Summary
Ved at kombinere indfødte og tværbindende kromatin immunofældning med høj opløsning massespektrometri, ChroP tilgang gør det muligt at dissekere den sammensatte proteom arkitektur histon modifikationer, varianter og ikke-histonic proteiner synergizing på funktionelt distinkte kromatin domæner.
Abstract
Kromatin er en meget dynamisk nukleoprotein kompleks lavet af DNA og proteiner, der styrer forskellige DNA-afhængige processer. Kromatin struktur og funktion på bestemte områder er reguleret af den lokale berigelse af histon post-translationelle modifikationer (hPTMs) og varianter, kromatin-bindende proteiner, herunder transkriptionsfaktorer og DNA methylering. Den proteomisk karakterisering af kromatin komposition ved distinkte funktionelle regioner har været hidtil hæmmet af manglen på effektive protokoller til at berige sådanne domæner på et passende renhed og beløb for den efterfølgende dybtgående analyse af massespektrometri (MS). Vi beskriver her en nydesignet kromatin proteomics strategi, opkaldt ChroP (CHRO matin P roteomics), hvorved en præparativ kromatin immunoprecipitation bruges til at isolere forskellige kromatin regioner, hvis funktioner i form af hPTMs, varianter og co-associerede ikke-histonic proteiner, er analyseres ved MS. Vi illustrerer hanre oprettelsen af ChroP til berigelse og analyse af transkriptionelt tavse heterochromatic regioner præget af tilstedeværelsen af tri-methylering af lysin 9 på histon H3. De opnåede resultater viser potentialet af ChroP i grundigt kendetegner heterochromatin proteom og bevise det som en stærk analytisk strategi for at forstå hvordan de forskellige protein determinanter for kromatin interagere og synergieffekt at etablere locusspecifikke strukturelle og funktionelle konfigurationer.
Introduction
Kromatin er en meget dynamisk nukleoprotein kompleks, der er involveret som primær skabelon for alle DNA-medierede processer. Den nukleosom er den grundlæggende gentagne enhed af kromatin og består af en proteinholdig octamer kerne indeholdende to molekyler af hver kanoniske histon H2A, H2B, H3 og H4, omkring hvilken 147 bp DNA er pakket 1,2. Alle centrale histoner er struktureret som en kugleformet domæne og et fleksibelt N-terminal "hale", der stikker udenfor nukleosom. En af de vigtigste mekanismer til regulering chromatin struktur og dynamik er baseret på covalente post-translationelle modifikationer (PTMS), som hovedsagelig forekommer på N-terminalerne af histoner 3,4. Histon modifikationer kan fungere enten ved ændring af højere orden chromatin struktur, ved at ændre kontakten mellem histoner-DNA eller mellem nucleosomer og dermed kontrollere tilgængeligheden af DNA-bindende proteiner (cis mekanismer), eller ved at fungere som docking sites for regulatoriske proteiner, enten som enkelte enheder, eller indlejret i multimeric komplekser. Sådanne regulerende proteiner kan udøve deres funktion på forskellige måder: ved direkte at modulere genekspression (dvs. TAF-proteiner), eller ved at ændre nukleosom positionering (dvs. chromatin remodeling komplekser) eller ved at ændre andre histon rester (dvs. proteiner med methyl-transferase eller acetyl- transferase aktivitet) (trans mekanismer) 5.. Den observation, at særskilte PTM mønstre klynge på specifikke kromatin loci førte til udarbejdelsen af den hypotese, at forskellige modifikationer på separate steder kan synergize at generere en molekylær kode medierende den funktionelle tilstand af den underliggende DNA. Den "histon kode hypotese" har vundet bred enighed i de kommende år, men dens eksperimentel verifikation har været holdt tilbage af tekniske 6,7 begrænsninger.
Massespektrometri (MS)-baserede proteomics er opstået som enkraftfuldt værktøj til at kortlægge histon modifikation mønstre og til at karakterisere kromatin proteiner 8. MS detekterer en ændring som et specifikt Δmass mellem den eksperimentelle og den teoretiske masse af et peptid. På de enkelte histoner, MS leverer en upartisk og omfattende metode til at kortlægge PTMS, så påvisning af nye ændringer og afslørende samspil blandt dem 9-14.
I de seneste år er der blevet udviklet en række strategier til at dissekere proteomik sammensætning chromatin herunder karakterisering af intakte mitotiske kromosomer 15, identifikation af opløselige hPTM proteiner 16-18 og isolering og analyse af specifikke kromatin regioner (dvs. telomerer) 19,20. Men den undersøgelse af locusspecifikke synergier mellem histon PTMS, varianter og kromatin-associerede proteiner er stadig ufuldstændig. Her beskriver vi en ny tilgang, opkaldt ChroP (Kro matin P roteomics) 21, som vi har udviklet til effektivt at karakterisere funktionelt distinkte kromatin domæner. Denne fremgangsmåde tilpasser chromatin immunoprecipitation (ChIP), en veletableret protokol, der bruges i epigenetisk forskning, for en effektiv MS-baserede proteom analyse af den berigede prøve. Vi har udviklet to forskellige protokoller, afhængigt af typen af kromatin anvendt som input og behandles af MS spørgsmål; især: 1) chip optagne indfødte kromatin fordøjet med MNase er ansat til at rense mono-nukleosomer og at dissekere de co-associere hPTMs (N-ChroP); 2) chip af tværbundet chromatin fragmenteres ved lydbehandling anvendes i kombination med en SILAC baseret interactomics strategi til at karakterisere alle co-berigende chromatin proteiner (X-ChroP). Vi illustrerer her kombinationen af N-og X-ChroP for at berige og studere heterochromatin hjælp H3K9me3 som lokkemad for immunopræcipitationsringenes trin. Anvendelsen af ChroP kan udvidesat studere enten adskilte regioner på kromatin, eller ændringer i kromatin sammensætning inden for samme region under overgangen til en anden funktionel stat og dermed bane vejen for forskellige applikationer i epigenetik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Celledyrkning
- Standard medium for indfødte chip
- Grow HeLa-celler i Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% glutamin, 1% Pen / Strep og 10 mM HEPES pH 7,5.
- SILAC mærkning tværbinding chip
- Grow HeLa-celler i SILAC DMEM-medium, depleteret for lysin og arginin, suppleret med 10% dialyseret FBS, 1% glutamin, 1% Pen / Strep, 10 mM HEPES pH 7,5, og enten den lette L-lysin (Lys 0) og L- arginin (Arg 0) eller deres tunge modstykker, L-lysin (Lys 8) og L-arginin (Arg 10) (Materialer tabel) ved endelige koncentrationer på 73 mg / l og 42 mg / L hhv.
- Grow celler for op til otte generationer i SILAC medium for at sikre fuldstændig isotop-kodede aminosyrer inkorporering. Pass celler hver to dage, når de når en densitet på 1,0-1,5 x 10 6 celler / ml, såning dem på aconcentration af 3 x 10 5 celler / ml.
- Vurdere celler vækst og levedygtighed i SILAC medium individualisere enhver mulig ændring fra fysiologi, der måtte følge af dårligere sammensætning SILAC medium; at gøre dette:
- Efterse celler morfologi ved mikroskopet hver dag i løbet af mærkningen.
- Tæl celler og plot vækstkurver celler, der vokser i SILAC versus standard medium.
2.. Native Chromatin Immunoprecipitation (N-chip)
- Kerner præparat fra dyrkede celler
- Anvendes 1-2 x 10 8 umærkede HeLaS3 celler pr eksperiment. Harvest celler gøre portion på 50 x 10 6 celler i 50 ml rør og centrifugeres ved 340 xg i 10 min ved 4 ° C, vaske dem med iskoldt PBS.
- Resuspender hver cellepellet i 8 ml lyseringsbuffer (tabel 1) og inkuberes i 10 minutter ved 4 ° C på et roterende hjul. Hæld carefully hvert cellelysat på en saccharosepude (tabel 1) og centrifugeres i en udsvingsrotor ved 3.270 xg i 20 minutter ved 4 ° C for at adskille kernerne fra cytoplasma.
- Kassér supernatanter holde nukleare pellets og vaske dem to gange i iskoldt PBS ved centrifugering, kassere supernatanten ved hver vask.
- Micrococcal Nuclease (MNase) fordøjelse (lille målestok) og kvalitetskontrol af kromatin efter fordøjelse
- Resuspender vasket nukleare pellet i 1 ml Digestion Buffer (tabel 1); opdele i to portioner af 500 ul og holde på is.
- Mål den optiske densitet (OD) ved 260 nm af en portion, fortyndet 1:200 i 0,2% natriumdodecylsulfat (SDS) Bemærk:. OD = 1 svarer til cirka 50 ug / ml kromatin DNA. Typisk starter fra 2 x 10 8 celler, OD er i intervallet 40-60.
- Tag 1% kerner, tilsættes MNase enzym til en slutkoncentration på 0.005 U enzym / ul af cellekerner og inkuberes ved 37 ° C for forskellige tidsforløb (0, 10, 20, 40, 60 min).
- På hvert tidspunkt, indsamle 4 pi nedbrudte kerner og tilsæt 1 mM EDTA for at standse MNase reaktionen. Hold på is.
- Uddrag DNA-prøver ved PCR oprensningskit og eluere dem i 50 pi TE-buffer (Tabel 1).
- Tage 20 ul af hver DNA-prøve tilsættes 10 pi Loading Buffer (tabel 1) og indlæse prøver på 1% (w / v) agarosegel indeholdende ethidiumbromid, med PCR-markør som en størrelse kontrol.
- Kontroller fordøjelsen evaluering kromatin nukleosom stigen produceret af MNase inkubation.
- Vælg det optimale tidspunkt for fordøjelsen, er baseret på forekomsten af mono-nukleosomer i præparatet. . Typisk for 0,005 U enzym / ul kerner det optimale tidspunkt for MNase fordøjelse er 60 min (figur 1B, venstre panel) Bemærk: Den optimale MNase koncentration / tid af fordøjepå kan justeres afhængigt af den ønskede celletype og på størrelsen af nucleosomes stretch.
- Large-scale/preparative MNase fordøjelse og genvinding af opløselige kromatin fraktioner
- Tilføj til hver alikvot (se 2.2.1) 5 pi MNase, svarende til en slutkoncentration på 0,005 U enzym / ul cellekerner; bland forsigtigt og inkuberes ved 37 ° C i 60 minutter (eller generelt for den optimerede tidsinterval baseret på test i lille skala).
- Tilsæt 1 mM EDTA for at standse reaktionen og holde på is. Pelleter nedbrudte kerner ved centrifugering ved 7.800 x g ved 4 ° C i 10 min. Overfør supernatanterne (fraktion S1) i et nyt rør og opbevares ved 4 ° C. Bemærk: S1 indeholder den første opløselige fraktion af kromatin, omfatter mono-nucleosomes. Tilsæt proteaseinhibitorer (tabel 1).
- Opblandes forsigtigt pellets i 1 ml dialysebuffer (tabel 1) og dialyse natten over ved 4 ° C (cut off af dialyserøret er 3,5 kDa), i 3 L dialysebuffer, med konstant mild omrøring. Saml dialyseret materiale og centrifugeres ved 7.800 xg i 10 minutter ved 4 ° C. Overfør supernatanten (S2 fraktion) i en ny Eppendorf rør og opbevares ved 4 ° C. Bemærk: S2 omfatter di-EPTA-nukleosomer, afhængigt af MNase fordøjelse omfang.
- Kvalitetskontrol af kromatin før immunoprecipitation
- Tag en portion svarende til 5 ug S1 og S2 kromatin fraktioner (kvantificeret ved at måle OD ved 260 nm i et NanoDrop system). Uddrag DNA ved PCR oprensningskit, og der elueres i 50 pi TE-buffer (Tabel 1).
- Tage 20 pi S1 og S2 DNA blandes med 10 ul Loading Buffer (tabel 1) og indlæse dem på 1% (w / v) agarosegel. Kontroller kvaliteten og effektiviteten af MNase fordøjelsen ved visuel inspektion af nukleosomer stigen Bemærk:. Fraktion S1 er megetberiget med mono-nukleosomer, mens fraktion S2 indeholder primært poly-nukleosomer (figur 1B, højre panel).
- Inkubation af kromatin med antistof
- Opbevar ved -20 ° C 50 pi S1 fraktion for efterfølgende massespektrometri-analyse.
- Tilsæt 1 volumen Chip fortyndingsbuffer (tabel 1) til fraktion S1.
- Tilsæt antistof mod hPTM (eller protein) af interesse; inkuber natten over på et roterende hjul ved 4 ° C. Bemærk: Typisk anvender 10 ug til 20 ug af antistof til 2 x 10 8 celler. Det optimale forhold mellem mængden af antistof og start celler nummer skal omhyggeligt sat fra sag til sag, afhængigt af den overflod af hPTM / protein, der anvendes som madding i prøven og antistoffet effektivitet. Optimering er eksperimenterende, baseret på følgende prøver:
- Sammenlign mængden af hPTM / protein af interesse mellem input og gennemstrømning (FT,se 2.7.2) ved Western Blot eller MS at kontrollere, at immunoprecipitation beriger en betydelig andel af specifik kromatin region Bemærk:. Dette er normalt opnås, når mindst 50% af den hPTM / protein agn er opbrugt i FT (figur 1C) .
- Kontroller at immunopræcipiteret protein af interesse kan detekteres på SDS-PAGE-gel, som sikrer, at en tilstrækkelig mængde materiale til rådighed for MS-analyse Bemærk:. Tilstedeværelsen på gelen af de bånd, der svarer til de fire centrale histoner på den korrekte støkiometri angiver, at den intakte nukleosom blevet immunopræcipiteret ved N-ChroP (figur 1D). Mangel på korrekt støkiometri er faktisk tegn på en delvis afbrydelse / udfoldning af nucleosome.
- Parallelt hermed forberede protein G-koblede magnetiske perler (se 2.6).
- Ligevægtsindstilling og blokering af protein G-koblede magnetiske perler
- Ækvilibrer 100 pi protein G-koblede magnetiske perler opslæmningen i blokeringsopløsning (tabel 1), vasket tre gange og inkubere dem natten over ved 4 ° C på et roterende hjul Bemærk:. Efter bindingskapacitet perler bruge 100 pi gyllen 2-20 ug antistof.
- Vask de blokerede perler gang med Blokering Solution og derefter to gange med chip Dilution Buffer (tabel 1).
- Tilsæt 100 pi blokerede perler S1 kromatin prøven og inkuber dem på et roterende hjul ved 4 ° C i 3 timer. Centrifuger ved 340 x g i 1 minut for at dreje ned prøven fra låget på spidserne. Sagt på en magnetisk stativ til pelletering perlerne.
- Supernatanten overføres til et nyt Eppendorf-rør. Dette er gennemstrømningen (FT), nemlig fraktionen af kromatin, som ikke binder til antistoffet.
- Vask perlerne firegange i vaskepuffer (tabel 1) forøge saltkoncentrationen ved hver vask (75, 125 og 175 mM NaCl).
- At eluere immunopræcipiteret chromatin inkuberes perlerne i 30 pi LDS prøvebuffer, suppleret med 50 mM dithiothreitol (DTT) i 5 minutter ved 70 ° C. Adskil de eluerede proteiner på en 4-12% Bis-Tris acrylamid SDS-PAGE færdigstøbte gradientgel og plette gelen Kolloid Coomassie-farvning kit (figur 1D).
3.. Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-chip)
- Tværbinding af celler med formaldehyd
- Tilføj 0,75% formaldehyd til SILAC-mærkede celler, blandes kort og inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur. Quench formaldehyd ved tilsætning af 125 mM glycin og inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Opdel celler i 5 x 10 7 portioner; skyl dem tre gange med iskold PBS ved centrifugering ved 430xg i 5 minutter ved 4 ° C og kasseres supernatanter efter hver vask. Ved den sidste vask, kasseres supernatanten og holde pellet. Bemærk: Når celler er tværbundet, kan de opbevares ved -80 ° C, hvis det ikke straks anvendes.
- Kerner forberedelse
- Resuspender hver cellepellet i 10 ml lyseringsbuffer (tabel 1). Inkuber i 10 minutter ved 4 ° C med rotation. Centrifuger ved 430 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Kassér supernatanterne; holde nukleare pellets.
- Resuspender hver nukleare pellet i 10 ml vaskepuffer (tabel 1). Inkuber ved stuetemperatur i 10 minutter på et roterende hjul.
- Centrifuger ved 430 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Kassér supernatanterne og indsamle pellets.
- Resuspender hver nukleare pellets i 3 ml chip inkubationspuffer (tabel 1). Hold på is.
- Chromatin lydbehandling og kvalitetskontrol
- Soniker chBemærk romatin på 200 W (cykler af 30 sek "On" og 1 min "off") i en afkølet Bioruptor, at fragmentere kromatin:. antallet af cykler og lydbehandling intervaller afhænger af celletype og den gennemsnitlige varighed af nukleosomal strække ønsket. Typisk er det nødvendigt at generere DNA-fragmenter på 300-500 bp i længder 30 min lydbehandling, svarende til di-og tri-nucleosomes. Valget af fragmenter størrelse afhænger af typen af kromatin domæne under efterforskning.
- Tag 2% af det samlede input, vende tværbinding ved inkubering ved 65 ° C i minimum 1 time i chip Incubation Buffer. Uddrag af DNA ved PCR oprensning kit, elueres i 50 ul TE-buffer og indlæse DNA på agarosegel at kontrollere kromatin fragmentering.
- Inkubation af kromatin med antistof
- Tilsæt 1/10 volumen 10% Triton X-100 til sonikeret kromatin. Der centrifugeres ved 12.000 xg i 10 minutter ved 4 ° C for at pelletere deBris.
- Spar 50 pi kromatin input fra tunge celler til test af inkorporering niveau SILAC aminosyrer i mærkede celler og for protein profilering.
- Tilsæt valgte antistof til den resterende tunge og lette mærket sonikeret kromatin og inkuberes natten over ved 4 ° C på roterende hjul. I lyset kanal, også tilføje et overskud fold af opløselige peptid. Der inkuberes natten over ved 4 ° C på en roterende hjul Noter:. Den optimale tilstand mellem ug antistof og udgangsmaterialet af celler er valgt fra sag til sag, som omtalt i 2.5.3. Den optimale overskydende fold molaritet af det opløselige peptid i forhold til antistof skal titreres omhyggeligt i hvert enkelt tilfælde.
- Isolering af kromatin anvendelse af magnetiske perler
- Ligevægt og blokere protein G-koblede magnetiske perler ved at følge de trin, der er beskrevet i 2.6 og bruge chip inkubationspuffer.
- Tilsæt 100 ul blokeret beads til kromatin prøver og inkuberes på et roterende hjul i 3 timer ved 4 ° C. Centrifuger ved 340 x g i 1 minut for at dreje ned prøven fra låget på spidserne. Sagt på en magnetisk stativ til pelletering perlerne. Supernatanten er gennemstrømningen (FT), som indeholder ubundne nukleosomer. Vask perler fire gange i vaskebuffer (tabel 1) med stigende koncentration salt (to vaske ved 150 mM og to på 300 mM NaCl).
- Inkuber perler i 30 pi SDS-PAGE indlæses prøvebuffer (tabel 1) og i 25 minutter ved 95 ° C til både eluerer og de-tværbindinger de immunopræcipiterede proteiner. Separate proteiner på 4-12% Bis-Tris acrylamid SDS-PAGE færdigstøbte geler (figur 3D).
4.. Prøveforberedelse Forud for MS
- I-Gel fordøjelse af histoner beriget fra N-chip
Bemærk: Under fordøjelsen af protein og peptid ekstraktionstrin passeat minimere keratin forureninger, der interfererer med LC-MS/MS, som tidligere beskrevet 22, 23.- Cut gelskiver svarer til de centrale histoner bands (figur 1D). De-pletten gelstykkerne med 50% acetonitril (ACN) i ddH2O, skiftevis med 100% ACN at skrumpe gelen. Gentag indtil geler stykker er helt af-farves og tør dem i et vakuum centrifuge.
- Tilføj D6-eddikesyreanhydrid 01:09 (v / v) i 1 M ammoniumbicarbonat (NH4 HCO 3) (typisk slutvolumenet er 60-100 pi) og 3 pi natriumacetat (CH3 COONa), som katalysator. Inkuber i 3 timer ved 37 ° C med kraftig rystning Bemærk:. Prøven kan generere bobler i de allerførste minutter efter samlingen af reaktion: det er vigtigt at håndtere med forsigtighed og slip gas genereres, åbning fra tid til anden rørene under inkubation.
- Skyl gelstykkerne flere gange wed NH4 HCO3, veksler med ACN i stigende andel (fra 50% til 100%), med henblik på helt at eliminere rester af D-6-eddikesyreanhydrid.
- Shrink gelstykkerne i 100% ACN; tørre dem i en vakuum centrifuge for at sikre en fuldstændig de-hydrering. Re-hydrat gelstykker med iskold 100 ng / ul trypsinopløsning i 50 mM NH4 HCO3 og inkuberes natten over ved 37 ° C. Bemærk: En kombination af kemisk modifikation af lysiner ved hjælp deutereret eddikesyreanhydrid og trypsinfordøjelse genererer en "Arg- C lide "i gel fordøjelse mønster af histoner 21,24.
- Kassér den overskydende opløsning og tilføje en volumen på 50 mM NH4 HCO3 til helt at dække gelstykkerne; inkuberes natten over ved 37 ° C.
- Saml opløselige fordøjede peptider i et nyt Eppendorf-rør. Lyofilisere peptider. Resuspender dem i 0,5% eddikesyre acid/0.1% trifluoreddikesyre (TFA). Afsalte og koncentrerespeptider på en omvendt fase C 18 / Carbon "sandwich" og ionbytningskromatografi (SCX) på håndlavede mikrosøjler (StageTip) 25.
- Forbered StageTip mikrosøjler ved at sætte Teflon meshwork diskene, der indeholder immobiliseret C 18 / Carbon ("sandwich"), og SCX-perler i en 200 tips ul. Opnå "sandwich" ved at indlæse C 18 mikrosøjlen på toppen af en anden spids fyldt med Kulfilter Bemærk:. De meget korte peptider, der ikke er tilbageholdt på C18 filtret, passerer i gennemstrømning, der er indlæst direkte på Carbon spids, som typisk optager dem. SCX StageTips berige specifikke peptider, såsom H3 (3-8) peptid, ikke effektivt tilbageholdt af omvendt fase-kromatografi.
- Belastning 50% af peptider på C 18 / Carbon "sandwich StageTip", og 50% på SCX StageTips. Eluer dem fra C 18 / Carbon Tips bruger 80% ACN/0.5% eddikesyre acid og fra SCX tips med 5% ammoniumhydroxid (NH4OH) / 30% methanol. Efter lyofilisering resuspender peptider i 0,1% FA og analysere ved LC-MS/MS.
- I gel Spaltning af immunorenset proteiner
I gel fordøjelsen af proteiner udføres som tidligere beskrevet 22, med mindre modifikationer.- Skær hver bane i ti skiver (fig. 3D), og hver skive i små tern på 1 mm 3. De-pletten gelstykkerne med 50 mM NH4 HCO 3/50% ethanol, og der tilsættes absolut ethanol for at skrumpe geler. Gentag indtil geler er fuldstændig de-farves.
- Tilføj reduktion puffer (tabel 1) til gelstykkerne i 1 time ved 56 ° C efterfulgt af tilsætning af alkylering puffer (tabel 1) i 45 minutter ved stuetemperatur i mørke. Vask og tør gelstykkerne i vakuum centrifuge.
- Rehydrere gelstykkerne med iskold 12,5 ng / ul trypsin solution i 50 mM NH4 HCO3 og inkuberes på is indtil fuldstændig rehydrering af gelstykker. Fjern trypsin i overskud.
- Tilsæt 50 mM NH4 HCO3 til helt at dække gelstykkerne. Inkuberes natten over ved 37 ° C.
- Saml den flydende del. Tilsæt ekstraktionsbuffer (tabel 1) til gelstykkerne; inkuberes med stærk omrøring i 10 minutter ved stuetemperatur. Gentag to gange.
- Inkubér gelstykkerne i ACN i 10 min med kraftig omrøring. Gentag to gange og samle alle supernatanter.
- Lyofilisere peptiderne. Resuspender tørrede peptider i 0,5% eddikesyre acid/0.1% TFA.
- Afsaltning og koncentrere peptider på en omvendt fase C18 StageTip som beskrevet 26, 27.
- Eluere peptider fra C 18 StageTip anvendelse af 80% ACN/0.5% eddikesyre. Fjerner det organiske opløsningsmiddel ved inddampning i vakuum centrifuge og resuspenderes peptiderne i 0,1% FA (typisk 5-10 &# 181, l), når de er klar til MS-analyse.
5.. LC-MS Analyse
- Væskekromatografi-analyse
- Pak analytisk kolonne i en 15 cm kvartsglas emitter (75 um indvendig diameter 350 um ydre diameter) under anvendelse af omvendt fase (RP) C18, 3 um harpiks i methanol ved en konstant heliumtryk (50 bar) under anvendelse af en bombe-loader-enhed, som beskrevet tidligere 28.
- Par pakket emitter (C 18 RP søjle) direkte til udløbet af 6-vejsventil HPLC gennem en 20 cm lang (25 um indvendig diameter) kvartsglas uden brug forkolonne eller spaltede enhed.
- Læg de fordøjede peptider i C 18 RP kolonne ved flow på 500 nl / min mobil fase A (0,1% FA / 5% ACN i Hedeselskabet 2 O).
- Efter prøve lastning, adskille peptider ved hjælp af følgende stigninger:
- Påfør 0-40% mobil fase B (0,1% FA/99% ACNi ddH2O) ved 250 nl / min over 90 minutter efterfulgt af en gradient på 40-60% i 10 minutter og 60-80% i løbet af 5 min til eluering af peptider afledt af histoner (se 2).
- Påfør 0-36% mobil fase B på 250 nl / min over 120 minutter efterfulgt af en gradient af 36-60% i 10 minutter og 60-80% i løbet af 5 min til eluering af peptider afledt af immunorenset proteiner (se 3).
- Massespektrometri-analyse under anvendelse LTQ-FT-ICR-Ultra massespektrometer
- Operere i et data-afhængig erhvervelse (DDA) funktionen for automatisk at skifte mellem MS og MSMS erhvervelse. MS full scan-spektre er erhvervet, typisk i m / z spænder fra 200-1,650, er erhvervet med opløsning R = 100.000 ved 400 m / z. De fem (Top5) mest intense ioner er isoleret for fragmentering i den lineære ionfælde hjælp af en kollision-induceret dissociation (CID) ved en målværdi på 5.000.
- Brug de parametre, der er anført i tabel 2 for "Tuning" erhvervelse fil.
- Indstil standardindstillingerne erhvervelsesomkostninger som anført i tabel 2.
6.. Dataanalyse
- Mærk fri kvantificering af histon modifikationer co-berigede chromatin domæner
- Konverter de erhvervede raw-filer på MGF filer ved hjælp Raw2msm software (version 1.10) 29.
- Søg i histon modifikationer hjælp Mascot Deamon (version 2.2.2), hvori de parametre, der er beskrevet i tabel 3.
- På Mascot output peptid liste, fjerne peptider med score lavere end 15 eller med mere end 5 formodede PTMS 29 Bemærk:. For hvert enkelt peptid-id, skal du vælge peptidet med den højeste Mascot score og filtrere alle de andre overflødige peptider med samme ID .
- Konstruere de udtrukne ion kromatogrammer (XIC) for hver forløber svarende til hver modificerede peptider, based på m / z-værdi, ved hjælp af QualBrowser. Beregne arealet under kurven (AUC) for hver top (figur 2A).
- Validere hver identificeret peptider indeholdende modifikationer ved visuel inspektion af MS / MS spektre vha. QualBrowser (figur 2B).
- Beregn den relative overflod for hver modificeret peptid. Beregn den relative berigelse af hver ændring i chippen-ed materiale Note:. Relativ overflod er beregnet som et forhold mellem AUC for hver specifik modificeret peptid over summen af AUC for alle de modificerede og umodificerede former af det samme peptid, mens relativ berigelse i forhold til den relative forekomst af den specifikke modifikation i chippen over indgang (figur 2C).
- Kvantitativ proteom analyse af proteiner co-associeret inden chromatin domæner
- For proteiner identifikation og kvantificering bruger MaxQuant pakke(Http://www. Maxquant.org /) 30. Konfigurer den indbyggede søgemaskine "Andromeda" ved hjælp af AndromedaConfig.exe 31 og indstille søgeparametre anført i tabel 3.
- Inkorporering test
- Vurdere graden af optagelse af tunge aminosyrer i proteiner i kromatin input heavy-mærket, ved hjælp MaxQuant software, som følger:
- Indstil parametrene som beskrevet i 6.2, men invaliderende re-kvantificere mulighed.
- Beregn inkorporering procent anvender følgende formel til ikke-redundante peptid nøgletal:. Indbygning (%) = ratio (H / L) / ratio (H / L) + 1 × 100 (figur 3B) Bemærk: Accepter kun, hvis inkorporering> 95 %.
- Vurdere graden af optagelse af tunge aminosyrer i proteiner i kromatin input heavy-mærket, ved hjælp MaxQuant software, som følger:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kromatin immunofældning er en kraftfuld teknik bruges til at profilere lokaliseringen af et protein eller et histon modifikation langs genomet. I et proteomics ækvivalent, er chipsættet fulgt af MS-baserede proteomics at identificere kvalitativt og kvantitativt hPTMs, histon varianter og kromatin-bindende proteiner, som er immunpræcipiterede sammen med den modifikation eller protein af interesse, der anvendes som "lokkemad". I N-ChroP fremgangsmåde skitseret i figur 1A, native chip, hvor kromatin fordøjes med MNase (figur 1B), anvendes som input til at oprense fra bulk chromatin en særskilt funktionelt domæne. Fordøjet kromatin beriget med mono-nucleosomes inkuberes med et specifikt antistof, og immunooprenset proteiner adskilles ved SDS-PAGE. I det viste eksempel H3K9me3, markør for tavs kromatin 32,33, der bruges til at oprette den tilgang. Valget er baseret på det faktum, at både dets funktionelle rolle somsåvel som nogle af dets protein interaktionskandidater er godt beskrevet. Desuden er en meget specifik og effektiv antistof optimeret til chip er tilgængelig 34, som også bekræftet ved visuel inspektion af Coomassie gel, hvor den intakte nukleosom, med kerne histoner på den korrekte støkiometri er beriget i passende mængder for MS (figur 1D ).
Sammenligningen mellem mængden af H3K9me3 stede i gennemstrømning (FT) og input (IN) viser, at omkring 50% af området af interesse immunoprenset, bortset fra risikoen for en bias som følge af berigelse af en mindre sub-population af kromatin (figur 1C). MS er ansat til at karakterisere PTMS co-associeret inden for de berigede nukleosomer: hver kerne histon er fordøjet ved hjælp af en protokol designet ad hoc med henblik på at opnå en "Arg-C som" fordøjelse, i polyacrylamidgel. I virkeligheden, på den ene side Arg-C er den bedste protease for MS-analyse af hPTMs because producerer peptider med optimale længde; på den anden side, er det ikke spalter effektivt i gel. For at overvinde denne begrænsning, vores skræddersyet protokol udnytter kemisk alkylering af lysin opnået ved inkubering af histon gelbånd med deutereret (D6)-eddikesyreanhydrid, efterfulgt af trypsinfordøjelse. Da trypsin ikke kløve D 3-acetylerede lysiner, de resulterende peptidblandingen efterligner en "Arg-C lignende" mønster (Figur 1E).
Tilføjelsen af en D 3-acetyl-delen til en lysin producerer en entydig delta masse på 45,0294 Dalton, diskriminere mellem indfødte og kemisk tilføjede acetyleringer i MS. Desuden D 3-acetylering giver yderligere to fordele for at lette skelnen af isobar modificerede peptider: først sker alkyleringen kun umodificerede og mono-methylerede lysiner, men ikke di-og tri-methylerede rester; som sådanne modificerede peptider med samme total række ændringer, men i forskellige ordninger er forskelligt dekoreret af særskilte sæt af D 3-acetylgrupper der producerer entydige m / z skiftehold. For det andet, forskellige mønstre af D3-alkylering forårsage lidt forskellige retentionstider i flydende chromatografi på omvendt fase søjle, som genererer et ekstra niveau af separation til isobar modificerede peptider 21.
Efter validering af alle hPTMs ved manuel inspektion af den tilsvarende MS / MS spektre (figur 2B), er etiketten fri kvantificering opnået i to trin: først beregner vi den relative forekomst af hver ændring ved hjælp af signalet intensiteten af umodificeret og modificeret arter for den tilsvarende peptid, målt ved beregningen af de ekstraherede ion kromatogrammer (XIc) (figur 2A og 2C, øvre panel); sekund, den relative berigelse estimeret som et forhold mellem den relative forekomst af hver modification i chippen-ed octamer og den tilsvarende relative forekomst fra input (figur 2C, nederste panel). Analysen af H3 (9-17)-peptid viser berigelsen af di-og tri-methylerede K9, med den tilsvarende udtømning af de umodificerede og mono-methyleret former (figur 2C). Med dette resulterer som positiv kontrol for antistof specificitet, kan co-forening eller udtynding af alle andre ændringer skal vurderes, både på det intra-molekylære niveau på samme H3 og på det inter-molekylære niveau, andre co-berigede histoner inden samme nucleosome. Dette tillader screening af hPTMs cross-samtaler indenfor H3K9me3 domæner, den såkaldte "heterochromatin modificome" (Figur 2D): er betydelig berigelse af kendte markører associeret med gen-nedregulering, med den tilsvarende udtømning af markører forbundet med genaktivering observeret . Desuden er nye sammenslutninger detekteres såsom berigelse af H3K18me1.
At screene for alle proteiner co-associere inden heterochromatin, er den klassiske krydsbinding chip kombineret med SILAC (stabile isotoper Mærkning af Aminosyrer i cellekultur) (figur 3A). I SILAC eksperiment, er lysin og arginin (lys form) erstattet med deres isotopmærkede analoger (tung form) i dyrkningsmediet. Ved celler dyrket og replikation i både lette og tunge medier, er de to differentielt isotop-kodede aminosyrer metabolisk inkorporeres i proteiner, genererer lette og tunge former af proteiner, henholdsvis, der kan skelnes af MS, på grund af en specifik Δmass. Før du starter en storstilet SILAC eksperiment, er mærkningen effektivitet evalueres, beregne indarbejdelse niveau, målt som den procentvise andel af tunge peptider versus summen af tunge og lette dem, der findes i den eneste tunge mærkede prøve. Inkorporering overlegen til 95% for både tung arginin og hanAvy lysin er påkrævet for nøjagtig protein kvantificering (figur 3B). Efter tværbinding af tunge og lette celler er kromatin fragmenteres ved sonikering. SILAC anvendes i forbindelse med et kompetitivt assay under anvendelse af et overskud fold af opløseligt H3 peptid (QTAR K STGG), der bærer tri-methylering på K9 for at diskriminere specifikke H3K9me3 interaktionskandidater fra baggrunden. Det opløselige peptid tilsættes i overskud i forhold til en af de to SILAC chip forsøg, hvor det mætter bindeevne antistoffet således "konkurrerende out" størstedelen af H3K9me3-nucleosomes, og følgelig alle specifikke interaktionskandidater. I det andet SILAC kanal, er det konkurrerende peptid ikke tilføjet til chippen og immunoprecipitation foregår normalt. SILAC konkurrenceklausuler eksperimenter udføres typisk i to eksemplarer på såkaldt "Frem" og "Tilbage"-formater, hvor konkurrencen med det overskydende opløselige peptid er slået fra the tung (H) til de lette (L) kromatin prøver. Dette resulterer i omvendte komplementære SILAC forholdet udlæsninger, der anvendes til at skelne ægte fra uspecifikke bindemidler: proteiner specifikt beriget er til stede med en højere intensitet i den tunge form sammenligning med let form (protein-forholdet H / L> 1) i eksperimentet, hvor overskydende peptid tilsættes til lyskanal (fremad) (figur 4A, øvre panel); en modsat tendens (protein-forholdet H / L <1) er observeret i Reverse replika (figur 4A, nederste panel). Proteiner, hvis intensitet i tunge og lette form, er ens i både forlæns og baglæns eksperimenter producere et konstant forhold tæt på 1 og er klassificeret som baggrund (figur 4B).
Valget af det optimale overskud fold for den opløselige peptid er vigtig og skal være indstillet nøjagtigt. Typisk vi indstille den korrekte antistof-til-peptid andel udfører en konkurrence assay USIng seriefortyndinger af overskydende peptid og sammenligning af niveauet af "lokkemad" (hPTM / protein) mellem den positive kontrol chip, hvor peptidet ikke er tilsat, og de forskellige serielle konkurrence chips, ved Western blot eller MS. Generelt er den optimale overskydende fold peptid reducerer på omkring 90% af mængden af hPTM / protein i immunpræcipiteret materiale. I virkeligheden, på den ene side, jo større protein-forholdet opnås, jo højere diskriminere magt SILAC; på den anden side kan en overdreven mætning af peptidet smide helt specifikke bindere fra antistoffet, hvilket fører til manglende H / L ratio for kvantificering og statistisk analyse. For H3K9me3 antistof definerede vi de korrekte proportioner ved at måle H / L ratio for QTARK (me3) STGG peptid, i en udført i en Forward konkurrence prøveopstillingen og vi tog denne værdi som et mål for konkurrence effektivitet (figur 3C ).
Skæringspunktet mellem Forward etd Omvendt X-chip-eksperimenter fører til identifikation af 635 proteiner, der findes i begge forsøg og kvantificerede med mindst 2 forholdet tæller. Log 2 grund af deres H / L-forhold udgør den såkaldte "heterochromatome" (Figur 4C), hvor de ægte H3K9me3 interaktionskandidater entydigt identificeret som proteiner til stede i det øverste 40% af proteinerne forholdet distributioner (øverste højre kvadrant punktplottet og figur 4D).
Figur 1: Skematisk billede af N-ChroP arbejdsgang A) Ordning af nativ chip kombineret med MS-analyse.. Kromatin fra celler fordøjes med MNase og fraktionen beriget med mono-nukleosomer (S1) immunpræcipiteres hjælp af en anti-H3K9me3 antistof. Immunooprenset proteiner separeret ved SDS-PAGE og kerne histoner er i gel-fordøjet med en ad hoc-protokol til at efterligne en Arg-C fordøjelse. Peptider analyseres ved nano-LC-MS/MS. Histon PTMS er identificeret, valideres ved manuel inspektion af MS / MS spektre og kvantificeres B) Lille skala MNase test:. DNA løst på en 1% agarose gel efter kromatin fordøjelse med MNase på forskellig tid bortfalder (venstre panel); storstilet MNase fordøjelse:. DNA løst på en 1% agarose gel efter 60 minutters MNase kromatin fordøjelse og efter udskillelse af S1-fraktion, der indeholder mono-nukleosomer fra S2 fraktion, der indeholder poly-nukleosomer (højre panel) C) Vurdering af berigelse / udtømning af umodificeret, mono-, di-og tri-methylerede K9 i flow-through (FT) i forhold til indgangen (IN). Histogram repræsenterer den gennemsnitlige ± SEM fra tre uafhængige forsøg for hver ændring. D) SDS-PAGE af kromatin input og co-immuno oprensede proteiner: kerne histoner H3, H4, H2A og H2B er synlige omkring og under 17kDa band, med H3 og H2B co-vandreklit (sorte firkanter) E) Hver kerne histon fra både immunpræcipiterede nukleosomer og input er kemisk alkylerede hjælp deuteret (. D 6)-eddikesyre-anhydrid inden trypsinbehandling, for at opnå en "Arg-C som" i gel fordøjelse. D-6-eddikesyreanhydrid reagerer med Epsilon aminogruppen af umodificerede og mono-methylerede lysiner men ikke med di-methylerede, tri-methylerede og acetylerede lysiner. Som følge heraf er den enzymatiske aktivitet af trypsin blokeret på alle indfødte og kemisk acetyleret lysin, hvilket frembringer en "Arg-C som" fordøjelse mønster. Dette tal er blevet ændret fra 21, ved hjælp af figur 1, figur S1 og figur S5 som reference. Klik her for at se større billede.
Figur 2:. Massespektrometri analyse af H3K9me3 "modificome" A) Zoomede massespektre og ekstraheret ion kromatogrammer (XIc) fremstillet ved den tilsvarende m / z-værdi på 2 + opkræve umodificeret, mono-, di-og tri-methylerede K9 i H3 (9-17)-peptid, både for input og chip prøver. B) Repræsentant MS / MS spektre ved hjælp CID fragmentering. B-ion og y-ion serie gør det muligt at definere rækkefølgen af H3 (9-17)-peptid og at lokalisere specifikt tri-methylering på K9 rest. C) Relativ overflod af de forskellige grader af methylering på K9 i H3 ( 9-17)-peptid, der anslås ved at dividere arealet under kurven (AUC) for hver modificeret peptid med summen af arealerne for alle observerede unmodified og modificerede former af denne peptid, i input og chip-ed octamer. Histogrammet repræsenterer gennemsnittet ± SEM fra tre uafhængige forsøg for hver ændring (øverste panel). Relativ berigelse af K9 methyleringer i H3 (9-17)-peptid. Berigelsen er udtrykt som en log 2 forholdet mellem den relative forekomst af hver methylering i chippen-ed octamer som sammenlignes med input. Histogram repræsenterer gennemsnit ± SEM fra tre uafhængige forsøg (nederste del). D) Heatmap sammenfatter berigelse af alle co-associere hPTMs identificeret på histon H3, H4 og H2A. Hver række svarer til en anden modifikation (nd er ikke registreret ændringer). Dette tal er blevet ændret fra 21, ved hjælp af figur 1, figur 2, figur 3 og S10 som reference. Klik her for at se større billede.
Figur 3: Skematisk visning af X-ChroP workflow A) Ordning af tværbinding chip kombineret med MS-analyse.. Celler dyrket i lette og tunge medier er fastgjort med formaldehyd og kromatin indgange fragmenteres ved lydbehandling til at generere DNA-fragmenter. I en ligeud oprettet, er lydbehandlet heavy-mærket kromatin immunpræcipiteret under anvendelse af anti-H3K9me3 antistof mens lyset-mærkede kromatin inkuberes med det samme antistof mættet med et overskud fold af opløseligt H3 peptid bærer K9me3. Immunopræcipiterede proteiner fra tunge og lette chromatins pooles, ekstraheret og separeret ved SDS-PAGE. Proteiner spaltes med trypsin og peptider analyseres ved nano-LC-MS/MS. B) Effektivitet af SILAC mærkning overvåges beregning af optagelse af tunge lysine (Lys8) og arginin (Arg10) til proteiner. I plottet, medianen af distributionen lysin og arginin peptider massefylde er lig med 0,974 (grøn linie) og 0,964 (rød linje), hhv. C) Zoomet massespektrer på den tilsvarende m / z-værdi på 2 + opkræve tri-methylerede K9 i H3 (9-17)-peptid, både for lette og tunge former, i input og chip-ed octamer. Mens input intensiteterne af tunge og lette peptid er tæt på 1, i ligeud SILAC chip, lysintensiteten peptid er meget lavere end den i den tunge modstykke, angiver således en effektiv konkurrence. D) SDS-PAGE af lys (L) og tunge (H) mærket kromatin input og af co-immunpræcipiterede materiale: vognbane, der svarer til chip-ed materiale er skåret i ti skiver (sort linje), mens kun to skiver input analyseres for indbygning test analyse ( blå linje). Dette tal er blevet ændret fra 21, ved hjælp af figur 4 og figur S6 som reference. Klik her for at se større billede.
Figur 4: massespektrometri analyse af H3K9me3 "interactome". A) Repræsentant fuld spektre viser SILAC-pair, der svarer til peptider fra HP1 og makro-2A proteiner: udvekslingsforholdene H / L> 1 i den forreste eksperiment (øverste paneler), afspejles i et nøgletal H / L <1 i omvendt replika (nederste paneler), demonstrere den specifikke berigelse af disse proteiner i heterochromatin B) Repræsentant fuld spektre med SILAC-pair, der svarer til peptid fra en baggrund protein:. H / L-forhold i frem og bak gentagelser er lig med 1 C) Kvantificerede proteiner. er distributed i et scatter plot baseret på deres SILAC-nøgletal i frem og bak eksperimenter (x-og y-akser, henholdsvis); røde stiplede linjer repræsenterer top 40% og 30% af protein-forhold, som angivet. D) Protein nøgletal uddelinger fra indgang (H / L blandet 1:1) (sort), Frem (blå) og omvendt (orange) X-ChroP eksperimenter; røde stiplede linjer repræsenterer top 40% af protein-forhold, der er fastsat som cutoffs at vælge den ægte interaktionskandidater. Dette tal er blevet ændret fra 21 med Figur 5, som reference. Klik her for at se større billede.
| Buffer til § 2 | Sammensætning |
| Lysis Buffer | 10% saccharose, 0,5 mM EGTA, pH 8,0, 15 mM NaCl, 60 mM KCI, 15 mM HEPES, 0,5% Triton, 0,5 mM PMSF, 1 mM DTT, 5 mM NAF, 5 mM Na 3 VO 4, 5 mM NaButyrate, 5 mg / ml aprotinin, 5 mg / ml pepstatin A, 5 mg / ml leupeptin |
| Saccharosepude | 2 g saccharose i 20 ml lysisbuffer |
| Digestion Buffer | 0,32 M saccharose, 50 mM Tris-HCI pH 7,6, 4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 0,1 mM PMSF |
| TE Buffer | 10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 1 mM EDTA |
| Dialyse Buffer | 10 mM Tris-HCI pH 7,6, 1 mM EDTA, 0,5 mM PMSF, 5 mM NAF, 5 mM Na 3 VO 4, 5 mM NaButyrate proteasehæmmere cocktail |
| Chip fortyndingsbuffer | 100 mM Tris-HCI pH 7,6, 100 mM NaCI og 10 mM EDTA |
| Blokering Løsning | BSA 0,5% i PBS |
| Vaskebuffer | 50 mM Tris-HCI pH 7.6,10 mM EDTA |
| Proteasehæmmere | EDTA-fri proteasehæmmere cocktail, 0,5 mM PMSF, 5 mM NAF, 5 mM Na3VO4, 5 mM NaButyrate |
| Loading Buffer | appelsin påføringsfarvestof, 50% (v / v) glycerol i H20 |
| Buffer til afsnit 3 | Sammensætning |
| Lysis Buffer | 50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glycerol, 0,5% NP-40, 0,25% Triton-100, 0,5 mM PMSF, 5 mM NAF, 5 mM Na 3 VO 4, 5 mM NaButyrate, 5 mg / ml aprotinin, 5 mg / ml pepstatin A, 5 mg / ml leupeptin |
| Vaskebuffer | 10 mM Tris-HCI pH 8, 200 mM NaCI, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 0,5 mM PMSF, 5 mM NAF, 5 mM Na 3 VO 4, 5 mM NaButyrate, 5 mg / ml aprotinin, 5 mg / ml Pepstatin A , 5 mg / ml Leupeptin |
| Chip inkubationspuffer | 10 mM Tris-HCI pH 8, 100 mM NaCI, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 0,1% natriumdeoxycholat, 0,5% natrium lauroylsarcoside, 0,5 mM PMSF, 5 mM NAF, 5 mM Na 3 VO 4, 5 mM NaButyrate 5.mg / ml aprotinin, 5 mg / ml pepstatin A, 5 mg / ml leupeptin |
| Vaskebuffer 2 | 20 mM Tris-HCI pH 7,6, 2 mM EDTA, 0,1% SDS, 1% Triton-100 |
| Loading Sample Buffer | 250 mM Tri-HCl pH 8,8, 0,5 M b-mercaptoethanol, 2% SDS |
| Buffer til § 4 | Sammensætning |
| Alkylering Buffer | 55 mM iodacetamid i 50 mM NH4 HCO3 |
| Reduktion Buffer | 10 mM dithiothreitol i 50 mM NH4 HCO3 |
| Extraction Buffer | 30% ACN og 3% TFA i ddH 2 0 |
Tabel 1.. Buffere Komposition.
| Tuning erhvervelse fil | Parametre |
| FT fuld scan | ophobning målværdi 1 x 10 6; maksimal fyldning tid 1.000 msek |
| IT MSn | ophobning målværdi 10 x 10 4; maksimal fyldning tid 150 ms |
| Erhvervelse indstilling | Parametre |
| Elektrospray spænding | 2,4 kV |
| Kappe og hjælpeudstyr gasflow | Nej |
| Ionoverførsel kapillær temperatur | 200 ° C |
| Dynamisk udelukkelse | op til 500 prækursor-ioner til 60 sek på MSMS |
| Udelukkelse masse bredde | 10 ppm |
| Normaliseret kollision energi ved hjælp af wide-band aktivering tilstand | 35% |
| Udvælgelse tærskler Ion | 100 tæller |
| Aktivering q | 0.25 |
| Activation tid | 30 msek |
Tabel 2. MS indstillinger.
| Mascor Deamon søgning | Parametre | Noter |
| Database | afhænger af organismen (dvs. for HeLa-celler: menneskelig database version 3.68, 87.061 poster) | |
| Enzym | Arg-C | Arg-C spalter ved C-terminalen af alle argininrester |
| Variable modifikationer | acetyl (K), oxidation (M), D-3-acetylering (K), methyl-D 3 - acetyl (K), dimethyl-(k), trimethyl (K) | acetyl [42,010 Da], oxidation [15.995 Da], D3-acetylation [45,0294 Da] methyl-D3-acetyl [sum af 14,016 Da og 45,0294 Da], dimethyl [28,031], trimethyl [42,046 Da] |
| Mistede spaltninger | op til 2 | |
| Masse nøjagtighed moderioner i søgningen | 10 ppm | |
| Mass-nøjagtighed for CID MSMS | 0.5 Da | |
| MaxQuant søgning | Parametre | Noter |
| Database | afhænger af organismen | |
| Enzym | trypsin / P | Trypsin spalter ved den C-terminale ende af alle lysin-og argininrester. Søgningen udføres tager i betragtning, at effektiviteten af trypsin til at spalte lysin og arginin reduceres, når den næste aminosyre er prolin (/ P). |
| Fast modifikation | carbamidomethylation | |
| Variable modifikationer | N-acetyl (protein), oxidation (M) | |
| Mistede spaltninger | op til 3 | |
| Label parametre | lys8 og arg10 | |
| Maximum label amminoacid | 3 for trypsin | |
| Mass-nøjagtigheden af moderioner i den indledende "Andromeda" search | 20 ppm | |
| Masse nøjagtighed moderioner i hovedsagen "Andromeda" search | 6 ppm | |
| Mass-nøjagtighed for CID MSMS | 0.5 Da (seks top toppe per100 Da) | |
| Peptid falsk opdagelse satser (FDR) | 0.01 | |
| Protein falsk opdagelse satser (FDR) | 0.01 | Indstilling FDR for peptid og protein til 0,01 betyder, at både peptider og proteiner identificeret forventes at indeholde 1% af falske positiver. Denne værdi er anslået ved hjælp af en target-lokkedue database |
| Maksimal posterior isror sandsynlighed (PEP) | 1 | PEP er sandsynligheden for, at en enkelt peptid er en falsk positiv kamp. PEP svarende til 1 i din indstilling betyder, at alle peptider vil blive taget uafhængigt af PEP således filtreringen er udelukkende baseret på FDR. |
| Minimum peptidlængde | 6 | |
| Mindste antal peptider | 2 | |
| Mindste antal unikke peptider | 1 | |
| Brug kun umodificerede peptider og oxidation (M) / acetyl (Protein N-Term) | aktivere muligheden | Peptider med modifikationer bør generelt ikke regnes for protein kvantificering da deres overflod ikke kan afspejle forholdet mellem den tilsvarende protein. |
| Minimumsforhold tæller | 1 | |
| "Match mellem kørsler" | aktivere muligheden |
Tabel 3. Dataanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har for nylig beskrevet ChroP en kvantitativ strategi for stor skala karakterisering af proteinkomponenter kromatin. ChroP kombinerer to komplementære tilgange, der anvendes i den epigenetiske område, Chip og MS, profiterer af deres styrker og overvinde deres respektive begrænsninger. Chip koblet til dyb sekventering (chip-Seq) gør det muligt genom-dækkende kortlægning af histon modifikationer på løsningen af nogle nucleosomes 35. Selvom fordelagtig for deres følsomhed er antistof-baserede assays begrænset i deres evne til at skelne lignende modifikationer og dissekere kombinatorisk aspekt af histon kode 36. På den anden side, mens MS giver en omfattende og uvildig analyse af hPTMs, enkeltvis og i kombinationer 9, det har hidtil været anvendt til analysen af bulk kromatin, med deraf følgende mangel på information om locusspecifikke PTMS mønstre. Vi beskæftiger en modificeret version af chip til at isolere funktioneltdistinkte kromatin domæner og massespektrometri til at karakterisere histon PTM mønstre og ikke-histonic proteiner specifikt co-beriget.
Ved anvendelse af N-ChroP analysen af hPTMs co-forbundet med H3K9me3 afslørede en signifikant berigelse af markører forbundet med tavse chromatin og en udtynding af ændringer i forbindelse med aktiv kromatin. Aftalen af disse resultater med tidligere undersøgelser 37 beviste robusthed strategien. I X-ChroP af H3K9me3 domæner, det SILAC-baserede undersøgelse af kromatin-interagerende proteiner bekræftet nogle tidligere beskrevne interaktionskandidater derved validere metoden.
ChroP præsenterer to vigtigste originale aspekter i forhold til de strategier, der allerede er til rådighed til at undersøge proteom komponent i kromatin: for eksempel mulighed for at afsløre inter-molekylære synergier mellem ændringer dekorerer forskellige kerne histoner inden for samme intakt mono-nukleotidereosome renses ved N-chips; anden mulighed for at vurdere den konkrete opdeling af histon varianter og linker histon undertyper. Da undersøgelsen af histon varianter holdes tilbage af manglen på god kvalitet reagenser (dvs. antistoffer), fremstår ChroP som den unikke værktøj til rådighed til at vurdere deres placering og funktionelle rolle.
En begrænsning af ChroP i sin nuværende oprettet løgne i peptid-centreret ("Bottom-up") tilgang, der anvendes i MS, med histoner fordøjet i korte peptider og den deraf følgende svækkelse i detektering af langdistance-konnektivitet mellem ændringer. Som sådan konjugeringen af ChroP med "Bottom-up"-MS analyse tillader en delvis vurdering af kombinatorisk aspekt af histon kode. Vi forestiller os, at implementeringen af alternative MS strategier, såsom "Mellem-og top-down" for hPTMs kortlægning på længere peptider (> 20 aa) op til på intakte proteiner 38-40, vil overvindedenne tilbageholdenhed.
Samlet N-, og X-ChroP er yderst komplementære, med mulighed for at dissekere kompleksiteten af kromatin struktur på funktionelt adskilte domæner, med en opløsning af mono-til oligo-nucleosomes. Vi forudser, at ChroP vil være nyttigt også at karakterisere sammensætningen af kromatin områder markeret ved tilstedeværelsen af specifikke ikke-histonic kerneproteiner, for eksempel transkriptionsfaktorer (TFS). Desuden kan ChroP anvendes i funktionelle undersøgelser for at kortlægge den dynamiske sammensætning kromatin på specifikke loci på forskellige forstyrrelser, for eksempel i den globale transkriptionel aktivering. Af disse grunde fremgår ChroP som et yderligere nyttigt redskab i det arsenal af analytiske strategier til dissekere proteom landskab kromatin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Denne forskning blev oprindeligt udgivet i Mol Cell Proteomics. Soldi M. og Bonaldi T. proteomik Undersøgelse af Chromatin funktionelle domæner afslører Novel synergi blandt Distinct heterochromatin Komponenter MCP. 2013; 12: 64-80. © American Society for Biokemi og Molekylær Biologi. Vi takker Roberta Noberini (italiensk Institute of Technology og IEO, Italien) for kritisk læsning af manuskriptet. TB arbejde er støttet af tilskud fra Giovanni Armenise-Harvard Foundation Career Development Program, den italienske Association for Cancer Research og det italienske sundhedsministerium. MS arbejde blev støttet af en FIRC fællesskab.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Lonza | BE12-614F | |
| FBS | Invitrogen | 10270-106 | |
| SILAC DMEM | M-Medical | FA30E15086 | |
| Dialyzed FBS | Invitrogen | 26400-044 | |
| Lysine 0 (12C6 14N2 L-lysine) | Sigma Aldrich | L8662 | |
| Arginine 0 (12C6 14N4 L-arginine) | Sigma Aldrich | A6969 | |
| Lysine 8 (13C6 15N2 L-lysine) | Sigma Aldrich | 68041 | |
| Arginine 10 (13C6 15N4 L-arginine) | Sigma Aldrich | 608033 | |
| Micrococcal Nuclease | Roche | 10 107 921 001 | |
| Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 04 693 132 001 | |
| Spectra/Por 3 dialysis tubing, 3.5K MWCO, 18mm flat width, 50 foot length | Spectrumlabs | 132720 | |
| QIAquick PCR purification kit | QIAGEN | 28104 | |
| Anti-Histone H3 tri-methylated K9-ChIP grade | Abcam | ab8898 | |
| Histone H3 peptide tri-methyl K9 | Abcam | ab1773 | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 100.04D | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel | Invitrogen | NP0335BOX | |
| Colloidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | |
| LDS Sample Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| Formaldheyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Aceti anhydride-d6 | Sigma Aldrich | 175641-1G |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Formic Acid | Sigma Aldrich | 94318-50ML-F | |
| Iodoacetamide ≥99% (HPLC), crystalline | Sigma Aldrich | I6125 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 43815 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin, Frozen 100 μg (5 × 20 μg) | Promega | V5113 | |
| Nanospray OD 360μm x ID 75μm, tips ID 8 μm uncoated Pk 5 | Microcolumn Srl | FS360-75-8-N-5-C15 | |
| ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 µm 15% C | Dr. Maisch GmbH | r13.aq. | |
| Carbon extraction disk, 47 mm | Agilent Technologies | 12145040 | |
| Cation extraction disk | Agilent Technologies | 66889-U |
References
- Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184, 868-871 (1974).
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Res. 21, 381-395 (2011).
- Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers. Nat Struct Mol Biol. 14, 1025-1040 (2007).
- Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293, 1074-1080 (2001).
- Spotswood, H. T., Turner, B. M. An increasingly complex code. J Clin Invest. 110, 577-582 (2002).
- Soldi, M., Cuomo, A., Bremang, M., Bonaldi, T. Mass spectrometry-based proteomics for the analysis of chromatin structure and dynamics. Int J Mol Sci. 14, 5402-5431 (2013).
- Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry. J Proteomics. 75, 3419-3433 (2012).
- Britton, L. M., Gonzales-Cope, M., Zee, B. M., Garcia, B. A. Breaking the histone code with quantitative mass spectrometry. Expert Rev Proteomics. 8, 631-643 (2011).
- Taverna, S. D., et al. Long-distance combinatorial linkage between methylation and acetylation on histone H3 N termini. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2086-2091 (2007).
- Garcia, B. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 11, 66-73 (2007).
- Villar-Garea, A., Imhof, A. The analysis of histone modifications. Biochim Biophys Acta. 1764, 1932-1939 (2006).
- Plazas-Mayorca, M. D., et al. One-pot shotgun quantitative mass spectrometry characterization of histones. J Proteome Res. 8, 5367-5374 (2009).
- Ohta, S., et al. The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics. Cell. 142, 810-821 (2010).
- Vermeulen, M., et al. Selective anchoring of TFIID to nucleosomes by trimethylation of histone H3 lysine 4. Cell. 131, 58-69 (2007).
- Vermeulen, M., et al. Quantitative interaction proteomics and genome-wide profiling of epigenetic histone marks and their readers. Cell. 142, 967-980 (2010).
- Bartke, T., et al. Nucleosome-interacting proteins regulated by DNA and histone methylation. Cell. 143, 470-484 (2010).
- Dejardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic Loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
- Lambert, J. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A novel proteomics approach for the discovery of chromatin-associated protein networks. Mol Cell Proteomics. 8, 870-882 (2009).
- Soldi, M., Bonaldi, T. The proteomic investigation of chromatin functional domains reveals novel synergisms among distinct heterochromatin components. Mol Cell Proteomics. 12, 764-780 (2013).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 1, 2856-2860 (2006).
- Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal Chem. 68, 850-858 (1996).
- Bonaldi, T., Regula, J. T., Imhof, A. The use of mass spectrometry for the analysis of histone modifications. Methods Enzymol. 377, 111-130 (2004).
- Cuomo, A., Moretti, S., Minucci, S., Bonaldi, T. SILAC-based proteomic analysis to dissect the "histone modification signature" of human breast cancer cells. Amino Acids. 41, 387-399 (2011).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nat Protoc. 2, 1896-1906 (2007).
- Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Anal Chem. 75, 663-670 (2003).
- Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Mol Cell Proteomics. 3, 608-614 (2004).
- Jung, H. R., Pasini, D., Helin, K., Jensen, O. N. Quantitative mass spectrometry of histones H3.2 and H3.3 in Suz12-deficient mouse embryonic stem cells reveals distinct, dynamic post-translational modifications at Lys-27 and Lys-36. Mol Cell Proteomics. 9, 838-850 (2010).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26, 1367-1372 (2008).
- Cox, J., et al. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. J Proteome Res. 10, 1794-1805 (2011).
- Lachner, M., O'Carroll, D., Rea, S., Mechtler, K., Jenuwein, T. Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins. Nature. 410, 116-120 (2001).
- Bannister, A. J., et al. Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain. Nature. 410, 120-124 (2001).
- Ram, O., et al. Combinatorial patterning of chromatin regulators uncovered by genome-wide location analysis in human cells. Cell. 147, 1628-1639 (2011).
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129, 823-837 (2007).
- Beck, H. C. Mass spectrometry in epigenetic research. Methods Mol Biol. 593, 263-282 (2010).
- Ernst, J., Kellis, M. Discovery and characterization of chromatin states for systematic annotation of the human genome. Nat Biotechnol. 28, 817-825 (2010).
- Tipton, J. D., et al. Analysis of intact protein isoforms by mass spectrometry. J Biol Chem. 286, 25451-25458 (2011).
- Young, N. L., et al. High throughput characterization of combinatorial histone codes. Mol Cell Proteomics. 8, 2266-2284 (2009).
- Boyne, M. T. 2nd, Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. Precise characterization of human histones in the H2A gene family by top down mass spectrometry. J Proteome Res. 5, 248-253 (2006).
