Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Den ChroP Approach Kombinerer Chip og massespektrometri å dissekere Locus-spesifikke proteomikk Landscapes of Kromatin

Published: April 11, 2014 doi: 10.3791/51220
Automatic Translation
1, 1
1Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology

Summary

Ved å kombinere mors og kryssbinding kromatin immunoprecipitation med høy oppløsning massespektrometri, ChroP tilnærming gjør det mulig å dissekere den sammensatte proteomikk arkitektur histonmodifikasjonene, varianter og ikke-histonic proteiner synergizing på funksjonelt distinkte kromatin domener.

Abstract

Chromatin er en svært dynamisk nucleoprotein kompleks fremstilt av DNA og proteiner som styrer forskjellige DNA-avhengige prosesser. Kromatin struktur og funksjon i spesifikke regioner er regulert av den lokale berikelse av histone post-translasjonell modifikasjoner (hPTMs) og varianter, kromatin-bindende proteiner, inkludert transkripsjonsfaktorer, og DNA-metylering. Den proteomikk karakterisering av kromatin sammensetning på forskjellige funksjonelle regioner har vært så langt hemmet av mangel på effektive protokoller for å berike slike domener på riktig renhet og beløp for den påfølgende grundig analyse av massespektrometri (MS). Vi beskriver her en nydesignet kromatin proteomikk strategi, heter ChroP (Chro matin P roteomics), der en forberedende kromatin immunoprecipitation brukes til å isolere forskjellige kromatin regioner der funksjonene, i form av hPTMs, varianter og co-forbundet ikke-histonic proteiner, er analysert av MS. Vi illustrerer hanre opprettelsen av ChroP for anriking og analyse av transcriptionally tause heterochromatic regioner, preget av tilstedeværelsen av tri-metylering av lysin 9 på histone H3. De oppnådde resultater viser potensialet i ChroP i grundig karakterisere heterochromatin proteomet og bevise det som en kraftig analytisk strategi for å forstå hvordan de forskjellige protein determinants av kromatin samhandle og synergize å etablere locus-spesifikke strukturelle og funksjonelle konfigurasjoner.

Introduction

Chromatin er en svært dynamisk nucleoprotein kompleks som er involvert i primær mal for alle DNA-medierte prosesser. Den nucleosome er den grunnleggende gjentatte enhet av kromatin og består av en proteinholdig oktamer kjerne inneholdende to molekyler av hver kanonisk histone H2A, H2B, H3 og H4, rundt hvilken 147 bp av DNA er pakket 1,2. Alle kjerne histoner er strukturert som en globular domene og en fleksibel N-terminal "hale" som stikker utenfor nukleosom. En av de viktigste mekanismer for regulering kromatinstruktur og dynamikk er basert på kovalente post-translasjonelle modifikasjoner (PTMs), som hovedsakelig forekommer i N-termini av histoner 3,4. Histonmodifikasjonene kan fungere enten ved å endre høyere orden kromatinstruktur, ved å bytte kontakt mellom histoner, DNA eller mellom nucleosomes, og dermed kontrollere tilgjengeligheten av DNA-bindende proteiner (cis mekanismer), eller ved å virke som docking sider for regulatoriske proteiner, enten som enkeltheter, eller innebygd i multimere komplekser. Slike regulerende proteiner kan utøve sin funksjon på forskjellige måter: ved å modulere direkte genekspresjon (f.eks TAF proteiner), eller ved å endre nucleosome posisjonering (dvs. kromatin ombygging komplekser) eller ved å modifisere andre histone rester (dvs. proteiner med metyl-transferase-eller acetyl- transferase aktivitet) (trans mekanismer) 5. Observasjonen som tydelig PTM mønstre klynge på spesifikke kromatin loci førte til utarbeidelsen av hypotesen om at ulike modifikasjoner på forskjellige nettsteder kan synergize å generere en molekylær kode medier funksjonell tilstand av den underliggende DNA. Den "histone kode hypotesen" har fått stor konsensus i årene, men sin eksperimentelle verifikasjon har blitt holdt tilbake av tekniske begrensninger 6,7.

Massespektrometri (MS)-baserte proteomikk har dukket opp som enkraftig verktøy for å kartlegge histone modifikasjon mønstre og å karakter kromatin-bindende proteiner åtte. MS detekterer en modifikasjon i et bestemt Δmass mellom den eksperimentelle og teoretiske massen av et peptid. På nivået av individuelle histoner, gir MS en objektiv og omfattende metode for å kartlegge PTMs, slik at påvisning av nye modifikasjoner og avslørende samspill blant dem 9-14.

I de senere årene, er det utviklet en rekke strategier for å dissekere proteomikk sammensetningen av kromatin, herunder karakterisering av intakte mitotiske kromosomer 15, identifisering av løselige Hptm bindende proteiner 16-18 og isolering og analyse av konkrete kromatin regioner (dvs. telomerer) 19,20. Men, er etterforskningen av locus-spesifikke synergier mellom histone PTMs, varianter, og kromatin-assosiert proteiner fortsatt ufullstendig. Her beskriver vi en ny tilnærming, heter ChroP (Chro matin P roteomics) 21, som vi har utviklet for å effektivt karakter funksjonelt distinkte kromatin domener. Denne tilnærmingen tilpasser kromatin immunoprecipitation (chip), en godt etablert protokoll som brukes i epigenetisk forskning, for effektiv MS-basert proteomikk analyser av beriket prøven. Vi har utviklet to forskjellige protokoller, avhengig av typen av kromatin brukt som inngang og spørsmålet adressert av MS; spesielt: 1) chip av unfixed innfødte kromatin fordøyd med MNase er ansatt for å rense mono-nucleosomes og å dissekere co-knytte hPTMs (N-ChroP); 2) ChIP av tverrbundet kromatin fragmenteres ved sonikering blir brukt i kombinasjon med et SILAC basert interactomics strategi for å karakterisere alle co-berikende kromatin bindende proteiner (X-ChroP). Vi viser her til kombinasjonen av N-og X-ChroP for å anrike og studere heterochromatin, ved hjelp H3K9me3 som agn for immunoprecipitation trinn. Bruken av ChroP kan forlengeså studere enten forskjellige regioner på kromatin, eller endringer i kromatin sammensetning innenfor den samme regionen i løpet av overgangen til en annen funksjonell tilstand, og dermed banet vei til ulike programmer i epigenetikk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Cell Culture

  1. Standard medium for innfødte chip
    1. Dyrk HeLa-celler i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplert med 10% kalvefosterserum (FBS), 1% glutamin, 1% Pen / Strep, og 10 mM HEPES pH 7,5.
  2. SILAC merking for kryssbinding chip
    1. Dyrk HeLa-celler i SILAC DMEM medium, utarmet med lysin og arginin, supplert med 10% dialysert FBS, 1% glutamin, 1% Pen / Strep, 10 mM HEPES pH 7,5, og enten lyset L-lysin (Lys 0) og L- arginin (Arg 0) eller deres tunge motstykker, L-lysin (Lys 8) og L-arginin (Arg 10) (Materialer Table), ved sluttkonsentrasjoner på 73 mg / l og 42 mg / L, henholdsvis.
    2. Grow celler i opptil åtte generasjoner i SILAC medium for å sikre fullstendig isotop-kodet aminosyrer innlemmelse. Pass celler hver dag, når de når en tetthet på 1,0-1,5 x 10 6 celler / ml, seeding dem på aconcentration av 3 x 10 5 celler / ml.
    3. Evaluere celler vekst og levedyktighet i SILAC medium å individuate eventuell endring fra fysiologi som kan resultere fra fattigere sammensetningen av SILAC medium; å gjøre dette:
      1. Inspiser visuelt celler morfologi på mikroskopet hver dag i løpet av merking.
      2. Telle celler og tomten vekstkurver av celler som vokser i SILAC versus standard medium.

2. Native Kromatin immunoprecipitation (N-chip)

  1. Kjerner forberedelse fra dyrkede celler
    1. Bruk 1-2 x 10 8 umerkede HeLaS3 celler per eksperiment. Slakte celler, gjør aliquot av 50 x 10 6-celler i 50 ml rør og sentrifugert ved 340 xg i 10 min ved 4 ° C, vaskes med iskald PBS.
    2. Resuspender cellepelleten hver i 8 ml Lysis Buffer (Tabell 1) og inkuberes i 10 min ved 4 ° C på et roterende hjul. Hell carefully hver cellulære lysatet på en sukrose pute (tabell 1) og sentrifuger i en swing-out rotor, ved 3270 xg i 20 min ved 4 ° C, for å skille kjerner fra cytoplasma.
    3. Kast Supernatantene, holde atom pellets og vaske dem to ganger i iskald PBS ved sentrifugering, kast supernatanten ved hver vask.
  2. Micrococcal Nuclease (MNase) fordøyelse (liten skala) og kvalitetskontroll av kromatin etter fordøyelse
    1. Resuspender pelleten vasket atom i 1 ml Fordøyelse Buffer (Tabell 1); deles i to aliquoter på 500 pl og holde på is.
    2. Måle den optiske tetthet (OD) ved 260 nm av en alikvot, fortynnet 1:200 i 0,2% natrium-dodecyl-sulfat (SDS). Merk: OD = 1 svarer til omtrent 50 pg / ml av kromatin DNA. Typisk, med start fra 2 x 10 8 celler, er OD i området fra 40-60.
    3. Ta 1% av kjerner, tilsett MNase enzym til en endelig konsentrasjon på 0.005 U av enzymet / mL av kjerner og inkuberes ved 37 ° C i forskjellige tids opphører (0, 10, 20, 40, 60 min).
    4. På hvert tidspunkt, samler 4 pl av fordøyd kjerner og tilsett 1 mM EDTA for å stoppe MNase reaksjonen. Hold på is.
    5. Pakk DNA-prøver av PCR rensing kit og elueres dem i 50 mL TE Buffer (Tabell 1).
    6. Ta 20 ul av hver DNA-prøve, tilsett 10 pl Loading Buffer (Tabell 1), og laste prøvene på 1% (w / v) agarosegel inneholdende etidiumbromid, med PCR da som en størrelses-kontroll.
    7. Sjekk fordøyelsen evaluere kromatin nukleosom stigen produsert av MNase inkubasjon.
    8. Velg det optimale tidspunktet for fordøyelsen, basert på forekomsten av mono-nucleosomes i utarbeidelsen. . Typisk for 0.005 U enzym / mL av kjerner det optimale tidspunktet for MNase fordøyelsen er 60 min (Figur 1B, venstre panel) Merk: Den optimale MNase konsentrasjon / tid på digestiden kan bli justert, avhengig av den ønskede celletype og av størrelsen på nucleosomes strekk.
  3. Large-scale/preparative MNase fordøyelse og gjenvinning av løselige kromatin fraksjoner
    1. Legg til hver prøve (se 2.2.1) 5 pl MNase, som svarer til en sluttkonsentrasjon på 0.005 U enzym / ul av kjernene; bland forsiktig og inkuber ved 37 ° C i 60 min (eller generelt for den optimaliserte tidsintervall, basert på den lille skala test).
    2. Tilsett 1 mM EDTA for å stoppe reaksjonen og holde på is. Pellet fordøyd atomkjerner ved sentrifugering ved 7800 xg ved 4 ° C i 10 min. Overfør supernatanten (fraksjon S1) i et nytt rør og oppbevares ved 4 ° C. Bemerk: S1 inneholder den første løselige fraksjon av kromatin, omfattende mono-nucleosomes. Tilsett proteasehemmere (Tabell 1).
    3. Nøye Resuspender pellet i 1 ml dialysebuffer (tabell 1) og dialyser over natten ved 4 ° C (cutca ut av dialyserøret er 3,5 kDa), i 3 L Dialyse buffer, med konstant mild omrøring. Samle dialyserte materiale og sentrifuger ved 7800 xg i 10 min ved 4 ° C. Overfør supernatant (S2 fraksjon) på et nytt Eppendorf-rør og oppbevares ved 4 ° C. Bemerk: S2 omfatter di-til Epta-nucleosomes, avhengig av MNase fordøyelse grad.
  4. Kvalitetskontroll av kromatin før immunoprecipitation
    1. Ta en porsjon tilsvarende 5 ug av S1 og S2 kromatin fraksjoner (kvantifisert ved måling av OD ved 260 nm i et Nanodrop system). Ekstraher DNA ved PCR rensing kit og elueres i 50 ul TE-buffer (tabell 1).
    2. Ta 20 ul S1-og S2-DNA blandes med 10 pl Loading Buffer (Tabell 1) og overføre dem på 1% (w / v) agarosegel. Sjekk kvaliteten og effektiviteten i MNase fordøyelsen ved visuell inspeksjon av nucleosomes stigen. Merk: Brøk S1 er sværtberiket i mono-nucleosomes, mens brøkdel S2 inneholder hovedsakelig poly-nucleosomes (Figur 1B, høyre panel).
  5. Inkubasjon av kromatin med antistoff
    1. Oppbevar ved -20 ° C 50 ul S1 fraksjon for påfølgende massespektrometri-analyse.
    2. Tilsett 1 volum av ChIP Dilution Buffer (Tabell 1) til fraksjon S1.
    3. Tilsett antistoff mot Hptm (eller protein) av interesse; inkuberes over natten på et roterende hjul ved 4 ° C. Bemerk: Vanligvis bruker 10 ug til 20 ug av antistoff i 2 x 10 8 celler. Det optimale forholdet mellom mengden av antistoff og starter celler nummer må være nøye angitt i hvert enkelt tilfelle, avhengig av den mengde av Hptm / protein anvendes som agn i prøven, og på den antistoff-effektivitet. Optimalisering er eksperimentell, basert på følgende tester:
      1. Sammenligne mengden av Hptm / protein av interesse mellom inngang og gjennomstrømning (FT,se 2.7.2) av Western Blot-eller MS for å bekrefte at immunoutfelling beriker en betydelig andel av spesifikk kromatin region. Merk: Dette blir generelt oppnådd når minst 50% av den Hptm / protein agn er oppbrukt i FT (fig. 1C) .
      2. Kontroller at immunoutfelte proteinet av interesse er detekterbar på SDS-PAGE gel, noe som sikrer at en tilstrekkelig mengde av materiale som er tilgjengelig for MS-analyse Obs. Tilstedeværelsen på gelen av båndene som tilsvarer de fire kjerne histoner i korrekt støkiometri viser at intakt nucleosome er blitt immunoutfelt med N-ChroP (fig. 1D). Mangel på korrekt støkiometri er nemlig en indikasjon på en delvis avbrudd / utfolding av nucleosome.
    4. Parallelt forberede protein G-coupled magnetiske kuler (se 2.6).
  6. Ekvilibrering og blokkering av G protein-koplede magnetiske kuler
  7. Stabil 100 mL av protein G-koplede magnetiske kuler slammet i Blocking Solution (tabell 1), vasket tre ganger og inkubert dem over natten ved 4 ° C på et roterende hjul. Merknad: Etter bindingskapasiteten av perler, bruke 100 pl av oppslemmingen i 2-20 mikrogram av antistoffet.
  8. Vask de blokkerte perler en gang med Blocking Solution og deretter to ganger med ChIP Dilution Buffer (Tabell 1).
  • Isolering av kromatin ved hjelp av magnetiske kuler
    1. Tilsett 100 ul av blokkerte perler til S1 kromatin prøven og inkuber dem på et roterende hjul ved 4 ° C i 3 timer. Sentrifuger ved 340 xg i 1 min til å spinne ned prøven fra lokket av tipsene. Sett i et magnetisk stativ for å klumpe perlene.
    2. Overfør supernatanten til et nytt Eppendorf-rør. Dette er strømmen gjennom (FT), nemlig den del av kromatin som ikke binder seg til antistoffet.
    3. Vask perlene fireganger i vaskebuffer (tabell 1) å øke saltkonsentrasjonen ved hver vask (75, 125 og 175 mM NaCl).
    4. For å eluere den immunoutfelt kromatin, inkuber perlene i 30 pl av LDS prøvebuffer supplert med 50 mM ditiotreitol (DTT) i 5 min ved 70 ° C. Separer eluted proteiner på en 4-12% Bis-Tris akrylamid SDS-PAGE pre-cast gradient gel og beis gel med kolloidalt Coomassie flekker kit (Figur 1D).

    • Tre. Crosslinking Kromatin immunoprecipitation (X-Chip)

    1. Tverrbinding av celler med formaldehyd
      1. Til 0,75% formaldehyd til SILAC-merkede celler, bland forsiktig og inkuber i 10 min ved romtemperatur. Slukke formaldehyd ved tilsetning av 125 mM glysin og inkuberes i 5 minutter ved romtemperatur.
      2. Dele celler i 5 x 10 7 porsjoner; skyll dem tre ganger med iskald PBS ved sentrifugering ved 430xg i 5 min ved 4 ° C, og hell supernatantene etter hver vask. I siste vask, kast supernatant og holde pelleten. Merk: Når cellene er tverrbundet, kan de bli lagret ved -80 ° C, hvis ikke umiddelbart benyttes.
    2. Atomkjerner forberedelse
      1. Resuspender cellepelleten i hver 10 ml Lysis Buffer (Tabell 1). Inkuber i 10 min ved 4 ° C med rotasjon. Sentrifuger ved 430 xg i 5 min ved 4 ° C. Kast supernatantene; holde atom pellets.
      2. Resuspender hver nukleære pellets i 10 ml vaskebuffer (tabell 1). Inkuber ved romtemperatur i 10 min på en roterende hjul.
      3. Sentrifuger ved 430 xg i 5 min ved 4 ° C. Kast Supernatantene og samle pellets.
      4. Resuspender hver nukleære pellets i 3 ml ChIP inkuberingsbuffer (tabell 1). Hold på is.
    3. Kromatin sonikator og kvalitetskontroll
      1. Sonicate lm. romatin på 200 W (sykluser på 30 sek "på" og en min "off"), i et avkjølt Bioruptor, for å fragmentere kromatin Merk: antall sykluser og lydbehandling intervaller avhengig av celletype og på den gjennomsnittlige lengden på nucleosomal strekke ønsket. Vanligvis 30 min av sonikering er nødvendig for å generere DNA-fragmenter på 300 til 500 bp i lengde, tilsvarende di-og tri-nucleosomes. Valget av fragmenter størrelse avhenger av typen av kromatin domene som undersøkes.
      2. Ta 2% av total input, reversere tverrbindingen av inkubering ved 65 ° C i minst 1 time i ChIP inkuberingsbuffer. Pakk DNA ved PCR rensing kit, elueres i 50 mL TE buffer og laste DNA på agarosegel for å sjekke kromatin fragmentering.
    4. Inkubasjon av kromatin med antistoff
      1. Til 1/10 volum av 10% Triton X-100 for å sonikert kromatin. Sentrifuger ved 12000 x g i 10 min ved 4 ° C for å pelletere debris.
      2. Lagre 50 pl av kromatin-inngang fra tunge-celler for testing av graden av inkorporering SILAC aminosyrer i merkede celler, og for protein profilering.
      3. Tilsett antistoff av valget til den gjenværende tunge og lette merket sonikert kromatin og inkuber over natten ved 4 ° C på den roterende hjulet. I den lyse kanal, tilsett dertil en ekstra fold av det oppløselige peptid. Inkuber over natten ved 4 ° C på et roterende hjul Bemerkninger:. Den optimale betingelse mellom det mikrogram av antistoffet og det anvendte utgangsmateriale med celler blir valgt i hvert enkelt tilfelle, som omtalt i 2.5.3. Det optimale overskudd ganger molariteten av den oppløselige peptid knyttet til antistoffet må være omhyggelig titrert i hvert enkelt tilfelle.
    5. Isolering av kromatin ved hjelp av magnetiske kuler
      1. Stabilisere og blokkere protein G-coupled magnetiske kuler ved å følge trinnene som er beskrevet i 2.6 og bruke chip Inkubasjon Buffer.
      2. Legg 100 mL av blokkert beads til kromatin prøvene og inkuberes på et roterende hjul i 3 timer ved 4 ° C. Sentrifuger ved 340 xg i 1 min til å spinne ned prøven fra lokket av tipsene. Sett i et magnetisk stativ for å klumpe perlene. Supernatanten er strømmen gjennom (FT), som inneholder ubundne nucleosomes. Vasking av perler fire ganger i vaskebuffer (tabell 1) med økende saltkonsentrasjon (to vaskinger ved 150 mM og to med 300 mM NaCl).
      3. Inkuber-perler i 30 pl SDS-PAGE prøvebuffer Loading (tabell 1) og i 25 min ved 95 ° C til både eluere og de-fornette immunoutfelt proteiner. Separate proteiner på 4-12% Bis-Tris akrylamid SDS-PAGE pre-cast gels (Figur 3D).

    4. Prøvepreparering Før MS

    1. I-Gel fordøyelsen av histoner beriket fra N-Chip
      Merk: Under protein fordøyelse og peptid utvinning skritt å ta varefor å minimalisere keratin forurensninger som forstyrrer LC-MS/MS, som tidligere beskrevet 22, 23.
      1. Cut gel skiver tilsvarer kjerne histoner band (figur 1D). De-beis gel stykker med 50% acetonitril (ACN) i DDH 2 O, som alternerer med 100% ACN å krympe gel. Gjenta inntil gels brikkene er fullstendig de-farget og tørk dem i et vakuum sentrifuge.
      2. Legg D 6-eddiksyre 01:09 (v / v) i 1M ammoniumbikarbonat (NH 4 HCO 3) (vanligvis den sluttvolum er 60 til 100 ul) og 3 pl natriumacetat (CH3 COONa), som katalysator. Inkuber i 3 timer ved 37 ° C med kraftig risting. Merk: Prøven kan danne bobler i de første minuttene etter monteringen av reaksjonen: er viktig å håndtere med forsiktighet og slipper gassen som dannes, åpning fra tid til annen rørene under inkubering.
      3. Skyll gel stykker flere ganger wed NH 4 HCO 3, veksler med ACN med økende prosenttall (fra 50% til 100%), for å fullstendig eliminere rester av D-6-eddiksyre.
      4. Krymp gel stykker i 100% ACN; tørkes i en vakuum-sentrifuge for å sikre fullstendig de-hydratisering. Re-hydrat-gel stykker med iskald 100 ng / pl trypsin-løsning i 50 mM NH 4 HCO 3 og inkuberes over natten ved 37 ° C. Bemerk: Kombinasjonen av kjemisk modifisering av lysines ved hjelp av deuterert eddiksyreanhydrid og trypsin fordøyelse genererer et "Arg- C liker "i gel fordøyelsen mønster av histoner 21,24.
      5. Kast den overskytende oppløsning og legge til et volum av 50 mM NH 4 HCO 3 for å fullstendig dekke gel stykker; inkuberes over natten ved 37 ° C.
      6. Samle løselig fordøyd peptider i en ny Eppendorf tube. Lyofiliser peptider. Resuspender dem i 0,5% eddiksyre acid/0.1% trifluoreddiksyre (TFA). Avsalte og konsentrerepeptider på en reversfase C-18 / Carbon "sandwich"-og ionebytterkromatografi (SCX) på hånd-laget microcolumns (StageTip) 25.
      7. Forbered StageTip microcolumns ved å sette Teflon meshwork disker som inneholder immobilisert C 18 / Carbon ("sandwich") og SCX perler i en 200 mL tips. Skaff "sandwich" ved å laste C 18 microcolumn på toppen av en andre tips lastet med kullfilter. Merk: De veldig korte peptider, som ikke beholdes på C 18 filter, passere i gjennomstrømning som er lastet direkte på Carbon Tip, som vanligvis fanger dem. SCX StageTips kan berike spesifikke peptider, slik som H3 (3-8) peptid, ikke effektivt opprettholdt ved omvendt fase-kromatografi.
      8. Belastning 50% av peptider på C 18 / Carbon "sandwich StageTip" og 50% på SCX StageTips. Elueres dem fra C 18 / Carbon Tips bruker 80% ACN/0.5% eddiksyre acid og fra SCX Tips med 5% ammoniumhydroksyd (NH 4 OH) / 30% metanol. Etter frysetørking, resuspender peptider i 0,1% FA og analysere ved LC-MS/MS.
    2. I-gel Fordøyelse av immunopurified proteiner
      I-gel fordøyelsen av proteiner ble utført som tidligere beskrevet 22 med mindre modifikasjoner.
      1. Skjær hver kjørefelt i ti skiver (Figur 3D) og hver skive i små terninger på 1 mm 3. De-flekken gel stykker med 50 mM NH 4 HCO 3/50% ethanol og tilsett absolutt etanol til å krympe gelene. Gjenta til gels er helt de-farget.
      2. Til reduksjon buffer (tabell 1) i stykker gel i 1 time ved 56 ° C, etterfulgt av tilsetning av alkylerings-buffer (tabell 1) i 45 min ved romtemperatur, i mørke. Vask og tørk gel stykker i vakuumsentrifuge.
      3. Rehydrere gel stykker med iskald 12,5 ng / mL trypsin solution i 50 mM NH 4 HCO 3 og inkuber på is inntil fullstendig rehydratisering av gel-bitene. Fjern trypsin i overkant.
      4. Legg 50 mM NH 4 HCO 3 å fullstendig dekke gel stykker. Inkuber over natten ved 37 ° C.
      5. Samle den flytende delen. Tilsett utvinning buffer (tabell 1) i gel-stykker; inkuberes med kraftig omrøring i 10 min ved romtemperatur. Gjenta to ganger.
      6. Inkuber gel stykker i ACN for 10 min med sterk uro. Gjenta to ganger og basseng alle supernatants.
      7. Lyofiliser peptider. Susp tørket peptider i 0,5% eddiksyre acid/0.1% TFA.
      8. Avsalte og konsentrere peptider på en reversfase C-18 StageTip, som beskrevet 26, 27.
      9. Eluere peptidene fra C 18 StageTip under anvendelse av 80% ACN/0.5% eddiksyre. Fjern det organiske løsningsmidlet ved inndamping i et vakuum sentrifuge og resuspender peptidene i 0,1% FA (typisk 5 til 10 &Nr. 181, l), når den er klar til MS-analyse.

    5. LC-MS Analysis

    1. Væskekromatografi analyse
      1. Pakk den analytiske kolonnen i en 15 cm smeltet silisiumdioksyd emitter (75 mikrometer indre diameter, 350 mikrometer ytre diameter) under anvendelse av revers-fase (RP) C 18, 3 mikrometer harpiks i metanol, ved en konstant heliumtrykk (50 bar) ved hjelp av en bombe-loader enhet, som beskrevet tidligere 28.
      2. Par pakket emitter (C 18 RP kolonne) direkte til utløpet av 6-port ventil av HPLC gjennom en 20 cm lang (25 mikrometer indre diameter) av smeltet silisiumdioksyd uten å bruke pre-kolonne eller split-enhet.
      3. Laste de fordøyd peptider i C 18 RP-kolonnen ved en strømnings på 500 nl / min mobil fase A (0,1% FA / 5% ACN i DDH 2 O).
      4. Etter prøven lasting, skille peptider ved hjelp av følgende graderinger:
        1. Påfør 0-40% mobilfase B (0,1% FA/99% ACNi DDH 2 O) på 250 nl / min over 90 minutter etterfulgt av en gradient på 40-60% i 10 min, og 60-80% i løpet av 5 min, for eluering av peptider som stammer fra histoner (se 2).
        2. Påfør 0-36% mobil fase B på 250 nl / min over 120 minutter etterfulgt av en gradient på 36-60% i 10 min, og 60-80% i løpet av 5 min, for eluering av peptider som stammer fra immunopurified proteiner (se 3).
    2. Massespektrometri analyse ved hjelp LTQ-FT-ICR-Ultra massespektrometer
      1. Opererer i en dataavhengig oppkjøp (DDA) modus for å automatisk bytte mellom MS og MSMS oppkjøpet. MS Full Scan spektra er kjøpt, typisk i m / z varierer fra 200-1,650, er ervervet med oppløsning R = 100 000 400 m / z. De fem (Top5) mest intense ioner er isolert for fragmentering i den lineære ion felle ved hjelp av en kollisjon-indusert dissosiasjon (CID) på et mål verdi av 5000.
      2. Bruk parametre er oppført i tabell 2 for den "Tuning" oppkjøpet fil.
      3. Sette standarden kjøp innstillinger som er oppført i Tabell 2.

    6. Data Analysis

    1. Etikett gratis kvantifisering av histonmodifikasjonene co-beriket i kromatin domener
      1. Konverter de oppkjøpte råfiler til MGF filer ved hjelp Raw2msm programvaren (versjon 1.10) 29.
      2. Søk i histonmodifikasjonene bruker Mascot Deamon (versjon 2.2.2), sette parametrene er beskrevet i Tabell 3.
      3. På Mascot utgang peptid listen, fjerne peptider med score lavere enn 15 eller med mer enn fem antatte PTMs 29 Merk:. For hver enkelt peptid ID, velg peptid med høyest Mascot poengsum og filtrere ut alle de andre overflødige peptider med samme ID .
      4. Konstruer de utpakkede ion kromatogrammene (XIC) for hver forløper som tilsvarer hver modifiserte peptider, based på m / z-verdien, bruker QualBrowser. Beregne arealet under kurven (AUC) for hver topp (figur 2A).
      5. Validere hver identifiserte peptider som inneholder modifikasjoner ved visuell inspeksjon av MS / MS spektra bruker QualBrowser (figur 2B).
      6. Beregn den relative mengde for hvert modifisert peptid. Beregn den relative anrikning av hver modifikasjon i chip-ed materialet Obs. Relativ mengde er beregnet som forholdet mellom AUC for hver spesifikke modifiserte peptid over summen av AUC for alle de modifiserte og umodifiserte former av det samme peptid, og for relativ anrikning som et forhold mellom den relative mengde av den spesifikke modifikasjon i brikken over inngang (figur 2C).
    2. Kvantitativ proteomikk analyser av proteiner co-forbundet innen kromatin domener
      1. For proteiner identifisering og kvantifisering bruke MaxQuant pakke(Http://www. Maxquant.org /) 30. Konfigurere den innebygde søkemotor "Andromeda" ved hjelp av AndromedaConfig.exe 31 og sette søkeparameterne er oppført i Tabell 3.
    3. Innlemmelse test
      1. Anslå graden av inkorporering av tunge aminosyrer til proteiner i heavy-merket kromatin inngang, bruker MaxQuant programvare, som følger:
        1. Still inn parametrene som er beskrevet i 6.2, men invalid re-kvantifisere alternativet.
        2. Beregn innlemmelse prosent anvende følgende formel for å ikke-redundante peptid forholdstall:. Stiftelse (%) = ratio (H / L) / ratio (H / L) + 1 × 100 (Figur 3B) Merk: Godta bare hvis innlemmelse> 95 %.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Chromatin immunoutfelling er en kraftfull teknikk som brukes til å profilere lokalisering av et protein eller et histon modifikasjon langs genomet. I en proteomikk tilsvarende, er brikkefulgt av MS-baserte proteomikk å identifisere kvalitativt og kvantitativt de hPTMs, histone varianter og kromatin-bindende proteiner som er immunoprecepitert sammen med endring eller protein av interesse, som brukes som "agn". I den N-ChroP tilnærming, vist i figur 1A, native ChIP, hvori kromatin oppsluttes med MNase (figur 1 B), blir brukt som inngang for å rense fra bulk kromatin en distinkt funksjonelt domene. Resymé kromatin anriket på mono-nucleosomes inkuberes med et spesifikt antistoff og de immunopurified proteinene separeres ved SDS-PAGE. I eksempelet illustrert, H3K9me3, markør for stille kromatin 32,33, blir brukt til å sette opp tilnærming. Valget er basert på det faktum at både den funksjonelle rollevel som noen av dets protein-interactors er godt beskrevet. Videre har en svært spesifikk og effektiv antistoff optimalisert for brikken er tilgjengelig 34, som også bekreftet ved visuell inspeksjon av Coomassie gel, hvor den intakte nucleosome, med kjernen histoner ved den korrekte støkiometri, er beriket i passende mengder for MS (figur 1D ).

    Sammenligningen mellom mengden av H3K9me3 tilstede i gjennomstrømnings (FT) og inngang (IN) indikerer at omtrent 50% av det område av interesse er immunopurified, med unntak av risikoen for en skjevhet på grunn av anrikning av en mindre sub-populasjon av kromatin (figur 1C). MS blir benyttet for å karakterisere PTMs co-assosiert innenfor de anrikede nucleosomes: hver kjerne histon oppsluttes ved hjelp av en protokoll utviklet ad hoc for å oppnå en "Arg-C som" fordøyelse, i polyakrylamid-gel. Faktisk, på den ene side Arg-C er det beste protease for MS-analyse av hPTMs because den produserer peptider av optimal lengde; på den annen side, vil det ikke holde seg effektivt i gel. For å overvinne denne begrensningen, utnytter vår tilpasset protokollen kjemisk alkylering av lysin oppnås ved inkubering av histon gel bånd med deuterert (D 6)-eddiksyre-anhydrid, fulgt av trypsin fordøyelsen. Siden trypsin ikke spalter D 3-acetylerte lysines, de resulterende peptider blandingen etterligner en "Arg-C som" mønster (figur 1E).

    Tilsetningen av et D-3-acetyl-delen av en lysin frembringer en utvetydig delta massen av 45,0294 Daltons, diskriminere mellom innfødte og kjemisk tilsatt acetylations i MS. Videre tilbyr D 3-acetylering ytterligere to fordeler som letter dømmekraft av isobariske modifiserte peptider: først, oppstår alkylation bare på umodifiserte og mono-denaturert lysines, men ikke på di-og tri-denaturert rester; som slike modifiserte peptider som bærer samme total rekke modifikasjoner, men får forskjellige ordninger er ulikt dekorert av distinkt sett av D 3-acetyl grupper som produserer entydige m / z skift. For det andre, adskilte mønstre av D-3-alkylering forårsake litt forskjellige oppholdstider i flytende kromatografi på reversfase-kolonnen, noe som genererer et ekstra nivå for separasjon for isobariske modifiserte peptider 21.

    Etter validering av alle hPTMs ved manuell inspeksjon av tilsvarende MS / MS spektra (figur 2B), er etiketten gratis kvantifisering oppnådd i to trinn: først, vi beregne den relative overflod av hver endring ved hjelp av signalstyrken for de umodifiserte og modifiserte arter for det tilsvarende peptid, målt ved beregning av de ekstraherte ion kromatogrammer (XIc) (figur 2A og 2C, øvre panel); sekund, er den relative berikelse beregnet som et forhold mellom den relative mengde av hver modification i chip-ed octamer og den tilsvarende relative overflod fra inngang (figur 2C, nedre panel). Analysen av H3 (9-17)-peptid viser anrikning av di-og tri-metylerte K9, med tilsvarende reduksjon av de umodifiserte og mono-metylert former (figur 2C). Med dette resulterer som positiv kontroll for antistoff spesifisitet, kan co-forening eller uttømming av alle andre endringer skal vurderes, både på intra-molekylære nivå på samme H3 og på inter-molekylære nivå, på andre co-beriket histoner innenfor samme nukleosom. Dette tillater screening av hPTMs kryss samtaler innenfor H3K9me3 domener, det såkalte "heterochromatin modificome" (figur 2d) er vesentlig berikelse av kjente markører assosiert med genet stanse, med den tilsvarende uttømming av markører forbundet med genaktivering observert . I tillegg er nye assosiasjoner detekteres slik som anrikning av H3K18me1.

    Til skjermen for alle proteiner co-knytte innen heterochromatin, er den klassiske tverrbindings chip kombinert med SILAC (stabile isotoper Merking av Aminosyrer i cellekultur) (figur 3A). I SILAC eksperimentet, er lysin-og arginin (lys form) erstattet med deres isotopisk merkede analoger (tung form) hos den dyrkning medium. Ved celler dyrket og replikering i både lette og tunge media, er de to differensielt isotop-kodede aminosyrer metabolisk inkorporert i proteiner, generering av lette og tunge former av proteiner, henholdsvis, som er identifiserbar av MS, på grunn av en spesifikk Δmass. Før du starter en storstilt SILAC eksperiment, er merking effektivitet evalueres, beregning av inkorporering nivå, målt som prosent brøkdel av tunge peptider versus summen av tunge og lette seg, som finnes i bare tungt merket prøven. Innlemmelse overlegen til 95% for både tunge arginin og hanavy lysin er nødvendig for nøyaktig kvantifisering protein (fig. 3B). Etter tverrbinding av tunge og lette celler, er kromatin fragmenteres ved sonikering. SILAC blir brukt i forbindelse med en konkurranseanalyse ved anvendelse av et overskudd fold av løselig H3 peptid (QTAR K STGG) som bærer tri-metylering på K9 for å diskriminere spesifikke H3K9me3 interactors fra bakgrunnen. Den løselige peptid blir tilsatt i overskudd til en av de to SILAC chip eksperimenter, hvor den metter bindingskapasitet av antistoffet, og dermed "konkurrerende ut" mesteparten av de H3K9me3-nucleosomes og følgelig alle spesifikke interactors. I den andre SILAC kanal, er det konkurrerende peptid ikke lagt til chip og immunoprecipitation foregår normalt. SILAC-konkurrerende eksperimenter blir typisk utført i duplikat i såkalte "forover" og "bakover"-format, hvor konkurranse med overskudd løselig peptid skiftes fra the tung (H) til lys (L) kromatin prøver. Dette resulterer i invertert komplementære SILAC forhold avlesninger, som brukes for å skjelne ekte fra uspesifikke bindemidler: proteiner spesielt anriket er tilstede med en høyere intensitet i den tunge form i sammenligning med lys form (protein-forhold H / L> 1) i forsøket hvor overskytende peptid tilsettes til den lyse kanal (fremover) (figur 4A, øvre panel); en motsatt tendens (protein-forhold H / L <1) er observert i omvendt kopi (figur 4A, nedre panel). Proteiner som intensiteten i den tunge og lette formen er lik i både forover og bakover eksperimenter produsere en konstant forholdet nær en og er klassifisert som bakgrunn (Figur 4B).

    Valget av den optimale skytende fold for den oppløselige peptid er viktig og må være innstilt nøyaktig. Vanligvis setter vi riktig antistoff-til-peptid andel utfører en konkurranse analysen USIng serielle fortynninger av overskytende peptid og å sammenligne nivået av "agn" (Hptm / protein) mellom den positive kontroll chip, hvor peptidet er lagt til, og de forskjellige serielle konkurranse chips, ved Western Blot eller MS. Vanligvis reduserer den optimale overskudd fold peptid på omtrent 90% av mengden av Hptm / protein i immunoutfelt materiale. Faktisk, på den ene side, jo større protein-forhold oppnås, desto høyere diskriminerende kraft SILAC; på den annen side kan en overdreven metning av peptidet kaste ut fullstendig den spesifikke bindemidler fra antistoffet, noe som fører til manglende H / L-forhold for kvantifisering og statistisk analyse. For H3K9me3 antistoff vi har definert den korrekte andelen ved måling av H / L-forhold for QTARK (me3) STGG peptid, i en konkurranse-test utført i en forover-oppstilling, og vi fant denne verdien som et mål på konkurransen effektivitet (figur 3C ).

    Skjæringspunktet av Forwarden end Omvendt X-chip eksperimenter fører til identifisering av 635 proteiner, som er tilstede i begge forsøk, og kvantifisert med minst to forhold teller. Loggen to plott av sine H / L-forhold representerer den såkalte "heterochromatome" (figur 4C), hvor de reelle H3K9me3 interactors er entydig identifisert som proteiner tilstede i de øverste 40% av proteinene forholdet fordelinger (øvre høyre kvadrant punktplottet og Figur 4D).

    Figur 1
    Figur 1: Skjematisk oversikt over N-ChroP arbeidsflyt A) Scheme av innfødte chip kombinert med MS analyse.. Chromatin celler oppsluttes med MNase og fraksjonen anriket med mono nucleosomes (S1) utfelles ved hjelp av et anti-H3K9me3 antistoff. Immunopurified proteiner er atskilt med SDS-PAGE og kjerne histoner er i gel-fordøyd med en ad hoc-protokollen for å etterligne en Arg-C fordøyelsen. Peptider blir analysert ved nano-LC-MS/MS. Histone PTMs er identifisert, validert ved manuell inspeksjon av MS / MS spektra og kvantifisert B) Småskala MNase test:. DNA løst på en 1% agarosegel etter kromatin fordøyelse med MNase på ulike tidspunkt lapse (venstre panel); storskala MNase fordøyelse:. DNA løst på en 1% agarosegel etter 60 minutter av MNase kromatin fordøyelsen og etter separasjon av S1 fraksjon, som inneholder mono-nucleosomes fra S2 fraksjon, som inneholder poly-nucleosomes (høyre panel) C) Vurdering av berikelse / uttømming av umodifisert, mono-, di-, og tri-metylerte K9 i gjennomstrømnings (FT) i forhold til inngang (IN). Histogram representerer gjennomsnittlig ± SEM fra tre uavhengige eksperimenter for hver endring. D) SDS-PAGE av kromatin innspill og co-immuno rensede proteiner: kjerne histoner H3, H4, H2A og H2B er synlige rundt og under 17kDa band, med H3 og H2B co-migrering (svarte firkanter) E) Hver kjerne histone fra både immunoprecepitert nucleosomes og innspill er kjemisk alkylerte med deuterert (. D-6)-eddiksyre-anhydrid før trypsin-behandling, for å oppnå en "Arg-C som" in-gel fordøyelsen. Den D-6-eddiksyre reagerer med Epsilon aminogruppen av umodifisert-og mono-metylerte lysines men ikke med di-metylert, tri-metylert og acetylerte lysines. Som følge av dette blir den enzymatiske aktiviteten av trypsin blokkert på alle opprinnelig og kjemisk acetylert lysin, og dermed produsere en "Arg-C som" fordøyelse mønster. Dette tallet har blitt endret fra 21, ved hjelp av Figur 1, Figur S1 og Figur S5 som referanse. Klikk her for å se større bilde.

    "Fo: keep-together.within-page =" always "> Fig. 2
    Figur 2:. Massespektrometri-analyse av H3K9me3 "modificome" A) Zoomed massespektra og ekstrahert ion kromatogrammer (XIC) konstruert på tilsvarende m / z verdi på 2 + lade umodifisert, mono-, di-, og tri-metylert K9 i H3 (9-17) peptid, både for inn-og chip prøver. B) Representant MS / MS spektra bruker CID fragmentering. B-ion, og y-ion serie tillater å definere sekvensen av H3 (9-17)-peptid, og for å lokalisere spesifikt tri-metylering på K9 residuum. C) Relativ mengde av de forskjellige grader av metylering på K9 i H3 ( 9-17)-peptid, beregnet ved å dividere arealet under kurven (AUC) for hver modifiserte peptid ved summen av de områder som tilsvarer alle observerte unmodified og modifiserte former av at peptid, i input og chip-ed octamer. Histogram representerer gjennomsnittlig ± SEM fra tre uavhengige eksperimenter for hver endring (øvre panel). Relativ berikelse av K9 methylations i H3 (9-17) peptid. Berikelse uttrykkes som en log 2 forholdet mellom den relative overflod av hver metylering i chip-ed octamer som sammenlignet med innspill. Histogram representerer gjennomsnitt ± SEM fra tre uavhengige eksperimenter (nedre panel). D) heatmap oppsummerer berikelse av alle co-knytte hPTMs identifisert på histone H3, H4 og H2A. Hver rad svarer til en annen modifikasjon (nd blir ikke detektert modifikasjoner). Dette tallet har blitt endret fra 21, ved hjelp av Figur 1, Figur 2, Figur 3 og Figur S10 som referanse. Klikk her for å se større bilde.


    Figur 3: Skjematisk oversikt over X-ChroP arbeidsflyt A) Scheme av kryssbinding chip kombinert med MS analyse.. Celler dyrket i lette og tunge materialer er faste med formaldehyd og kromatin innganger er fragmentert ved sonikering for å generere DNA-fragmenter. I satt opp en Forward, er lydbehandlet heavy-merket kromatin immunoutfelt bruker anti-H3K9me3 antistoff mens light-merket kromatin inkuberes med samme antistoff mettet med et overskudd fold av løselig H3 peptid peiling K9me3. Immunoutfelte proteiner fra tunge og lette chromatins blir slått sammen, ekstrahert og separert ved SDS-PAGE. Proteiner blir spaltet med trypsin, og peptidene ble analysert ved nano-LC-MS/MS. B) Effektivitet av SILAC merking overvåkes beregning inkorporering av tunge lysine (Lys8) og arginin (Arg10) til proteiner. I tomten, er lik 0,974 (grønn linje) og 0,964 (rød linje), henholdsvis. C) Zoomet masse spektra ved den tilsvarende m / z verdi av 2 + lade tri-denaturert medianen av lysin og arginin peptider tetthet distribusjon K9 i H3 (9-17) peptid, både for lette og tunge former, i innspill og chip-ed octamer. Mens i inngangsintensitetene av tunge og lette peptid er nær 1, i forover SILAC ChIP, intensiteten av lyset peptid er mye lavere enn den for den tunge motstykke, noe som indikerer en effektiv konkurranse. D) SDS-PAGE av lyset (L) og tunge (H) merket kromatin inngang og av ko-immunoutfelt materiale: kjørefelt svarende til chip-ed materiale skjæres i ti skiver (sort linje), mens bare to skiver inngang blir analysert for inkorporering testanalysen ( blå linje). Dette tallet er blitt endret fra 21, ved hjelp av figur 4, og Figur S6 som rekonferansen. Klikk her for å se større bilde.

    Figur 4
    Figur 4: massespektrometri-analyse av H3K9me3 "interactome". A) Representant fulle spektra viser SILAC-pair tilsvarende peptider fra HP1 og makro-2A proteiner: forholdstall H / L> 1 i termin forsøket (øvre paneler), speiles av en forholdstall H / L <1 i Reverse replika (nedre paneler), viser den spesifikke berikelse av disse proteinene i heterochromatin B) Representant fulle spektra med SILAC-pair som tilsvarer peptid fra en bakgrunn protein:. H / L forholdstall i forover og revers gjentak er lik en C) kvantifiserte proteiner. er distributed i et spredningsplott basert på deres SILAC-prosenter i forover og bakover eksperimenter (x-og y-aksene); røde stiplede linjene representerer den øverste 40% og 30% av protein forholdstall, som indikert. D) Protein forholdstall utdelinger fra inngang (H / L blandet 1:01) (svart), Forward (blå) og revers (oransje) X-ChroP eksperimenter; røde stiplede linjene representerer den øverste 40% av protein forholdstall, satt som cutoffs å velge ekte interactors. Dette tallet har blitt endret fra 21, ved hjelp av Figur 5 som referanse. Klikk her for å se større bilde.

    Buffer for seksjon 2 Sammensetning
    Lysis Buffer 10% sukrose, 0,5 mM EGTA pH 8,0, 15 mM NaCl, 60 mM KCl, 15 mM HEPES, 0,5% Triton, 0,5 mM PMSF, 1 mM DTT, 5 mM NAF, 5 mM Na 3 VO 4, 5 mM NaButyrate, 5 mg / ml aprotinin, 5 mg / ml pepstatin A, 5 mg / ml Leupeptin
    Sukrose pute 2 g sukrose i 20 ml lysebuffer
    Fordøyelse Buffer 0,32 M sukrose, 50 mM Tris-HCl pH 7,6, 4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 0,1 mM PMSF
    TE-buffer 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA
    Dialyse Buffer 10 mM Tris-HCl pH 7,6, 1 mM EDTA, 0,5 mM PMSF, 5 mM NAF, 5 mM Na 3 VO 4, 5 mM NaButyrate, proteasehemmere cocktail
    ChIP Fortynning Buffer 100 mM Tris-HCl pH 7,6, 100 mM NaCl og 10 mM EDTA
    Blokkering Solution 0,5% BSA i PBS
    Vaske Buffer 50 mM Tris-HCl pH 7.6,10 mM EDTA
    Proteasehemmere EDTA-fri proteasehemmere cocktail, 0,5 mM PMSF, 5 mM NAF, 5 mM Na3VO4, 5mM NaButyrate
    Legge Buffer orange lasting fargestoff, 50% (v / v) glyserol i H20
    Buffer for seksjon 3 Sammensetning
    Lysis Buffer 50 mM HEPES-KOH pH 7,5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glyserol, 0,5% NP-40, 0,25% Triton-100, 0,5 mM PMSF, 5 mM NAF, 5 mM Na 3 VO 4, 5 mM NaButyrate, 5 mg / ml aprotinin, 5 mg / ml pepstatin A, 5 mg / ml Leupeptin
    Vaske Buffer 10 mM Tris-HCl pH 8, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 0,5 mM PMSF, 5 mM NAF, 5 mM Na 3 VO 4, 5 mM NaButyrate, 5 mg / ml aprotinin, 5 mg / ml pepstatin A , 5 mg / ml Leupeptin
    ChIP Inkubasjon Buffer 10 mM Tris-HCl pH 8, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 0,1% natrium-deoksycholat, 0,5% natrium-lauroylsarcoside, 0,5 mM PMSF, 5 mM NAF, 5 mM Na 3 VO 4, 5 mM NaButyrate, 5mg / ml aprotinin, 5 mg / ml pepstatin A, 5 mg / ml Leupeptin
    Vaske Buffer 2 20 mM Tris-HCl pH 7,6, 2 mM EDTA, 0,1% SDS, 1% Triton-100
    Laster Sample Buffer 250 mM Tri-HCl pH 8.8, 0.5 M B-merkaptoetanol, 2% SDS
    Buffer for seksjon 4 Sammensetning
    Alkylering Buffer 55 mm jodacetamid i 50 mM NH 4 HCO 3
    Reduksjon Buffer 10 mM ditiotreitol i 50 mM NH 4 HCO 3
    Utvinning Buffer 30% ACN og 3% TFA i DDH 2 0

    Tabell 1. Buffere Sammensetning.

    Tuning oppkjøpet fil Parametere
    FT fulle scan akkumulering målverdien 1 x 10 til 6; maksimal fylling tid 1000 msek
    IT MSn opphopning målverdien 10 x 10 4; maksimal fylling tid 150 ms
    Oppkjøp innstilling Parametere
    Electro spenning 2,4 kV
    Kappe og hjelpe gasstrømmen Nei
    Ion overføring kapillær temperatur 200 ° C
    Dynamisk eksklusjon opp til 500 forløper ioner for 60 sek på MSMS
    Utelukkelse masse bredde 10 ppm
    Normalisert kollisjon energi ved hjelp av bred-bånd aktivering modus 35%
    Ion valg terskler 100 tellinger
    Aktivering q 0,25
    Activasjon tid 30 msek

    Tabell 2. MS innstillinger.

    Mascor Deamon søk Parametere Merknader
    Database avhenger av organismen (dvs. for HeLa celler: menneskelig database, versjon 3.68, 87 061 oppføringer)
    Enzym Arg-C Arg-C henge fast ved C-terminalen av alle arginindeler
    Variable modifikasjoner acetyl (K), oksidasjon (M), D-3-acetylering (K), metyl-D-3 - acetyl (K), dimetyl (k), trimethyl (K) acetyl [42,010 Da], oksidasjon [15.995 Da], D3-acetylering [45,0294 Da], metyl-D3-acetyl [sum av 14,016 Da og 45,0294 Da], dimetyl [28,031], trimetyl [42,046 Da]
    Tapte splittelsene opp til 2
    Masse nøyaktigheten av foreldre ioner i søke 10 ppm
    Mass-nøyaktighet for CID MSMS 0,5 Da
    MaxQuant søk Parametere Merknader
    Database er avhengig av organismen
    Enzym trypsin / P Trypsin spalter ved den C-terminale til alle lysin og arginin rester. Søkingen utføres tar i betraktning det faktum at effektiviteten av trypsin å spalte lysin og arginin er redusert når den neste aminosyren er prolin (/ P).
    Fast modifikasjon carbamidomethylation
    Variable modifikasjoner N-acetyl (Protein), oksidasjon (M)
    Tapte splittelsene opp til tre
    Etikett parametere lys8 og arg10
    Maksimal etikett amminoacid 3 for Trypsin
    Mass-nøyaktigheten av foreldre ioner i den første "Andromeda" søk 20 ppm
    Masse nøyaktigheten av foreldre ioner i hoved "Andromeda" søk 6 ppm
    Mass-nøyaktighet for CID MSMS 0,5 Da (seks topp topper per100 Da)
    Peptid falske funnrate (FDR) 0,01
    Protein falske funnrate (FDR) 0,01 Innstilling av FDR for peptid og protein til 0,01 betyr at både peptider og proteiner som er identifisert er ventet å inneholde 1% av falske positiver. Denne verdien er beregnet ved hjelp av en target-decoy database
    Maksimal posterior ehror sannsynlighet (PEP) 1 PEP er sannsynligheten for at en person peptid er en falsk positiv kamp. PEP lik 1 i omgivelser innebærer at alle peptider vil kunne tas uavhengig av PEP slik filtrering er utelukkende basert på FDR.
    Minimum peptid lengde 6
    Minimum antall peptider 2
    Minimum antall unike peptider 1
    Bruke bare umodifiserte peptider og oksidasjon (M) / acetyl (Protein N-Term) aktivere alternativet Peptider med modifikasjoner vil vanligvis ikke bli regnet for protein kvantifisering siden deres mengde ikke kan gjenspeile forholdet av det tilsvarende protein.
    Minimum ratio teller 1
    "Match mellom runs" aktivere alternativet

    Tabell 3.. Dataanalyse.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Vi har nylig beskrevet ChroP, en kvantitativ strategi for storskala karakterisering av proteinkomponentene av kromatin. ChroP kombinerer to komplementære tilnærminger som brukes i epigenetisk feltet, Chip og MS, profittere fra sine styrker og overvinne sine respektive begrensninger. ChIP koblet til dyp sekvensering (chip-Seq) gjør at genom-wide kartlegging av histonmodifikasjonene ved oppløsning av få nucleosomes 35. Selv om fordelaktige for deres følsomhet, blir antistoff-baserte assays begrenset i deres evne til å skille mellom lignende modifikasjoner og i dissecting kombinatorisk aspekt av histon-koden 36.. På den annen side, mens MS gir en omfattende og objektiv analyse av hPTMs, enkeltvis og i kombinasjoner 9, det har så langt blitt brukt til analyse av bulk kromatin, med påfølgende mangel på informasjon om locus spesifikke PTMs patters. Vi benytter en modifisert versjon av chip for å isolere funksjoneltdistinkte kromatin domener og massespektrometri for å karakterisere histone PTM mønstre og de ikke-histonic proteiner spesielt co-beriket.

    Ved å bruke N-ChroP, analyse av hPTMs co-forbundet med H3K9me3 avslørte en betydelig anrikning av markører assosiert med stille kromatin og uttømming av modifikasjoner i forbindelse med virke kromatin. Avtalen av disse resultatene med tidligere studier 37 påviste robustheten i strategien. I X-ChroP av H3K9me3 domener, den SILAC-basert undersøkelse av kromatin-samspill proteiner bekreftet noen tidligere beskrevet interactors, dermed validere metoden.

    ChroP presenterer to hoved opprinnelige forhold i forhold til de strategier som allerede er tilgjengelig for å undersøke proteomikk komponenten av kromatin: for eksempel muligheten for å avdekke inter-molekylære synergisms mellom modifikasjoner dekorere adskilte kjerne histoner i samme intakte mono-Nucleosome renset ved N-Chip; andre sjansen til å vurdere den konkrete compartmentalization av histone varianter og linker histone subtyper. Siden etterforskningen av histone varianter er holdt tilbake av mangel på god kvalitet reagenser (dvs. antistoffer), ChroP fremstår som det unike verktøyet tilgjengelig for å vurdere deres plassering og funksjonell rolle.

    En begrensning av ChroP i sin nåværende satt opp løgner i peptid-sentriske ("Bottom-up") tilnærmingen som brukes i MS, med histoner fordøyd i korte peptider og den påfølgende verdifall i å oppdage på lang avstand tilkobling mellom modifikasjoner. Som sådan, konjugering av ChroP med "Bottom-up" MS-analyse tillater en delvis vurdering av kombinatorisk aspekt av histon-koden. Vi ser for oss at gjennomføringen av alternative MS strategier, for eksempel "Middle-og Top-Down" for hPTMs kartlegging på lengre peptider (> 20 aa) opp til på intakte proteiner 38-40, vil overvinnedenne tilbakeholdenhet.

    Overall, N-og X-ChroP er svært komplementære, med mulighet for å dissekere kompleksiteten i kromatinstruktur på funksjonelt forskjellige domener, med en oppløsning på mono-til oligo-nucleosomes. Vi forutsi at ChroP vil være nyttig også for å karakterisere sammensetningen av kromatin områder som er merket ved nærvær av bestemte ikke-histonic nukleære proteiner, f.eks transkripsjonsfaktorer (TFS). I tillegg kan ChroP anvendes i funksjonelle studier for å kartlegge den dynamiske sammensetningen av kromatin ved bestemte geometriske steder på ulike forstyrrelser, for eksempel under global transkripsjonelle aktivering. For disse grunner, ChroP fremstår som en ekstra nyttig verktøy i arsenalet av analytiske strategier tilgjengelig for å dissekere proteomikk landskapet i kromatin.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Ingen interessekonflikter erklært.

    Acknowledgments

    Denne forskningen ble opprinnelig publisert i Mol Cell Proteomikk. Soldi M. og Bonaldi T. proteomikk Gransking av Chromatin funksjonelle domener avslører Novel Synergisms blant Tydelig heterochromatin Komponenter MCP. 2013; 12: 64-80. © American Society for biokjemi og molekylær biologi. Vi takker Roberta Noberini (italiensk Institute of Technology og IEO, Italia) for kritisk lesing av manuskriptet. TB arbeid er støttet med tilskudd fra Giovanni Arme-Harvard Foundation Career Development Program, den italienske foreningen for kreftforskning og det italienske helsedepartementet. MS arbeidet ble støttet av en Firc fellesskap.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    DMEM  Lonza BE12-614F
    FBS Invitrogen 10270-106
    SILAC DMEM M-Medical FA30E15086
    Dialyzed FBS Invitrogen 26400-044
    Lysine 0 (12C6 14N2 L-lysine) Sigma Aldrich L8662
    Arginine 0 (12C6 14N4 L-arginine) Sigma Aldrich A6969
    Lysine 8 (13C6 15N2 L-lysine) Sigma Aldrich 68041
    Arginine 10 (13C6 15N4 L-arginine) Sigma Aldrich 608033
    Micrococcal Nuclease Roche 10 107 921 001
    Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets Roche 04 693 132 001
    Spectra/Por 3 dialysis tubing, 3.5K MWCO, 18mm flat width, 50 foot length Spectrumlabs 132720
    QIAquick PCR purification kit QIAGEN 28104
    Anti-Histone H3 tri-methylated K9-ChIP grade Abcam ab8898
    Histone H3 peptide tri-methyl K9  Abcam ab1773
    Dynabeads Protein G Invitrogen 100.04D
    NuPAGE Novex 4-12%                            Bis-Tris Gel  Invitrogen NP0335BOX
    Colloidal Blue Staining Kit Invitrogen LC6025
    LDS Sample Buffer Invitrogen NP0007
    Formaldheyde Sigma Aldrich F8775
    Aceti anhydride-d6 Sigma Aldrich 175641-1G
    Name Company Catalog Number Comments
    Formic Acid Sigma Aldrich 94318-50ML-F
    Iodoacetamide ≥99% (HPLC), crystalline Sigma Aldrich I6125
    DL-Dithiothreitol Sigma Aldrich 43815
    Sequencing Grade Modified Trypsin, Frozen 100 μg (5 × 20 μg) Promega V5113
    Nanospray OD 360μm x ID 75μm, tips ID 8 μm uncoated Pk 5 Microcolumn Srl FS360-75-8-N-5-C15
    ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 µm   15% C Dr. Maisch GmbH r13.aq.
    Carbon extraction disk, 47 mm Agilent Technologies 12145040
    Cation extraction disk Agilent Technologies 66889-U

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184, 868-871 (1974).
    2. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
    3. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
    4. Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Res. 21, 381-395 (2011).
    5. Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers. Nat Struct Mol Biol. 14, 1025-1040 (2007).
    6. Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293, 1074-1080 (2001).
    7. Spotswood, H. T., Turner, B. M. An increasingly complex code. J Clin Invest. 110, 577-582 (2002).
    8. Soldi, M., Cuomo, A., Bremang, M., Bonaldi, T. Mass spectrometry-based proteomics for the analysis of chromatin structure and dynamics. Int J Mol Sci. 14, 5402-5431 (2013).
    9. Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry. J Proteomics. 75, 3419-3433 (2012).
    10. Britton, L. M., Gonzales-Cope, M., Zee, B. M., Garcia, B. A. Breaking the histone code with quantitative mass spectrometry. Expert Rev Proteomics. 8, 631-643 (2011).
    11. Taverna, S. D., et al. Long-distance combinatorial linkage between methylation and acetylation on histone H3 N termini. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2086-2091 (2007).
    12. Garcia, B. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 11, 66-73 (2007).
    13. Villar-Garea, A., Imhof, A. The analysis of histone modifications. Biochim Biophys Acta. 1764, 1932-1939 (2006).
    14. Plazas-Mayorca, M. D., et al. One-pot shotgun quantitative mass spectrometry characterization of histones. J Proteome Res. 8, 5367-5374 (2009).
    15. Ohta, S., et al. The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics. Cell. 142, 810-821 (2010).
    16. Vermeulen, M., et al. Selective anchoring of TFIID to nucleosomes by trimethylation of histone H3 lysine 4. Cell. 131, 58-69 (2007).
    17. Vermeulen, M., et al. Quantitative interaction proteomics and genome-wide profiling of epigenetic histone marks and their readers. Cell. 142, 967-980 (2010).
    18. Bartke, T., et al. Nucleosome-interacting proteins regulated by DNA and histone methylation. Cell. 143, 470-484 (2010).
    19. Dejardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic Loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
    20. Lambert, J. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A novel proteomics approach for the discovery of chromatin-associated protein networks. Mol Cell Proteomics. 8, 870-882 (2009).
    21. Soldi, M., Bonaldi, T. The proteomic investigation of chromatin functional domains reveals novel synergisms among distinct heterochromatin components. Mol Cell Proteomics. 12, 764-780 (2013).
    22. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 1, 2856-2860 (2006).
    23. Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal Chem. 68, 850-858 (1996).
    24. Bonaldi, T., Regula, J. T., Imhof, A. The use of mass spectrometry for the analysis of histone modifications. Methods Enzymol. 377, 111-130 (2004).
    25. Cuomo, A., Moretti, S., Minucci, S., Bonaldi, T. SILAC-based proteomic analysis to dissect the "histone modification signature" of human breast cancer cells. Amino Acids. 41, 387-399 (2011).
    26. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nat Protoc. 2, 1896-1906 (2007).
    27. Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Anal Chem. 75, 663-670 (2003).
    28. Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Mol Cell Proteomics. 3, 608-614 (2004).
    29. Jung, H. R., Pasini, D., Helin, K., Jensen, O. N. Quantitative mass spectrometry of histones H3.2 and H3.3 in Suz12-deficient mouse embryonic stem cells reveals distinct, dynamic post-translational modifications at Lys-27 and Lys-36. Mol Cell Proteomics. 9, 838-850 (2010).
    30. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26, 1367-1372 (2008).
    31. Cox, J., et al. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. J Proteome Res. 10, 1794-1805 (2011).
    32. Lachner, M., O'Carroll, D., Rea, S., Mechtler, K., Jenuwein, T. Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins. Nature. 410, 116-120 (2001).
    33. Bannister, A. J., et al. Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain. Nature. 410, 120-124 (2001).
    34. Ram, O., et al. Combinatorial patterning of chromatin regulators uncovered by genome-wide location analysis in human cells. Cell. 147, 1628-1639 (2011).
    35. Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129, 823-837 (2007).
    36. Beck, H. C. Mass spectrometry in epigenetic research. Methods Mol Biol. 593, 263-282 (2010).
    37. Ernst, J., Kellis, M. Discovery and characterization of chromatin states for systematic annotation of the human genome. Nat Biotechnol. 28, 817-825 (2010).
    38. Tipton, J. D., et al. Analysis of intact protein isoforms by mass spectrometry. J Biol Chem. 286, 25451-25458 (2011).
    39. Young, N. L., et al. High throughput characterization of combinatorial histone codes. Mol Cell Proteomics. 8, 2266-2284 (2009).
    40. Boyne, M. T. 2nd, Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. Precise characterization of human histones in the H2A gene family by top down mass spectrometry. J Proteome Res. 5, 248-253 (2006).

    Tags

    Biokjemi kromatin histone posttranslasjonelle modifikasjoner (hPTMs) epigenetikk massespektrometri proteomikk SILAC kromatin immunoprecipitation histone varianter chromatome hPTMs kryss-forhandlingene
    Den ChroP Approach Kombinerer Chip og massespektrometri å dissekere Locus-spesifikke proteomikk Landscapes of Kromatin
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP… More

    Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin. J. Vis. Exp. (86), e51220, doi:10.3791/51220 (2014).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter