEADS للعينات لونين واحتضان على عجلة دوارة لمدة 3 ساعة على 4 درجات مئوية. أجهزة الطرد المركزي في 340 x ج لمدة 1 دقيقة لتدور باستمرار عينة من غطاء من النصائح. وضعها في رف المغناطيسي لتكوير الخرز. طاف هو تدفق من خلال (FT)، التي تحتوي على Nucleosomes للغير منضم. غسل حبات أربع مرات في غسل العازلة (الجدول 1) مع زيادة تركيز الملح (اثنان يغسل في 150 ملي واثنين على 300 ملي مول كلوريد الصوديوم).
      3. احتضان حبات في 30 ميكرولتر عينة SDS-PAGE تحميل العازلة (الجدول 1) ومدة 25 دقيقة في 95 درجة مئوية لكلا أزل وإزالة البروتينات immunoprecipitated تشعبي. البروتينات منفصلة على 4-12٪ مكرر تريس الأكريلاميد SDS-PAGE المواد الهلامية مسبقة الصب (الشكل 3D).

    4. إعداد نموذج قبل MS

    1. في جل هضم الهستونات المخصب من N-الشذرة
      ملاحظة: أثناء اتخاذ الهضم من البروتين والببتيد استخراج الخطوات الرعايةللحد من التلوث الكيراتين التي تتداخل مع LC-MS/MS، كما هو موضح سابقا 22 و 23.
      1. قطع شرائح هلام المقابلة لhistones الأساسية العصابات (1D الشكل). دي صمة عار القطع هلام مع 50٪ أسيتونتريل (ACN) في DDH 2 O، بالتناوب مع 100٪ ACN لتقليص هلام. تكرار حتى يتم تماما دي الملون والمواد الهلامية القطع وتجفيفها في جهاز للطرد المركزي فراغ.
      2. إضافة D 6 الخليك أنهيدريد 01:09 (ت / ت) في 1 M بيكربونات الأمونيوم (NH 4 HCO 3) (عادة الحجم النهائي هو 60-100 ميكرولتر) و 3 ميكرولتر خلات الصوديوم (CH 3 COONa)، والمحفز. احتضان لمدة 3 ساعة على 37 درجة مئوية مع الهز قوي ملاحظة: العينة قد تولد فقاعات في الدقائق الأولى بعد التجميع من ردود الفعل: من المهم التعامل بحذر والافراج عن الغاز ولدت، وفتح من وقت لآخر للأنابيب أثناء الحضانة.
      3. شطف القطع هلام عدة مرات ثإيث NH 4 HCO 3، تتناوب مع ACN إلى زيادة مئوية (من 50٪ الى 100٪)، من أجل القضاء على مخلفات D أنهيدريد الخليك 6 تماما.
      4. تقليص قطعة هلام في 100٪ ACN؛ تجفيفها في جهاز للطرد المركزي فراغ لضمان كاملة إزالة الماء. إعادة هيدرات قطعة هلام مع الثلج الباردة 100 نانوغرام / ميكرولتر حل التربسين في 50MM NH 4 HCO 3 واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. ملاحظة: مزيج من التعديل الكيميائي للlysines باستخدام أنهيدريد الخليك بالديوتيريوم والتربسين الهضم يولد "الارجنتين- C أحب "في نمط الهضم هلام من الهستونات 21،24.
      5. تجاهل الحل الزائدة وإضافة حجم 50 ملي NH 4 HCO 3 لتغطية كامل القطع هلام؛ احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
      6. جمع الببتيدات هضمها للذوبان في أنبوب إيبندورف جديدة. يجفد الببتيدات. في resuspend لهم في 0.5٪ الخليك acid/0.1٪ حمض trifluoracetic (TFA). Desalt والتركيزالببتيدات على عكس المرحلة C 18 / الكربون "ساندويتش"، والتبادل الأيوني اللوني (SCX) على microcolumns يدوية الصنع (StageTip) 25.
      7. إعداد microcolumns StageTip عن طريق وضع أقراص تحتوي على شبكه تفلون يجمد C 18 / الكربون ("ساندويتش") وحبات SCX في 200 نصائح ميكرولتر. الحصول على "ساندويتش" عن طريق تحميل microcolumn C 18 على رأس تلميح الثانية محملة فلتر الكربون ملاحظة: إن الببتيدات قصيرة جدا، وهذا لا يتم الاحتفاظ على مرشح C 18، وتمرير في التدفق من خلال التي يتم تحميلها مباشرة على تلميح الكربون، والتي عادة ما يلتقط لهم. يمكن StageTips SCX إثراء الببتيدات محددة، مثل H3 (3-8) الببتيد، لا يتم الاحتفاظ بكفاءة من خلال عكس المرحلة اللوني.
      8. الحمل 50٪ من الببتيدات على C 18 / الكربون "StageTip شطيرة" و 50٪ على SCX StageTips. أزل لهم من نصائح C 18 / الكربون باستخدام 80٪ ACN/0.5٪ ميلان الخليكومعرف من نصائح SCX مع هيدروكسيد الأمونيوم 5٪ (NH 4 OH) / 30٪ الميثانول. بعد الببتيدات تجفيد، resuspend في 0.1٪ FA وتحليل من قبل LC-MS/MS.
    2. في جل هضم البروتينات immunopurified
      ويتم في جل هضم البروتينات خارج كما هو موضح سابقا 22، مع تعديلات طفيفة.
      1. قطع كل حارة في عشر شرائح (الشكل 3D) وكل شريحة في مكعبات صغيرة من 1 مم 3. دي صمة عار القطع هلام مع 50 ملي NH 4 HCO 3/50٪ من الإيثانول وإضافة الإيثانول المطلق لتقليص المواد الهلامية. كرر حتى المواد الهلامية هي تماما ملطخة دي.
      2. إضافة العازلة التخفيض (الجدول 1) إلى القطع هلام لمدة 1 ساعة عند 56 درجة مئوية، تليها إضافة العازلة الألكلة (الجدول 1) لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، في الظلام. غسل وتجفيف القطع هلام في فراغ الطرد المركزي.
      3. ترطيب قطعة هلام مع الثلج الباردة 12.5 نانوغرام / ميكرولتر التربسين سولution في 50 ملي NH 4 HCO 3 واحتضان على الجليد حتى الإماهة كاملة من القطع هلام. إزالة التربسين في الزائدة.
      4. إضافة 50 ملي NH 4 HCO 3 لتغطية كامل القطع هلام. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
      5. جمع الجزء السائل. إضافة العازلة استخراج (الجدول 1) إلى القطع هلام؛ احتضان مع الانفعالات القوية لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. كرر مرتين.
      6. احتضان القطع هلام في ACN لمدة 10 دقيقة مع الانفعالات القوية. كرر مرتين وتجميع جميع supernatants.
      7. يجفد الببتيدات. في resuspend الببتيدات المجففة في 0.5٪ الخليك acid/0.1٪ TFA.
      8. Desalt والتركيز الببتيدات على عكس المرحلة C 18 StageTip، كما هو موضح 26، 27.
      9. أزل الببتيدات من StageTip C 18 باستخدام 80٪ ACN/0.5٪ حامض الخليك. إزالة المذيبات العضوية عن طريق تبخير في جهاز للطرد المركزي فراغ و resuspend الببتيدات في 0.1٪ FA (عادة 5-10 و# 181؛ ل)، عندما تصبح جاهزة لتحليل MS.

    5. LC-MS تحليل

    1. التحليل اللوني السائل
      1. حزمة العمود التحليلية في 15 سم تنصهر السيليكا باعث (75 ميكرون القطر الداخلي، 350 ميكرون القطر الخارجي)، وذلك باستخدام عكس المرحلة (RP) C 18، 3 الراتنج ميكرومتر في الميثانول، عند ضغط الهيليوم ثابتة (50 بار) باستخدام الجهاز قنبلة لودر، كما هو موضح سابقا 28.
      2. زوجين باعث (C 18 العمود RP) معبأة مباشرة إلى منفذ صمام 6 المنفذ من خلال HPLC طويلة (25 ميكرون القطر الداخلي) 20 سم، وتنصهر السيليكا دون استخدام ما قبل العمود أو الجهاز الانقسام.
      3. تحميل الببتيدات هضمها في العمود C 18 RP في تدفق 500 NL / دقيقة الطور المتحرك A (0.1٪ FA / 5٪ ACN في DDH 2 O).
      4. بعد عينة التحميل وفصل الببتيدات باستخدام التدرجات التالية:
        1. تطبيق 0-40٪ الطور المتحرك B (0.1٪ FA/99٪ ACNفي DDH 2 O) في 250 NL / دقيقة أكثر من 90 دقيقة تليها التدرج من 40-60٪ في 10 دقيقة و 60-80٪ خلال 5 دقائق، لشطف من الببتيدات المستمدة من الهستونات (انظر 2).
        2. تطبيق 0-36٪ في الطور المتحرك B 250 NL / دقيقة أكثر من 120 دقيقة تليها التدرج من 36-60٪ في 10 دقيقة و 60-80٪ خلال 5 دقائق، لشطف من الببتيدات المستمدة من البروتينات immunopurified (انظر 3).
    2. تحليل الطيف الكتلي باستخدام LTQ-FT-ICR-الترا مطياف الكتلة
      1. تعمل في الاستحواذ التي تعتمد على البيانات (DDA) واسطة للتبديل تلقائيا بين MS واكتساب MSMS. يتم الحصول على MS أطياف مسح كامل، وعادة في نطاق م / ض من 200-1،650، ​​ويكتسب لقرار R = 100،000 في 400 م / ض. يتم عزل الخمسة (TOP5) الأيونات على أشده للتجزئة في فخ ايون الخطية باستخدام التفكك المستحث الاصطدام (CID) بقيمة 5،000 هدف.
      2. استخدام المعلمات المدرجة في الجدول 2 FOص على "ضبط" ملف الاستحواذ.
      3. تعيين إعدادات اقتناء القياسية كما هو موضح في الجدول رقم 2.

    6. تحليل البيانات

    1. تسمية الكمي خالية من التعديلات هيستون التخصيب المشترك في المجالات الكروماتين
      1. تحويل الملفات الخام المكتسبة إلى ملفات إم جي إف باستخدام Raw2msm البرمجيات (الإصدار 1.10) 29.
      2. بحث التعديلات هيستون باستخدام برنامج Deamon التميمة (الإصدار 2.2.2)، تعيين المعلمات وصفها في الجدول 3.
      3. على التميمة الانتاج القائمة الببتيد، وإزالة الببتيدات مع درجة أقل من 15 أو أكثر من 5 PTMs المفترضة 29 ملاحظة: للحصول على كل معرف الببتيد واحد، حدد الببتيد وفقا لأعلى درجة التميمة وتصفية جميع الببتيدات زائدة أخرى مع نفس معرف .
      4. بناء المخططات الاستشرابية أيون استخراج (XIC) لكل السلائف المقابلة لكل الببتيدات المعدلة والسفلىإد على قيمة م / ض، وذلك باستخدام QualBrowser. حساب مساحة تحت المنحنى (AUC) لكل الذروة (الشكل 2A).
      5. التحقق من صحة كل الببتيدات تحتوي على التعديلات التي تم تحديدها عن طريق التفتيش البصري من أطياف MS / MS باستخدام QualBrowser (الشكل 2B).
      6. حساب الوفرة النسبية لكل الببتيد المعدلة. حساب تخصيب النسبية لكل التعديل في المواد الشذرة إد ملاحظة: يتم احتساب فرة النسبية كنسبة بين مفوضية الاتحاد الأفريقي من كل الببتيد تعديل محددة على مبلغ من الجامعة الأمريكية بالقاهرة من جميع أشكال معدلة وغير معدلة من نفس الببتيد، في حين النسبية تخصيب كنسبة من الوفرة النسبية للتعديل محددة في الشذرة على الإدخال (الشكل 2C).
    2. تحليل البروتين الكمي من البروتينات المرتبطة شارك ضمن المجالات لونين
      1. لتحديد وتقدير البروتينات استخدام حزمة MaxQuant(http://www. maxquant.org /) 30. تكوين محرك البحث المدمج في "أندروميدا" باستخدام AndromedaConfig.exe 31 وتعيين معلمات البحث المدرجة في الجدول 3.
    3. اختبار التأسيس
      1. تقدير درجة التأسيس من الأحماض الأمينية إلى بروتينات الثقيلة في الثقيلة المسمى إدخال لونين، وذلك باستخدام البرمجيات MaxQuant، على النحو التالي:
        1. تعيين المعلمات كما هو موضح في 6.2 ولكن تعطيل خيار إعادة تحديد.
        2. حساب النسبة المئوية التأسيس تطبيق الصيغة التالية لنسب الببتيد غير زائدة: التأسيس (٪) = نسبة (H / L) / نسبة (H / L) + 1 × 100 (الشكل 3B) ملاحظة: قبول إلا إذا دمج> 95 ٪.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    مناعي لونين هي تقنية قوية تستخدم لملف توطين البروتين أو تعديل هيستون على طول الجينوم. في ما يعادل البروتينات، ويتبع الشذرة بواسطة البروتينات يستند إلى MS-لتحديد نوعيا وكميا في hPTMs، المتغيرات بروتينات بسيطة وملزم لونين التي immunoprecipitated جنبا إلى جنب مع تعديل أو البروتين من الفائدة، كما تستخدم "الطعم". في نهج N-ChroP، والموضحة في الشكل 1A، ورقاقة الأم، التي يتم هضمها لونين مع MNase (الشكل 1B)، ويستخدم كمدخل لتنقية الأكبر من الكروماتين مجال ظيفية متميزة. وحضنت لونين هضمها المخصب في أحادية Nucleosomes للمع الأجسام المضادة المحددة ويتم فصل البروتينات immunopurified بواسطة SDS-PAGE. في المثال الموضح، H3K9me3، علامة لونين الصمت 32،33، ويستخدم لإعداد النهج. ويستند الاختيار على حقيقة أن كلا من دور وظيفي على النحووكذلك بعض interactors البروتين وصفا جيدا. وعلاوة على ذلك، والضد محددة وفعالة للغاية الأمثل لالشذرة متاح 34، كما أكد أيضا عن طريق التفتيش البصري من هلام Coomassie، حيث النيوكليوسومات سليمة، مع histones الأساسية في العناصر المتفاعلة الصحيح، غير المخصب بكميات مناسبة لمرض التصلب العصبي المتعدد (الشكل 1D ).

