Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Den ChroP Approach Kombinerar Chip och masspektrometri att dissekera Locus-specifika Proteomic Landscapes of Chromatin

Published: April 11, 2014 doi: 10.3791/51220

Summary

Genom att kombinera infödda och tvärbindning kromatin immunoprecipitation med högupplösande masspektrometri, ChroP metod gör det möjligt att dissekera den sammansatta proteomik arkitektur histon modifikationer, varianter och icke-histonic proteiner synergizing på funktionellt distinkta kromatin domäner.

Abstract

Kromatin är en mycket dynamisk nukleoprotein komplex gjort av DNA och proteiner som styr olika DNA-beroende processer. Kromatin struktur och funktion hos specifika regioner regleras av lokal anrikning av histon posttranslationell modifieringar (hPTMs) och varianter, kromatin-bindande proteiner, inklusive transkriptionsfaktörer och DNA-metylering. Den proteomik karakterisering av kromatin sammansättning vid olika funktionella regioner har hittills försvårats av bristen på effektiva protokoll för att berika sådana domäner på lämplig renhet och beloppet för den senare omfattande analys av masspektrometri (MS). Vi beskriver här en nydesignad kromatin proteomik strategi, som heter ChroP (Chro matin P roteomics), varigenom en preparativ kromatin immunoprecipitation används för att isolera distinkta kromatin regioner vars funktioner, vad gäller hPTMs, varianter och co-associerade icke-histonic proteiner, är analyserades med MS. Vi illustrerar hanre inrättandet av ChroP för anrikning och analys av transkriptionellt tysta heterochromatic regioner, präglas av förekomsten av tri-metylering av lysin 9 på histon H3. De resultat som uppnåtts visa potentialen i ChroP i noggrant karakterisera heterokromatin proteomet och bevisa det som en kraftfull analytisk strategi för att förstå hur de olika proteinbestämnings kromatin samverka och samverka för att skapa locus-specifika strukturella och funktionella konfigurationer.

Introduction

Kromatin är en mycket dynamisk nukleoprotein komplex som är involverad som primär mall för alla DNA-medierade processer. Nukleosomen är den grundläggande upprepad enhet av kromatin och består av ett proteinhaltigt octameric kärna som innehåller två molekyler av varje kanonisk histon H2A, H2B, H3 och H4, runt vilken 147 bp av DNA lindas 1,2. Alla kärn histoner är uppbyggda som en klot domän och en flexibel N-terminal "svans" som sticker ut utanför nukleosomen. En av de viktigaste mekanismerna för att reglera kromatinstrukturen och dynamik baseras på kovalenta modifieringar efter translation (PTMs), som i huvudsak förekommer på den N-termini av histoner 3,4. Histon modifieringar kan fungera antingen genom att förändra det högre ordning kromatinstrukturen, genom att ändra kontakten mellan histoner-DNA eller mellan nukleosomer och sålunda styra tillgängligheten av DNA-bindande proteiner (cis mekanismerna), eller genom att fungera som docking platser för reglerande proteiner, antingen som enskilda enheter, eller inbäddade i multimera komplex. Sådana reglerande proteiner kan utöva sin funktion på olika sätt: genom att modulera direkt genuttryck (dvs. TAF-proteiner), eller genom att ändra nukleosomen positionering (dvs. kromatin remodeling komplex) eller genom att ändra andra histon rester (dvs proteiner med metyl-transferas eller acetyl- transferasaktivitet) (trans mekanismer) 5. Observationen att distinkta PTM mönster kluster vid specifika kromatin loci ledde till utarbetandet av hypotesen att olika modifieringar på olika webbplatser kan samverka för att skapa en molekylär kod förmedla funktionella tillståndet i underliggande DNA. Den "histone koden hypotes" har fått stor enighet under åren, men dess experimentell verifiering har hållits tillbaka av tekniska begränsningar 6,7.

Masspektrometri (MS)-baserad proteomik har vuxit fram som enkraftfullt verktyg för att kart histonmodifiering mönster och för att karakterisera kromatin-bindande proteiner 8. MS detekterar en ändring som ett specifikt Δmass mellan experimentella och teoretiska massan för en peptid. På nivån för enskilda histoner, ger MS en opartisk och heltäckande metod för att kart PTMs, vilket gör upptäckten av nya ändringar och avslöjande samspelar bland dem 9-14.

Under de senaste åren har ett antal strategier utvecklats för att dissekera proteomik sammansättningen av kromatin, inbegripet karakterisering av intakta mitotiska kromosomer 15, identifiering av lösliga hPTM-bindande proteiner 16-18 och isolering och analys av specifika kromatin regioner (dvs. telomerer) 19,20. Dock är fortfarande ofullständig utredning av locus-specifika synergier mellan histon PTMs, varianter och kromatin-associerade proteiner. Här beskriver vi en ny metod, som heter ChroP (Chro matin P roteomics) 21, som vi har utvecklat för att på ett effektivt sätt karakterisera funktionellt distinkta kromatin domäner. Detta tillvägagångssätt anpassar kromatin immunoprecipitation (chip), ett väletablerat protokoll som används i epigenetisk forskning, för effektiv MS-baserad proteomik analys av det anrikade prov. Vi har utvecklat två olika protokoll, beroende på den typ av kromatin som används som råmaterial och frågan behandlas av MS; särskilt: 1) chip av icke upptaget infödd kromatin rötas med MNas används för att rena mono-nukleosomer och att dissekera de samar associerar hPTMs (N-ChroP); 2) ChIP av tvärbunden kromatin fragmenteras genom ultraljudbehandling används i kombination med en SILAC baserade interactomics strategi för att karakterisera alla co-berikande kromatin bindande proteiner (X-ChroP). Vi visar här kombinationen av N-och X-ChroP för att berika och studera heterochromatin hjälp H3K9me3 som bete för immunoprecipitation steg. Användningen av ChroP kan utökasatt studera antingen distinkta regioner på kromatin, eller förändringar i kromatin sammansättning inom samma region under övergången till en annan funktionell stat, och därigenom bereda vägen för olika tillämpningar inom epigenetik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Cellodling

  1. Standard medium för infödda chip
    1. Väx HeLa-celler i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS), 1% glutamin, 1% Pen / Strep och 10 mM HEPES pH 7,5.
  2. SILAC märkning för tvärbindning av chip
    1. Väx HeLa-celler i SILAC DMEM-medium, utarmat av lysin och arginin, kompletterat med 10% dialyserad FBS, 1% glutamin, 1% Pen / Strep, 10 mM HEPES pH 7,5 och antingen den lätta L-lysin (Lys 0) och L- arginin (Arg 0) eller deras tunga motsvarigheter, L-lysin (Lys 8) och L-arginin (Arg 10) (Material-tabellen), till slutliga koncentrationer av 73 mg / l och 42 mg / L, respektive.
    2. Väx celler för upp till åtta generationer i SILAC medium för att se komplett isotop-kodade aminosyrorna inkorporering. Pass celler varannan dag, när de når en densitet på 1,0 till 1,5 x 10 6 celler / ml, sådd dem på aconcentration av 3 x 10 5 celler / ml.
    3. Utvärdera celler tillväxt och lönsamhet i SILAC medium för att individualisera eventuell förändring från fysiologi som kan följa av sämre sammansättning SILAC mediet; att göra detta:
      1. Inspektera visuellt celler morfologi vid mikroskopet varje dag under märkningen.
      2. Räkna celler och tomt tillväxtkurvor av celler som växer i SILAC kontra standard medium.

2. Native Kromatin Immunoprecipitation (N-chip)

  1. Kärnor förberedelse från odlade celler
    1. Använd 1-2 x 10 8 omärkta HeLaS3 celler per experiment. Harvest celler, gör alikvot av 50 x 10 6 celler i 50 ml rör och centrifugera vid 340 xg under 10 minuter vid 4 ° C, tvätta dem med iskall PBS.
    2. Resuspendera varje cell pelleten i 8 ml lyseringsbuffert (tabell 1) och inkubera under 10 min vid 4 ° C på ett roterande hjul. Häll carefully varje cellulärt lysat på en sackaroskudde (tabell 1) och centrifugera i en swing-out-rotor vid 3270 xg under 20 minuter vid 4 ° C, för att separera kärnorna från cytoplasman.
    3. Kasta supernatanterna, hålla kärn pellets och tvätta dem två gånger i iskall PBS genom centrifugering, kassera supernatanten vid varje tvätt.
  2. Mikrokocknukleas (MNas) matsmältning (liten skala) och kvalitetskontroll av kromatin efter rötning
    1. Resuspendera den tvättade nukleära pelleten i 1 ml Digestion Buffer (tabell 1); dela upp i två portioner av 500 l och hålla på is.
    2. Mät den optiska tätheten (OD) vid 260 nm av en alikvot, utspädd 1:200 i 0,2% natriumdodecylsulfat (SDS). Anm: OD = 1 motsvarar ca 50 | j, g / ml av kromatin-DNA. Typiskt, med start från 2 x 10 8-celler, är OD i intervallet från 40 till 60.
    3. Ta 1% av kärnorna, till MNas enzym till en slutlig koncentration av 0.005 U enzym / | il av cellkärnor och inkubera vid 37 ° C under olika tidsluckor (0, 10, 20, 40, 60 min).
    4. Vid varje tidpunkt, samla 4 pl av digere kärnor och tillsätt 1 mM EDTA för att stoppa MNas reaktionen. Håll på is.
    5. Extrahera DNA-prov med hjälp av PCR-reningskit och eluera dem i 50 | il TE-buffert (Tabell 1).
    6. Ta 20 l av varje DNA-prov, tillsätt 10 l buffert (tabell 1) och läsa in prover på 1% (vikt / volym) agarosgel innehållande etidiumbromid, med PCR-markör som en storlek kontroll.
    7. Kontrollera matsmältningen utvärdera kromatin nukleosomen stege producerad av MNas inkubation.
    8. Välj den optimala tiden för matsmältningen, baserat på förekomsten av mono nucleosomes i beredningen. . Typiskt för 0,005 U enzym / l av kärnor den optimala tiden för MNas matsmältning är 60 min (Figur 1B, till vänster) Anmärkning: Den optimala MNas koncentration / tid för digestiden kan justeras beroende på önskad celltyp och på storleken av nukleosomer stretch.
  3. Large-scale/preparative MNas matsmältning och återvinning av lösliga kromatin fraktioner
    1. Tillsätt till varje alikvot (se 2.2.1) 5 jil MNas, motsvarande en slutlig koncentration av 0,005 U enzym / | il av kärnor; Blanda försiktigt och inkubera vid 37 ° C under 60 min (eller i allmänhet för den optimerade tidsintervall, baserat på den småskaliga test).
    2. Lägg 1 mM EDTA för att stoppa reaktionen och hålla på is. Pelletera spjälkade kärnorna genom centrifugering vid 7800 xg vid 4 ° C under 10 min. Överför supernatanten (fraktion S1) i ett nytt rör och förvaras vid 4 ° C. Anmärkning: S1 innehåller den första lösliga fraktionen av kromatin, innefattande mono-nukleosomer. Lägg de proteashämmare (tabell 1).
    3. Noggrant återsuspendera pellets i 1 ml dialysbuffert (tabell 1) och dialysera över natten vid 4 ° C (cut av av dialysröret är 3,5 kDa), i 3 L Dialys Buffer, med konstant mild omrörning. Samla dialyserat material och centrifugera vid 7800 xg under 10 minuter vid 4 ° C. Överför supernatanten (S2-fraktionen) i ett nytt Eppendorf-rör och förvaras vid 4 ° C. Anmärkning: S2 innefattar di-EPTA-nukleosomer, beroende på MNas digestion utsträckning.
  4. Kvalitetskontroll av kromatin innan immunoprecipitation
    1. Tag en alikvot motsvarande 5 ^ g av S1 och S2 kromatin fraktioner (kvantifieras genom att mäta OD vid 260 nm i en Nanodrop-system). Extrahera DNA genom PCR-reningskit och eluera i 50 | il TE-buffert (Tabell 1).
    2. Ta 20 l av S1 och S2-DNA, blanda med 10 pl buffert (tabell 1) och ladda dem på 1% (vikt / volym) agarosgel. Kontrollera kvaliteten och effektiviteten i MNas matsmältningen genom visuell inspektion av nucleosomes stege Anm. Fraktion S1 är mycketanrikas i mono-nucleosomes, medan fraktion S2 innehåller huvudsakligen poly-nucleosomes (Figur 1B, höger panel).
  5. Inkubation av kromatin med antikropp
    1. Förvara vid -20 ° C 50 pl S1 fraktion för efterföljande masspektrometri analys.
    2. Tillsätt 1 volym chip spädningsbuffert (tabell 1) till bråk S1.
    3. Till antikropp mot hPTM (eller protein) av intresse; inkubera över natten på ett roterande hjul vid 4 ° C. Anmärkning: Vanligtvis använder 10 pg till 20 pg av antikroppen under 2 x 10 8-celler. Det optimala förhållandet mellan mängden antikroppar och starta celler nummer måste försiktigt från fall till fall, beroende på det överflöd av hPTM / protein som används som bete i provet och om effektiviteten kroppen. Optimering är experimentellt, baserat på följande test:
      1. Jämför mängden hPTM / protein av intresse mellan in-och genomflödes (FT,se 2.7.2) med Western blot eller MS för att kontrollera att den immunoprecipitation berikar en betydande del av specifika kromatin region Anm. Detta uppnås i allmänhet när minst 50% av hPTM / protein bete utarmas i FT (Figur 1C) .
      2. Kontrollera att immunoprecipiterade proteinet av intresse kan detekteras på SDS-PAGE-gel, vilket säkerställer att en tillräcklig mängd material som finns tillgängligt för MS-analys Obs. Närvaron på gelén av de band som motsvarar de fyra kärnhistonerna vid korrekt stökiometri indikerar att den intakta nukleosomen har immunprecipiterades av N-ChroP (figur 1D). Brist på korrekt stökiometri är i själva verket ett tecken på ett partiellt avbrott / utbredning av nukleosomen.
    4. Parallellt framställa protein G-kopplade magnetiska pärlor (se 2.6).
  6. Jämvikts och blockering av protein G-kopplade magnetiska kulor
  7. Jämvikta 100 pl av protein G-kopplade magnetiska pärlor uppslamning i blockeringslösning (tabell 1), tvättades tre gånger och inkubera dem över natten vid 4 ° C på ett roterande hjul. Anm: Efter bindningskapacitet av pärlor, använd 100 pl av uppslamningen under 2-20 ^ g av antikroppen.
  8. Tvätta de blockerade pärlorna en gång med blockeringslösning och sedan två gånger med ChIP Dilution Buffer (tabell 1).
  • Isolering av kromatin med användning av magnetiska pärlor
    1. Addera 100 pl av blockerade granulaten till kromatin prov S1 och inkubera dem på ett roterande hjul vid 4 ° C under 3 timmar. Centrifugera vid 340 x g under 1 min för att centrifugera ner provet från locket av tipsen. Sätt i en magnetisk rack till pellets kulorna.
    2. Överför supernatanten till ett nytt Eppendorf-rör. Detta är genomflödet (FT), det vill säga den del av kromatin som inte band till antikroppen.
    3. Tvätta pärlor fyragånger i tvättbuffert (tabell 1) att öka saltkoncentrationen vid varje tvätt (75, 125 och 175 mM NaCl).
    4. För att eluera immunoutfälldes kromatin, inkubera pärlorna i 30 | il av LDS-provbuffert, kompletterad med 50 mM ditiotreitol (DTT) under 5 minuter vid 70 ° C. Separera de eluerade proteinerna på en 4-12% Bis-Tris akrylamid SDS-PAGE pre-cast gradientgel och färga gelen med kolloidalt Coomassie färgning kit (figur 1D).
  • 3. Crosslinking Kromatin Immunoprecipitation (X-chip)

    1. Tvärbindning av cellerna med formaldehyd
      1. Addera 0,75% formaldehyd till SILAC-märkta celler, blanda snabbt och inkubera under 10 min vid rumstemperatur. Släck formaldehyd genom tillsats av 125 mM glycin och inkubera under 5 min vid rumstemperatur.
      2. Dela upp celler i 5 x 10 7 portioner; skölj dem tre gånger med iskall PBS genom centrifugering vid 430xg under 5 min vid 4 ° C och kasta bort supernatanten efter varje tvätt. Vid den sista tvättningen, kasta supernatanten och hålla pelleten. Anm: När cellerna är tvärbundna, kan de lagras vid -80 ° C, om den inte användes omedelbart.
    2. Nuclei beredning
      1. Resuspendera varje cellpelleten i 10 ml lyseringsbuffert (tabell 1). Inkubera under 10 minuter vid 4 ° C med rotation. Centrifugera vid 430 x g under 5 min vid 4 ° C. Kasta supernatanterna; hålla kärn pellets.
      2. Resuspendera varje kärn-pelleten i 10 ml tvättbuffert (tabell 1). Inkubera vid rumstemperatur i 10 min på ett roterande hjul.
      3. Centrifugera vid 430 x g under 5 min vid 4 ° C. Kassera supernatanterna och samla pellets.
      4. Resuspendera varje kärn pellets i 3 ml ChIP Incubation Buffer (Tabell 1). Håll på is.
    3. Chromatin ultraljudsbehandling och kvalitetskontroll
      1. Sonikera ch. romatin på 200 W (cykler om 30 sek "på" och 1 min "off"), i en kyld Bioruptor, att fragmentera kromatin OBS: antalet cykler och sonication intervall beror på vilken celltyp och den genomsnittliga längden på nucleosomal stretch önskas. Typiskt 30 min av ultraljudbehandling är nödvändig för att generera DNA-fragment av 300-500 bp i längder, motsvarande di-och tri-nukleosomer. Valet av fragment storlek beror på vilken typ av kromatin domän under utredning.
      2. Ta 2% av totalinsatsen, vända tvärbindningen genom inkubation vid 65 ° C i minst 1 timme i Chip Incubation Buffer. Extrahera DNA med PCR-rening kit, eluera i 50 l TE buffert och ladda DNA på agarosgel för att kontrollera kromatin fragmentering.
    4. Inkubation av kromatin med antikropp
      1. Tillsätt 1/10 volym av 10% Triton X-100 till sonikerades kromatin. Centrifugera vid 12.000 xg under 10 minuter vid 4 ° C för att pelletera debris.
      2. Spara 50 pl kromatin input från tunga celler för att testa införlivandet nivån SILAC aminosyror i märkta celler och för proteinprofilering.
      3. Lägg antikroppen enligt val till den återstående tunga och lätta märkt sonikerades kromatin och inkubera över natten vid 4 ° C på det roterande hjulet. I ljuset kanalen lägger också en överskotts faldigt av den lösliga peptiden. Inkubera över natten vid 4 ° C på ett roterande hjul Anmärkningar:. Det optimala villkoret mellan ig av antikroppen och utgångsmaterialet av celler som väljs från fall till fall, vilket diskuteras i 2.5.3. Den optimala överskott faldig molaritet av den lösliga peptiden i förhållande till antikroppen måste titreras noggrant från fall till fall.
    5. Isolering av kromatin med användning av magnetiska pärlor
      1. Jämvikt och blockera protein G-kopplade magnetiska kulor genom att följa stegen som beskrivs i 2.6 och med hjälp av chip Incubation Buffer.
      2. Tillsätt 100 l av blockerad bEADS till kromatin prov och inkubera på ett roterande hjul under 3 h vid 4 ° C. Centrifugera vid 340 x g under 1 min för att centrifugera ner provet från locket av tipsen. Sätt i en magnetisk rack till pellets kulorna. Den överstående vätskan är genomflödet (FT), som innehåller obundna nukleosomer. Tvätta pärlor fyra gånger i tvättbuffert (tabell 1) med ökande saltkoncentration (två tvättar med 150 mm och två på 300 mM NaCl).
      3. Inkubera pärlorna i 30 | il SDS-PAGE Loading Sample Buffer (tabell 1) och efter 25 min vid 95 ° C för både eluatet och de-tvärbinda immunoutfällda proteiner. Separata proteiner på 4-12% Bis-Tris akrylamid SDS-PAGE-förgjutna geler (Figur 3D).

    4. Provberedning Innan MS

    1. I-Gel rötning av histoner berikade från N-chip
      OBS: Under protein matsmältningen och peptid extraktion steg tar handatt minimera keratin föroreningar som interfererar med LC-MS/MS, såsom tidigare beskrivits 22, 23.
      1. Skär gelskivor motsvarande kärnhistonerna banden (figur 1D). De-färga gelen bitar med 50% acetonitril (ACN) i DDH 2 O, omväxlande med 100% ACN att krympa gelen. Upprepa tills geler bitarna är helt de-färgas och torka dem i en vakuumcentrifug.
      2. Lägg D 6-ättiksyraanhydrid 01:09 (v / v) i 1 M ammoniumbikarbonat (NH 4 HCO 3) (typiskt den slutliga volymen är 60 till 100 | il) och 3 | il natriumacetat (CH 3 COONa) som katalysator. Inkubera under 3 h vid 37 ° C med kraftig skakning Anm. Provet kan generera bubblor i de allra första minuterna efter monteringen av reaktionen: det är viktigt att hantera med försiktighet och frigöra gas som genereras, öppning från gång till gång rören under inkubationstiden.
      3. Skölj gelstycken flera gånger with NH 4 HCO 3, alternerar med ACN vid ökande andel (från 50% till 100%), för att fullständigt eliminera rester av D-6-ättiksyraanhydrid.
      4. Krymp gelen bitar i 100% ACN; torka dem i en vakuumcentrifug för att säkerställa fullständig de-hydratisering. Återfukta gel bitar med iskall 100 ng / l trypsin lösning i 50 mM NH 4 HCO 3 och inkubera över natten vid 37 ° C. Anm: Kombinationen av kemisk modifiering av lysin använder deuterad ättiksyraanhydrid och trypsin matsmältningen genererar en "Arg- C gillar "i gel matsmältning mönster av histoner 21,24.
      5. Kasta bort överskottslösning och tillsätt en volym av 50 mM NH 4 HCO 3 för att helt täcka de gelpartierna; inkubera över natten vid 37 ° C.
      6. Samla lösliga spjälkade peptiderna i ett nytt Eppendorf-rör. Lyofilisera peptidema. Resuspendera dem i 0,5% ättiksyra acid/0.1% trifluoro-ättiksyra (TFA). Avsalta och koncentrerapeptider på en omvänd fas C 18 / Carbon "sandwich" och jonbyteskromatografi (SCX) på handgjorda mikrokolonner (StageTip) 25.
      7. Förbered StageTip mikrokolonner genom att sätta teflon meshwork-skivor som innehåller immobiliserade C 18 / Kol ("sandwich") och SCX pärlor i en 200 l tips. Skaffa den "sandwich" genom att ladda C 18 mikrokolonnen ovanpå en andra spets lastad med Kolfilter Anm. De mycket korta peptider, som inte hålls kvar på C 18-filter, passera i genomflödet som laddas direkt på Carbon Tip, som normalt fångar dem. SCX StageTips kan berika specifika peptider, såsom H3 (3-8)-peptiden, inte effektivt kvarhålles genom omvänd fas-kromatografi.
      8. Belastning 50% av peptider på C 18 / Carbon "sandwich StageTip" och 50% på SCX StageTips. Eluera dem från C 18 / Carbon Tips använder 80% ACN/0.5% ättiksyra acid och från SCX Tips med 5% ammoniumhydroxid (NH4OH) / 30% metanol. Efter frystorkning, resuspendera peptider i 0,1% FA och analysera med LC-MS/MS.
    2. I-gel Rötning av immunrenat proteiner
      In-gel digestion av proteiner genomföres såsom beskrivits tidigare 22, med smärre modifieringar.
      1. Skär varje körfält i tio skivor (Figur 3D) och varje skiva i små kuber av 1 mm 3. De-stain gelstycken med 50 mM NH4 HCO3 / 50% etanol och tillsätt absolut etanol för att krympa gelerna. Upprepa tills gelerna är helt de-färgade.
      2. Lägg buffert minskning (tabell 1) till gelén stycken för en timme vid 56 ° C, följt av tillsats av alkylerings-buffert (Tabell 1) under 45 min vid rumstemperatur, i mörker. Tvätta och torka gelen bitarna i vakuumcentrifug.
      3. Rehydrera gelen bitar med iskall 12,5 ng / l trypsin solution i 50 mM NH 4 HCO 3 och inkubera på is tills fullständig rehydratisering av gelén bitar. Ta bort trypsin i överskott.
      4. Lägg till 50 mM NH 4 HCO 3 för att helt täcka gelen bitar. Inkubera över natten vid 37 ° C.
      5. Samla upp den flytande delen. Till extraktionsbuffert (Tabell 1) till gelén bitar; inkubera med kraftig omröring under 10 min vid rumstemperatur. Upprepa två gånger.
      6. Inkubera gelpartierna i ACN i 10 min med kraftig omröring. Upprepa två gånger och slå samman alla supernatanter.
      7. Lyofilisera peptidema. Resuspendera torkade peptider i 0,5%-ig acid/0.1% TFA.
      8. Avsalta och koncentrera peptider på en omvänd fas C-18 StageTip, såsom beskrivits 26, 27.
      9. Eluera peptider från C 18 StageTip användning av 80% ACN/0.5% ättiksyra. Ta det organiska lösningsmedlet genom indunstning i en vakuumcentrifug och suspendera peptider i 0,1% FA (normalt 5-10 &# 181, l), när de är färdiga till MS-analys.

    5. LC-MS-analys

    1. Vätskekromatografi analys
      1. Packa den analytiska kolonnen i en 15 cm kvarts emitter (75 ^ m innerdiameter, 350 | im yttre diameter), med användning av omvänd-fas (RP): C 18, 3 um hartset i metanol, vid en konstant heliumtrycket (50 bar) med hjälp av en bomb-loader anordningen, såsom beskrivits tidigare 28.
      2. Par den packade emitter (C18 RP-kolonn) direkt till utloppet hos sex-portsventilen av HPLC genom en 20 cm lång (25 ^ m innerdiameter) kvartsglas utan användning av förkolonn eller delad enhet.
      3. Ladda nedbrutna peptider i C 18 RP kolonn vid flöde av 500 nl / min mobil fas A (0,1% FA / 5% ACN i DDH 2 O).
      4. Efter provladdning, separera peptiderna med följande gradienter:
        1. Applicera 0-40% mobil fas B (0,1% FA/99% ACNi DDH 2 O) vid 250 nl / min under 90 min, följt av en gradient av 40-60% i 10 min och 60-80% under 5 min, för eluering av peptider som härrör från histoner (se 2).
        2. Applicera 0-36% mobil fas B vid 250 nl / min under 120 min, följt av en gradient av 36 till 60% under 10 min och 60-80% under 5 min, för eluering av peptider som härrör från immunrenade proteiner (se 3).
    2. Masspektrometri analys med LTQ-FT-ICR-Ultra masspektrometer
      1. Använd på en databeroende förvärv (DDA) läge för att automatiskt växla mellan MS och MSMS förvärvet. MS fullscan-spektra förvärvas, vanligtvis i m / z varierar från 200-1,650, förvärvas med upplösning R = 100.000 vid 400 m / z. De fem (top5) mest intensiva jonerna är isolerade för fragmentering i den linjära jonfälla med hjälp av en kollision-inducerad dissociation (CID) vid ett målvärde på 5.000.
      2. Använd de parametrar som anges i tabell 2 for det "Tuning" förvärvs fil.
      3. Ställ in standardförvärvsinställningarna enligt tabell 2.

    6. Dataanalys

    1. Märk fri kvantifiering av histon modifieringar co-berikade i kromatin domäner
      1. Konvertera de förvärvade råfiler till MGF filer med Raw2msm programvara (version 1.10) 29.
      2. Sök histon ändringar med hjälp Mascot Deamon (version 2.2.2), inställning av parametrar som beskrivs i tabell 3.
      3. På utgångspeptidlistan Mascot, ta bort peptider med poäng lägre än 15 eller med mer än 5 förmodade PTMs 29 Anm. För varje enskild peptid-ID, väljer peptiden med högsta Mascot poäng och filtrera bort alla andra redundanta peptider med samma ID .
      4. Konstruera de extraherade jonkromatogram (XIC) för varje föregångare som motsvarar varje modifierade peptider, based på m / z-värde, med hjälp av QualBrowser. Beräkna arean under kurvan (AUC) för varje topp (figur 2A).
      5. Validera vardera identifierade peptider som innehåller ändringar genom visuell inspektion av MS / MS spektra med hjälp av QualBrowser (Figur 2B).
      6. Beräkna den relativa abundansen för varje modifierad peptid. Beräkna den relativa anrikning av varje ändring i chip-ed material Anm. Relativ överflöd beräknas som ett förhållande mellan AUC för varje specifik modifierad peptid över summan av AUC för alla modifierade och omodifierade former av samma peptid, medan relativa anrikning som ett förhållande mellan den relativa förekomsten av den specifika ändringen i chip över Input (figur 2C).
    2. Kvantitativ proteomik analys av proteiner co-associerade inom kromatin domäner
      1. För proteiner identifiering och kvantifiering använder MaxQuant paketet(Http://www. Maxquant.org /) 30. Konfigurera den inbyggda sökmotorn "Andromeda" med AndromedaConfig.exe 31 och ställa in sökparametrarna som förtecknas i tabell 3.
    3. Inkorporering testet
      1. Uppskatta graden av inkorporering av tunga aminosyror i proteiner i tung-märkt kromatin ingång, med hjälp MaxQuant programvara, enligt följande:
        1. Ställ in parametrarna som beskrivs i 6.2 men inaktiveåter kvantifiera alternativet.
        2. Beräkna införlivandet procentsats följande formel till icke-redundanta peptidförhållanden:. Inkorporering (%) = ratio (H / L) / ratio (H / L) + 1 × 100 (Figur 3B) Anmärkning: Acceptera endast om inkorporering> 95 %.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Kromatin immunoprecipitation är en kraftfull teknik som används för att profilera lokaliseringen av ett protein eller en histon modifiering längs genomet. I en proteomik motsvarande, ChIP följt av MS-baserade proteomik för att identifiera kvalitativt och kvantitativt hPTMs, histon varianter och kromatin-bindande proteiner som är immunoutfällda tillsammans med modifikation eller proteinet av intresse, som används som "bete". I N-ChroP strategi, som beskrivs i figur 1 A, infödd chip, där kromatin rötas med MNas (Figur 1B), används som input för att rena från bulk kromatin en tydlig funktionell domän. Digested kromatin anrikat på mono-nukleosomer inkuberas med en specifik antikropp och den immunproteiner separeras genom SDS-PAGE. I det visade exemplet H3K9me3, markör för tyst kromatin 32,33, används för att ställa in metoden. Valet är baserat på det faktum att både dess funktionella roll somsåväl som några av dess protein interactmedlemmar är väl beskrivna. Dessutom finns 34 en mycket specifik och effektiv antikropp optimerad för chip, vilket också bekräftas av visuell inspektion av Coomassie gel, där den intakta nukleosomen, med kärnhistonerna vid rätt stökiometri, anrikas i lämpliga mängder för MS (figur 1D ).

    Jämförelsen mellan mängden H3K9me3 närvarande i genomflödet (FT) och ingång (IN) anger att cirka 50% av det intressanta området är immunrenades, med undantag för risken för en förspänning på grund av anrikningen av en mindre undergrupp av kromatin (Figur 1C). MS användes för att karakterisera den PTMs co-associerad inom de anrikade nukleosomer: varje kärn histon spjälkas genom att använda ett protokoll för ad hoc-för att uppnå en "Arg-C-liknande" digestion i polyakrylamidgel. I själva verket å ena sidan Arg-C är den bästa proteas för MS-analys av hPTMs because den producerar peptider av optimal längd; å andra sidan, inte klyver effektivt i gel. För att övervinna denna begränsning, utnyttjar vår skräddarsytt protokoll kemisk alkylering av lysin uppnås genom inkubering histon gelbanden med deutererad (D 6)-ättiksyra-anhydrid, följt av trypsin digestion. Eftersom trypsin inte klyver D 3-acetylerade lysiner, de resulterande peptider blandningen härmar en "Arg-C som" mönster (figur 1E).

    Tillsatsen av en D-3-acetylenheten till en lysin ger en otvetydig delta massa av 45,0294 dalton, diskriminera mellan nativa och kemiskt tillsatta acetyleringar i MS. Dessutom erbjuder D 3-acetylering ytterligare två fördelar som underlättar urskiljandet av isobariska modifierade peptider: först sker alkyleringen endast på omodifierade och mono-metylerade lysiner, men inte på di-och tri-metylerade rester; som sådana modifierade peptider med samma total antal ändringar, men i olika arrangemang är differentiellt dekorerade av distinkt uppsättning av D 3-acetylgrupper som ger entydiga m / z-skift. För det andra, distinkta mönster av D 3-alkylering orsaka något olika retentionstider i vätskekromatografi på omvänd fas kolonn, som alstrar en ytterligare nivå av separation för isobariska modifierade peptider 21.

    Efter validering av alla hPTMs genom manuell inspektion av motsvarande MS / MS spektra (figur 2B), är etiketten fri kvantifiering uppnås i två steg: först, vi beräknar den relativa förekomsten av varje ändring med hjälp av signalintensiteten av de omodifierade och modifierade arter för motsvarande peptid, mätt genom beräkning av de extraherade jonkromatogram (XIC) (figur 2A och 2C, övre fältet); andra, är den relativa anrikning beräknas som förhållandet mellan den relativa förekomsten av varje modification i chip-ed oktamer och motsvarande relativa förekomsten av ingång (Figur 2C, lägre panelen). Analysen av H3 (9-17) peptid visar anrikning av di-och tri-metylerade K9, med motsvarande utarmning av de omodifierade och mono-metylerade former (Figur 2C). Med detta resultat som positiv kontroll för antikroppsspecificitet, kan co-förening eller utarmning av alla andra ändringar bedömas, både på intra-molekylär nivå på samma H3 och på inter molekylär nivå, på andra co-berikade histoner inom samma nucleosome. Detta möjliggör screening av hPTMs kors samtal inom H3K9me3 domäner, den så kallade "heterokromatin modificome" (Figur 2D): är den betydande anrikning av kända markörer associerade med geners uttryck, med motsvarande utarmning av markörer kopplade med genaktivering observerade . Dessutom tillhandahålles nya föreningar detekteras såsom anrikning av H3K18me1.

    Att screena för alla proteiner samar associerar inom heterochromatin, är den klassiska tvärbindnings chip kombinerat med SILAC (Stable Isotope Märkning av aminosyror i cellkultur) (Figur 3A). I SILAC experimentet under lysin och arginin (ljus form) ersättas med deras isotopiskt märkta analoger (tung form) i odlingsmediet. Upon celler odlade och replikering i både lätt och tungt material, är de två differentiellt isotopkodade aminosyror metaboliskt inkorporeras i proteiner, generera lätta och tunga former av proteiner, respektive, som är urskiljbar från MS, på grund av en specifik Δmass. Innan du startar en storskalig SILAC experiment, är effektiviteten märknings utvärderas, beräkning införlivandet nivå, mätt som den procentuella andelen tunga peptider jämfört med summan av tunga och lätta sådana, som finns i den enda tunga märkta provet. Inkorporering överlägsen 95% för både tunga arginin och hanavy lysin krävs för korrekt protein kvantifiering (figur 3B). Efter tvärbindning av den tunga och lätta celler, kromatin fragmenteras genom sonikering. SILAC används i samverkan med en konkurrensanalys med användning av ett överskott av veck av löslig H3 peptid (QTAR K STGG) som bär tri-metylering på K9 för att diskriminera specifika H3K9me3 interactmedlemmar från bakgrunden. Den lösliga peptiden tillsätts i överskott i förhållande till en av de två SILAC ChIP experiment, där det mättar bindningskapaciteten av antikroppen, och därmed "konkurrera ut" majoriteten av H3K9me3-nukleosomer och följaktligen alla de specifika interagerande. I den andra SILAC kanalen, är den konkurrerande peptiden inte till i chip och immunfällning sker normalt. SILAC konkurrens experiment vanligen utförs i två exemplar på så kallade "framåt" och "bakåt"-format, där konkurrensen med överskottet lösliga peptiden kopplas från the tung (H) till ljus (L) kromatin prov. Detta resulterar i inverterade komplementära SILAC ratio avläsning, som används för att urskilja äkta från ospecifika bindemedel: proteiner specifikt berikade är närvarande med en högre intensitet i den tunga form i jämförelse med den lätta formen (proteinförhållande H / L> 1) i experimentet där överskott peptid sättes till ljuskanalen (Forward) (figur 4A, övre fältet); en motsatt trend (proteinförhållande H / L <1) ses i den omvända repliken (Figur 4A, lägre panelen). Proteiner vars intensitet i den tunga och lätta formen är liknande i både framåt och bakåt experiment producerar ett konstant förhållande nära 1 och klassificeras som bakgrund (Figur 4B).

    Valet av den optimala överskott faldig för den lösliga peptiden är viktig och måste avstämmas exakt. Typiskt, vi ställa in rätt antikropp-till-peptid andel utför en konkurrensanalys USIng serieutspädningar av överskott peptiden och jämföra nivån av "bete" (hPTM / protein) mellan den positiva kontrollen chip, där peptiden inte tillsätts, och de olika seriekonkurrens chips, genom Western Blot-eller MS. I allmänhet minskar det optimala överskottet faldig peptid av omkring 90% av mängden hPTM / protein i immunoprecipiterades materialet. I själva verket är å ena sidan, ju större proteinförhållande erhållas, desto högre discriminating kraft SILAC; å andra sidan kan en överdriven mättnad genom peptiden vräka helt de specifika bindemedlen från den antikropp, vilket sålunda leder till saknas H / L-förhållanden för kvantifiering och statistisk analys. För H3K9me3 antikropp definierade vi rätt andel genom att mäta H / L-förhållande för QTARK (ME3) STGG peptid, i ett konkurrenstest som utförs i en Forward ställa upp och vi tog detta värde som ett mått på konkurrenseffektivitet (figur 3C ).

    I skärningspunkten mellan Forward end Omvänd X-CHIP experiment leder till identifiering av 635 proteiner, som finns i både försök och kvantifieras med minst 2 ratio räknas. Loggen 2 plot av deras H / L-förhållanden utgör den så kallade "heterochromatome" (Figur 4C), där de äkta H3K9me3 interactmedlemmar är entydigt identifierats som de proteiner som är närvarande i den övre 40% av proteinerna ratio distributioner (övre högra kvadranten av den punktdiagram och figur 4D).

    Figur 1
    Figur 1: Schematisk bild av den N-ChroP arbetsflöde A) Schema för nativt ChIP kombination med MS-analys.. Kromatin från celler spjälkas med MNas och fraktionen anrikad på mono-nukleosomer (S1) är immunutfälldes med användning av en anti-H3K9me3 antikropp. Immunrenade proteinerna separerades genom SDS-PAGE och core-histoner är i gel-digererad med ett ad hoc-protokollet för att efterlikna en Arg-C-digestion. Peptider analyseras av nano-LC-MS/MS. Histon PTMs identifieras, valideras genom manuell inspektion av MS / MS spektra och kvantifieras B) Småskalig MNas test:. DNA beslutade om en 1% agarosgel efter kromatin uppslutning med MNas vid olika tidsförlopp (till vänster); storskalig MNas matsmältning:. DNA beslutade om en 1% agarosgel efter 60 minuter av MNas kromatin matsmältningen och efter separation av S1-fraktion, som innehåller mono-nukleosomer från S2 fraktion, som innehåller poly-nucleosomes (högra panelen) C) Uppskattning av anrikning / utarmning av omodifierade, mono-, di-och tri-metylerade K9 i genomströmnings (FT) i förhållande till ingången (IN). Histogram representerar medelvärdet ± SEM från tre oberoende försök för varje modifiering. D) SDS-PAGE av kromatin ingång och co-immuno renade proteiner: core histoner H3, H4, H2A och H2B syns runt och under 17kDa-bandet, med H3 och H2B co-migrering (svarta fyrkanter) E) Varje kärn histon från både immunutfällda nukleosomer och input är kemiskt alkylerade använda deutererad (. D-6)-ättiksyra-anhydrid före trypsinbehandling, i syfte att erhålla en "Arg-C-liknande" i gel digestion. D 6-ättikssyraanhydrid reagerar med epsilon-aminogruppen av omodifierade och mono-metylerade lysiner men inte med di-metylerade, tri-metylerade och acetylerade lysiner. Som resultat, är den enzymatiska aktiviteten av trypsin blockerad på alla nativa och kemiskt acetylerat lysin, således skapas ett "Arg-C-liknande" digereringsmönster. Denna siffra har ändrats från 21, med hjälp av Figur 1, Figur S1 och figur S5 som referens. Klicka här för att visa en större bild.

    "Fo: keep-together.within-page =" alltid "> Figur 2
    Figur 2:. Masspektrometri analys av H3K9me3 "modificome" A) Zoomad masspektra och extraherades jonkromatogram (XIC) konstruerades på motsvarande m / z-värde av 2 + ladda omodifierad, mono-, di-och tri-metylerad K9 i H3 (9-17) peptid, både för in-och flisprover. B) Representant MS / MS spektra använda CID fragmentering. De b-jon-och y-jon-serien gör det möjligt att definiera sekvenserna för H3 (9-17) peptid och att lokalisera specifikt tri-metylering på K9 rester. C) relativa förekomsten av de olika grader av metylering på K9 i H3 ( 9-17) peptid, beräknas genom att dividera arean under kurvan (AUC) för varje modifierad peptid med summan av de områden som motsvarar alla observerade unmodified och modifierade former av denna peptid, i in-och chip-ed oktamer. Histogram representerar medelvärdet ± SEM från tre oberoende försök för varje ändring (övre panelen). Relativ anrikning av K9 metyleringar i H3 (9-17) peptid. Anrikn uttrycks som en stock 2 förhållandet mellan den relativa förekomsten av varje metylering i chip-ed oktamer som jämför med input. Histogrammet representerar medelvärden ± SEM från tre oberoende försök (nedre panelen). D) heatmap sammanfattar anrikning av alla sam-associerar hPTMs identifierats på histoner H3, H4 och H2A. Varje rad motsvarar en annan modifiering (nd inte upptäcks ändringar). Denna siffra har ändrats från 21, med hjälp av Figur 1, Figur 2, Figur 3 och Figur S10 som referens. Klicka här för att visa en större bild.


    Figur 3: Schematisk bild av X-ChroP arbetsflöde A) ordning för tvärbindning chip i kombination med MS-analys.. Celler odlas i lätta och tunga medier fixeras med formaldehyd och kromatin ingångar fragment genom ultraljudsbehandling för att generera DNA-fragment. I en Forward inrättat, är det sonikerade tunga märkta kromatin immunprecipiteras hjälp av anti-H3K9me3 kroppen medan ljuset märkta kromatin inkuberas med samma antikropp mättad med ett överskott vikning av lösligt H3 peptid som bär K9me3. Immunoutfällda proteiner från tunga och lätta chromatins poolas, extraherades och separerades genom SDS-PAGE. Proteiner spjälkas med trypsin och peptider analyseras av nano-LC-MS/MS. B) Effektivitet av SILAC märkning övervakas beräkning införlivandet av tunga lysine (Lys8) och arginin (Arg10) till proteiner. På tomten, är lika med 0.974 (grön linje) och 0.964 (röd linje), respektive. C) Zoomad mass spektra vid motsvarande m / z-värdet för 2 + ladda tri-metylerade medianen distributions lysin och arginin peptider densitet K9 i H3 (9-17) peptid, både för lätta och tunga former, i in-och chip-ed oktamer. Även i input intensiteterna för tunga och lätta peptid är nära 1, i Forward SILAC chip, är ljusintensiteten peptid mycket lägre än den av den tunga motsvarighet, vilket indikerar en effektiv konkurrens. D) SDS-PAGE av ljus (L) och tung (H) märkt kromatin ingång och co-immunoutfällda material: den kö som motsvarar Chip-ed materialet skärs i tio skivor (svart linje), medan endast två skivor ingång analyseras för inbyggnad testanalys ( blå linje). Denna siffra har ändrats från 21, med hjälp av Figur 4 och Figur S6 som rekonferensen. Klicka här för att visa en större bild.

    Figur 4
    Figur 4: masspektrometri analys av H3K9me3 "interactome". A) representant fullt spektra visar SILAC-paret motsvarande peptider från HP1 och makro 2A proteiner: de nyckeltal H / L> 1 i Forward experiment (övre paneler), speglad genom ett nyckeltal H / L <1 i omvänd replik (lägre paneler), visar den specifika anrikning av dessa proteiner i heterochromatin B) Representant fullt spektra med SILAC-pair motsvarande peptid från en bakgrund protein:. H / L-förhållanden framåt och bakåt replikat är lika med 1 C) Kvantifierade proteiner. finns för utdelningsed i ett spridningsdiagram baserat på deras SILAC-förhållanden framåt och bakåt experiment (x-och y-axlarna, respektive); röda streckade linjerna representerar de översta 40% och 30% av proteinförhållanden, såsom anges. D) Protein nyckeltal utdelningar från ingång (H / L blandades 1:1) (svart), Forward (blå) och bakåt (orange) X-ChroP experiment; röda streckade linjerna representerar de översta 40% av proteinförhållanden, fastställs som cutoffs att välja den äkta interagerande. Denna siffra har ändrats från 21, med hjälp av figur 5 som referens. Klicka här för att visa en större bild.

    Buffert för avsnitt 2 Komposition
    Lysis Buffer 10% sackaros, 0,5 mM EGTA, pH 8,0, 15 mM NaCl, 60 mM KCl, 15 mM HEPES, 0,5% Triton, 0,5 mM PMSF, 1 mM DTT, 5 mM NAF, 5 mM Na-3 VO 4, 5 mM NaButyrate, 5 mg / ml aprotinin, 5 mg / ml pepstatin A, 5 mg / ml leupeptin
    Sackaroskudde 2 g sackaros i 20 ml lyseringsbuffert
    Digestion Buffert 0,32 M sackaros, 50 mM Tris-HCl pH 7,6, 4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 0,1 mM PMSF
    TE-buffert 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA
    Dialys Buffert 10 mM Tris-HCl pH 7,6, 1 mM EDTA, 0,5 mM PMSF, 5 mM NAF, 5 mM Na-3 VO 4, 5 mM NaButyrate, proteashämmare cocktail
    Chip spädningsbuffert 100 mM Tris-HCl pH 7,6, 100 mM NaCl och 10 mM EDTA
    Blockeringslösning BSA 0,5% i PBS
    Tvättbuffert 50 mM Tris-HCI pH 7.6,10 mM EDTA
    Proteashämmare EDTA-fri proteashämmare cocktail, 0,5 mM PMSF, 5 mM NAF, 5 mM Na3VO4, 5 mM NaButyrate
    Laddningsbuffert apelsin loading dye, 50% (volym / volym) glycerol i H20
    Buffert för avsnitt 3 Komposition
    Lysis Buffer 50 mM HEPES-KOH pH 7,5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glycerol, 0,5% NP-40, 0,25% Triton-100, 0,5 mM PMSF, 5 mM NAF, 5 mM Na-3 VO 4, 5 mM NaButyrate, 5 mg / ml aprotinin, 5 mg / ml pepstatin A, 5 mg / ml leupeptin
    Tvättbuffert 10 mM Tris-HCl pH 8, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 0,5 mM PMSF, 5 mM NAF, 5 mM Na-3 VO 4, 5 mM NaButyrate, 5 mg / ml aprotinin, 5 mg / ml Pepstatin A , 5 mg / ml leupeptin
    ChIP Incubation Buffer 10 mM Tris-HCl pH 8, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 0,1% natriumdeoxikolat, 0,5% natrium lauroylsarcoside, 0,5 mM PMSF, 5 mM NAF, 5 mM Na-3 VO 4, 5 mM NaButyrate, 5mg / ml aprotinin, 5 mg / ml pepstatin A, 5 mg / ml leupeptin
    Tvättbuffert 2 20 mM Tris-HCl pH 7,6, 2 mM EDTA, 0,1% SDS, 1% Triton-100
    Laddar provbuffert 250 mM Tri-HCl, pH 8,8, 0,5 M b-merkaptoetanol, 2% SDS
    Buffert för avsnitt 4 Komposition
    Alkylering Buffert 55 mM jodacetamid i 50 mM NH 4 HCO 3
    Reduktion Buffert 10 mM ditiotreitol i 50 mM NH4 HCO3
    Extraction Buffer 30% ACN och 3% TFA i DDH 2 0

    Tabell 1. Buffers sammansättning.

    Tuning förvärv fil Parametrar
    FT fullständig scan ackumulering målvärde 1 x 10 6; högsta tillåtna fyllningstiden 1.000 msek
    IT MSn ackumulering målvärde 10 x 10 4; högsta tillåtna fyllningstiden 150 msek
    Förvärv inställning Parametrar
    Elektros spänning 2,4 kV
    Mantel och hjälp gasflöde Ingen
    Ion överföring kapillär temperatur 200 ° C
    Dynamisk utestängning upp till 500 bildande joner för 60 sek på MSMS
    Uteslutning massa bredd 10 ppm
    Normaliserad kollisionsenergi med hjälp av bredbandsaktiveringsläge 35%
    Ion tröskelvärden selection 100 räknar
    Aktivering q 0,25
    Activation tid 30 msec

    Tabell 2. MS inställningar.

    MASCOR Deamon sökning Parametrar Anmärkningar
    Databas beror på organismen (dvs. för HeLa-celler: mänsklig databas, version 3.68, 87.061 poster)
    Enzym Arg-C Arg-C klyver vid C-terminalen av samtliga argininrester
    Variabla modifieringar acetyl (K), oxidering (M), D-3-acetylering (K), metyl-D-3 - acetyl-(K), dimetyl (k), trimetyl (K) acetyl [42,010 Da], oxidation [15.995 Da], D3-acetylering [45,0294 Da], metyl-D3-acetyl [summan av 14,016 Da och 45,0294 Da], dimetyl [28,031], tri [42,046 Da]
    Missade klyvningar upp till 2
    Mass noggrannhet av moderjoner i sökandet 10 ppm
    Mass-noggrannhet för CID MSMS 0,5 Da
    MaxQuant sökning Parametrar Anmärkningar
    Databas beror på den organism
    Enzym trypsin / P Trypsin klyver vid den C-terminala av alla lysin-och argininrester. Sökningen utförs med följande i beaktande det faktum att effektiviteten för trypsin att klyva lysin och arginin reduceras när nästa aminosyra är prolin (/ P).
    Fast modifiering carbamidomethylation
    Variabla modifieringar N-acetyl-(protein), oxidation (M)
    Missade klyvningar upp till 3
    Märknings parametrar lys8 och arg10
    Maximal etikett amminoacid 3 för trypsin
    Mass-noggrannhet av moderjoner i den inledande "Andromeda" sökning 20 ppm
    Mass noggrannhet av moderjoner i huvud "Andromeda" sökning 6 ppm
    Mass-noggrannhet för CID MSMS 0,5 Da (sex topp toppar per100 Da)
    Peptid falska upptäckt priser (FDR) 0,01
    Protein falska upptäckt priser (FDR) 0,01 Inställning av FDR för peptid och protein till 0,01 innebär att både peptider och proteiner som identifierats förväntas innehålla 1% av falska positiva. Detta värde beräknas med hjälp av en mål-bulvan databas
    Maximal posterior ERror sannolikhet (PEP) 1 PEP är sannolikheten att en enskild peptid är ett falskt positivt match. PEP lika med 1 i din inställning innebär att alla peptider tas oberoende av PEP därmed filtreringen är uteslutande baserad på FDR.
    Minsta peptidlängd 6
    Minsta antal peptider 2
    Minsta antal unika peptider 1
    Genom att bara använda omodifierade peptider och oxidation (M) / acetyl (protein N-Term) Aktivera alternativet Peptider med ändringar bör i allmänhet inte räknas för protein kvantifiering eftersom deras överflöd inte kan återspegla förhållandet mellan motsvarande protein.
    Minsta antal som förhållandet 1
    "Match mellan körningar" Aktivera alternativet

    Tabell 3. Dataanalys.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Vi har nyligen beskrivit ChroP en kvantitativ strategi för storskalig karaktärisering av proteinkomponenterna i kromatin. ChroP kombinerar två kompletterande tillvägagångssätt som används i den epigenetiska området, Chip och MS, dra vinning av sina starka sidor och övervinna sina respektive begränsningar. Chip kopplat till djupa sekvensering (chip-Seq) gör genomet omfattande kartläggning av histon ombyggnadsarbeten vid upplösningen av få nukleosomer 35. Trots fördel för deras känslighet, är antikroppsbaserade analyser begränsade i sin förmåga att skilja liknande modifieringar och dissekera den kombinatoriska aspekten av histonen koden 36. Å andra sidan, medan MS ger en omfattande och opartisk analys av hPTMs, enstaka och i kombinationer 9, det har hittills använts för analysen av bulk kromatin, med därav följande brist på information om locus specifika PTMs mönster. Vi använder en modifierad version av chip för att isolera funktionelltdistinkta kromatin domäner och masspektrometri för att karakterisera de histon PTM mönster och de icke-histonic proteiner specifikt sam-berikad.

    Med användning av N-ChroP, analys av hPTMs samtidig associerade med H3K9me3 avslöjade en signifikant anrikning av markörer associerade med tyst kromatin, och en utarmning av ändringar associerade med aktiv kromatin. Överenskommelsen av dessa resultat med tidigare studier 37 visade robustheten i strategin. I X-ChroP av H3K9me3 domäner, det SILAC baserad undersökning av kromatin-interagerande proteiner bekräftade några tidigare beskrivna interactmedlemmar och därmed validera metoden.

    ChroP presenterar två ursprungliga aspekter i förhållande till de strategier som redan finns tillgängliga för att undersöka proteomik komponenten i kromatin: till exempel möjligheten att avslöja intermolekylära synergieffekter mellan ändringar dekorerar distinkta kärnhistonerna inom samma intakta mono Nucleosome renas genom N-chip; andra chans att bedöma specifika uppdelning av histon varianter och länkare histon subtyper. Eftersom utredningen av histon varianter hålls tillbaka av bristen på bra kvalitet reagenser (dvs antikroppar), framträder ChroP som unikt verktyg som finns för att bedöma deras placering och funktionell roll.

    En begränsning av ChroP i sin nuvarande upprätta lögner i peptid-centrerad ("Bottom-up") metod som används i MS, med histoner rötas i korta peptider och den därav följande försämring i att upptäcka den långväga anslutning mellan ändringar. Som sådan konjugering av ChroP med "bottom-up" MS-analys medger en partiell bedömning av den kombinatoriska aspekt av histon kod. Vi planerar att genomföra alternativa MS-strategier, såsom "Middle-och Top-Down" för hPTMs kartläggning på längre peptider (> 20 aa) upp till den intakta proteiner 38-40, kommer att övervinnadenna återhållsamhet.

    Sammantaget, N-och X-ChroP kompletterar varandra mycket väl, med möjlighet att dissekera komplexiteten i kromatinstrukturen vid funktionellt distinkta domäner, med en upplösning på mono-till oligo-nucleosomes. Vi förutspår att ChroP kommer att vara användbar även för att karakterisera sammansättningen av kromatin regioner markerade med närvaron av specifika icke-histonic nukleära proteiner, t ex transkriptionsfaktorer (TFS). Dessutom kan ChroP användas i funktionella studier för att kartlägga den dynamiska sammansättningen av kromatin på specifika loci på olika störningar, t ex under globala transkriptionell aktivering. Av dessa skäl framgår ChroP som ett ytterligare användbart verktyg i den arsenal av analytiska strategier som kan dissekera proteomic landskap av kromatin.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Inga intressekonflikter deklareras.

    Acknowledgments

    Denna forskning publicerades ursprungligen i Mol Cell Proteomics. Soldi M. och Bonaldi T. Proteomic Utredning av Chromatin Funktionella domäner avslöjar Novel synergieffekter bland Distinkta heterokromatin Components MCP. 2013; 12: 64-80. © American Society for biokemi och molekylärbiologi. Vi tackar Roberta Noberini (italienska institutet för teknik och IEO, Italien) för kritisk läsning av manuskriptet. TB arbete stöds av bidrag från Giovanni Armenise-Harvard Foundation Career Development Program, den italienska föreningen för cancerforskning och det italienska hälsoministeriet. MS arbete stöddes av en FIRC gemenskap.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    DMEM  Lonza BE12-614F
    FBS Invitrogen 10270-106
    SILAC DMEM M-Medical FA30E15086
    Dialyzed FBS Invitrogen 26400-044
    Lysine 0 (12C6 14N2 L-lysine) Sigma Aldrich L8662
    Arginine 0 (12C6 14N4 L-arginine) Sigma Aldrich A6969
    Lysine 8 (13C6 15N2 L-lysine) Sigma Aldrich 68041
    Arginine 10 (13C6 15N4 L-arginine) Sigma Aldrich 608033
    Micrococcal Nuclease Roche 10 107 921 001
    Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets Roche 04 693 132 001
    Spectra/Por 3 dialysis tubing, 3.5K MWCO, 18mm flat width, 50 foot length Spectrumlabs 132720
    QIAquick PCR purification kit QIAGEN 28104
    Anti-Histone H3 tri-methylated K9-ChIP grade Abcam ab8898
    Histone H3 peptide tri-methyl K9  Abcam ab1773
    Dynabeads Protein G Invitrogen 100.04D
    NuPAGE Novex 4-12%                            Bis-Tris Gel  Invitrogen NP0335BOX
    Colloidal Blue Staining Kit Invitrogen LC6025
    LDS Sample Buffer Invitrogen NP0007
    Formaldheyde Sigma Aldrich F8775
    Aceti anhydride-d6 Sigma Aldrich 175641-1G
    Name Company Catalog Number Comments
    Formic Acid Sigma Aldrich 94318-50ML-F
    Iodoacetamide ≥99% (HPLC), crystalline Sigma Aldrich I6125
    DL-Dithiothreitol Sigma Aldrich 43815
    Sequencing Grade Modified Trypsin, Frozen 100 μg (5 × 20 μg) Promega V5113
    Nanospray OD 360μm x ID 75μm, tips ID 8 μm uncoated Pk 5 Microcolumn Srl FS360-75-8-N-5-C15
    ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 µm   15% C Dr. Maisch GmbH r13.aq.
    Carbon extraction disk, 47 mm Agilent Technologies 12145040
    Cation extraction disk Agilent Technologies 66889-U

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184, 868-871 (1974).
    2. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
    3. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
    4. Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Res. 21, 381-395 (2011).
    5. Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers. Nat Struct Mol Biol. 14, 1025-1040 (2007).
    6. Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293, 1074-1080 (2001).
    7. Spotswood, H. T., Turner, B. M. An increasingly complex code. J Clin Invest. 110, 577-582 (2002).
    8. Soldi, M., Cuomo, A., Bremang, M., Bonaldi, T. Mass spectrometry-based proteomics for the analysis of chromatin structure and dynamics. Int J Mol Sci. 14, 5402-5431 (2013).
    9. Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry. J Proteomics. 75, 3419-3433 (2012).
    10. Britton, L. M., Gonzales-Cope, M., Zee, B. M., Garcia, B. A. Breaking the histone code with quantitative mass spectrometry. Expert Rev Proteomics. 8, 631-643 (2011).
    11. Taverna, S. D., et al. Long-distance combinatorial linkage between methylation and acetylation on histone H3 N termini. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2086-2091 (2007).
    12. Garcia, B. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 11, 66-73 (2007).
    13. Villar-Garea, A., Imhof, A. The analysis of histone modifications. Biochim Biophys Acta. 1764, 1932-1939 (2006).
    14. Plazas-Mayorca, M. D., et al. One-pot shotgun quantitative mass spectrometry characterization of histones. J Proteome Res. 8, 5367-5374 (2009).
    15. Ohta, S., et al. The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics. Cell. 142, 810-821 (2010).
    16. Vermeulen, M., et al. Selective anchoring of TFIID to nucleosomes by trimethylation of histone H3 lysine 4. Cell. 131, 58-69 (2007).
    17. Vermeulen, M., et al. Quantitative interaction proteomics and genome-wide profiling of epigenetic histone marks and their readers. Cell. 142, 967-980 (2010).
    18. Bartke, T., et al. Nucleosome-interacting proteins regulated by DNA and histone methylation. Cell. 143, 470-484 (2010).
    19. Dejardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic Loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
    20. Lambert, J. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A novel proteomics approach for the discovery of chromatin-associated protein networks. Mol Cell Proteomics. 8, 870-882 (2009).
    21. Soldi, M., Bonaldi, T. The proteomic investigation of chromatin functional domains reveals novel synergisms among distinct heterochromatin components. Mol Cell Proteomics. 12, 764-780 (2013).
    22. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 1, 2856-2860 (2006).
    23. Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal Chem. 68, 850-858 (1996).
    24. Bonaldi, T., Regula, J. T., Imhof, A. The use of mass spectrometry for the analysis of histone modifications. Methods Enzymol. 377, 111-130 (2004).
    25. Cuomo, A., Moretti, S., Minucci, S., Bonaldi, T. SILAC-based proteomic analysis to dissect the "histone modification signature" of human breast cancer cells. Amino Acids. 41, 387-399 (2011).
    26. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nat Protoc. 2, 1896-1906 (2007).
    27. Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Anal Chem. 75, 663-670 (2003).
    28. Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Mol Cell Proteomics. 3, 608-614 (2004).
    29. Jung, H. R., Pasini, D., Helin, K., Jensen, O. N. Quantitative mass spectrometry of histones H3.2 and H3.3 in Suz12-deficient mouse embryonic stem cells reveals distinct, dynamic post-translational modifications at Lys-27 and Lys-36. Mol Cell Proteomics. 9, 838-850 (2010).
    30. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26, 1367-1372 (2008).
    31. Cox, J., et al. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. J Proteome Res. 10, 1794-1805 (2011).
    32. Lachner, M., O'Carroll, D., Rea, S., Mechtler, K., Jenuwein, T. Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins. Nature. 410, 116-120 (2001).
    33. Bannister, A. J., et al. Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain. Nature. 410, 120-124 (2001).
    34. Ram, O., et al. Combinatorial patterning of chromatin regulators uncovered by genome-wide location analysis in human cells. Cell. 147, 1628-1639 (2011).
    35. Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129, 823-837 (2007).
    36. Beck, H. C. Mass spectrometry in epigenetic research. Methods Mol Biol. 593, 263-282 (2010).
    37. Ernst, J., Kellis, M. Discovery and characterization of chromatin states for systematic annotation of the human genome. Nat Biotechnol. 28, 817-825 (2010).
    38. Tipton, J. D., et al. Analysis of intact protein isoforms by mass spectrometry. J Biol Chem. 286, 25451-25458 (2011).
    39. Young, N. L., et al. High throughput characterization of combinatorial histone codes. Mol Cell Proteomics. 8, 2266-2284 (2009).
    40. Boyne, M. T. 2nd, Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. Precise characterization of human histones in the H2A gene family by top down mass spectrometry. J Proteome Res. 5, 248-253 (2006).

    Tags

    Biokemi kromatin histon post-translationella modifieringar (hPTMs) epigenetik masspektrometri proteomik SILAC kromatin immunoprecipitation histon varianter chromatome hPTMs kors samtalen
    Den ChroP Approach Kombinerar Chip och masspektrometri att dissekera Locus-specifika Proteomic Landscapes of Chromatin
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroPMore

    Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin. J. Vis. Exp. (86), e51220, doi:10.3791/51220 (2014).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter