Summary
기본 결합 및 고해상도 질량 분석과 크로 마틴 면역 가교으로 ChroP 접근 방식은 히스톤 수정, 변형 및 기능적으로 구별 염색질 영역에서 시너지 효과가 아닌 histonic 단백질의 복합 단백체 구조를 해부 할 수 있습니다.
Abstract
염색질은 다양한 DNA에 의존하는 프로세스를 제어하는 DNA와 단백질로 이루어진 매우 역동적 인 핵 단백질 복합체이다. 특정 지역에서 염색질의 구조와 기능은 전사 인자 및 DNA 메틸화를 포함 히스톤 번역 후 변형 (hPTMs) 및 변종, 크로 마틴 결합 단백질의 지역 농축에 의해 조절된다. 서로 다른 기능 영역에서 크로 마틴 조성물의 프로테오믹스 특성은 지금까지 질량 분석 (MS)에 의해 후속 심층 분석에 적합한 순도와 양에 같은 도메인을 풍부하게하는 효율적인 프로토콜의 부족에 의해 방해되었다. 우리는 여기에 예비 크로 마틴 면역이 그 기능 hPTMs의 측면에서, 변종 공동 관련된 비 histonic 단백질 별개의 염색질 영역을 분리하는 데 사용된다 ChroP (색도 MATIN의 P의 roteomics)라는 이름의 새롭게 디자인 된 염색질 단백질 체학 전략을, 설명 MS에 의해 분석 하였다. 우리는 그가를 설명히스톤 H3상의 라이신 9의 트라이 메틸화의 존재에 의해 표시 전사적으로 침묵 염색질 영역의 농축 및 분석을위한 ChroP의 설정까지 재. 달성 된 결과는 완전히 이질 염색질 프로테옴의 특징과 염색질의 고유 한 단백질 결정의 상호 작용 및 현장 별 구조 및 기능 구성을 설정하는 시너지 효과 방법을 이해하기위한 강력한 분석 전략으로 그것을 증명에 ChroP의 가능성을 보여줍니다.
Introduction
염색질은 모든 DNA가 중재 프로세스에 대한 기본 템플릿으로 관여하는 매우 역동적 인 핵 단백질 복합체이다. 뉴 클레오 솜은 염색질의 기본 반복 단위이며, DNA의 147 BP는 1, 2를 포장하는 주위에 각 표준 히스톤 H2A, H2B, H3 및 H4, 두 분자를 포함하는 단백질 octameric 코어로 구성되어 있습니다. 모든 핵심 히스톤은 구형 도메인과 뉴 클레오 외부에 돌출 유연한 N-말단 "꼬리"로 구성되어있다. 염색질 구조와 역학을 조절하기위한 중요한 메커니즘 중 하나는 주로 3,4 히스톤의 N-말단에 공유 결합이 발생 번역 후 변형 (PTMS)에 기초한다. 히스톤 변형이 히스톤-DNA 사이 또는 뉴 클레오 간의 접점을 변경함으로써, 고차 염색질 구조를 변경하고, 따라서 DNA 결합 단백질 (시스 메카니즘)의 액세스 가능성을 제어함으로써 어느 작동하거나 dockin 역할을하여규제 단백질, 하나 하나의 단위 또는 다중 체 복합체에 포함 된 같은 G 사이트. 이러한 조절 단백질이 다른 방법으로 그 기능을 발휘할 수있다 : 직접 유전자 발현 (즉, TAF 단백질)을 변조하여, 또는 뉴 클레오 솜 위치 (즉, 염색질 단지를 리모델링)을 변경하거나 다른 히스톤의 잔류 물 (메틸 트랜스퍼 나있는, 즉 단백질의 아세틸을 수정하여 전이 활성) (트랜스 메커니즘) 5. 특정 염색질의 유전자 좌에서 별개의 PTM 패턴 클러스터는 별개의 사이트에서 다른 수정이 기본이되는 DNA의 기능 상태를 중재하는 분자 코드를 생성하는 시너지 효과를 수 있다는 가설의 고심을 주도하는 관찰. "히스톤 코드의 가설은"몇 년 동안 큰 공감대를 얻고있다하지만 실험적인 검증은 기술적 인 한계 6,7에 의해 다시 개최되었습니다.
질량 분석 (MS) 기반 프로테오믹스는로 떠오르고있다강력한 도구 히스톤 변형 패턴을 매핑하고, 염색질 결합 단백질 8의 특징을. MS는 펩티드의 이론 및 실험 질량 사이의 특정 Δmass로 변경을 감지합니다. 개별 히스톤의 수준에서, MS는 그 9-14 사이에서 새로운 수정과 계시 interplays의 검출을 허용, PTMS를 매핑하는 공정한하고 포괄적 인 방법을 제공한다.
최근, 전략의 숫자는 그대로 유사 분열 염색체 15, 수용성 hPTM 결합 단백질 16-18의 식별과 특정한 염색질 영역의 분리 및 분석의 특성을 포함하여 염색질의 프로테오믹스 조성물을 해부 개발되었다 (즉 말단 소립) 19, 20. 그러나, 히스톤 PTMS, 변형, 염색질 관련 단백질의 궤적 별 시너지 효과의 조사는 아직 불완전하다. 여기, 우리는 (ChroP라는 새로운 접근 방식을 설명우리는 효율적으로 기능 별개의 염색질 도메인의 특성을 개발하는 것이 색도 MATIN의 P의 roteomics) 21. 이 방법은 풍부한 샘플의 효율적인 MS 기반 단백체 분석을위한 크로 마틴 면역 침전 (칩), 후생 유전 학적 연구에 사용되는 잘 확립 된 프로토콜을 적응시킨다. 우리는 입력 및 MS에 의해 어드레싱 된 질문으로서 사용 염색질의 종류에 따라 두 가지 프로토콜을 개발 하였다; 특히 : MNase로 소화 고정되지 않은 기본 염색질의 1) 칩 모노 뉴 클레오을 정화하고 공동 연관 hPTMs (N-ChroP)를 해부하기 위해 사용된다; 2) 초음파에 의해 조각난 가교 염색질의 칩은 단백질 (X-ChroP)를 결합 모든 공동 농축 염색질의 특성을 SILAC 기반 interactomics 전략과 함께 사용됩니다. 우리는 여기에 면역 침전 단계에 대한 미끼로 H3K9me3를 사용하여, 이질 염색질을 풍부하게 공부에 대한 N-및 X-ChroP의 조합을 보여줍니다. ChroP의 사용은 연장 될 수있다따라서 후성 유전학의 다양한 응용 프로그램에 방법을 포장, 별개의 염색질에 지역, 또는 다른 기능 상태로 전환하는 동안 같은 지역 내에서 염색질 구성의 변화 중 하나를 공부합니다.
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Protocol
1. 세포 배양
- 기본 칩의 표준 매체
- 10 % 태아 소 혈청 (FBS), 1 %의 글루타민, 1 % 펜 / Strep의 10 mM의 HEPES pH를 7.5로 보충 된 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM)에서 HeLa 세포 성장.
- 칩을 가교 SILAC 라벨링
- 10 % 투석 된 FBS, 1 %의 글루타민, 1 % 펜 / Strep의 10 mM의 HEPES pH를 7.5 및 광 L-라이신 (리스 0) 및 L-선택 보충 된 라이신과 아르기닌 고갈 SILAC DMEM 배지에서 HeLa 세포를, 성장 아르기닌 (의 Arg 0) 또는 무거운 대응, L-라이신 (리스 8) 및 L-아르기닌 (의 Arg 10) (자료 표), 각각 73 ㎎ / L, 42 ㎎ / L의 최종 농도.
- 완전한 동위 원소 코딩 아미노산 결합을 보장하기 위해 SILAC 매체에 최대 8 세대에 세포를 성장. 그들은 AC에서 그들을 시드, 1.0-1.5 × 106 세포 / ml의 밀도에 도달했을 때, 이틀 셀 합격oncentration 5 10 × 3의 세포 / ml.
- SILAC 매체의 가난한 구성에서 발생할 수 생리학에서 가능한 모든 변경을 개별화 할 수 SILAC 매체에있는 세포의 성장과 생존 능력을 평가; 이 작업을 수행하려면 :
- 시각 세포가 표시 동안 매일 현미경으로 형태를 검사합니다.
- 표준 매체 대 SILAC에서 성장 세포의 세포와 음모의 성장 곡선을 계산합니다.
2. 기본 염색질 면역 침전 (N-칩)
- 배양 된 세포에서 핵 준비
- 실험 1 ~ 2 × 10 8 레이블 HeLaS3 세포를 사용합니다. 수확 세포는, 4 ° C에서 10 분 340 XG에 50 ML 튜브와 원심 분리기에 50 X 10 6 세포의 분취 량을 얼음처럼 차가운 PBS로 씻어.
- 8 ㎖를 용해 버퍼 (표 1)의 각 세포 펠렛을 재현 탁하고 회전하는 바퀴에 4 ° C에서 10 분 동안 배양한다. 캘리포니아을 붓고지나는 곳마다 세포의 세포질에서 핵을 분리하는 4 ° C에서 20 분 동안 3,270 XG에서 스윙 아웃 로터에서 자당 쿠션 (표 1)과 원심 분리기에 해물.
- , 상층 액을 버리고 핵 펠렛을 유지하고 각각의 세척에 뜨는 폐기, 원심 분리하여 얼음처럼 차가운 PBS에서 그들을 두 번 씻는다.
- Micrococcal 클레아 제 (MNase) 소화 (작은 규모) 소화 후 염색질의 품질 관리
- 1 ㎖ 소화 버퍼 (표 1)에서 세척 핵 펠렛을 재현 탁; 500 μL의 두 분량 씩 나누어 얼음 계속.
- 나누어지는 260 nm에서 광학 밀도 (OD)를 측정, 0.2 % 나트륨 도데 실 설페이트 (SDS)에 1:200으로 희석 주 :. OD = 1 염색질의 DNA의 약 50 ㎍ / ㎖의에 해당한다. 통상적으로, 2 × 108 세포로부터 시작 OD는 40-60의 범위이다.
- , 핵의 1 %을 0의 최종 농도에 MNase 효소를 추가합니다.005 U 효소 / 핵 ㎕의 서로 다른 시간 경과 (0, 10, 20, 40, 60 분), 37 ° C에서 알을 품다.
- 각 시점에서, 소화 핵의 4 μl를 수집하고 MNase의 반응을 정지 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 추가합니다. 얼음에 보관하십시오.
- PCR 정제 키트에 의해 DNA 샘플을 추출하고 50 ㎕의 TE 버퍼 (표 1)에서 그들을 용출.
- 각 DNA 샘플의 20 μl를 가지고 버퍼 (표 1)로드 10 μl를 추가하고 1 %의 샘플을로드 (w / v)의 크기 제어와 같은 PCR 마커와 에티 디움 브로마이드를 포함하는 아가로 오스 겔.
- MNase 배양에 의해 생성 된 염색질 뉴 클레오 사다리를 평가하는 소화를 확인합니다.
- 준비 모노 뉴 클레오 솜의 보급에 따라, 소화를위한 최적의 시간을 선택합니다. . 일반적으로 MNase 소화의 최적 시간은 60 분 (그림 1B, 왼쪽 패널)는 핵의 효소 / μL의 0.005 U에 대한 참고 : digesti의 최적 MNase 농도 / 시간에 것은 원하는 세포 유형과 뉴 클레오 스트레치의 크기에 따라 조절 될 수있다.
- Large-scale/preparative MNase 소화 및 가용성 염색질 분수 복구
- 각 분취 액에 추가 핵 효소 / μL 0.005 U의 최종 농도에 대응하는, 5 μL의 MNase (2.2.1 참조); 부드럽게 혼합 (작은 규모의 테스트를 기반으로 최적화 된 시간 간격 또는 일반적으로) 60 분 동안 37 ° C에서 알을 품다.
- 반응을 중지하고 얼음에 계속 1 ㎜ EDTA를 추가합니다. 10 분 동안 4 ° C에서 7,800 XG에서 원심 분리하여 소화 핵 펠렛. 새로운 튜브에 상층 액 (분수 S1)을 전송하고 4 ° C. 주에서 보관 : S1은 모노 뉴 클레오를 포함 염색질의 첫 번째 가용성 분획을 포함하고 있습니다. 단백질 분해 효소 억제제 (표 1)를 추가합니다.
- 조심스럽게 재현 탁 1 ㎖ 투석 버퍼 (표 1)의 펠릿과 4 ° C (C에서 하룻밤 dialyze투석 관의 오프 유타) 3.5 kDa의입니다, 일정한 온화한 교반하면서 3 L 투석 버퍼에서. 4 ℃에서 10 분 동안 7,800 XG에서 투석 재료와 원심 분리기를 수집 새로운 에펜 도르프 튜브에 뜨는 (S2 분율)를 전송하고 4 ° C. 주에서 보관 : S2 포함한다 MNase 소화 정도에 따라 epta-뉴 클레오, 디 -에.
- 면역 전에 염색질의 품질 관리
- (NanoDrop 시스템에서 260 nm에서 OD를 측정하여 정량화) S1과 S2 염색질 분수의 5 μg에 해당하는 나누어지는 가져 가라. PCR 정제 키트에 의해 DNA를 추출하고 50 ㎕의 TE 버퍼 (표 1)에서 용출.
- , S1과 S2 DNA 20 ㎕을 버퍼 (표 1)로드 10 μL와 혼합 (w / v) 아가로 오스 겔 1 %에 그들을로드합니다. 품질과 뉴 클레오 사다리의 육안 검사로 MNase 소화의 효율성을 확인합니다 :. 분수 S1은 높게일부 S2는 주로 폴리 뉴 클레오 솜 (그림 1B, 오른쪽 패널)를 포함하는 동안, 모노 뉴 클레오 충실.
- 항체와 염색질의 배양
- -20 ° C 이후의 질량 분석 분석을위한 S1 분율의 50 μL에 보관하십시오.
- 분수 S1에 칩 희석 버퍼 (표 1)의 1 볼륨을 추가합니다.
- 관심 hPTM (또는 단백질)에 대한 항체를 추가; 4 ° C. 주에서 회전하는 바퀴에 밤새 품어 : 일반적으로, 2 × 10 8 세포를 10 μg 항체 ㎍의 20을 사용합니다. 항체의 양과 시작 세포 수 사이의 최적의 비율은주의 깊게 샘플 내에서 미끼로 사용 hPTM / 단백질의 풍요 로움과 항체의 효율에 따라 사례별로 설정해야합니다. 최적화는 다음의 시험에 기초하여, 실험적 :
- 입력과 흐름을 통해 (FT 사이에 관심의 hPTM / 단백질의 양을 비교,면역은 특정 염색질 영역의 상당 부분을 풍요롭게하는지 확인 서양의 얼룩이나 MS에 의해 2.7.2)를 참조하십시오 참고 :. hPTM / 단백질 먹이의 50 % 이상이 FT (그림 1C)에 남아 있던 경우는 일반적으로 달성 .
- 관심의 면역 침강 단백질 물질의 충분한 양의 MS 분석에 사용할 수 있음을 보장 SDS-PAGE 젤에 감지 할 수 있는지 확인합니다 :. 정확한 화학 양론에있는 4 개의 코어 히스톤에 대응하는 밴드의 겔의 존재를 본래 뉴 클레오는 N-ChroP (그림 1D)에 의해 면역 침전되었음을 나타냅니다. 적절한 화학 양론의 부족은 뉴 클레오의 전개 부분 중단 / 나타내는 사실입니다.
- 병렬 (2.6 참조) 단백질 G-결합 자석 구슬을 준비합니다.
- 평형 및 단백질 G-결합 자석 구슬의 차단
- 슬러리의 100 μl를 사용하여 구슬의 결합 용량 다음과 같습니다. 단백질 100 μl를 평형 G 결합 자석 구슬 솔루션 (표 1), 세 번 세척하고 회전하는 바퀴에 4 ° C에서 하룻밤을 배양 주를 차단 슬러리 항체의 2-20 μg.
- 칩 희석 버퍼 (표 1)로 두 번 다음 솔루션을 차단하고 한 번 차단 된 구슬을 씻으십시오.
- S1 염색질 샘플 차단 구슬 100 μl를 첨가하고 3 시간 동안 4 ° C에서 회전 휠을 품어. 팁의 뚜껑에서 샘플을 스핀 다운 1 분 340 XG에 원심 분리기. 구슬을 펠렛 자기 랙에 넣습니다.
- 새로운 에펜 도르프 튜브에 뜨는을 전송합니다. 이 (FT)를 통해 흐름, 항체에 결합하지 않은 염색질, 즉 분수입니다.
- 비즈 네 세척각 세척 (75, 125, 175 mM의 염화나트륨)의 소금 농도를 증가 버퍼 (표 1) 세척의 배.
- 면역 침강 염색질을 용출, 70 ℃에서 5 분 동안 50 mM 디티 오 트레이 톨 (DTT) 보충 LDS 샘플 버퍼 30 μL에서 구슬을 품어 4-12% 비스 - 트리스 아크릴 아미드 SDS-PAGE 프리 캐스트 그라데이션 젤에 용출 된 단백질을 분리하고 콜로이드 쿠마시 염색 키트 (그림 1D)와 젤을 얼룩.
3. 가교 염색질 면역 침전 (X-칩)
- 포름 알데히드와 세포의 가교
- 간략하게 혼합하고 실온에서 10 분 동안 품어 SILAC 표지 세포에 0.75 %의 포름 알데히드를 추가합니다. 125 mM의 글리신을 첨가하여 포름 알데히드를 켄 칭하고 실온에서 5 분 동안 배양한다.
- 5 × 7 분량 씩 세포를 나눈다; (430)에서 원심 분리하여 그들에게 얼음처럼 차가운 PBS로 3 회 씻어5 4 ° C에서 최소 각 세척 후 상층 액을 폐기하기위한 XG. 마지막 세척에서, 상층 액을 버리고 침전물을 유지합니다. 참고 : 세포가 가교가되면 바로 사용하지 않을 경우, 그들은, -80 ° C에 저장할 수 있습니다.
- 핵 준비
- 10 ml의 용해 완충액 (표 1)에서 각 세포 펠렛을 재현 탁. 회전 4 ° C에서 10 분 동안 품어. 4 ℃에서 5 분 430 XG에 원심 분리기 상층 액을 버리고; 핵 펠렛을 유지합니다.
- 버퍼 (표 1) 세탁기 10 ㎖에 각각 핵 펠렛을 Resuspend. 회전 휠을 10 분 동안 실온에서 배양한다.
- 4 ℃에서 5 분 430 XG에 원심 분리기 상층 액을 버리고 알약을 수집합니다.
- 3 ㎖ 칩 보육 버퍼 (표 1)에 각각 핵 펠렛을 Resuspend. 얼음에 보관하십시오.
- 염색질의 초음파 및 품질 관리
- 초음파 처리 채널. 200 W 냉각 Bioruptor 소재 ( "off"1 분 "on"30 초주기), 염색질 단편에서 romatin 참고 : 사이클 및 초음파 간격의 수는 세포 분류에 및 뉴 클레오의 평균 길이에 달려 원하는 스트레칭. 전형적으로, 초음파의 30 분간은 디 - 및 트리 - 뉴 클레오에 대응하는 길이의 300 ~ 500 염기쌍의 DNA 단편을 생성하는 것이 필요하다. 조각의 크기 선택은 조사에서 염색질 도메인의 종류에 따라 다릅니다.
- 칩 보육 버퍼에 1 시간의 최소 65 ° C에서 배양 가교 역, 전체 입력의 2 %를 가져 가라. , PCR 정제 키트에 의해 DNA를 추출 50 μL TE 버퍼에 용출 및 염색질 조각을 확인하는 아가로 오스 겔에서 DNA를로드합니다.
- 항체와 염색질의 배양
- 초음파 염색질 10 % 트리톤 X-100 1 / 10 볼륨을 추가합니다. 펠렛 4 ° C에서 10 분 동안 12,000 XG에 원심 분리기 드BRIS.
- 라는 세포에서 SILAC 아미노산의 결합 수준을 테스트하기 위해 단백질 프로파일 링 무거운 세포에서 염색질 입력 50 μl를 저장합니다.
- 나머지 무겁고 가벼운 표시 초음파 염색질의 선택의 항체를 추가하고 회전하는 바퀴에 4 ° C에서 밤새 품어. 광 채널에서, 또한 수용성 펩티드의 과잉 배를 추가합니다. 회전하는 바퀴에 4 ° C에서 밤새 품어 주 :. 2.5.3에서 논의 항체의 μg과 세포의 원료 사이의 최적의 조건은, 케이스에 케이스를 선택한다. 항체와 관련있는 수용성 펩타이드의 최적 초과 배의 몰 농도는 조심스럽게 케이스에 케이스를 적정해야합니다.
- 자석 구슬을 사용하여 염색질의 분리
- 평형 및 2.6에 기술 된 절차에 따라 칩 인큐베이션 완충액을 사용하여 G-단백질 결합 된 자성 비드를 차단.
- 차단 B 100 μl를 추가합니다염색질 샘플 및 4 ℃에서 3 시간 동안 회전 바퀴에 품어 EADS 팁의 뚜껑에서 샘플을 스핀 다운 1 분 340 XG에 원심 분리기. 구슬을 펠렛 자기 랙에 넣습니다. 상등액 바운드 뉴 클레오 함유 (FT)를 통해 흐름이다. 세척이 증가하고 염 농도 (두 개의 150 ㎜로 세척 및 300 mM의 NaCl을 두)와 버퍼 (표 1) 세척 4 회를 구슬로 장식한다.
- 용출 및 탈 가교 면역 침강 단백질에 모두 95 ° C에서 30 μL SDS-PAGE 로딩 샘플 버퍼 (표 1)에서 25 분 동안 구슬을 품어. 분리 된 단백질 4-12% 비스 - 트리스 아크릴 아미드 SDS-PAGE 사전 캐스트 젤 (그림 3D)에 대한 것입니다.
이전에 MS에 4. 샘플 준비
- 인 - 젤 N-칩에서 풍부한 히스톤의 소화
참고 : 단백질 소화와 펩타이드 추출 단계를 돌봐 동안이전 (22), (23)을 한 바와 같이, LC-MS/MS 방해 각질 오염을 최소화.- 컷 젤 슬라이스 핵심 히스톤 밴드 (그림 1D)에 해당. 젤을 축소하는 100 % ACN과 교류, DDH 2 O의 50 % 아세토 니트릴 (ACN)와 젤 조각을 드 얼룩. 젤 조각이 완전히 해제 스테인드 될 때까지 반복하여 진공 원심 분리기를 건조.
- D 6 - 아세트산을 추가 무수 1시 9분 (V / V) 1 M 중탄산 암모늄의 (NH 4 HCO 3) (일반적으로 최종 부피가 60 ~ 100 ㎕의 경우) 및 촉매 등 3 μL 아세트산 나트륨 (CH 3 COONa를). 강한 흔들림 37 ° C에서 3 시간 동안 품어 주 :. 샘플은 반응의 조립 후 첫 번째 분의 거품을 생성 할 수 있습니다 : 그것은 중요한주의 처리하고 발생하는 가스, 수시로 개방 튜브를 해제 배양시.
- 여러 번 승 젤 조각을 씻어i 번째 NH 4 HCO 3, 완전 D-6 아세트산 무수물 잔기를 해소하기 위해 증가 백분율 (50 %부터 100 %까지)에서 ACN으로 대체.
- 100 % ACN에서 젤 조각을 축소; 완전한 드 수분을 보장하기 위해 진공 원심 분리기를 건조. 중수 소화 무수 초산과 트립신 소화를 이용하여 라이신의 화학적 변형의 조합을 생성하는 "아르 게 : 얼음처럼 차가운 100 NG / 50mM의 NH 4 HCO 3 트립신 솔루션 μL와 37 ° C. 주에서 밤새 품어로 다시 수화 젤 조각 히스톤 21, 24의 젤 소화 패턴에 "C 언어.
- 여분의 용액을 버리고 완전히 젤 조각을 커버하는 50 mM NH 4 HCO 3의 볼륨을 추가; 37 ℃에서 하룻밤 배양
- 새로운 에펜 도르프 튜브에 용해 소화 펩티드를 수집합니다. 펩티드를 냉동 건조. 0.5 % 아세트산 acid/0.1 %의 트리 플루오로 아세트산 (TFA)에 그들에 resuspend. 탈염 및 농축역상 손으로 만든 마이크로 컬럼에 C 18 / 탄소 "샌드위치"와 이온 교환 크로마토 그래피 (SCX) (StageTip) 25 펩티드.
- 200 ㎕의 팁에 고정 C 18 / 탄소 ( "샌드위치")와 SCX 비즈를 포함하는 테플론 섬유주 디스크를 넣어 StageTip 마이크로 컬럼을 준비합니다. 탄소 필터와 함께로드 두 번째 팁의 상단에 C 18 마이크로 칼럼을로드하여 "샌드위치"를 얻 참고 :. C (18) 필터에 유지되지 않습니다 매우 짧은 펩티드를 직접에로드 된 흐름을 통해 전달 일반적으로 비디오를 캡처 탄소 팁. SCX의 StageTips은 H3와 같은 특정 펩타이드를 효율적으로 역상 크로마토 그래피로 유지되지 않습니다 (3-8) 펩타이드를 풍부하게 할 수 있습니다.
- SCX StageTips 상 C 18 / 탄소 "샌드위치 StageTip"50 % 상에로드 펩티드의 50 %. 80 % ACN/0.5 %의 초산 교류를 사용하여 C 18 / 탄소 끝에서 그들을 용출ID 및 5 % 수산화 암모늄으로 SCX 팁 (NH 4 OH) / 30 % 메탄올에서. 0.1 % FA의 동결 건조에 resuspend 펩티드 후 LC-MS/MS로 분석 할 수 있습니다.
- immunopurified 단백질에서 젤 소화
단백질 중 겔 소화는 사소한 수정으로, 상술 한 바와 같이 22 행한다.- 열 조각 (그림 3D)의 각 레인 1 내지 3 mm의 작은 큐브의 각 조각을 잘라. 50 mM의 NH 4 HCO 50분의 3 % 에탄올 겔 조각을 드 얼룩과 젤을 축소 무수 에탄올을 추가합니다. 젤이 완전히 드 스테인드 때까지 반복합니다.
- 어둠 속에서 실온에서 45 분 동안 알킬화 완충액 (표 1)을 첨가하여 56 ° C에서 1 시간 용 젤 조각에 환원 완충액 (표 1)을 추가한다. 진공 원심 분리기에 젤 조각을 세척하고 건조.
- 얼음처럼 차가운 12.5 NG / μL 트립신 졸 겔 조각을 재수50 mM의 NH 4 HCO 3의 ution 겔 조각의 완전 재수까지 얼음에 품어. 초과 트립신을 제거합니다.
- 완전히 젤 조각을 커버하는 50 mM NH 4 HCO 3을 추가합니다. 37 ℃에서 하룻밤 배양한다
- 액체 부분을 수집합니다. 겔 조각으로 추출 완충액 (표 1)을 추가; 실온에서 10 분간 강하게 교반하면서 배양한다. 두 번 반복합니다.
- 강한 교반과 함께 10 분 동안 ACN에서 젤 조각을 품어. 두 번 반복하고 모든 상층 액을 풀.
- 펩티드를 냉동 건조. 0.5 % 아세트산 acid/0.1 %의 TFA에서 건조 펩티드를 Resuspend.
- 탈염 및 (26, 27)을 한 바와 같이, 역상 C 18 StageTip에 펩티드를 집중한다.
- 80 % ACN/0.5 %의 아세트산을 사용하여 C 18 StageTip로부터 펩타이드를 용출한다. 진공 원심 분리기에 증발시켜 유기 용매를 제거하고 0.1 % FA (일반적으로 5 ~ 10 &에 펩티드를 재현 탁# 181, L), 때 MS 분석 주시기 바랍니다.
5. LC-MS 분석
- 액체 크로마토 그래피 분석
- 를 사용하여 일정한 헬륨 압력 (50 줄)의 역상을 (RP) C (18), 메탄올 3 μm의 수지를 사용하여, 15cm 용융 실리카 이미 터 (75 μm의 내경, 350 μm의 외경)의 분석 컬럼 팩 폭탄 로더 장치, 이전에 설명한 바와 같이 28.
- 부부는 직접 20 cm 길이 (25 μm의 내경)를 통해 HPLC의 6 포트 밸브의 콘센트에 포장 된 에미 터 (C 18 RP 열) 전 열 또는 분할 장치를 사용하지 않고 실리카를 융합.
- 500 NL / 분 이동상 A (DDH 0.1 % FA / 5 % ACN 2 O)의 흐름에 C 18 RP 열에서 소화 펩티드를 넣습니다.
- 샘플을 로딩 한 후, 다음의 구배를 사용하여 펩티드를 분리 :
- 0-40% 이동상 B (0.1 % FA/99의 %의 ACN 적용250 NL / 분 DDH 2 O)에서 히스톤에서 파생 된 펩타이드의 용출에 대한 5 분 이상 10 분 60 - 80 %에서 40 % ~ 60 %의 농도 구배 90 분 (2)를 참조하십시오.
- immunopurified 단백질에서 파생 된 펩타이드의 용출에 대한 5 분 이상 10 분 60 - 80 % (3 참조) 36-60%의 기울기에 따라 250 NL / 분 120 분에 0-36% 이동상 B를 적용합니다.
- LTQ-FT-ICR-울트라 질량 분석기를 사용하여 질량 분석 분석
- 자동으로 MS와 MSMS 수집 사이를 전환 할 수있는 데이터에 의존하는 수집 (DDA) 모드에서 작동합니다. MS 전체 검색 스펙트럼이 200-1,650에서 일반적으로 M / Z의 범위, 취득, 400m / Z에서 해상도 R = 10 만에 취득. 오 (top5에) 가장 강렬한 이온은 5000의 목표 값에 충돌 유발 분해 (CID)를 사용하여 선형 이온 트랩에서 조각에 격리됩니다.
- 표 2 FO에 나열된 매개 변수를 사용하여R "조정"인수 파일.
- 표 2에 나열된 규격 취득 설정을 설정합니다.
6. 데이터 분석
- 염색질 영역에서의 협력 강화 히스톤 수정 무료 정량화 레이블
- 획득 한 RAW 파일은 Raw2msm 소프트웨어 (버전 1.10) 29를 사용하여 MGF 파일을 변환합니다.
- 표 3에 기재된 파라미터를 설정, 마스코트 Deamon를 (버전 2.2.2)를 사용하여 히스톤 수정 검색.
- 마스코트 출력 펩타이드 목록에서 15보다 낮은 점수 또는 5 개 이상 추정 PTMS (29) 펩티드를 제거 참고 :. 각각의 단일 펩타이드 ID의 경우, 가장 높은 마스코트 점수 펩타이드를 선택하고 같은 ID를 가진 다른 모든 중복 펩티드를 필터링 .
- BAS, 모든 수정 된 펩타이드에 해당하는 각각의 전구체의 추출 이온 크로마토 그램 (XIC)를 구축QualBrowser을 사용하여 M / Z 값에 ED. 각 피크 (그림 2A)의 곡선 (AUC)에서 지역을 계산합니다.
- QualBrowser (그림 2B)를 사용하여 MS / MS 스펙트럼의 육안 검사에 의해 수정을 포함하는 각각의 식별 된 펩티드의 유효성을 검사합니다.
- 수정 된 각 펩타이드의 상대적인 풍요 로움을 계산합니다. 칩 혼성 재료의 각 변형의 상대적인 농축을 계산합니다 :. 상대 풍부 동일한 펩타이드의 모든 수정과 수정되지 않은 형태의 AUC의 합을 통해 각각의 특정 변형 된 펩타이드의 AUC의 비율로 계산되는 반면, 상대적으로 입력 (도 2c)을 통해 칩의 특정 변형의 상대적인 풍부함의 비율로 농축.
- 단백질의 정량 프로테오믹스 분석 염색질 도메인 내에서 공동으로 관련
- 단백질 식별 및 정량화 MaxQuant 패키지를 사용(http://www. maxquant.org /) 30. AndromedaConfig.exe (31)를 사용하여 기본 검색 엔진 "안드로메다"를 구성하고 표 3에 검색 매개 변수를 설정합니다.
- 설립 테스트
- 다음과 같이, MaxQuant 소프트웨어를 사용하여, 헤비 - 표지 염색질 입력 내의 단백질로 헤비 아미노산의 혼입 정도를 개산 :
- 6.2에서 설명하지만, 다시 양을 옵션을 비활성화로 매개 변수를 설정합니다.
- 법인의 비 중복 펩타이드 비율로 다음과 같은 공식을 적용하는 비율을 계산한다. 법인 (%) = 비 (H / L) / 비 (H / L) + 1 × 100 (그림 3B)를 참고 : 동의하는 경우에만 설립> 95 %.
- 다음과 같이, MaxQuant 소프트웨어를 사용하여, 헤비 - 표지 염색질 입력 내의 단백질로 헤비 아미노산의 혼입 정도를 개산 :
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Representative Results
크로 마틴 면역 게놈 따라 단백질이나 히스톤 변형의 현지화를 프로파일 링하는 데 사용하는 강력한 기술이다. 프로테오믹스 동등한에서, 칩, 관심의 수정이나 단백질과 함께 면역 침강 "미끼"로 사용되는 정 성적 및 정량적으로 hPTMs, 히스톤 변형 및 염색질 결합 단백질을 식별하는 MS 기반 프로테오믹스옵니다. N-ChroP 접근 방식에서, 염색질이 MNase (그림 1B)로 분해되는 그림 1A, 기본 칩에 설명 된, 별개의 기능 도메인을 염색질 대량의 정화 입력으로 사용됩니다. 모노 뉴 클레오 풍부한 소화 염색질은 특정 항체와 함께 배양하고 immunopurified 단백질은 SDS-PAGE에 의해 분리된다. 예시 된 예에서, H3K9me3, 침묵 염색질 (32, 33)의 마커는 방법을 설정하는 데 사용됩니다. 선택은 사실에 근거 것과 모두 기능적 역할그 단백질 인터랙의 일부가 잘 설명되어 있습니다뿐만 아니라. 또한 본래의 뉴 클레오는 올바른 화학 양론의 핵심 히스톤으로, MS (그림 1D에 적절한 양의 충실 쿠마 젤의 육안 검사에 의해 확인 된 또한, 칩에 최적화 된 매우 구체적이고 효율적인 항체는, 34 사용할 수 있습니다 ).
흐름을 통해 (FT) 및 입력 (IN)에 존재 H3K9me3의 양 사이의 비교의 작은 하위 집단의 농축으로 인해 편견의 위험을 제외하고, 관심 영역의 약 50 %가 immunopurified을 나타냅니다 염색질 (그림 1C). 각 코어 히스톤은 폴리 아크릴 아마이드 겔에서 소화 "처럼의 Arg-C"를 달성하기 위해 애드혹 설계된 프로토콜을 사용하여 소화 : MS는 충실 뉴 클레오 내에 공동 연관된 PTMS을 특성화하기 위해 사용된다. 사실, 한 손의 Arg-C는 hPTMs B의 MS 분석에 유용한 프로테아제여를 그 최적의 길이의 펩티드를 생산; 한편, 젤 효율적 절단하지 않는다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리의 원단 프로토콜 트립신 소화 하였다 중수 소화 (D 10) 아세트산 무수물과 히스톤 겔 밴드를 배양함으로써 달성 라이신 화학 알킬화를 이용한다. 트립신은 D 3-아세틸 라이신, 생성 된 펩티드 혼합물을 모방 패턴 (그림 1E) "등의 Arg-C"를 절단하지 않기 때문에.
라이신 D 3 - 아세틸 부분의 추가는 MS에 네이티브 및 화학적으로 추가 acetylations을 구별, 45.0294 달톤의 명확한 델타 질량을 생성합니다. 또한, D 3-아세틸 동중 수정 된 펩티드의 식별을 용이하게 두 개의 추가 이점을 제공한다 : 첫째, 알킬화는하지만 디 - 및 트리 - 메틸화 잔류 물에 만 수정되지 않은 및 모노 메틸화 라이신에서 발생; 이러한 변형 된 펩티드가 같은 어린 아이 베어링 등알 수정 수 있지만, 다른 배열에이 차별적으로 명확한 M / Z의 변화를 생산하는 D 3 - 아세틸 그룹의 고유 한 집합으로 장식되어 있습니다. 둘째, D 3-알킬화의 독특한 패턴 동중 수정 펩티드 (21)에 대한 분리 수준을 추가로 생성 역상 컬럼에 액체 크로마토 그래피에서 약간 다른 유지 시간의 원인이됩니다.
해당 MS / MS 스펙트럼 (그림 2B)의 수동 검사의 모든 hPTMs 검증 한 후, 라벨 무료 정량은 두 단계로 이루어진다 : 첫째, 우리는 수정되지 않은 수정 된 종의 신호 강도를 사용하여 각 변형의 상대적인 풍요 로움을 계산 추출 된 이온 크로마토 그램 (XIC)의 계산 (그림 2A와 2C, 상단 패널)을 통해 측정 된 해당 펩타이드에 대한; 둘째, 농축 상대 각 modificatio의 상대적인 풍부함 간의 비로서 추정N 칩 - 에드 옥타 입력 (그림 2C, 낮은 패널)에서 해당 상대적으로 풍부. H3의 분석 (9-17) 펩티드는 수정되지 않은 및 모노 메틸화 된 형태 (그림 2C)의 해당 고갈과, 디 - 및 트리 - 메틸화 K9의 농축을 보여줍니다. 이 항체 특이성에 대한 긍정적 인 제어 결과와 함께 공동 협회 또는 다른 변형의 고갈 내의 다른 공동 풍부한 히스톤에, 같은 H3에 내 분자 수준과 간 분자 수준에서 모두 평가 될 수있다 같은 뉴 클레오. 유전자 침묵과 관련된 알려진 마커의 중요한 농축, 유전자 활성화와 연결 마커의 해당 고갈과 관찰 :이 hPTMs H3K9me3 도메인 내에서 간 회담의 심사는, 소위 "이질 염색질의 modificome"(그림 2D)이 수 . 또한, 새로운 협회는 이러한 H3K18m의 농축으로 감지E1.
이질 염색질에서 공동 연결하는 모든 단백질에 대한 화면으로, 고전적인 가교 칩 (세포 배양에있는 아미노산에 의해 안정 동위 원소 라벨링) SILAC와 결합된다 (그림 3A). SILAC 실험에서 리신과 아르기닌 (광 양식) 배양 배지에서 자신의 동위 원소 표지 동족체 (무거운 형태)로 대체됩니다. 가볍고 무거운 매체 모두에서 성장 및 복제 세포에 두 개의 차동 동위 원소로 인코딩 된 아미노산 대사에 의한 특정 Δmass에 MS에 의한 구별은 각각 단백질의 가볍고 무거운 형태,,, 생성, 단백질에 통합됩니다. 대규모 SILAC 실험을 시작하기 전에, 표지 효율은 단지 무거운 표지 샘플에서 발견 무겁고 가벼운 것들의 합에 비해 무거운 펩티드의 백분율 비율로서 측정 내장 레벨을 산출, 평가된다. 무거운 아르기닌 그는 모두 95 % 우수 법인 설립AVY 리신은 정확한 단백질 정량 (그림 3B)가 필요합니다. 무겁고 가벼운 세포의 가교 후, 염색질은 초음파에 의해 분열된다. SILAC는 배경에서 특정 H3K9me3의 인터랙 터들을 구별하기 위해 K9에 트라이 메틸화을지지 수용성 H3 펩타이드 (QTAR K STGG)의 과잉 배를 사용하여 경쟁 분석과 함께 사용됩니다. 수용성 펩티드는 항체의 결합능, 이에 따라, 모든 특정 인터랙 H3K9me3-뉴 클레오의 대부분을 "축소 경쟁"및 포화이 SILAC 칩 실험 중 하나에 과량으로 첨가된다. 다른 SILAC 채널에서 경쟁 펩타이드 칩에 첨가하고, 면역 정상적으로 일어나는 아니다. SILAC - 경쟁 실험은 일반적으로 과량의 수용성 펩타이드와 경쟁이 일부터 전환 소위 "앞으로"와 "역"형식에 중복 수행E 빛 (L) 염색질 샘플에 (H) 무거운. 이것은 불특정 바인더에서 정품 안목에 사용되는 반전 보완 SILAC 비율 판독, 결과 : 특히 풍부한 단백질은 실험에서 빛 형태 (단백질 비율 H / L> 1)에 비해 무거운 형태의 높은 강도의 존재 위치를 초과 펩타이드는 광 채널 (포워드) (그림 4A, 상단 패널)에 추가됩니다; 반대의 경향 (단백질 비율 H / L는 <1) 역 복제 (그림 4A, 낮은 패널)에서 관찰된다. 그 강도 무거운 가벼운 형태로 앞으로 모두에서 유사하며 반전 실험 1에 일정한 비율에 가까운 생산 및 배경 (그림 4B)으로 분류 된 단백질.
수용성 펩타이드에 대한 최적의 과잉 배의 선택은 중요하고 정확하게 조정해야합니다. 일반적으로, 우리는 경쟁 분석 USI을 수행하는 올바른 항체 - 투 - 펩타이드 비율을 설정여분의 펩티드의 시리얼 희석을 겨와 서양의 얼룩이나 MS에 의해 펩타이드를 첨가하지 않은 양성 대조군 칩 사이의 "미끼"(hPTM / 단백질), 및 다른 일련 경쟁 칩의 레벨을 비교. 일반적으로, 최적의 과잉 방면 펩티드는 약 90 %의 면역 침강 소재 hPTM / 단백질의 양을 감소시킨다. 사실, 한편, 큰 얻어진 단백질 비율 SILAC의 판별 전원 이상; 한편, 펩티드에 의한 과도한 포화 따라서 정량화 및 통계적 분석을위한 H / L 비를 결함에 이르는 완전 항체로부터 특정 결합제를 제거있다. H3K9me3 항체를 들어 우리는 QTARK (ME3) STGG 펩타이드의 H / L의 비율을 측정하여 정확한 비율을 정의 앞으로 수행 경쟁 시험에 설정하고 우리가 경쟁 효율 (그림 3C의 척도로이 값을했다 ).
앞으로의 교차X-칩 실험 역 d는 두 실험에서 현재와 최소 2 비율의 계산으로 정량 (635) 단백질의 식별에 이르게한다. 자신의 H / L 비율의 로그 2 줄거리는 진짜 H3K9me3의 인터랙 터들이 명확하게 단백질의 비율 분포의 상위 40 % (1 사분면 내에 존재하는 단백질로 확인 된 소위 "heterochromatome"(그림 4C)를 나타냅니다 산점도 그림 4D).
그림 1 :. N-ChroP 워크 플로우 MS 분석과 함께 기본 칩) 방식의 개략도. 세포에서 염색질은 MNase 및 모노 뉴 클레오 솜 (S1)에서 농축 비율이 반대로 H3를 사용하여 면역 침강되어 분해된다K9me3 항체. Immunopurified 단백질은 SDS-PAGE에 의해 분리 및 핵심 히스톤 젤 소화의 Arg-C의 소화를 모방하는 특별 프로토콜에 있습니다. 펩티드는 nano-LC-MS/MS에 의해 분석된다. 히스톤 PTMS는 MS / MS 스펙트럼의 수동 검사를 통해서 확인 및 정량, 식별 B) 작은 규모의 MNase 시험 :. 서로 다른 시간의 경과 (왼쪽 패널)에서 MNase와 염색질 소화 한 후 1 % 아가로 오스 겔에 해결 DNA; 대규모 MNase 소화 :. DNA를 농축 C) 추정 폴리 뉴 클레오 솜 (오른쪽 패널)를 포함, S2 도당에서 모노 뉴 클레오를 포함, MNase 염색질 소화 60 분 및 S1 분획을 분리 한 후 1 % 아가로 오스 겔에 해결 / 변성의 고갈, 모노 -, 디 -, 및 관류에 트라이 메틸화 K9 (FT)가 입력 (IN)에 비해. 막대 그래프가 수정 염색질 입력 및 공동 면역의. D) SDS-PAGE에 대한 세 가지 독립적 인 실험에서 평균 ± SEM을 나타냅니다 정제 된 단백질 :. 코어 H3, H4, H2A와 H2B를 히스톤 면역 침강 뉴 클레오 입력 모두에서 각 핵심 히스톤은 (사용이 중수 소화 화학적으로 알킬화 볼 주위 17kDa 밴드 아래, H3 및 H2B 공동 마이그레이션 (검은 색 사각형) E 있습니다) 겔 소화 "처럼의 Arg-C"를 얻기 위해, 트립신 처리 전의 D 6) - 아세트산 무수물. D 6 무수 초산이 수정되지 않은 및 모노 메틸화 라이신의 엡실론 아미노기와 반응하지만 디 - 메틸화 메틸화 - 트리 및 아세틸 라이신과 함께. 그 결과, 트립신 효소 활성 따라서 소화 패턴 "처럼의 Arg-C"를 생산, 모두 네이티브 및 화학 물질 아세틸 라이신에 차단됩니다. 이 그림은 참고로 그림 1, 그림 S1 그림 S5를 사용하여, 21에서 수정되었습니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2.의 해당 M / Z 값에 건설 질량 분석 H3K9me3 "modificome"A의 분석) 확대 된 질량 스펙트럼 추출 이온 크로마토 그램 (XIC) 2 + 충전 수정되지 않은, 모노 -, 디 - 및 트리 - 메틸화 H3의 K9 (9-17) 펩티드, 입력 및 칩 샘플. B) 대표 MS / MS 스펙트럼은 CID 조각화를 사용하여. B-이온 및 y-이온 시리즈 (H3의 순서 (9-17) 펩티드를 정의하고 구체적으로 K9 잔류. C의 트라이 메틸화를 지역화) H3의 K9에 메틸화의 다른 정도의 상대 풍부 허용 9-17) 펩티드는, 모두에 대응하는 영역의 합에 의해 수정 된 각 펩티드의 곡선 (AUC) 아래의 영역을 분할함으로써 잡은 unmodifi 관찰ED와 입력 및 칩 에드 옥타에서 해당 펩타이드의 변형 형태,. 히스토그램은 각 수정 (상단 패널)에 대한 세 가지 독립적 인 실험에서 ± SEM 평균을 나타냅니다. H3 (9-17) 펩티드의 K9의 methylations 상대 농축. 농축은 입력 비교와 칩 - 에드 옥타의 각 메틸화의 상대 풍부 사이의 로그 2의 비율로 표시됩니다. 히스톤 H3, H4와 H2A에 식별 된 모든 공동 연관 hPTMs의 농축을 요약 막대 그래프는 세 가지 독립적 인 실험 (아래 패널)에서 ± SEM 평균을 나타냅니다. D) 히트 맵. 각 행은 다른 수정 (차 수정을 감지하지 않음)에 해당합니다. 이 그림은 그림 1, 그림 2 참고로 그림 3과 그림 S10를 사용하여, 21에서 수정되었습니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. MS 분석과 함께 칩을 가교 X-ChroP 워크 플로우 A) 방식의 개략도. 포름 알데히드와 염색질 입력이 DNA 조각을 생성하는 초음파에 의해 단편화로 가볍고 무거운 미디어에서 자란 세포 수는 고정되어 있습니다. 앞으로이 설정에서, 초음파 무거운 표지 염색질은 빛 표지 염색질이 K9me3 베어링 수용성 H3 펩티드의 과잉 배 포화 같은 항체와 함께 배양하는 동안 안티 H3K9me3 항체를 이용하여 면역 침전된다. 무겁고 가벼운 chromatins에서 면역 침전 단백질, 풀링 추출 및 SDS-PAGE에 의해 분리된다. SILAC 라벨의) 단백질을 트립신으로 분해되어 펩타이드 nano-LC-MS/MS. B에 의해 분석 효율은 무거운리스의 설립을 계산 모니터링오프라인 (Lys8) 및 아르기닌 (Arg10) 단백질에. 플롯에서 라이신과 아르기닌 펩티드 밀도 분포의 평균은 각각 0.974 (녹색 선)과 0.964 (빨간 선). C) 2 + 충전 트라이 메틸화의 해당 M / Z 값에 확대 된 질량 스펙트럼과 동일 모두 빛과 입력 및 칩 에드 옥타 머 무거운 형태의 H3의 K9 (9-17) 펩티드. 입력 무거운 빛 펩타이드의 농도가 앞으로 SILAC 칩, 1에 가까운 반면, 빛 펩타이드의 강도는 따라서 효율적인 경쟁을 나타내는 무거운 상대의 것보다 훨씬 낮습니다. 빛 D) SDS-PAGE (L) 및 중량 (H)는 염색질의 입력을 표시하고 공동 면역 침전 물질 : 입력의 두 조각이 결합 시험 분석 (분석하는 동안 칩 혼성 물질에 해당하는 차선은, 열 조각 (검은 선)으로 잘라 파란 선). 이 그림은 다시로 그림 4와 그림 S6를 사용하여, 21에서 수정 된전파 방해. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : H3K9me3 "interactome"의 질량 분석 분석. A) HP1에서 펩티드와 매크로-2A 단백질에 해당하는 SILAC 쌍 보여주는 대표 전체 스펙트럼 : 역 복제의 비율 H / L <1으로 미러링 비율 앞으로 실험 (상단 패널에있는 H / L> 1), (아래 패널), 이질 염색질에있는이 단백질의 특정 농축을 보여 B) SILAC 쌍은 하나의 배경 단백질의 펩티드에 대응하는 대표 전체 스펙트럼 :. 정량화 된 단백질) 앞으로의 H / L의 비율과 반복 실험 1 C 동등한 역을. distribut 있습니다그들의 앞으로의 SILAC - 비와 (각각 x와 y 축) 역 실험에 근거 산점도 에드; 빨간 점선 표시된대로 상위 40 %와 단백질 비율의 30 %를 나타냅니다. 입력에서 D) 단백질의 비율 분포 (H / L)가 블랙 (1:1) 혼합, 앞으로 (파란색)과 역방향 (오렌지) X-ChroP 실험; 빨간색 점선은 진짜 인터랙을 선택 접수 마감 시간으로 설정 단백질 비율의 상위 40 %를 나타냅니다. 이 그림은 참고로 그림 5를 사용하고, 21에서 수정되었습니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 섹션 2 버퍼 | 구성 |
| 용해 버퍼 | 10 %의 자당, 0.5 밀리미터 EGTA의 pH 8.0, 15 mM의 염화나트륨, 60 밀리미터의 KCl, 15 mM의 HEPES, 0.5 % 트리톤 (Triton), 0.5 ㎜ PMSF, 1mM의 DTT, 5 mM의 NAF, 5 밀리미터 나 3 VO 4, 5mM의 NaButyrate5 ㎎ / ㎖ 아프로 티닌 (Aprotinin), 5 ㎎ / ㎖ 펩 스타틴 A, 5 ㎎ / ㎖ 류 펩틴 |
| 자당 쿠션 | 용해 버퍼 20 ㎖에 2g 자당 |
| 소화 버퍼 | 0.32 M 슈 크로스, 50 mM 트리스 - 염산 pH를 7.6, 4 mM의 MgCl2를, 1 ㎜의 CaCl2, 0.1 mM의 PMSF |
| TE 버퍼 | 10 mM 트리스 - 염산의 pH 7.5, 1 mM의 EDTA |
| 투석 버퍼 | 10 mM 트리스 - 염산의 pH 7.6, 1 mM의 EDTA, 0.5 mM의 PMSF, 5 mM의 NAF, 5 밀리미터 나 3 VO 4, 5mM의 NaButyrate, 단백질 분해 효소 억제제 칵테일 |
| 칩 희석 버퍼 | 100 MM 트리스 염산의 pH 7.6, 100 mM의 NaCl을 10 mM의 EDTA |
| 차단 솔루션 | PBS에서 BSA 0.5 % |
| 버퍼를 세척 | 50 mM 트리스 - 염산의 pH 7.6,10 mM의 EDTA |
| 프로테아제 억제제 | EDTA없는 프로테아제 억제제 칵테일, 0.5 ㎜ PMSF, 5 mM의 NAF, 5 mM의 Na3VO4의 5mm NaButyrat전자 |
| 버퍼를로드 | H20 오렌지 로딩 염료, 50 % (V / V) 글리세롤 |
| 섹션 3 버퍼 | 구성 |
| 용해 버퍼 | 50 mM의 HEPES-KOH의 pH 7.5, 140 mM의 염화나트륨, 1 mM의 EDTA, 10 % 글리세롤, 0.5 % NP-40, 0.25 % 트리톤-100, 0.5 ㎜ PMSF, 5 mM의 NAF, 5 밀리미터 나 3 VO 4, 5mM의 NaButyrate, 5 ㎎ / ㎖ 아프로 티닌 (Aprotinin), 5 ㎎ / ㎖ 펩 스타틴 A, 5 ㎎ / ㎖ 류 펩틴 |
| 버퍼를 세척 | 10 mM 트리스 - 염산의 pH 8, 200 mM의 염화나트륨, 1 mM의 EDTA, 0.5 mM의 EGTA, 0.5 ㎜ PMSF, 5 mM의 NAF, 5 밀리미터 나 3 VO 4, 5mM의 NaButyrate, 5 ㎎ / ㎖ 아프로 티닌 (Aprotinin), 5 ㎎ / ㎖ 펩 스타틴 5 ㎎ / ㎖ 류 펩틴 |
| 칩 보육 버퍼 | 10 mM 트리스 - 염산 pH를 8, 100 mM의 염화나트륨, 1 mM의 EDTA, 0.5 mM의 EGTA, 0.1 % 나트륨 데 옥시 콜레이트, 0.5 % 나트륨 lauroylsarcoside, 0.5 mM의 PMSF, 5 mM의 NAF, 5 mM의 나 3 VO 4, 5 mM의 NaButyrate, 오㎎ / ㎖ 아프로 티닌 (Aprotinin), 5 ㎎ / ㎖ 펩 스타틴 A, 5 ㎎ / ㎖ 류 펩틴 |
| 버퍼 2를 세척 | 20 mM 트리스 - 염산 pH를 7.6, 2 mM의 EDTA, 0.1 % SDS, 1 % 트리톤-100 |
| 로드 샘플 버퍼 | 250 ㎜ 트라이 - 염산의 pH 8.8, 0.5 M의 B-머 캅토 에탄올, 2 % SDS |
| 4 절에 대한 버퍼를 | 구성 |
| 알킬화 버퍼 | 55 mM의 50 mM의 NH 4 HCO 3에 요오도 아세트 아미드 |
| 감소 버퍼 | 10 mM의 50 mM의 NH 4 HCO 3에 디티 오 트레이 톨 |
| 추출 버퍼 | DDH 2에서 30 % ACN 3 % TFA 0 |
표 1. 버퍼 조성.
| 인수 파일을 조정 | 매개 변수 |
| FT 전체 SCAN | 퇴적 목표 값 1 × 106; 최대 충전 시간을 1000 밀리 초 |
| IT의 MSN | 퇴적 목표치 10 × 104; 최대 충전 시간이 150 밀리 초 |
| 취득 설정 | 매개 변수 |
| 전기 분무 전압 | 2.4 kV의 |
| 시스 및 보조 가스 유동 | 아니 |
| 이온 전달 모세관 온도 | 200 ° C |
| 동적 제외 | MSMS시 60 초 동안 최대 500 전구체 이온 |
| 제외 질량 폭 | 10 ppm의 |
| 광대역 활성화 모드를 사용하여 정규화 된 충돌 에너지 | 35 % |
| 이온 선택 임계 | 100 카운트 |
| 정품 인증 Q | 0.25 |
| 액티브ATION 시간 | 30 밀리 초 |
표 2. MS 설정.
| Mascor Deamon를 검색 | 매개 변수 | 주의 사항 |
| 데이터베이스 | (:; 87,061 항목 인간의 데이터베이스, 버전 3.68, 즉 헬라 세포에 대한) 유기체에 따라 달라집니다 | |
| 효소 | ARG-C | 모든 아르기닌 잔기의 C-말단에 ARG-C 쪼갠다 |
| 변수 수정 | 아세틸 (K), 산화 (M), D 3-아세틸 (K), 메틸-D 3 - 아세틸 (K), 디메틸 (K), 트리메틸 (K) | 아세틸 [42.010 다], 산화 [15.995 다], D3-아세틸 [45.0294 다], 메틸-D3-아세틸 [14.016 다와 45.0294 다의 합계], 디메틸 [28.031], 트리메틸 [42.046 다] |
| 부재중 분열 | 최대 2 개 | |
| 검색 상위 이온 질량 정확도 | 10 ppm의 | |
| CID MSMS에 대한 질량 정확도 | 0.5 다 | |
| MaxQuant 검색 | 매개 변수 | 주의 사항 |
| 데이터베이스 | 유기체에 따라 달라집니다 | |
| 효소 | 트립신 / P | 모든 라이신과 아르기닌 잔기의 C-말단에 트립신을 절단. 검색이 계정에서 트립신의 효율이 리신을 절단하고 다음의 아미노산이 프롤린 (/ P) 인 경우, 아르기닌이 감소된다는 사실을 가지고 수행된다. |
| 고정 수정 | carbamidomethylation | |
| 변수 수정 | N-아세틸 (단백질), 산화 (M) | |
| 부재중 분열 | 3까지 | |
| 레이블 매개 변수 | lys8 및 arg10 | |
| 라벨 최대 amminoacid | 트립신 3 | |
| 초기 "안드로메다"검색 상위 이온의 질량 정확도 | 20 ppm으로 | |
| 주 "안드로메다"검색 상위 이온 질량 정확도 | 6 PPM | |
| CID MSMS에 대한 질량 정확도 | 0.5 다 (다 per100 상위 6 피크) | |
| 펩타이드 거짓 발견 속도 (FDR) | 0.01 | |
| 단백질 거짓 발견 속도 (FDR) | 0.01 | 0.01 펩타이드와 단백질의 FDR을 설정하면 식별 모두 펩티드 및 단백질은 오탐 (false positive)의 1 %를 포함 할 것으로 예상된다는 것을 의미한다. 이 값은 목표 미끼 데이터베이스를 사용하여 추정 |
| 최대 후방 어ROR 확률 (PEP) | 1 | PEP는 개별 펩티드 가양 일치 확률이다. 당신의 설정에서 1에 해당 PEP는 모든 펩타이드 따라서 필터링이 FDR에 독점적으로 기반에 관계없이 PEP의 수행된다는 것을 의미합니다. |
| 최소 펩타이드 길이 | 6 | |
| 펩티드의 최소 수 | 2 | |
| 독특한 펩티드의 최소 수 | 1 | |
| 만 수정되지 않은 펩타이드와 산화 (M)를 사용하여 / 아세틸 (단백질 N-기간) | 옵션을 활성화 | 자신의 풍요 로움은 해당 단백질의 비율을 반영하지 않을 수 있기 때문에 수정을 펩티드는 일반적으로 단백질 정량 계산 할 수 없습니다. |
| 최소 비율 카운트 | 1 | |
| "실행 사이의 일치" | 옵션을 활성화 |
표 3. 데이터 분석.
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Discussion
우리는 최근 ChroP, 염색질의 단백질 성분의 대규모 특성화 양적 전략을 설명 하였다. ChroP는 성적인 분야에서 사용되는 두 개의 보완적인 접근 방식, 칩과 MS, 자신의 강점에서 이익과 각각의 한계를 극복을 결합한다. 깊은 시퀀싱 (칩 - 시퀀서)에 결합 된 칩은 몇 가지 뉴 클레오 솜 (35)의 해상도에서 히스톤 수정의 게놈 전체의 매핑을 할 수 있습니다. 자신의 감성에 유리하지만, 항체 기반의 분석은 유사한 수정을 구분하기 위해 자신의 능력과 히스톤 코드 (36)의 조합 측면을 해부 제한됩니다. MS가 hPTMs, 단독 및 조합으로 15에서의 종합적이고 공정한 분석을 제공하면서 한편, 지금까지의 궤적 특정 PTMS 재잘 정보의 필연적 부족 벌크 염색질의 분석에 적용되었다. 우리는 기능적으로 분리 칩의 수정 된 버전을 사용히스톤 PTM 패턴 및 비 histonic 단백질의 특성을 구별 염색질 도메인 및 질량 분석은 특히 공동 충실.
N-ChroP를 사용하여, H3K9me3와 공동 관련된 hPTMs의 분석은 자동 염색질과 관련된 마커의 중요한 농축 및 활성 염색질과 관련된 수정의 고갈을 공개했다. 이전의 연구 (37)이 결과의 계약은 전략의 견고성을 입증했다. H3K9me3 도메인의 X-ChroP에서 크로 마틴 상호 작용하는 단백질의 SILAC 기반 조사함으로써 방법의 유효성을 검사하는 일부 이전에 설명 인터랙을 확인했다.
ChroP는 염색질의 프로테오믹스 구성 요소를 조사하기 위해 이미 전략과 관련하여 두 가지 주요 원래 측면을 선물 : 예를 들어, 같은 그대로 모노 nucl 내에서 별개의 핵심 히스톤 장식 수정 사이의 분자간 상승 작용을 공개 할 수있는 가능성N-칩에 의해 정제를 eosome; 히스톤 변형 및 링커 히스톤 하위의 특정 구획화를 평가하기 위해 두 번째 기회. 히스톤 변형의 조사가 좋은 품질의 시약 (즉, 항체)의 부족에 의해 다시 개최되기 때문에, ChroP는 자신의 위치와 기능적인 역할을 평가하기 위해 사용할 수있는 유일한 도구로 나온다.
현재의 ChroP의 한 제한은 짧은 펩티드와 수정 사이의 장거리 연결을 감지하는 필연적 인 손상에 소화 히스톤으로, MS에 사용되는 펩타이드 중심 ( "상향식") 접근 방식에 거짓말을 설정합니다. 이와 같이, "상향식"MS 분석으로 ChroP의 접합은 히스톤 코드의 조합 양태의 부분적인 평가를 허용한다. 우리는 더 이상 펩티드에 hPTMs 매핑에 대해 "중간 및 높은 아래"로 대체 MS의 전략, (> 20 AA)를 그대로 단백질에에 38-40의 구현을 극복 할 것을 관찰하다이 구속.
전반적으로, N-및 X-ChroP 모노 - 투 올리고 뉴 클레오의 해상도로, 기능적으로 별개의 도메인에서 염색질 구조의 복잡성을 해부의 가능성, 높은 보완. 우리는 ChroP는 예를 들어 전사 인자 (TFS)에 대해 특정 비 histonic 핵 단백질의 존재에 의해 표시 염색질 영역의 구성을 특징 유용 할 것으로 예측하고있다. 또, ChroP 글로벌 전사 활성화 중에, 예를 들면 각종 섭동시 특정 유전자좌에서 염색질의 동적 구성을 매핑하는 기능 연구에 사용될 수있다. 이러한 이유로, ChroP는 염색질의 프로테오믹스 풍경을 해부 할 수 분석 전략의 무기고에 추가 유용한 도구로 나온다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구는 원래 몰 세포 단백질 체학 (Proteomics)에 출판되었다. SOLDI M. 및 염색질 기능 영역의 Bonaldi T. 프로테오믹스 조사는 고유 이질 염색질 구성 요소 MCP 사이 소설 상승 작용을 보여준다. 2013; 64-80 : 12. © 생화학 및 분자 생물학을위한 미국 사회. 우리는 원고의 비판적 읽기 로베르타 Noberini (기술 및 IEO 이탈리아 연구소, 이탈리아) 감사합니다. TB의 작품은 지오반니 Armenise 하버드 재단 경력 개발 프로그램, 암 연구 및 건강의 이탈리아 정부에 대한 이탈리아 협회에서 교부금에 의해 지원됩니다. MS의 작업은 FIRC 친교에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Lonza | BE12-614F | |
| FBS | Invitrogen | 10270-106 | |
| SILAC DMEM | M-Medical | FA30E15086 | |
| Dialyzed FBS | Invitrogen | 26400-044 | |
| Lysine 0 (12C6 14N2 L-lysine) | Sigma Aldrich | L8662 | |
| Arginine 0 (12C6 14N4 L-arginine) | Sigma Aldrich | A6969 | |
| Lysine 8 (13C6 15N2 L-lysine) | Sigma Aldrich | 68041 | |
| Arginine 10 (13C6 15N4 L-arginine) | Sigma Aldrich | 608033 | |
| Micrococcal Nuclease | Roche | 10 107 921 001 | |
| Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 04 693 132 001 | |
| Spectra/Por 3 dialysis tubing, 3.5K MWCO, 18mm flat width, 50 foot length | Spectrumlabs | 132720 | |
| QIAquick PCR purification kit | QIAGEN | 28104 | |
| Anti-Histone H3 tri-methylated K9-ChIP grade | Abcam | ab8898 | |
| Histone H3 peptide tri-methyl K9 | Abcam | ab1773 | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 100.04D | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel | Invitrogen | NP0335BOX | |
| Colloidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | |
| LDS Sample Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| Formaldheyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Aceti anhydride-d6 | Sigma Aldrich | 175641-1G |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Formic Acid | Sigma Aldrich | 94318-50ML-F | |
| Iodoacetamide ≥99% (HPLC), crystalline | Sigma Aldrich | I6125 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 43815 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin, Frozen 100 μg (5 × 20 μg) | Promega | V5113 | |
| Nanospray OD 360μm x ID 75μm, tips ID 8 μm uncoated Pk 5 | Microcolumn Srl | FS360-75-8-N-5-C15 | |
| ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 µm 15% C | Dr. Maisch GmbH | r13.aq. | |
| Carbon extraction disk, 47 mm | Agilent Technologies | 12145040 | |
| Cation extraction disk | Agilent Technologies | 66889-U |
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