    المقارنة بين كمية H3K9me3 موجودة في التدفق من خلال (FT) والمدخلات (IN) يشير إلى أن حوالي 50٪ من المنطقة من اهتمام وimmunopurified، باستثناء خطر بسبب وجود تحيز في إثراء قاصر يبلغ عدد سكانها الفرعية لل لونين (الشكل 1C). يعمل MS لتوصيف PTMs المشترك المصاحب داخل Nucleosomes للالمخصب: يتم هضم كل هيستون الأساسية باستخدام بروتوكول مصممة مخصصة من أجل تحقيق "الارجنتين-C مثل" الهضم، في هلام بولي أكريلاميد. في الواقع، من ناحية الارجنتين-C هو أفضل البروتيني للتحليل MS من hPTMs بecause أنها تنتج الببتيدات من طول الأمثل؛ من ناحية أخرى، فإنه لا يلتصق بكفاءة في هلام. للتغلب على هذا القيد، بروتوكول لدينا مصممة يستغل الألكلة الكيميائية ليسين التي يحتضنها العصابات هلام هيستون مع بالديوتيريوم (D 6) أنهيدريد الخليك-، تليها التربسين الهضم تحقيقها. منذ التربسين لا يلتصق D lysines 3 الأسيتيل، والببتيدات الناتجة يقلد الخليط على "الارجنتين-C مثل" النمط (الشكل 1E).

    إضافة إلى D-3 الاسيتيل شاردة ليسين تنتج كتلة دلتا لا لبس فيها من 45.0294 دالتون، التمييز بين acetylations الأصلي، وأضاف كيميائيا في MS. وعلاوة على ذلك، D-3 أستلة تقدم اثنين من المزايا الإضافية التي تسهل الفطنه من الببتيدات المعدلة إسوي الضغط: أولا، يحدث الألكلة فقط على lysines معدلة وميثليته أحادية، ولكن ليس على بقايا ثنائي وثلاثي ميثليته؛ على هذا النحو الببتيدات المعدلة تحمل نفس طفلزينت آل عدد من التعديلات ولكن في ترتيبات مختلفة بشكل مختلف من قبل مجموعة متميزة من الفئات D-3 الاسيتيل التي تنتج تحولات لا لبس فيها م / ض. الثانية، وأنماط متميزة من D-3 الألكلة يسبب مرات الاحتفاظ مختلفة قليلا في اللوني السائل على العمود مرحلة العكسي، التي تولد مستوى إضافي من الانفصال عن الببتيدات المعدلة إسوي الضغط 21.

    بعد التحقق من صحة جميع hPTMs عن طريق التفتيش اليدوي من المقابلة MS / MS الأطياف (الشكل 2B)، ويتحقق الكمي حرة التسمية في خطوتين: الأولى، نحسب الوفرة النسبية للكل تعديل باستخدام كثافة إشارة من الأنواع غير معدلة وتعديلها لالببتيد المقابلة، وتقاس من خلال حساب الاستشرابية أيون استخراج (XIC) (الشكل 2A و 2C، اللوحة العليا)؛ الثانية، ويقدر تخصيب النسبية كنسبة بين الوفرة النسبية لكل modificatioن في octamer الشذرة إد والوفرة النسبية المقابلة من المدخلات (الشكل 2C، اللوحة السفلى). تحليل H3 يظهر (9-17) الببتيد في إثراء ثنائي وثلاثي ميثليته K9، مع نضوب المقابلة من أشكال معدلة وأحادية ميثليته (الشكل 2C). مع هذا النتائج مراقبة إيجابية بالنسبة للأجسام المضادة خصوصية، للجمعية التعاون أو استنفاد كافة التعديلات الأخرى يمكن تقييمها، سواء على المستوى الجزيئي داخل على نفس H3 وعلى المستوى المشترك بين الجزيئية، على الهستونات أخرى التخصيب المشترك داخل نفس جسيم نووي. وهذا يسمح للفحص hPTMs محادثات الصليب في المجالات H3K9me3، ما يسمى ب "modificome المغاير" (الشكل 2D): لوحظ في إثراء كبير من علامات المعروفة المرتبطة إسكات الجينات، مع نضوب المقابلة من علامات مرتبطة مع تنشيط الجينات . بالإضافة إلى ذلك، تم الكشف عن جمعيات جديدة مثل تخصيب H3K18mE1.

    للكشف عن جميع البروتينات شارك ربط داخل المغاير، يتم الجمع بين يشابك الشذرة الكلاسيكية مع SILAC (مستقر النظائر وسمها بواسطة الأحماض الأمينية في خلية ثقافة) (الشكل 3A). في التجربة SILAC، يتم استبدال يسين وأرجينين (شكل ضوء) مع النظير المسمى isotopically بها (شكل الثقيلة) في المتوسط ​​زراعة. على الخلايا المزروعة وتكرارها في كل من الضوء وسائل الإعلام الثقيلة، ويتم دمج اثنين من الأحماض الأمينية تفاضلي ترميز النظائر عملية الأيض في البروتينات، وتوليد الخفيفة والثقيلة أشكال البروتينات، على التوالي، التي يمكن تمييزها من قبل MS، بسبب Δmass محددة. قبل البدء في التجربة SILAC على نطاق واسع، يتم تقييم كفاءة وضع العلامات، وحساب مستوى التأسيس، التي تقاس على أنها جزء من نسبة الببتيدات الثقيلة مقابل مبلغ منها الثقيلة والخفيفة، وجدت في العينة وصفت الثقيلة فقط. دمج متفوقة على 95٪ لكل من أرجينين الثقيلة وانهمطلوب AVY يسين البروتين الكمي للدقيقة (الشكل 3B). بعد يشابك من الخلايا الثقيلة والخفيفة، تم تجزئة لونين من قبل صوتنة. يستخدم SILAC بالتزامن مع فحص المنافسة باستخدام أضعاف فائض قابل للذوبان الببتيد H3 (QTAR K STGG) التي تحمل ثلاثي مثيلة على K9 من أجل تميز interactors محددة H3K9me3 من الخلفية. يتم إضافة الببتيد القابلة للذوبان في الزائدة إلى واحد من اثنين من التجارب SILAC الشذرة، حيث التشبع قدرة ملزمة من الأجسام المضادة، وبالتالي "خارج المنافسة" غالبية H3K9me3-Nucleosomes لل، وبالتالي كل interactors محددة. في القناة SILAC أخرى، لا يتم إضافة الببتيد المتنافسة إلى الشذرة ومناعي يحدث عادة. وعادة ما يتم تنفيذ التجارب SILAC المنافسة في مكررة في ما يسمى ب "إلى الأمام" و "عكس" الأشكال، حيث تحولت المنافسة مع الببتيد القابلة للذوبان الزائدة من اله الثقيلة (H) إلى النور (L) عينات لونين. هذه النتائج في مقلوب التكميلية قراءات نسبة SILAC، وتستخدم لتمييز حقيقي من المجلدات غير محددة: البروتينات التخصيب تحديدا موجودة مع أعلى كثافة في شكل كثيف في المقارنة مع النموذج ضوء (نسبة البروتين H / L> 1) في التجربة حيث الزائدة يضاف الببتيد إلى القناة الضوء (مهاجم) (4A الشكل، لوحة العلوي)؛ اتجاه المعاكس (نسبة البروتين H / L <1) لوحظ في النسخة المتماثلة عكسي (الشكل 4A، اللوحة السفلى). البروتينات التي كثافة في شكل الثقيلة والخفيفة متشابهة في كل من الأمام وعكس التجارب تنتج نسبة ثابتة قريبة إلى 1 وتصنف على أنها الخلفية (الشكل 4B).

    اختيار أضعاف الزائدة الأمثل لالببتيد القابلة للذوبان مهم ويجب ضبطها بدقة. عادة، وضعنا الصحيح نسبة الأجسام المضادة إلى الببتيد إجراء فحص المنافسة باليودنانوغرام التخفيفات المسلسل من الببتيد الزائدة وبمقارنة مستوى "الطعم" (hPTM / البروتين) بين الشذرة مراقبة إيجابية، حيث لا يتم إضافة الببتيد، ومختلف رقائق المنافسة المسلسل، من خلال لطخة غربية أو MS. عموما، ويقلل من الأمثل الزائدة أضعاف الببتيد من حوالي 90٪ من كمية hPTM / البروتين في المواد immunoprecipitated. في الواقع، من ناحية، وأكبر نسبة البروتين التي تم الحصول عليها، وارتفاع قوة التمييز من SILAC؛ من ناحية أخرى، والتشبع المفرط من قبل الببتيد قد طرد تماما المجلدات المحددة من الأجسام المضادة، مما يؤدي إلى نسب في عداد المفقودين H / L لالكمي والتحليل الإحصائي. لH3K9me3 الضد حددنا نسبة الصحيح عن طريق قياس نسبة H / L لQTARK (me3) STGG الببتيد، في اختبار المنافسة التي أجريت في الأمام إعداد وأخذنا هذه القيمة كمقياس للكفاءة المنافسة (الشكل 3C ).

    تقاطع الأمام ود عكسي التجارب X-الشذرة يؤدي إلى التعرف على 635 البروتينات والحاضر في كل التجارب وكميا مع 2 على الأقل بحساب النسبة. 2 مؤامرة سجل نسب H / L بهم تمثل ما يسمى "heterochromatome" (الشكل 4C)، حيث يتم تحديد interactors H3K9me3 حقيقية لا لبس فيه مثل البروتينات الموجودة ضمن أفضل 40٪ من نسبة التوزيعات البروتينات (العلوي الأيمن من رباعي مؤامرة مبعثر والشكل 4D).

    الشكل 1
    الشكل 1: عرض تخطيطي لسير العمل N-ChroP A) مخطط الشذرة الأم جنبا إلى جنب مع تحليل MS. يتم هضم لونين من الخلايا مع MNase وimmunoprecipitated الكسر المخصب في أحادية Nucleosomes لل(S1) باستخدام مضاد للH3K9me3 الأجسام المضادة. يتم فصل البروتينات Immunopurified بواسطة SDS-PAGE وhistones الأساسية هي في مع بروتوكول مخصصة لمحاكاة عملية الهضم والارجنتين-C-هضمها هلام. ويتم تحليل الببتيدات بواسطة nano-LC-MS/MS. ويتم تحديد PTMs هيستون، المصادق عليها من قبل التفتيش اليدوي للMS / MS الأطياف وكميا B) اختبار MNase الصغيرة: الحمض النووي حل على 1٪ هلام الاغاروز بعد الهضم لونين مع مرور الوقت في MNase مختلفة (اللوحة اليسرى)؛ MNase الهضم على نطاق واسع: الحمض النووي حل على 1٪ هلام الاغاروز بعد 60 دقيقة من لونين MNase الهضم وبعد انفصال جزء S1، التي تحتوي على أحادية Nucleosomes للمن S2 فصيل، التي تحتوي على البولي Nucleosomes لل(اللوحة اليمنى) C) تقدير تخصيب / استنزاف معدلة، أحادية، دي، و K9-ميثليته الثلاثية في التدفق من خلال (FT) مقارنة المدخلات (IN). يمثل الرسم البياني متوسط ​​± SEM من ثلاث تجارب مستقلة عن كل تعديل. D) SDS-PAGE المدخلات لونين وشارك المناعية البروتينات المنقى: الهستونات الأساسية H3، H4، H2A وH2B مرئية حول وتحت الفرقة 17kDa، مع H3 وH2B المشترك المهاجرة (المربعات السوداء) E) كل هيستون الأساسية من كلا Nucleosomes للimmunoprecipitated والمدخلات هي الألكيلية كيميائيا باستخدام بالديوتيريوم (. D 6) أنهيدريد الخليك قبل التربسين العلاج، من أجل الحصول على "الارجنتين-C مثل" جل في الهضم. مد أنهيدريد الخليك 6 يتفاعل مع المجموعة الأمينية ابسيلون من lysines معدلة وميثليته أحادية ولكن ليس مع ميثليته دي، lysines ثلاثي ميثليته والأسيتيل. نتيجة، يتم حظر النشاط الأنزيمي من التربسين على جميع يسين الأسيتيل الأم والكيميائية، وبالتالي إنتاج "الارجنتين-C مثل" نمط الهضم. تم تعديل هذا الرقم من 21، وذلك باستخدام الشكل 1، الشكل والشكل S1 S5 كمرجع. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

    "FO: المحافظة على together.within صفحة =" دائما "> الرقم 2
    الشكل 2: تحليل الطيف الكتلي من "modificome" H3K9me3 A) تم تكبيره أطياف الشامل والمخططات الاستشرابية أيون استخراج (XIC) التي شيدت في المقابل قيمة م / ض من 2 + شحن معدلة، أحادية، دي، وثلاثي ميثليته K9 في H3 (9-17) الببتيد، سواء بالنسبة للعينات المدخلات والشذرة. ب) الممثل MS / MS الأطياف باستخدام تجزئة إدارة البحث الجنائي. سلسلة ب ليثيوم أيون وذ تسمح لتحديد تسلسل H3 (9-17) الببتيد في توطين وتحديدا للمثيلة ثلاثي على بقايا K9. C) وفرة النسبية لدرجات مختلفة من الحامض على K9 في H3 ( 9-17) الببتيد، يقدر بتقسيم المنطقة تحت المنحنى (AUC) كل الببتيد تعديل على مجموع المناطق المقابلة لاحظ جميع unmodifi إد وأشكال معدلة من هذا الببتيد، في المدخلات والشذرة إد octamer. يمثل الرسم البياني متوسط ​​± SEM من ثلاث تجارب مستقلة لكل تعديل (اللوحة العليا). تخصيب النسبية methylations K9 في H3 (9-17) الببتيد. وأعرب عن تخصيب اليورانيوم كشرط نسبة 2 سجل بين الوفرة النسبية لكل مثيلة في octamer الشذرة إد كما قارن إلى المدخلات. الرسم البياني يمثل متوسطات ± SEM من ثلاث تجارب مستقلة (اللوحة السفلى). D) Heatmap يلخص إثراء جميع hPTMs شارك في ربط التعرف على H3 هيستون، H4 وH2A. كل صف يناظر التعديل مختلفة (الثانية لم يتم الكشف عن التعديلات). تم تعديل هذا الرقم من 21، وذلك باستخدام الشكل 1 الشكل 2 الشكل 3 والشكل S10 كمرجع. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

    "دائما"> الرقم 3
    الشكل 3: منظر تخطيطي لسير العمل ChroP X-A) مخطط يشابك الشذرة جنبا إلى جنب مع تحليل MS. يتم إصلاح الخلايا المزروعة في ضوء وسائل الإعلام الثقيلة مع ومجزأة الفورمالديهايد والكروماتين المدخلات من قبل صوتنة لتوليد شظايا الحمض النووي. في تعيين ما يصل إلى الأمام، وimmunoprecipitated وو sonicated لونين الثقيلة المسمى استخدام الألغام المضادة للH3K9me3 الأجسام المضادة في حين حضنت لونين المسمى الخفيف مع نفس الأجسام المضادة المشبعة مع أضعاف فائض قابل للذوبان الببتيد H3 تحمل K9me3. يتم تجميع البروتينات Immunoprecipitated من chromatins الثقيلة والخفيفة، واستخراج مفصولة SDS-PAGE. ويتم رصد يتم هضمها البروتينات مع التربسين ويتم تحليل الببتيدات بواسطة nano-LC-MS/MS. ب) كفاءة وضع العلامات SILAC حساب إدماج اليس الثقيلةالمعهد الوطني للإحصاء (Lys8) وأرجينين (Arg10) إلى بروتينات. في المؤامرة، وسيطة من توزيع كثافة يسين وأرجينين الببتيدات يساوي 0.974 (الخط الأخضر) و0.964 (الخط الأحمر)، على التوالي. C) تم تكبيره أطياف الشامل في المقابل قيمة م / ض من 2 + تهمة ثلاثي ميثليته K9 في H3 (9-17) الببتيد، سواء بالنسبة للضوء وأشكال الثقيلة، في المدخلات والشذرة إد octamer. بينما في إدخال شدة الثقيلة والخفيفة الببتيد هي قريبة إلى 1، في الأمام SILAC الشذرة، وشدة الضوء الببتيد هو أقل بكثير من واحد من نظيره الثقيلة، مما يدل على أن المنافسة كفاءة. D) SDS-PAGE الضوء (L) والثقيلة (H) المسمى إدخال لونين والمواد immunoprecipitated المشترك: هو قطع الممر المقابل للمادة الشذرة افتتاحية في عشر شرائح (الخط الأسود)، في حين يتم تحليل سوى اثنين من شرائح من المدخلات لتحليل اختبار التأسيس ( الخط الأزرق). تم تعديل هذا الرقم من 21، وذلك باستخدام الشكل 4 والشكل S6 عن إعادةference. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

    الرقم 4
    الشكل 4: تحليل الطيف الكتلي من "interactome" H3K9me3. A) أطياف الكامل الممثل تبين SILAC الزوج الموافق الببتيدات والبروتينات من HP1-2A الكلي: نسب H / L> 1 في التجربة (لوحات العلوي إلى الأمام)، الذي يتجلى في نسب H / L <1 في النسخة المتماثلة عكسي (لوحات الدنيا)، شرح تخصيب محددة من هذه البروتينات في المغاير B) أطياف الكامل مع الممثل SILAC الزوج الموافق الببتيد من البروتين خلفية واحدة: نسب H / L في الأمام وعكس مكررات متساوون إلى 1 C) البروتينات كميا. هي distributإد في مؤامرة مبعثر على أساس بهم SILAC-النسب في الأمام والتجارب عكسي (x و y محاور، على التوالي)؛ الخطوط المنقطة الحمراء تمثل أعلى 40٪ و 30٪ من نسب البروتين، كما هو مبين. نسب D) البروتين التوزيعات من المدخلات (H / L مختلطة 1:01) (أسود)، الأمام (الازرق) وعكس (برتقالي) X-ChroP التجارب؛ الخطوط المنقطة الحمراء تمثل أعلى 40٪ من نسب البروتين، على النحو انقطاع لتحديد interactors حقيقية. تم تعديل هذا الرقم من 21، وذلك باستخدام الشكل 5 كمرجع. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

    العازلة للقسم 2 تركيب
    تحلل العازلة 10٪ سكروز، 0.5 ملي EGTA درجة الحموضة 8.0 و 15 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 60 ملي بوكل، 15 ملي HEPES، 0.5٪ تريتون، 0.5 ملي PMSF، 1MM DTT، 5 ملي ناف، 5 ملي نا 3 VO 4، 5MM NaButyrate، 5 ملغ / مل أبروتينين، 5 ملغ / مل Pepstatin A، 5 ملغ / مل Leupeptin
    وسادة السكروز 2 ز السكروز في 20 مل من الاحتياطي تحلل
    الهضم العازلة 0.32 M السكروز، و 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.6، 4 ملم MgCl2، 1 ملم CaCl2، 0.1 ملي PMSF
    TE العازلة 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.5، 1 ملم EDTA
    غسيل الكلى العازلة 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.6، 1 ملم EDTA، 0.5 ملي PMSF، 5 ملي ناف، 5 ملي نا 3 VO 4، 5MM NaButyrate، مثبطات الأنزيم البروتيني كوكتيل
    الشذرة التخفيف العازلة 100 ملي تريس حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.6، 100 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 10 ملي EDTA
    عرقلة الحل BSA 0.5٪ في برنامج تلفزيوني
    غسل العازلة 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.6،10 ملي EDTA
    مثبطات الأنزيم البروتيني EDTA خالية من مثبطات الأنزيم البروتيني كوكتيل، 0.5 ملي PMSF، 5 ملي ناف، 5 ملي Na3VO4، 5MM NaButyratه
    تحميل العازلة صبغة البرتقال التحميل، و 50٪ (V / V) الجلسرين في H20
    العازلة للباب 3 تركيب
    تحلل العازلة 50 ملي HEPES KOH-7.5 درجة الحموضة، 140 ملي مول كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA، 10٪ الجلسرين، و 0.5٪ NP-40، 0.25٪ تريتون-100، 0.5 ملي PMSF، 5 ملي ناف، 5 ملي نا 3 VO 4، 5MM NaButyrate، 5 ملغ / مل أبروتينين، 5 ملغ / مل Pepstatin A، 5 ملغ / مل Leupeptin
    غسل العازلة 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8، 200 ملي مول كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA، 0.5 ملي EGTA، 0.5 ملي PMSF، 5 ملي ناف، 5 ملي نا 3 VO 4، 5MM NaButyrate، 5 ملغ / مل أبروتينين، 5 ملغ / مل Pepstatin A ، 5 ملغ / مل Leupeptin
    الشذرة العازلة الحضانة 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8، 100 ملي مول كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA، 0.5 ملي EGTA، 0.1٪ deoxycholate الصوديوم، و 0.5٪ lauroylsarcoside الصوديوم، 0.5 ملي PMSF، 5 ملي ناف، 5 ملي نا 3 VO 4، 5 ملي NaButyrate، 5ملغ / مل أبروتينين، 5 ملغ / مل Pepstatin A، 5 ملغ / مل Leupeptin
    غسل العازلة 2 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.6، 2 مم EDTA، 0.1٪ SDS، 1٪ تريتون-100
    العازلة عينة التحميل 250 ملي ثلاثي حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.8، 0.5 M ب المركابتويثانول، 2٪ SDS
    العازلة للقسم 4 تركيب
    الألكلة العازلة 55 ملم في 50 ملم iodoacetamide NH 4 HCO 3
    خفض الاحتياطي 10 ملي dithiothreitol في 50 ملي NH 4 HCO 3
    استخراج العازلة 30٪ و 3٪ ACN TFA في DDH 2 0

    الجدول 1. بمخازن التركيب.

    ضبط ملف الاستحواذ المعلمات
    FT هيئة السلع التموينية كاملةن تراكم القيمة المستهدفة 1 × 10 6؛ الحد الأقصى لملء الوقت 1،000 ميللي ثانية
    ام اس ان تكنولوجيا المعلومات تراكم القيمة المستهدفة 10 × 10 4؛ الحد الأقصى لملء الوقت 150 ميللي ثانية
    إعداد الاستحواذ المعلمات
    الجهد Electrospray 2.4 كيلو فولت
    غمد وتدفق الغاز المساعدة لا
    أيون نقل الحرارة الشعرية 200 ° C
    استبعاد ديناميكية ما يصل إلى 500 أيونات السلائف لمدة 60 ثانية على MSMS
    عرض الإقصاء الشامل 10 صفحة في الدقيقة
    تطبيع الطاقة الاصطدام باستخدام وضع التنشيط واسعة النطاق 35٪
    عتبات اختيار أيون 100 تهمة
    تفعيل ف 0.25
    أكتيفالوقت أوجه 30 ميللي ثانية

    الجدول 2. إعدادات MS.

    البحث Mascor برنامج Deamon المعلمات الملاحظات
    قاعدة بيانات يعتمد على الكائن الحي (أي للخلايا هيلا: قاعدة بيانات الإنسان، الإصدار 3.68؛ 87061 إدخالات)
    خميرة ARG-C ARG-C يلتصق في C-محطة من جميع مخلفات أرجينين
    التعديلات متغير الاسيتيل (K)، والأكسدة (M)، D-3 أستلة (K)، ميثيل مد 3 - أسيتيل (K)، ثنائي ميثيل (ك)، ثلاثي ميثيل (K) الاسيتيل [42،010 دا]، والأكسدة [15،995 دا]، D3-أستلة [+45.0294 دا]، الميثيل-D3-الاسيتيل [مجموع +14.016 دا دا و+45.0294]، ثنائي ميثيل [28،031]، ثلاثي ميثيل [42،046 دا]
    الانشقاقات غاب لتصل إلى 2
    دقة كتلة أيونات الأم في البحث 10 صفحة في الدقيقة
    الشامل دقة لCID MSMS 0.5 دا
    البحث MaxQuant المعلمات الملاحظات
    قاعدة بيانات يعتمد على الكائن الحي
    خميرة التربسين / P يشق التربسين في C-محطة من جميع يسين وأرجينين المخلفات. يتم تنفيذ البحث مع الأخذ في الاعتبار حقيقة أن كفاءة التربسين ليلتصق ليسين وأرجينين عندما يتم خفض الأحماض الأمينية القادمة هو البرولين (/ P).
    التعديل ثابتة carbamidomethylation
    التعديلات متغير N-أسيتيل (البروتين)، والأكسدة (M)
    الانشقاقات غاب تصل إلى 3
    المعلمات التسمية lys8 وarg10
    الحد الأقصى amminoacid التسمية 3 لالتربسين
    الشامل دقة الأيونات الأصل في الأولي "أندروميدا" البحث 20 صفحة في الدقيقة
    دقة كتلة أيونات الأم في الرئيسيين "أندروميدا" البحث 6 جزء في المليون
    الشامل دقة لCID MSMS 0.5 دا (ستة من كبار قمم per100 دا)
    الببتيد معدلات اكتشاف كاذبة (روزفلت) 0.01
    البروتين معدلات اكتشاف كاذبة (روزفلت) 0.01 وضع روزفلت لالببتيد والبروتينات إلى 0.01 يعني أن من المتوقع أن تحتوي على 1٪ من ايجابيات كاذبة على حد سواء الببتيدات والبروتينات التي تم تحديدها. ويقدر هذه القيمة باستخدام قاعدة بيانات المستهدفة شرك
    الحد الأقصى إيه الخلفيROR احتمال (PEP) 1 PEP هو احتمال أن الببتيد الفردية هي مباراة ايجابية كاذبة. PEP يساوي 1 في الإعداد يعني أن جميع الببتيدات ستتخذ بغض النظر عن PEP بالتالي يستند حصرا على تصفية روزفلت.
    الحد الأدنى لطول الببتيد 6
    الحد الأدنى لعدد الببتيدات 2
    الحد الأدنى لعدد الببتيدات فريدة من نوعها 1
    فقط باستخدام الببتيدات معدلة والأكسدة (M) / الاسيتيل (بروتين N الأمد) تفعيل الخيار الببتيدات مع تعديلات يجب عموما لا تحسب للبروتين الكمي منذ فرة بهم قد لا تعكس نسبة البروتين المقابلة.
    الحد الأدنى العد نسبة 1
    "تطابق بين أشواط" تفعيل الخيار

    الجدول 3. تحليل البيانات.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    وصفناها مؤخرا ChroP، استراتيجية الكمية لتوصيف نطاق واسع من مكونات البروتين لونين. ChroP يجمع بين نهجين متكاملين المستخدمة في مجال جينية، والشذرة MS، والاستفادة من نقاط القوة والتغلب على القيود الخاصة بها. الشذرة جانب لتسلسل عميق (رقاقة تسلسل) يسمح للرسم خرائط الجينوم واسعة من التعديلات هيستون في القرار من عدد قليل Nucleosomes لل35. على الرغم من المفيد لحساسيتها، المقايسات القائمة على الضد محدودة في قدرتها على تمييز تعديلات مماثلة في وتشريح الجانب اندماجي من قانون هيستون 36. من ناحية أخرى، في حين يوفر MS تحليل شامل وغير متحيز من hPTMs، فرادى ومجموعات في 9، وقد تم حتى الآن تطبيقه على تحليل لونين بالجملة، مع ما يترتب على عدم وجود معلومات محددة موضع PTMs أنماط. نحن نوظف نسخة معدلة من الشذرة لعزل وظيفياالمجالات لونين متميزة وقياس الطيف الكتلي لتوصيف أنماط هيستون PTM والبروتينات غير histonic تحديدا شارك المخصب.

    باستخدام N-ChroP، كشف تحليل hPTMs شارك المرتبطة مع H3K9me3 لتخصيب كبيرة من علامات المرتبطة ونين صامتة، واستنزاف التعديلات المرتبطة الكروماتين النشط. اتفاق هذه النتائج مع الدراسات السابقة أثبتت متانة 37 من الاستراتيجية. في X-ChroP من المجالات H3K9me3، أكد التحقيق على أساس SILAC من البروتينات المتفاعلة لونين بعض interactors سبق وصفها، وبالتالي التحقق من صحة الأسلوب.

    ChroP يقدم جانبين الأصلي الرئيسي فيما يتعلق الاستراتيجيات المتاحة بالفعل للتحقيق عنصر البروتين لونين: على سبيل المثال، إمكانية الكشف عن synergisms بين الجزيئية بين التعديلات تزيين histones الأساسية متميزة داخل نفس سليمة أحادية nucleosome تنقيته بواسطة N-الشذرة؛ الثانية فرصة لتقييم تجزئة محددة من المتغيرات هيستون ورابط فرعية هيستون. منذ التحقيق من المتغيرات هيستون يقام مرة أخرى بسبب عدم وجود الكواشف ذات نوعية جيدة (أي الأجسام المضادة)، ChroP تبرز بوصفها أداة فريدة متاحة لتقييم موقعها ودورها وظيفية.

    واحدة من القيد في ChroP الحالي إعداد يكمن في الببتيد مركزية ("من أسفل إلى أعلى") النهج المستخدمة في MS، مع الهستونات هضمها في الببتيدات القصيرة ويترتب على ذلك من انخفاض في الكشف عن اتصال لمسافات طويلة بين التعديلات. على هذا النحو، واقتران ChroP مع "أسفل إلى أعلى" تحليل MS يسمح تقييم جزئي من الجانب اندماجي من قانون هيستون. نتصور أن تنفيذ الاستراتيجيات البديلة MS، مثل "الشرق وأعلى لأسفل" لرسم خرائط hPTMs على الببتيدات أطول (> 20 أأ) حتى على البروتينات سليمة 38-40، سيتغلبهذا ضبط النفس.

    عموما، وN-X-ChroP متكاملان الى حد كبير، مع إمكانية تشريح تعقيد بنية الكروماتين في مجالات متميزة وظيفيا، مع قرار من أحادية إلى بنسبة ضئيلة من Nucleosomes لل. نتوقع أن ChroP سوف يكون من المفيد أيضا لوصف تكوين مناطق الكروماتين والتي تمثلت في وجود البروتينات النووية غير histonic محددة، على سبيل المثال العوامل النسخ (تي إف إس). بالإضافة إلى ذلك، ChroP يمكن استخدامها في الدراسات وظيفية لتعيين التكوين الديناميكي للونين في مواضع محددة على مختلف الاضطرابات، على سبيل المثال خلال تفعيل النسخي العالمية. لهذه الأسباب، ChroP تبرز كأداة إضافية مفيدة في ترسانة الاستراتيجيات التحليلية المتاحة للتشريح المشهد البروتين من لونين.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    أعلن عن أي تضارب في المصالح.

    Acknowledgments

    وقد نشر هذا البحث في الأصل في مول البروتيوميات الخلية. Soldi M. وBonaldi T. والبروتيومية التحقيق في لونين المجالات الوظيفية يكشف رواية Synergisms بين مكونات متميزة المغاير MCP. عام 2013؛ 12: 64-80. © الجمعية الأمريكية للكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية. نشكر روبرتا Noberini (المعهد الإيطالي للتكنولوجيا ومكتب التقييم المستقل، إيطاليا) لقراءة نقدية للمخطوطة. ويدعم عمل السل من المنح المقدمة من جامعة هارفارد، Armenise برنامج جيوفاني مؤسسة التطوير الوظيفي، والجمعية الإيطالية لأبحاث السرطان ووزارة الصحة الإيطالية. وأيد العمل MS بواسطة زمالة FIRC.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    DMEM  Lonza BE12-614F
    FBS Invitrogen 10270-106
    SILAC DMEM M-Medical FA30E15086
    Dialyzed FBS Invitrogen 26400-044
    Lysine 0 (12C6 14N2 L-lysine) Sigma Aldrich L8662
    Arginine 0 (12C6 14N4 L-arginine) Sigma Aldrich A6969
    Lysine 8 (13C6 15N2 L-lysine) Sigma Aldrich 68041
    Arginine 10 (13C6 15N4 L-arginine) Sigma Aldrich 608033
    Micrococcal Nuclease Roche 10 107 921 001
    Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets Roche 04 693 132 001
    Spectra/Por 3 dialysis tubing, 3.5K MWCO, 18mm flat width, 50 foot length Spectrumlabs 132720
    QIAquick PCR purification kit QIAGEN 28104
    Anti-Histone H3 tri-methylated K9-ChIP grade Abcam ab8898
    Histone H3 peptide tri-methyl K9  Abcam ab1773
    Dynabeads Protein G Invitrogen 100.04D
    NuPAGE Novex 4-12%                            Bis-Tris Gel  Invitrogen NP0335BOX
    Colloidal Blue Staining Kit Invitrogen LC6025
    LDS Sample Buffer Invitrogen NP0007
    Formaldheyde Sigma Aldrich F8775
    Aceti anhydride-d6 Sigma Aldrich 175641-1G
    Name Company Catalog Number Comments
    Formic Acid Sigma Aldrich 94318-50ML-F
    Iodoacetamide ≥99% (HPLC), crystalline Sigma Aldrich I6125
    DL-Dithiothreitol Sigma Aldrich 43815
    Sequencing Grade Modified Trypsin, Frozen 100 μg (5 × 20 μg) Promega V5113
    Nanospray OD 360μm x ID 75μm, tips ID 8 μm uncoated Pk 5 Microcolumn Srl FS360-75-8-N-5-C15
    ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 µm   15% C Dr. Maisch GmbH r13.aq.
    Carbon extraction disk, 47 mm Agilent Technologies 12145040
    Cation extraction disk Agilent Technologies 66889-U

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184, 868-871 (1974).
    2. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
    3. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
    4. Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Res. 21, 381-395 (2011).
    5. Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers. Nat Struct Mol Biol. 14, 1025-1040 (2007).
    6. Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293, 1074-1080 (2001).
    7. Spotswood, H. T., Turner, B. M. An increasingly complex code. J Clin Invest. 110, 577-582 (2002).
    8. Soldi, M., Cuomo, A., Bremang, M., Bonaldi, T. Mass spectrometry-based proteomics for the analysis of chromatin structure and dynamics. Int J Mol Sci. 14, 5402-5431 (2013).
    9. Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry. J Proteomics. 75, 3419-3433 (2012).
    10. Britton, L. M., Gonzales-Cope, M., Zee, B. M., Garcia, B. A. Breaking the histone code with quantitative mass spectrometry. Expert Rev Proteomics. 8, 631-643 (2011).
    11. Taverna, S. D., et al. Long-distance combinatorial linkage between methylation and acetylation on histone H3 N termini. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2086-2091 (2007).
    12. Garcia, B. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 11, 66-73 (2007).
    13. Villar-Garea, A., Imhof, A. The analysis of histone modifications. Biochim Biophys Acta. 1764, 1932-1939 (2006).
    14. Plazas-Mayorca, M. D., et al. One-pot shotgun quantitative mass spectrometry characterization of histones. J Proteome Res. 8, 5367-5374 (2009).
    15. Ohta, S., et al. The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics. Cell. 142, 810-821 (2010).
    16. Vermeulen, M., et al. Selective anchoring of TFIID to nucleosomes by trimethylation of histone H3 lysine 4. Cell. 131, 58-69 (2007).
    17. Vermeulen, M., et al. Quantitative interaction proteomics and genome-wide profiling of epigenetic histone marks and their readers. Cell. 142, 967-980 (2010).
    18. Bartke, T., et al. Nucleosome-interacting proteins regulated by DNA and histone methylation. Cell. 143, 470-484 (2010).
    19. Dejardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic Loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
    20. Lambert, J. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A novel proteomics approach for the discovery of chromatin-associated protein networks. Mol Cell Proteomics. 8, 870-882 (2009).
    21. Soldi, M., Bonaldi, T. The proteomic investigation of chromatin functional domains reveals novel synergisms among distinct heterochromatin components. Mol Cell Proteomics. 12, 764-780 (2013).
    22. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 1, 2856-2860 (2006).
    23. Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal Chem. 68, 850-858 (1996).
    24. Bonaldi, T., Regula, J. T., Imhof, A. The use of mass spectrometry for the analysis of histone modifications. Methods Enzymol. 377, 111-130 (2004).
    25. Cuomo, A., Moretti, S., Minucci, S., Bonaldi, T. SILAC-based proteomic analysis to dissect the "histone modification signature" of human breast cancer cells. Amino Acids. 41, 387-399 (2011).
    26. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nat Protoc. 2, 1896-1906 (2007).
    27. Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Anal Chem. 75, 663-670 (2003).
    28. Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Mol Cell Proteomics. 3, 608-614 (2004).
    29. Jung, H. R., Pasini, D., Helin, K., Jensen, O. N. Quantitative mass spectrometry of histones H3.2 and H3.3 in Suz12-deficient mouse embryonic stem cells reveals distinct, dynamic post-translational modifications at Lys-27 and Lys-36. Mol Cell Proteomics. 9, 838-850 (2010).
    30. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26, 1367-1372 (2008).
    31. Cox, J., et al. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. J Proteome Res. 10, 1794-1805 (2011).
    32. Lachner, M., O'Carroll, D., Rea, S., Mechtler, K., Jenuwein, T. Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins. Nature. 410, 116-120 (2001).
    33. Bannister, A. J., et al. Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain. Nature. 410, 120-124 (2001).
    34. Ram, O., et al. Combinatorial patterning of chromatin regulators uncovered by genome-wide location analysis in human cells. Cell. 147, 1628-1639 (2011).
    35. Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129, 823-837 (2007).
    36. Beck, H. C. Mass spectrometry in epigenetic research. Methods Mol Biol. 593, 263-282 (2010).
    37. Ernst, J., Kellis, M. Discovery and characterization of chromatin states for systematic annotation of the human genome. Nat Biotechnol. 28, 817-825 (2010).
    38. Tipton, J. D., et al. Analysis of intact protein isoforms by mass spectrometry. J Biol Chem. 286, 25451-25458 (2011).
    39. Young, N. L., et al. High throughput characterization of combinatorial histone codes. Mol Cell Proteomics. 8, 2266-2284 (2009).
    40. Boyne, M. T. 2nd, Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. Precise characterization of human histones in the H2A gene family by top down mass spectrometry. J Proteome Res. 5, 248-253 (2006).

    Tags

    الكيمياء الحيوية، العدد 86، لونين، والتعديلات هيستون آخر متعدية (hPTMs)، علم التخلق، مطياف الكتلة، البروتينات، SILAC، مناعي لونين، المتغيرات هيستون، chromatome، hPTMs عبر المحادثات
    النهج ChroP يجمع بين الشذرة والطيف الكتلي لتشريح المناظر الطبيعية البروتيومية الحالة رقم محدد من الكروماتين
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP… More

    Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin. J. Vis. Exp. (86), e51220, doi:10.3791/51220 (2014).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter