Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

De ChroP aanpak combineert chip en massaspectrometrie te ontleden Locus-specifieke Proteomic Landschappen van Chromatin

Published: April 11, 2014 doi: 10.3791/51220
Automatic Translation
1, 1
1Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology

Summary

Door de combinatie van inheemse en verknopen van chromatine immunoprecipitatie met een hoge-resolutie massaspectrometrie, ChroP benadering stelt aan de samengestelde proteomics architectuur van histonmodificaties, varianten en niet-histonic eiwitten synergizing op functioneel verschillende chromatinedomeinen ontleden.

Abstract

Chromatine is een zeer dynamische nucleoproteïne complex van DNA en eiwitten die verschillende DNA-afhankelijke processen regelt. Chromatinestructuur en functie op specifieke gebieden wordt geregeld door de plaatselijke verrijking van histon post-translationele modificaties (hPTMs) en varianten, chromatine-bindende eiwitten, waaronder transcriptiefactoren en DNA methylatie. De proteomics karakterisering van chromatine samenstelling op verschillende functionele gebieden tot dusver is gehinderd door het ontbreken van efficiënte protocollen om dergelijke domeinen te verrijken op de juiste zuiverheid en voor de daaropvolgende diepgaande analyse door massaspectrometrie (MS). We beschrijven hier een nieuw ontworpen chromatine proteomics strategie, genaamd ChroP (Chro matin P roteomics), waarbij een preparatieve chromatine immunoprecipitatie wordt gebruikt om verschillende chromatine gebieden waarvan de kenmerken qua hPTMs, varianten en co-geassocieerde derde histonic eiwitten te isoleren, zijn door MS geanalyseerd. We illustreren hijre het opzetten van ChroP voor de verrijking en analyse van transcriptioneel stille heterochromatic regio, gekenmerkt door de aanwezigheid van tri-methylatie van lysine 9 op histon H3. De behaalde resultaten tonen het potentieel van ChroP in grondig karakteriseren van de heterochromatin proteoom en bewijzen dat het als een krachtige analytische strategie om te begrijpen hoe de verschillende eiwit determinanten van chromatine interactie en synergie te locus-specifieke structurele en functionele configuraties vast te stellen.

Introduction

Chromatine is een zeer dynamische nucleoproteïne complex dat betrokken als primaire template voor DNA-gemedieerde processen. Het nucleosoom is de basis herhaalde eenheid van chromatine en bestaat uit een eiwitachtig octamère kern met twee moleculen van elk canonieke histon H2A, H2B, H3 en H4, waaromheen 147 bp DNA verpakt 1,2. Alle kernhistonen zijn gestructureerd als een bolvormige domein en een flexibele N-terminale "staart" die buiten de nucleosome uitsteekt. Een van de belangrijkste mechanismen voor het reguleren chromatinestructuur en dynamica is gebaseerd op covalente post-translationele modificaties (PTMs), die voornamelijk voor de N-termini van histonen 3,4. Histon modificaties kunnen functioneren hetzij door wijziging van de hogere orde chromatinestructuur door verandering contacten tussen histon-DNA of tussen nucleosomen en daarmee de toegankelijkheid van DNA-bindende eiwitten (cis mechanismen) regelen, of door als Docking sites voor regulerende eiwitten, hetzij als afzonderlijke eenheden, of ingebed in multimere complexen. Dergelijke regulerende eiwitten hun functie in verschillende manieren: door direct moduleren van genexpressie (bijvoorbeeld TAF eiwitten), of door het veranderen van de nucleosoom positionering (dwz chromatine complexen) of door het modificeren van andere histon residuen (bijvoorbeeld eiwitten met methyl-transferase of acetyl- transferase activiteit) (trans mechanismen) 5. De observatie dat verschillende PTM patronen cluster op specifieke chromatine loci geleid tot de uitwerking van de hypothese dat verschillende wijzigingen op verschillende plaatsen kan synergize een moleculaire code bemiddelen van de functionele staat van de onderliggende DNA te genereren. De "histoncode hypothese" heeft opgedaan grote consensus in de jaren, maar haar experimentele verificatie is tegengehouden door technische 6,7 beperkingen.

Massaspectrometrie (MS)-gebaseerde proteomics heeft ontpopt als eenkrachtig hulpmiddel om histonmodificatie patronen in kaart en chromatine-bindende eiwitten 8 karakteriseren. MS detecteert een wijziging als een specifieke Δmass tussen de experimentele en theoretische massa van een peptide. Op het niveau van individuele histonen, MS biedt een onbevooroordeelde en uitgebreide methode in kaart PTMs, waardoor de detectie van nieuwe veranderingen en onthullende wisselwerkingen tussen hen 9-14.

De laatste jaren zijn een aantal strategieën ontwikkeld om het proteomische samenstelling van chromatine ontleden, zoals de karakterisatie van intacte mitotische chromosomen 15, de identificatie van oplosbare Hptm bindingseiwitten 16-18 en de isolatie en analyse van specifieke chromatine gebieden (dwz telomeren) 19,20. Uit het onderzoek van de locus-specifieke synergieën tussen histon PTMs, varianten, en chromatine-geassocieerde eiwitten is nog onvolledig. Hier beschrijven we een nieuwe aanpak, genaamd ChroP (Chro matin P roteomics) 21, die we hebben ontwikkeld voor het efficiënt karakteriseren functioneel verschillende chromatine domeinen. Deze aanpak past chromatine immunoprecipitatie (chip), een gevestigde protocol dat wordt gebruikt in epigenetisch onderzoek, voor de efficiënte MS-gebaseerde proteomics analyse van het verrijkte monster. We hebben twee verschillende protocollen ontwikkeld, afhankelijk van het type chromatine als input en door de lidstaten gemaakte vraag; in het bijzonder: 1) chip van de losgemaakte inheemse chromatine geknipt met MNase wordt gebruikt om mono-nucleosomen te zuiveren en de co-associëren hPTMs (N-ChroP) ontleden; 2) ChIP verknoopt chromatine gefragmenteerd door sonificatie wordt gebruikt in combinatie met een SILAC gebaseerde strategie interactomics alle co-verrijken chromatine bindende eiwitten (X-ChroP) te karakteriseren. We illustreren hier de combinatie van N-en X-ChroP voor het verrijken en het bestuderen heterochromatin, gebruik H3K9me3 als aas voor de immunoprecipitatie stappen. Het gebruik van ChroP kunnen worden uitgebreidofwel verschillende regio's op chromatine, of veranderingen in het chromatine samenstelling binnen dezelfde regio tijdens de overgang naar een andere functionele staat te bestuderen, waardoor de weg vrij voor verschillende toepassingen in de epigenetica.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Celkweek

  1. Standaard medium voor inheemse ChIP
    1. Groeien HeLa cellen in gemodificeerd Eagle's medium van Dulbecco (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 1% glutamine, 1% Pen / Strep en 10 mM HEPES pH 7,5.
  2. SILAC etikettering voor het verknopen van ChIP
    1. Groeien HeLa cellen in SILAC DMEM medium uitgeput van lysine en arginine, aangevuld met 10% gedialyseerd FBS, 1% glutamine, 1% Pen / Strep, 10 mM HEPES pH 7,5 en ofwel de lichte L-lysine (Lys 0) en L- arginine (Arg 0) of hun zware tegenhangers, L-lysine (Lys 8) en L-arginine (Arg 10) (Materialen tabel), bij eindconcentraties van 73 mg / L en 42 mg / L, respectievelijk.
    2. Groei cellen voor maximaal acht generaties SILAC medium tot volledige-isotoop gecodeerde aminozuren incorporatie waarborgen. Pass cellen om de twee dagen, bij het ​​bereiken van een dichtheid van 1,0-1,5 x 10 6 cellen / ml, ze zaaien bij aconcentration van 3 x 10 5 cellen / ml.
    3. Evalueer groei cellen en levensvatbaarheid in SILAC medium om eventuele wijziging van de fysiologie die kunnen voortvloeien uit de armere samenstelling van het SILAC medium individualiseren; om dit te doen:
      1. Inspecteer visueel cellen morfologie bij de microscoop elke dag tijdens de etikettering.
      2. Tellen cellen en groei plot rondingen van cellen groeien in SILAC versus standaard medium.

2. Inheemse Chromatine immunoprecipitatie (N-chip)

  1. Kernen voorbereiding van gekweekte cellen
    1. Gebruik 1-2 x 10 8 ongelabelde HeLaS3 cellen per experiment. Oogst cellen, maak monster van 50 x 10 6 cellen in 50 ml en centrifugeer bij 340 xg gedurende 10 min bij 4 ° C, wassen met ijskoude PBS.
    2. Resuspendeer elk celpellet in 8 ml Lysis Buffer (Tabel 1) en incubeer gedurende 10 minuten bij 4 ° C op een roterend wiel. Giet carefully elke cellulaire lysaat op een sucrosekussen (tabel 1) en centrifuge in een swing-out rotor, bij 3270 xg gedurende 20 min bij 4 ° C, om kernen te scheiden van cytoplasma.
    3. Gooi bovenstaande vloeistoffen, houden nucleaire pellets en was ze tweemaal in ijskoud PBS door centrifugeren, gooi supernatant bij elke wasbeurt.
  2. Micrococcal Nuclease (MNase) spijsvertering (kleinschalig) en kwaliteitscontrole van chromatine na vertering
    1. Resuspendeer de gewassen nucleaire pellet in 1 ml Digestion Buffer (tabel 1); verdelen in twee porties van 500 pl en blijf op ijs.
    2. Meet de optische dichtheid (OD) bij 260 nm van een monster, verdund 1:200 in 0,2% natriumdodecylsulfaat (SDS). Opmerking: OD = 1 komt overeen met ongeveer 50 ug / ml van chromatine DNA. Typisch vanaf 2 x 10 8 cellen, de OD in het bereik van 40-60.
    3. Neem 1% kernen, voeg MNase enzym tot een uiteindelijke concentratie van 0.005 U enzym / ul kernen en incubeer bij 37 ° C gedurende verschillende tijd verstrijkt (0, 10, 20, 40, 60 min).
    4. Op elk tijdstip, verzamel 4 pi geknipt kernen en voeg 1 mM EDTA aan het MNase reactie te stoppen. Blijf op ijs.
    5. Extraheer DNA-monsters door PCR zuivering kit en elueren ze in 50 pi TE-buffer (Tabel 1).
    6. Neem 20 pi van elk DNA-monster, voeg 10 pl laadbuffer (tabel 1) en plaats de monsters op 1% (w / v) agarosegel bevattende ethidiumbromide, met PCR teller als een maat controle.
    7. Controleer de spijsvertering evaluatie van het chromatine nucleosome ladder geproduceerd door MNase incubatie.
    8. Kies de optimale tijd voor de spijsvertering, gebaseerd op de prevalentie van mono-nucleosomen in het preparaat. . Typisch voor 0.005 U enzym / ul van kernen het optimale tijdstip van MNase spijsvertering is 60 min (Figuur 1B, linkerpaneel) Opmerking: De optimale MNase concentratie / tijd van digestiop kan worden aangepast aan de gewenste celtype en van de grootte van nucleosomen stretch.
  3. Large-scale/preparative MNase spijsvertering en herstel van oplosbare chromatine fracties
    1. In elk monster (zie 2.2.1) 5 pl MNase, overeenkomend met een uiteindelijke concentratie van 0,005 U enzym / ul kernen; Meng voorzichtig en incubeer bij 37 ° C gedurende 60 minuten (of in het algemeen voor de optimale tijdsinterval, gebaseerd op kleine schaal test).
    2. Voeg 1 mM EDTA om de reactie te stoppen en blijf op ijs. Pellet de gedigereerd kernen door centrifugeren bij 7800 xg bij 4 ° C gedurende 10 minuten. Breng de supernatanten (fractie S1) in een nieuwe buis en opgeslagen bij 4 ° C. Opmerking: S1 bevat de eerste oplosbare fractie van chromatine, omvattende mono-nucleosomen. Voeg de proteaseremmers (tabel 1).
    3. Zorgvuldig mengen pellets in 1 ml dialysebuffer (tabel 1) en dialyseer gedurende de nacht bij 4 ° C (cut off van de dialyse buis is 3,5 kDa), in 3 L dialysebuffer, met een constante milde roeren. Verzamel gedialyseerde materiaal en centrifugeer bij 7800 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Breng de bovenstaande (S2 fractie) in een nieuw Eppendorf buis en bewaren bij 4 ° C. Opmerking: S2 omvat di-EPTA-nucleosomen, afhankelijk MNase vertering mate.
  4. Kwaliteitscontrole van chromatine voordat immunoprecipitation
    1. Breng een hoeveelheid overeenkomend met 5 ug S1 en S2 chromatine fracties (gekwantificeerd door meting van de OD bij 260 nm in een NanoDrop systeem). Extraheer DNA door PCR zuivering kit en elueren in 50 pl TE-buffer (Tabel 1).
    2. Neem 20 pi S1 en S2 DNA mengen met 10 gl laadbuffer (tabel 1) en plaats ze op 1% (w / v) agarosegel. Controleer de kwaliteit en efficiëntie van MNase spijsvertering door visuele inspectie van de nucleosomen ladder. Opmerking: Fraction S1 is zeerverrijkt in mono-nucleosomen, terwijl fractie S2 bevat voornamelijk poly-nucleosomen (Figuur 1B, rechter paneel).
  5. Incubatie van chromatine met antilichaam
    1. Bewaar bij -20 ° C 50 pl S1 fractie voor verdere massaspectrometrie analyse.
    2. Voeg 1 volume ChIP Dilution Buffer (Tabel 1) om fractie S1.
    3. Voeg het antilichaam tegen het Hptm (of eiwit) van belang; incubeer overnacht op een draaiend wiel bij 4 ° C. Opmerking: Typisch gebruik 10 ug tot 20 ug antilichaam gedurende 2 x 10 8 cellen. De optimale verhouding tussen de hoeveelheid antilichaam en uitgangscellen nummer moet zorgvuldig worden per geval bepaald, afhankelijk van de hoeveelheden van de Hptm / proteïne als aas in het monster en het antilichaam efficiëntie. Optimalisatie experimentele basis van de volgende proeven:
      1. Vergelijk de hoeveelheid Hptm / eiwit van belang tussen input en doorstroom (FT,zie 2.7.2) door Western Blot of MS om te controleren of de immunoprecipitatie verrijkt een aanzienlijk deel van de specifieke chromatine regio. Opmerking: Dit wordt in het algemeen bereikt wanneer ten minste 50% van de Hptm / eiwit aas is uitgeput in de FT (figuur 1C) .
      2. Controleer of de immunologisch eiwit van belang detecteerbaar op SDS-PAGE-gel die ervoor zorgt dat voldoende materiaal beschikbaar is voor MS analyse. Opmerking: De aanwezigheid van de gel van de band van de vier kernhistonen op de juiste stoïchiometrie geeft aan dat het intacte nucleosoom is immunologisch door N-ChroP (figuur 1D). Gebrek aan de juiste stoichiometrie is in feite een indicatie van een gedeeltelijke verstoring / ontvouwen van de nucleosoom.
    4. Tegelijkertijd bereiden de eiwit-G gekoppelde magnetische korrels (zie 2.6).
  6. Equilibration en afscherming van eiwit-G gekoppelde magnetische korrels
  7. Equilibreer 100 pl proteïne G-gekoppelde magnetische korrels slurry in Blocking Solution (tabel 1), driemaal wassen en incuberen gedurende de nacht bij 4 ° C op een roterend wiel. Opmerking: Na de bindingscapaciteit van kralen, gebruiken 100 ul suspensie voor 2-20 ug antilichaam.
  8. Was de geblokkeerde parels eenmaal met blockingbuffer en vervolgens tweemaal met ChIP Dilution Buffer (Tabel 1).
  • Isolatie van chromatine via magnetische partikels
    1. Voeg 100 ul van geblokkeerde parels aan de S1 chromatine monster en incubeer ze op een draaiend wiel bij 4 ° C gedurende 3 uur. Centrifugeer bij 340 xg gedurende 1 min verminderde snelheid van de monster van het deksel van de uiteinden. In een magnetische rek om de kralen pellet.
    2. Breng de bovenstaande om een ​​nieuwe Eppendorf buis. Dit is de stroom door (FT), namelijk de fractie van chromatine die niet binden aan antilichaam.
    3. Was de kralen vierkeer in wasbuffer (tabel 1) verhoging van de zoutconcentratie bij elke wasbeurt (75, 125 en 175 mM NaCl).
    4. De immunologisch chromatine elueren, incubeer de kralen in 30 ui LDS monsterbuffer, aangevuld met 50 mM dithiothreitol (DTT) gedurende 5 min bij 70 ° C. Scheid de eiwitten geëlueerd op een 4-12% Bis-Tris acrylamide SDS-PAGE pre-cast gradiëntgel en vlekken op de gel met colloïdaal Coomassie kleuring kit (figuur 1D).

    • 3. Crosslinking Chromatine immunoprecipitatie (X-chip)

    1. Verknoping van cellen met formaldehyde
      1. Voeg 0,75% formaldehyde-SILAC gemerkte cellen, meng kort en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Doof het formaldehyde door toevoeging 125 mM glycine en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
      2. Verdeel cellen in 5 x 10 7 porties; spoel ze drie keer met ijskoude PBS door centrifugeren bij 430xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C en werp de supernatant na elke wasbeurt. Bij de laatste wasbeurt, gooi supernatant en houden de pellet. Opmerking: Als cellen verknoopt, kunnen ze opgeslagen bij -80 ° C, indien niet onmiddellijk wordt gebruikt.
    2. Kernen voorbereiding
      1. Resuspendeer elk celpellet in 10 ml Lysis Buffer (Tabel 1). Incubeer gedurende 10 minuten bij 4 ° C onder rotatie. Centrifugeer bij 430 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Gooi de bovenstaande vloeistoffen; houden nucleaire pellets.
      2. Resuspendeer elke nucleaire pellet in 10 ml wasbuffer (tabel 1). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min op een roterend wiel.
      3. Centrifugeer bij 430 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Gooi de bovenstaande vloeistoffen en het verzamelen van de pellets.
      4. Resuspendeer elke nucleaire pellets in 3 ml ChIP incubatiebuffer (tabel 1). Blijf op ijs.
    3. Chromatine sonicatie en kwaliteitscontrole
      1. Sonicaat ch. romatin bij 200 W (cycli van 30 sec "aan" en 1 min "off"), in een gekoelde Bioruptor, chromatine fragmenteren Opmerking: het aantal cycli en sonicatie intervallen afhankelijk van het celtype en de gemiddelde duur van nucleosomale stretch gewenst. Typically, 30 min. sonicatie noodzakelijk om DNA fragmenten van 300-500 bp in lengte te genereren, corresponderend met di-en tri-nucleosomen. De keuze van de fragmenten hangt af van de aard van chromatine domein onderzocht.
      2. Neem 2% van de totale invoer in omgekeerde verknoping door incubatie bij 65 ° C gedurende ten minste 1 uur bij ChIP incubatiebuffer. Pak het DNA door PCR zuivering kit, elueren in 50 ui TE-buffer en laad de DNA op agarosegel om chromatine fragmentatie controleren.
    4. Incubatie van chromatine met antilichaam
      1. Voeg 1/10 volume 10% Triton X-100 aan gesoniceerd chromatine. Centrifugeer bij 12.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C tot pellet debris.
      2. Spaar 50 ul van chromatine input van zware cellen voor het testen van de integratie niveau van SILAC aminozuren in gelabelde cellen en voor eiwit profilering.
      3. Voeg het antilichaam van keuze om de resterende zware en lichte gelabeld gesoniceerd chromatine en incubeer overnacht bij 4 ° C op de draaiende schijf. In het licht kanaal, voeg ook een overmaat vouw van de oplosbare peptide. Incubeer overnacht bij 4 ° C op een roterend wiel. Opmerkingen: De optimale conditie tussen ug antilichaam en het uitgangsmateriaal van cellen gekozen geval tot geval, zoals besproken in 2.5.3. De optimale voudige overmaat molariteit van de oplosbare peptide ten opzichte van het antilichaam moet zorgvuldig worden getitreerd per geval.
    5. Isolatie van chromatine via magnetische partikels
      1. Equilibreer en blokkeren eiwit-G gekoppelde magnetische korrels door de stappen in 2.6 beschreven en met behulp van chip Incubation Buffer.
      2. Voeg 100 ul van geblokkeerde bEADS chromatin monsters en incubeer op een roterend wiel gedurende 3 uur bij 4 ° C. Centrifugeer bij 340 xg gedurende 1 min verminderde snelheid van de monster van het deksel van de uiteinden. In een magnetische rek om de kralen pellet. Het supernatant is de stroom door (FT), die ongebonden nucleosomen. Was kralen viermaal wasbuffer (tabel 1) met toenemende zoutconcentratie (twee wasbeurten bij 150 mM en twee bij 300 mM NaCl).
      3. Incubeer kralen in 30 pl SDS-PAGE geladen Sample Buffer (Tabel 1) en gedurende 25 min bij 95 ° C geëlueerd en de-verknopen de immunologisch neergeslagen eiwitten. Afzonderlijke eiwitten op 4-12% Bis-Tris acrylamide SDS-PAGE pre-cast gels (figuur 3D).

    4. Monstervoorbereiding Voorafgaand aan MS

    1. In-gel digestie van histonen verrijkt N-chip
      Opmerking: Tijdens de vertering van eiwitten en peptiden extractiestappen verzorgenkeratine verontreinigingen die interfereren met LC-MS/MS, zoals eerder beschreven 22, 23 te minimaliseren.
      1. Cut gelstukjes overeenkomt met de kernhistonen banden (figuur 1D). De vlek-de gelstukken met 50% acetonitril (ACN) in DDH 2 O, afgewisseld met 100% ACN om de gel krimpt. Herhaal dit tot gels stukken zijn volledig de-gekleurd en droog ze in een vacuüm centrifuge.
      2. D 6-azijnzuur anhydride commentaar 1:09 (v / v) 1 M ammoniumbicarbonaat (NH 4 HCO 3) (typisch het eindvolume is 60-100 ul) en 3 pl natriumacetaat (CH3COONa) als katalysator. Incubeer 3 uur bij 37 ° C onder krachtig schudden. Opmerking: Het monster kan na montage van de reactie bellen in de eerste minuten genereren: het van belang te behandelen voorzichtig en laat het gegenereerde gas, die van tijd tot tijd de buizen tijdens incubatie.
      3. Spoel de gel stukken meerdere malen wet NH 4 HCO 3, afgewisseld met ACN bij stijgend percentage (van 50% tot 100%), teneinde resten van D-6 azijnzuuranhydride volledig te elimineren.
      4. Verklein de gel stukken in 100% ACN; drogen in een vacuüm centrifuge complete de-hydratatie te garanderen. Re-hydraat gelstukken met ijskoude 100 ng / ul trypsine-oplossing in 50 mM NH 4 HCO 3 en incubeer overnacht bij 37 ° C. Opmerking: De combinatie van chemische modificatie van lysines met gedeutereerde azijnzuuranhydride en trypsine digestie genereert een "Arg- C-achtige "in gel verteringpatroon van histonen 21,24.
      5. Gooi de overtollige oplossing en voeg een hoeveelheid van 50 mM NH 4 HCO 3 volledig te bedekken de gelstukken; incubeer overnacht bij 37 ° C.
      6. Verzamel oplosbaar verteerd peptiden in een nieuw Eppendorf buis. Lyofiliseren peptiden. Resuspendeer ze in 0,5% azijnzuur acid/0.1% trifluorazijnzuur (TFA). Ontzouten en concentrerenpeptiden op een omgekeerde fase C 18 / Carbon "sandwich" en ionenuitwisselingschromatografie (SCX) op handgemaakte microkolommen (StageTip) 25.
      7. Bereid de StageTip microkolommen door er Teflon meshwork schijven met geïmmobiliseerd C 18 / Koolstof ("sandwich") en SCX kralen in een 200 ul tips. Het verkrijgen van de "sandwich" door het laden van de C 18 microkolom bovenop een tweede tip geladen met koolstoffilter. Opmerking: De zeer korte peptiden, die niet op de C 18-filter worden vastgehouden, pas in de flow-through die direct op wordt geladen de Carbon Tip, die doorgaans vangt hen. SCX StageTips kan verrijken specifieke peptiden, zoals H3 (3-8) peptide, niet efficiënt bewaard door omgekeerde fase chromatografie.
      8. Belasting 50% van peptiden op de C 18 / Carbon "sandwich StageTip" en 50% op SCX StageTips. Elueren ze van de C 18 / Carbon Tips behulp van 80% ACN/0.5% azijnzuur acid en de SCX Punten met 5% ammoniumhydroxide (NH4OH) / 30% methanol. Na vriesdrogen, resuspendeer peptiden in 0,1% FA en te analyseren door LC-MS/MS.
    2. In-gel Spijsvertering van immuungezuiverd eiwitten
      In-gel vertering van eiwitten wordt uitgevoerd zoals eerder beschreven 22 uitgevoerd, met kleine aanpassingen.
      1. Snijd elke baan in tien plakjes (Figuur 3D) en elke plak in kleine blokjes van 1 mm 3. De vlek-de gelstukken met 50 mM NH 4 HCO 3/50% ethanol en voeg absolute ethanol aan de gels krimpen. Herhaal dit totdat de gels zijn volledig de-gekleurd.
      2. Voeg reductie buffer (tabel 1) om de gel stukken gedurende 1 uur bij 56 ° C, gevolgd door de toevoeging van alkylering buffer (tabel 1) gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Was en droog de gel stukken in vacuüm centrifuge.
      3. Rehydrateren de gel stukken met ijskoude 12,5 ng / ul trypsine solution in 50 mM NH 4 HCO 3 en incubeer op ijs tot volledige rehydratie van de gel stukken. Verwijder trypsine in overmaat.
      4. Voeg 50 mM NH 4 HCO 3 volledig te bedekken de gelstukken. Incubeer overnacht bij 37 ° C.
      5. Verzamel de vloeibare deel. Voeg de extractiebuffer (tabel 1) om de gel stukken; incuberen met sterke schudden gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Tweemaal herhalen.
      6. Incubeer de gelstukken in ACN gedurende 10 min onder krachtig roeren. Tweemaal herhalen en bundelen alle bovenstaande vloeistoffen.
      7. Lyofiliseren de peptiden. Resuspendeer gedroogd peptiden in 0,5% azijnzuur acid/0.1% TFA.
      8. Ontzouten en concentreren peptiden op een omgekeerde fase C 18 StageTip, zoals beschreven 26, 27.
      9. Elueer peptiden uit de C 18 StageTip met 80% ACN/0.5% azijnzuur. Verwijder het organische oplosmiddel door verdampen onder vacuüm centrifuge en resuspendeer de peptiden in 0,1% FA (typisch 5-10 &# 181; l), wanneer je klaar bent om de MS-analyse.

    5. LC-MS Analysis

    1. Vloeistofchromatografie-analyse
      1. Verpak de analytische kolom in een 15 cm fused silica emitter (75 urn inwendige diameter 350 urn buitendiameter) met omgekeerde fase (RP) C 18, 3 urn hars in methanol bij een constante helium druk (50 bar) met een bom-loader apparaat, zoals eerder 28 beschreven.
      2. Paar het gepakte emitter (C18 RP kolom) bij de uitlaat van de 6-wegklep van de HPLC door een 20-cm (25 micrometer binnendiameter) kwartsglas zonder pre-kolom of split apparaat.
      3. Laad het verteerde peptiden C 18 RP-kolom bij een stroomsnelheid van 500 nl / min mobiele fase A (0,1% FA / 5% ACN in DDH 2 O).
      4. Na monster laden, scheiden de peptiden met de volgende hellingen:
        1. Solliciteer 0-40% mobiele fase B (0,1% FA/99% ACNin DDH 2 O) en 250 nl / min in 90 minuten gevolgd door een gradiënt van 40-60% in 10 min en 60-80% in 5 min, voor elutie van peptiden afkomstig van histonen (zie 2).
        2. Breng 0-36% mobiele fase B bij 250 nl / min op 120 min gevolgd door een gradiënt van 36-60% in 10 min en 60-80% in 5 min, voor elutie van peptiden die uit immuungezuiverd eiwitten (zie 3).
    2. Massaspectrometrie analyse met behulp LTQ-FT-ICR-Ultra massaspectrometer
      1. Opereren in een data-afhankelijke acquisitie (DDA) functie automatisch overschakelen tussen MS en MSMS acquisitie. MS volledige scan spectra worden verworven, meestal in de m / z variëren van 200-1,650, wordt verworven met een resolutie R = 100.000 op 400 m / z. De vijf (Top5) meest intense ionen worden geïsoleerd voor fragmentatie in de lineaire ion trap met een botsingsgeïnduceerde dissociatie (CID) bij een streefwaarde van 5.000.
      2. Gebruik de in tabel 2 fo genoemde parametersr de 'Tuning' overname bestand.
      3. Stel de standaard verwerving instellingen vermeld in Tabel 2.

    6. Data Analysis

    1. Label gratis kwantificering van histonmodificaties co-verrijkt in chromatinedomeinen
      1. Zetten de verworven raw bestanden naar MGF bestanden met behulp Raw2msm software (versie 1.10) 29.
      2. Doorzoek het histonmodificaties behulp Mascot Deamon (versie 2.2.2), het instellen van de in tabel 3 beschreven parameters.
      3. Op de Mascot uitgang peptide lijst verwijderen peptiden met een score lager dan 15 of meer dan 5 vermeende PTMs 29. Opmerking: Voor elke afzonderlijke peptide ID, selecteer het peptide met de hoogste score Mascot en filteren alle andere overbodige peptiden met dezelfde ID .
      4. Teken de geëxtraheerde ion chromatogrammen (XIC) voor elke precursor correspondeert met elke gemodificeerde peptiden, based op de waarde m / z, met de QualBrowser. Bereken de oppervlakte onder de curve (AUC) voor elke piek (figuur 2A).
      5. Valideren elke geïdentificeerde peptiden die wijzigingen door visuele inspectie van de MS / MS-spectra met behulp van de QualBrowser (Figuur 2B).
      6. Bereken de relatieve abundantie voor elke gewijzigde peptide. Bereken de relatieve verrijking van elke wijziging in de ChIP-ed materiaal. Opmerking: relatieve overvloed wordt berekend als een verhouding tussen de AUC van elk specifiek gemodificeerd peptide via som van AUC van de gemodificeerde en ongemodificeerde vormen van hetzelfde peptide, terwijl relatieve verrijking als een verhouding van de relatieve overvloed van de specifieke wijziging in de chip boven de ingang (figuur 2C).
    2. Kwantitatieve proteomics analyse van eiwitten co-verband binnen chromatinedomeinen
      1. Voor eiwitten identificatie en kwantificatie gebruik de MaxQuant pakket(Http://www. Maxquant.org /) 30. Configureren van de ingebouwde zoekmachine "Andromeda" met de AndromedaConfig.exe 31 en stel de zoekparameters in tabel 3.
    3. Oprichting testen
      1. Schat de mate van integratie van zware aminozuren in eiwitten in zwaar-gemarkeerde chromatine-ingang, gebruik MaxQuant programmatuur, als hieronder:
        1. Stel de parameters zoals beschreven in 6.2, maar het uitschakelen van de re-kwantificeren optie.
        2. Bereken de opname vast voor de volgende formule om niet-redundante peptide ratio's:. Oprichting (%) = verhouding (H / L) / ratio (H / L) + 1 x 100 (Figuur 3B) Opmerking: Accepteer alleen als incorporatie> 95 %.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Chromatine immunoprecipitatie is een krachtige techniek om de lokalisatie van een eiwit of een histonmodificatie langs het genoom profiel. In een proteomics-equivalent, wordt ChIP gevolgd door MS-gebaseerde proteomics om kwalitatief en kwantitatief de hPTMs, histon varianten en chromatine-bindende eiwitten die aan elkaar zijn geïmmunoprecipiteerd met de wijziging of eiwit van belang, wordt gebruikt als "lokaas" te identificeren. In de N-ChroP benadering, beschreven in figuur 1A, inwoner ChIP, waarbij chromatine wordt geknipt met MNase (Figuur 1B), wordt gebruikt als invoer voor het zuiveren van bulk chromatine een duidelijke functionele domein. Gedigereerd chromatine verrijkt mono-nucleosomen wordt geïncubeerd met een specifiek antilichaam en immuungezuiverd eiwitten gescheiden door SDS-PAGE. In het geïllustreerde voorbeeld, H3K9me3, marker van stille chromatine 32,33, wordt gebruikt voor het opzetten van de aanpak. De keuze is gebaseerd op het feit dat zowel de functionele rolevenals enkele van haar eiwit interactoren zijn goed beschreven. Bovendien is een zeer specifieke en efficiënte antilichaam geoptimaliseerd voor ChIP beschikbaar 34, zoals bevestigd door visuele inspectie van de Coomassie-gel, waarbij de intacte nucleosomen, de kernhistonen op de juiste stoechiometrie wordt verrijkt in geschikte hoeveelheden MS (figuur 1D ).

    De vergelijking tussen de hoeveelheid H3K9me3 in de doorstroom (FT) en de ingang (IN) geeft aan dat ongeveer 50% van het gebied van belang is immuungezuiverd, zonder het risico van een voorspanning door de verrijking van een kleine subpopulatie van chromatine (figuur 1C). MS wordt gebruikt om de PTMs karakteriseren co-geassocieerde binnen de verrijkte nucleosomen: elke kern histon wordt gedigereerd met een protocol ontwikkeld ad hoc om een "Arg-C achtige" bereiken spijsvertering in polyacrylamidegel. In feite, enerzijds Arg-C is het beste protease voor MS analyse hPTMs because produceert peptiden optimale lengte; Anderzijds, is het niet efficiënt splitsen in gel. Om deze beperking te overwinnen, onze speciaal protocol maakt gebruik van de chemische alkylering van lysine bereikt door incubatie histon gelbanden met gedeutereerd (D 6)-azijnzuuranhydride, gevolgd door trypsine digestie. Aangezien trypsine niet aankleven D 3-geacetyleerd lysinen, de resulterende peptiden mengsel bootst een "Arg-C als" patroon (figuur 1E).

    De toevoeging van een D3-acetyl groep aan een lysine produceert een eenduidige delta massa 45,0294 dalton onderscheid tussen autochtone en chemisch toegevoegd acetyleringen in MS. Bovendien D 3-acetylering biedt twee extra voordelen die het onderscheiden van isobare gemodificeerde peptiden te vergemakkelijken: enerzijds de alkylering gebeurt alleen ongemodificeerd mono-gemethyleerd lysines, maar niet op di-en tri-gemethyleerd residuen; als zodanig gemodificeerde peptiden met dezelfde total aantal wijzigingen, maar in verschillende regelingen zijn verschillend ingericht door afzonderlijke reeks van D 3-acetyl groepen die eenduidige m / z verschuivingen produceren. Ten tweede, verschillende patronen van D3-alkylering veroorzaken enigszins verschillende retentietijden van vloeistofchromatografie op omgekeerde fase kolom die een extra niveau van scheiding van isobare gemodificeerde peptiden 21 genereren.

    Na validatie van hPTMs door handmatige inspectie van de overeenkomstige MS / MS spectra (figuur 2B), wordt het label vrije kwantificering bereikt in twee stappen: eerst, berekenen we de relatieve abundantie van elke wijziging met de signaalintensiteit van de ongemodificeerde en gemodificeerde soorten het overeenkomstige peptide, gemeten door de berekening van de geëxtraheerde ion chromatogrammen (XIC) (Figuur 2A en 2C, bovenste paneel); ten tweede wordt de relatieve verrijking geraamd verhouding tussen de relatieve abundantie van elke WIJZIGIn in de chip-ed octameer en de bijbehorende relatieve overvloed van input (figuur 2C, onderste paneel). De analyse van de H3 (9-17) peptide toont de verrijking van di-en tri-gemethyleerd K9, met de bijbehorende uitputting van de ongemodificeerde en mono-gemethyleerde vormen (figuur 2C). Met deze resultaten als positieve controle voor antilichaam specificiteit, kan het co-vereniging of uitputting van alle andere wijzigingen worden beoordeeld, zowel op intra-moleculair niveau op dezelfde H3 en bij de inter-moleculaire niveau, op andere co-verrijkt histonen binnen dezelfde nucleosome. Dit maakt de screening van hPTMs cross-gesprekken binnen de H3K9me3 domeinen, de zogenaamde "heterochromatine modificome" (Figuur 2D): is de aanzienlijke verrijking van bekende merkers geassocieerd met gen-silencing, met de bijbehorende uitputting van merkers gekoppeld gen activatie waargenomen . Daarnaast worden nieuwe associaties gedetecteerd zoals de verrijking van H3K18me1.

    Om te screenen op alle eiwitten co-associëren binnen heterochromatin, wordt de klassieke verknoping chip gecombineerd met SILAC (stabiele isotopen Etikettering van aminozuren in celcultuur) (figuur 3A). In de SILAC experiment, de lysine en arginine (lichte vorm) worden vervangen door hun isotoopgelabelde analogen (zware vorm) in het kweekmedium. Bij cellen gekweekt en replicatie in zowel lichte als zware media, worden de twee differentieel isotoop gecodeerde aminozuren metabolisch opgenomen in eiwitten genereren lichte en zware vormen van eiwitten, respectievelijk dat onderscheiden door MS, vanwege een specifiek Δmass. Voordat u begint een grootschalig SILAC experiment, wordt de etikettering efficiëntie geëvalueerd, het berekenen van de integratie, gemeten als het percentage fractie van zware peptiden ten opzichte van de som van zware en lichte degenen, gevonden in de enige zware gelabelde monster. Oprichting superieur is aan 95% voor zowel zware arginine en hijavy lysine is vereist voor nauwkeurige kwantificering eiwit (figuur 3B). Na verknoping van zware en lichte cellen, wordt chromatine gefragmenteerd door sonicatie. SILAC wordt gebruikt in combinatie met een competitiebepaling met een overmaat voudig oplosbaar H3 peptide (QTAR K STGG) dat tri-methylatie in K9 beren om specifieke H3K9me3 interactors onderscheiden van de achtergrond. Het oplosbare peptide wordt dan toegevoegd aan een van de twee SILAC ChIP experimenten, waarbij verzadigt de bindingscapaciteit van het antilichaam, waardoor "concurrerende out" de meeste H3K9me3-nucleosomen en dus alle specifieke interactoren. In de andere SILAC kanaal, wordt de concurrerende peptide niet toegevoegd aan de chip en de immunoprecipitatie plaatsvindt normaal. SILAC-competitie-experimenten worden meestal uitgevoerd in tweevoud in de zogenaamde "Forward" en "Reverse" formats, waar de concurrentie met de overmaat oplosbare peptide wordt omgeschakeld van the zware (H) aan het licht (L) chromatine monsters. Dit resulteert in omgekeerde complementaire SILAC verhouding uitlezingen voor veeleisende echte van onspecifieke bindmiddelen: eiwitten specifiek verrijkt aanwezig zijn met een hogere intensiteit in de zware vorm ten opzichte van de lichte vorm (eiwitverhouding H / L> 1) in de proef zijn waar teveel peptide wordt toegevoegd aan het licht kanaal (Forward) (Figuur 4A, bovenste paneel); een tegenovergestelde trend (eiwitverhouding H / L <1) wordt waargenomen in de Reverse replica (figuur 4A, onderste paneel). Eiwitten waarvan de intensiteit in de zware en lichte vorm zijn vergelijkbaar in zowel vooruit als achteruit experimenten een constante verhouding dicht bij 1 te produceren en zijn geclassificeerd als achtergrond (Figuur 4B).

    De keuze van de optimale overmaat vouw voor de oplosbare peptide is belangrijk en moet worden afgesteld. Typisch, zetten we de juiste antilichaam-to-peptide deel uitvoeren van een competitiebepaling using seriële verdunningen van overmaat peptide en vergelijking van het niveau van het "lokaas" (Hptm / eiwit) tussen de positieve controle chip, waarbij het peptide niet wordt toegevoegd, en de andere seriële competitie chips door Western Blot of MS. Algemeen de optimale voudige overmaat peptide vermindert ongeveer 90% van de hoeveelheid Hptm / eiwit in het immunologisch neergeslagen materiaal. In feite, enerzijds, hoe groter de eiwitverhouding verkregen, hoe hoger de onderscheidende kracht van SILAC; Anderzijds kan een te hoge intensiteit door het peptide volledig verdrijven specifieke binders van het antilichaam, hetgeen leidt tot ontbrekende H / L ratio kwantificering en statistische analyse. Voor H3K9me3 antilichaam de juiste verhouding gedefinieerd we door het meten van de H / L-ratio voor de QTARK (ME3) STGG peptide, in een wedstrijd proef in een overgedragen opgezet en we namen deze waarde als een maat voor de efficiëntie concurrentie (figuur 3C ).

    Het snijpunt van de Forward eend Reverse X-chip experimenten leidt tot de identificatie van 635 eiwitten, aanwezig in beide experimenten en gekwantificeerd met ten minste 2 verhouding telt. De log 2 grafiek van de H / L-verhoudingen geven de zogenaamde "heterochromatome" (Figuur 4C), waarbij de echte H3K9me3 interactors ondubbelzinnig worden geïdentificeerd als de onderhavige in de top 40% van de eiwitten verhouding verdelingen (rechtsboven kwadrant van proteïnen de scatterplot en Figuur 4D).

    Figuur 1
    Figuur 1: Schematische weergave van de N-ChroP workflow A) Regeling van inheemse chip in combinatie met MS-analyse.. Chromatine uit cellen wordt geknipt met MNase en de fractie verrijkt met mono-nucleosomen (S1) wordt aan immuunprecipitatie met een anti-H3K9me3 antilichaam. Immuungezuiverd eiwitten gescheiden door SDS-PAGE en kernhistonen in-gel gedigereerd met een ad hoc protocol een Arg-C digestie nabootsen. Peptiden worden geanalyseerd door nano-LC-MS/MS. Histon PTMs worden geïdentificeerd, gevalideerd door handmatige inspectie van MS / MS spectra en gekwantificeerd B) Kleinschalige MNase proef. DNA gescheiden op een 1% agarosegel na digestie met chromatine MNase op verschillende tijdspanne (linker paneel); grootschalige MNase spijsvertering:. DNA opgelost op een 1% agarosegel na 60 minuten MNase chromatine spijsvertering en na scheiding van S1 fractie, met mono-nucleosomen van S2 factie, die poly-nucleosomen (rechter paneel) C) Schatting van verrijking / uitputting van ongemodificeerd, mono-, di-en tri-gemethyleerd K9 in doorstroom (FT) vergeleken ingang (IN). Histogram vertegenwoordigt het gemiddelde ± SEM van drie onafhankelijke experimenten voor elke wijziging. D) SDS-PAGE van chromatine-en co-immuno gezuiverde eiwitten: kernhistonen H3, H4, H2A en H2B zijn zichtbaar rond en onder de 17kDa band, met H3 en H2B co-migreren (zwarte vierkantjes) E) Elke kern histon van zowel immunogeprecipiteerd nucleosomen en input zijn chemisch gealkyleerd met behulp van gedeutereerde (. D 6)-azijnzuur-anhydride voor trypsine behandeling, teneinde een "Arg-C achtige" verkrijgen gel digestie. De D-6 azijnzuuranhydride reageert met de Epsilon aminogroep van ongemodificeerde en mono gemethyleerd lysines maar niet met gemethyleerd di, tri-gemethyleerde en geacetyleerde lysines. Als gevolg, wordt de enzymatische activiteit van trypsine geblokkeerd alle inheemse en chemische geacetyleerde lysine, waardoor een "Arg-C achtige" verteringpatroon. Dit cijfer is gewijzigd van 21, met behulp van Figuur 1, Figuur S1 en Figuur S5 als referentie. Klik hier voor grotere afbeelding.

    "Fo: keep-together.within-page =" altijd "> Figuur 2
    Figuur 2:. Massaspectrometrie analyse van de H3K9me3 "modificome" A) ingezoomd massaspectra en geëxtraheerd ion chromatogrammen (XIC) gebouwd in de bijbehorende m / z waarde van de 2 + laden gemodificeerd, mono-, di-en tri-gemethyleerde K9 in de H3 (9-17) peptide, zowel voor input en chip monsters. B) Vertegenwoordiger MS / MS-spectra met behulp van CID fragmentatie. Het b-ion en y-ion serie maken met de sequentie van H3 (9-17) peptide definiëren en specifiek lokaliseren tri-methylatie in K9 resten. C) Relatieve hoeveelheden van de verschillende niveaus van methylatie op K9 in H3 ( 9-17) peptide, geschat door het delen verdeelt onder de curve (AUC) van elke gewijzigde peptide door de som van de oppervlakte voor alle waargenomen unmodified en gemodificeerde vormen van dat peptide, in de input en chip-ed octameer. Histogram is het gemiddelde ± SEM van drie onafhankelijke experimenten voor elke wijziging (bovenste paneel). Relatieve verrijking van K9 methylaties in H3 (9-17) peptide. De verrijking wordt uitgedrukt als log2 verhouding tussen de relatieve overvloed van elk methylatie in de ChIP-ed octameer te vergelijken invoeren. Histogram geeft de gemiddelden ± SEM van drie onafhankelijke experimenten (onderste paneel). D) Temperatuurkaart samenvatting van de verrijking van alle co-associëren hPTMs geïdentificeerd op histon H3, H4 en H2A. Elke rij correspondeert met een andere modificatie (nd niet gedetecteerd modificaties). Dit cijfer is gewijzigd van 21, met behulp van Figuur 1, Figuur 2, Figuur 3 en Figuur S10 als referentie. Klik hier voor grotere afbeelding.


    Figuur 3: Schematische weergave van X-ChroP workflow A) Regeling van verknopen chip in combinatie met MS-analyse.. Cellen gekweekt in lichte en zware media worden gefixeerd met formaldehyde en chromatine ingangen zijn gefragmenteerd door sonicatie om DNA-fragmenten te genereren. In set een Forward-up, is de gesonificeerde zwaar-gemarkeerde chromatine immunogeprecipiteerd met behulp van anti-H3K9me3 antilichaam terwijl de licht-gelabelde chromatine wordt geïncubeerd met hetzelfde antilichaam verzadigd met een overmaat vouw van oplosbare H3 peptide dragende K9me3. Immunologisch neergeslagen eiwitten uit zware en lichte chromatins worden samengevoegd, geëxtraheerd en gescheiden door SDS-PAGE. Eiwitten worden verteerd met trypsine en peptiden worden geanalyseerd door nano-LC-MS/MS. B) Efficiëntie van SILAC etikettering wordt bewaakt de berekening van de opname van zware lysine (Lys8) en arginine (Arg10) in eiwitten. In de plot, de mediaan van distributie lysine en arginine peptiden dichtheid is gelijk aan 0,974 (groene lijn) en 0.964 (rode lijn), respectievelijk. C) Ingezoomd massa spectra op de corresponderende m / z waarde van de 2 + opladen tri-gemethyleerde K9 in de H3 (9-17) peptide, zowel voor lichte en zware vormen, in-en chip-ed octameer. Terwijl in de ingang van de intensiteiten van zware en lichte peptide zijn dicht bij 1, in de Vooruit SILAC chip, de intensiteit van het licht peptide is veel lager dan die van de zware tegenhanger, hetgeen wijst op een efficiënte concurrentie. D) SDS-PAGE van het licht (L) en zware (H) gemerkt chromatine input en van co-immunogeprecipiteerd materiaal: de baan die overeenkomt met de chip-ed materiaal wordt gesneden in tien plakjes (zwarte lijn), terwijl slechts twee sneetjes ingang worden geanalyseerd voor inbouw-test analyse ( blauwe lijn). Dit cijfer is gewijzigd van 21, zie Figuur 4 en Figuur S6 als reconferentie. Klik hier voor grotere afbeelding.

    Figuur 4
    Figuur 4: massaspectrometrie analyse van de H3K9me3 "interactoom". A) Vertegenwoordiger volledige spectra die de SILAC-pair die overeenkomt met peptiden uit HP1 en macro-2A eiwitten: de verhoudingen H / L> 1 in de Vooruit experiment (bovenste panelen), weerspiegeld door een ratio H / L <1 in de Reverse replica (onderste panelen), tonen de specifieke verrijking van deze eiwitten in heterochromatin B) Vertegenwoordiger volledige spectra met SILAC-pair die overeenkomt met peptide uit een achtergrond eiwit:. H / L ratio's in Vooruit en achteruit herhalingen zijn gelijk aan 1 C) gekwantificeerde eiwitten. zijn distributed in een scatterplot op basis van hun SILAC-verhoudingen in vooruit en achteruit experimenten (x-en y-assen, respectievelijk); rode gestippelde lijnen geven de top 40% en 30% eiwit verhoudingen, zoals aangegeven. D) Eiwitten verhoudingen distributies van input (H / L 1:1 gemengd) (zwart), Forward (blauw) en Reverse (oranje) X-ChroP experimenten; rode gestippelde lijnen geven de top 40% van eiwit verhoudingen, ingesteld als afgrenzingsprocedures de echte interactoren selecteren. Dit cijfer is gewijzigd van 21, met behulp van Figuur 5 als referentie. Klik hier voor grotere afbeelding.

    Buffer voor deel 2 Samenstelling
    Lysis Buffer 10% sucrose, 0,5 mM EGTA pH 8,0, 15 mM NaCl, 60 mM KCl, 15 mM HEPES, 0,5% Triton, 0,5 mM PMSF, 1 mM DTT, 5 mM NAF, 5 mM Na 3 VO 4, 5 mM NaButyrate, 5 mg / ml aprotinine, 5 mg / ml pepstatine A, 5 mg / ml leupeptine
    Sucrosekussen 2 g sucrose in 20 ml lysisbuffer
    Digestion Buffer 0.32 M sucrose, 50 mM Tris-HCl pH 7,6, 4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 0,1 mM PMSF
    TE-buffer 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA
    Dialysebuffer 10 mM Tris-HCl pH 7,6, 1 mM EDTA, 0,5 mM PMSF, 5 mM NAF, 5 mM Na 3 VO 4, 5 mM NaButyrate, proteaseremmers cocktail
    ChIP VerdunningsBuffer 100 mM Tris HCl pH 7,6, 100 mM NaCl en 10 mM EDTA
    Blocking Solution 0.5% BSA in PBS
    Wasbuffer 50 mM Tris-HCl pH 7.6,10 mM EDTA
    Proteaseremmers EDTA-vrij proteaseremmers cocktail, 0,5 mM PMSF, 5 mM NAF, 5 mM Na3VO4, 5 mM NaButyrate
    Laden Buffer sinaasappel ladingskleurstof, 50% (v / v) glycerol in H20
    Buffer voor sectie 3 Samenstelling
    Lysis Buffer 50 mM HEPES-KOH pH 7,5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% glycerol, 0,5% NP-40, 0,25% Triton-100, 0,5 mM PMSF, 5 mM NAF, 5 mM Na 3 VO 4, 5 mM NaButyrate, 5 mg / ml aprotinine, 5 mg / ml pepstatine A, 5 mg / ml leupeptine
    Wasbuffer 10 mM Tris-HCl pH 8, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 0,5 mM PMSF, 5 mM NAF, 5 mM Na 3 VO 4, 5 mM NaButyrate, 5 mg / ml aprotinine, 5 mg / ml pepstatine A , 5 mg / ml leupeptine
    ChIP Incubatie Buffer 10 mM Tris-HCl pH 8, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 0,1% natriumdeoxycholaat, 0,5% natrium lauroylsarcoside, 0,5 mM PMSF, 5 mM NAF, 5 mM Na 3 VO 4, 5 mM NaButyrate, 5mg / ml aprotinine, 5 mg / ml pepstatine A, 5 mg / ml leupeptine
    Wasbuffer 2 20 mM Tris-HCl pH 7,6, 2 mM EDTA, 0,1% SDS, 1% Triton-100
    Laden Sample Buffer 250 mM Tri-HCl pH 8,8, 0,5 M B-mercaptoethanol, 2% SDS
    Buffer voor sectie 4 Samenstelling
    Alkylering Buffer 55 mM joodacetamide in 50 mM NH 4 HCO 3
    Reductie Buffer 10 mM dithiothreitol in 50 mM NH 4 HCO 3
    Extraction Buffer 30% ACN en 3% TFA in DDH 2 0

    Tabel 1. Buffers samenstelling.

    Tuning overname bestand Parameters
    FT volledige scan accumulatie streefwaarde 1 x 10 6; maximale vultijd 1000 msec
    IT MSn accumulatie streefwaarde 10 x 10 4; maximale vultijd 150 msec
    Acquisitie instelling Parameters
    Elektrospray spanning 2.4 kV
    Schede en hulpstoffen gasstroom Geen
    Ion overdracht capillaire temperatuur 200 ° C
    Dynamische uitsluiting tot 500 precursorionen gedurende 60 seconden bij MSMS
    Uitsluiting massa breedte 10 ppm
    Genormaliseerde botsing energieverbruikende wide-band activeringsmodus 35%
    Ion selectie drempels 100 counts
    Activering q 0.25
    Activatie tijd 30 msec

    Tabel 2. MS instellingen.

    MASCOR Deamon zoekopdracht Parameters Notes
    Database afhankelijk van het organisme (dwz voor HeLa-cellen: de menselijke database versie 3.68; 87.061 entries)
    Enzym Arg-C Arg-C splitsen bij het C-uiteinde van arginine residuen
    Variabele modificaties acetyl (K), oxidatie (M), D 3-acetylering (K), methyl-D 3 - acetyl (K), dimethyl (k), trimethyl (K) acetyl [42,010 Da], oxidatie [15,995 Da], D3-acetylering [45,0294 Da], methyl-D3-acetyl [som van 14,016 Da en 45,0294 Da], dimethyl [28,031], trimethyl [42,046 Da]
    Gemiste breuklijnen tot 2
    Nauwkeurigheid van massa's van de ouder-ionen in de zoektocht 10 ppm
    Mass-nauwkeurigheid voor CID MSMS 0.5 Da
    MaxQuant zoekopdracht Parameters Notes
    Database afhankelijk van het organisme
    Enzym trypsine / P Trypsine splitst bij de C-terminus van alle lysine en arginine residuen. De zoekopdracht wordt uitgevoerd rekening houdend met het feit dat de doeltreffendheid van trypsine lysine en arginine splitst wordt verminderd wanneer de volgende aminozuur proline (/ P).
    Vaste modificatie carbamidomethylation
    Variabele modificaties N-acetyl (eiwit), oxidatie (M)
    Gemiste breuklijnen tot 3
    Label parameters lys8 en arg10
    Maximale label amminoacid 3 voor Trypsine
    Massa-nauwkeurigheid van de ouder-ionen in de eerste "Andromeda" zoekopdracht 20 ppm
    Nauwkeurigheid van massa's van de ouder-ionen in het hoofd "Andromeda" zoekopdracht 6 dpm
    Mass-nauwkeurigheid voor CID MSMS 0.5 Da (zes hoogste toppen per100 Da)
    Peptide valse ontdekking tarieven (FDR) 0.01
    Eiwit valse ontdekking tarieven (FDR) 0.01 Instellen FDR van peptide en eiwit 0,01 betekent dat beide peptiden en eiwitten geïdentificeerd zouden bevatten 1% valse positieven. Deze waarde wordt geschat met behulp van een doel-decoy-database
    Maximum posterior error waarschijnlijkheid (PEP) 1 PEP is de kans dat een individu peptide is een vals positieve match. PEP gelijk aan 1 in uw instelling betekent dat alle peptiden, ongeacht de PEP zal worden genomen waardoor filtering is uitsluitend gebaseerd op FDR.
    Minimale peptidenlengte 6
    Minimum aantal peptiden 2
    Minimum aantal unieke peptiden 1
    Met alleen ongewijzigde peptiden en oxidatie (M) / acetyl (Protein N-Term) activeer de optie Peptiden met wijzigingen in het algemeen niet worden meegeteld voor eiwit kwantificering omdat hun overvloed kan geen afspiegeling van de verhouding tussen de overeenkomstige eiwit.
    Minimumverhouding count 1
    "Match tussen runs" activeer de optie

    Tabel 3. Data Analysis.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    We hebben recent beschreven ChroP een kwantitatieve strategie voor de grootschalige karakterisering van de eiwitcomponenten van chromatine. ChroP combineert twee complementaire benaderingen gebruikt in de epigenetische veld, chip en MS, profiteren van hun sterke punten en het overwinnen van hun beperkingen. ChIP gekoppeld aan diepe sequencing (ChIP-Seq) maakt het genoom-brede kartering van histon modificaties aan de resolutie van enkele nucleosomen 35. Hoewel voordelig voor hun gevoeligheid, zijn op antilichaam gebaseerde testen beperkt in hun vermogen om soortgelijke modificaties onderscheiden en ontleden de combinatorische aspect van de histoncode 36. Aan de andere kant, terwijl MS biedt een volledige en onpartijdige analyse van hPTMs, afzonderlijk en in combinaties 9, het is tot nu toe is toegepast op de analyse van bulk chromatine, met als gevolg een gebrek aan informatie over locusspecifieke PTMs geklets. We maken gebruik van een aangepaste versie van de chip om functioneel te isolerenafzonderlijke chromatinedomeinen en massaspectrometrie histone PTM patronen en de niet-histonic eiwitten te karakteriseren specifiek co-verrijkt.

    Door N-ChroP de analyse van hPTMs samen betrokken bij de H3K9me3 bleek een significante verrijking van markers geassocieerd met stille chromatine en een uitputting van wijzigingen geassocieerd met actieve chromatine. De overeenkomst van deze resultaten met eerdere studies 37 bleek de robuustheid van de strategie. In X-ChroP van H3K9me3 domeinen, de-SILAC gebaseerde onderzoek naar de chromatine-interagerende eiwitten bevestigd wat eerder beschreven interactors, waardoor de methode te valideren.

    ChroP presenteert twee oorspronkelijke aspecten met betrekking tot de reeds beschikbare strategieën voor het proteomische component van chromatine onderzoeken: bijvoorbeeld de mogelijkheid om intermoleculaire synergisme blijkt tussen verschillende modificaties versieren kernhistonen binnen dezelfde intacte mono-nucleosome gezuiverd door N-chips; tweede de kans om de specifieke compartimentering van histon varianten en linker histon subtypes beoordelen. Sinds het onderzoek van histon varianten wordt tegengehouden door het gebrek aan goede kwaliteit reagentia (dwz antilichamen), ChroP voren als de unieke tool beschikbaar om hun locatie en functionele rol te beoordelen.

    Een beperking van ChroP in zijn huidige opstelling ligt in peptide-centric ("bottom-up") benadering gebruikt in MS, met histonen verteerd in korte peptiden en de daaruit voortvloeiende beperkingen in het opsporen van de connectiviteit op lange afstand tussen wijzigingen. Als zodanig, de vervoeging van ChroP met "Bottom-up" MS analyse maakt een gedeeltelijke beoordeling van de combinatorische aspect van de histoncode. We voorzien dat de uitvoering van alternatieve MS-strategieën, zoals "Midden-en Top-Down" voor hPTMs mapping op langere peptiden (> 20 bis) tot op intacte eiwitten 38-40, zal overwinnendeze terughoudendheid.

    Kortom, N-en X-ChroP zijn zeer complementair, met de mogelijkheid van het ontleden van de complexiteit van chromatinestructuur op functioneel verschillende domeinen met een resolutie van mono-tot oligo-nucleosomen. We voorspellen dat ChroP ook nuttig zijn om de samenstelling van chromatine regio gekenmerkt door de aanwezigheid van specifieke niet-histonic nucleaire eiwitten te karakteriseren, bijvoorbeeld transcriptiefactoren (TFS). Bovendien kan ChroP worden gebruikt in functionele studies om de dynamische samenstelling van chromatine kaart op specifieke loci op verschillende verstoringen, bijvoorbeeld gedurende globale transcriptionele activatie. Om deze redenen, ChroP voren als een extra nuttig instrument in het arsenaal van analytische strategieën beschikbaar om de proteomics landschap van chromatine ontleden.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Geen belangenconflicten verklaard.

    Acknowledgments

    Dit onderzoek werd oorspronkelijk gepubliceerd in Mol Cell Proteomics. Soldi M. en Bonaldi T. De Proteomic Onderzoek van chromatine functionele domeinen Onthult Nieuwe synergieën tussen Verschillende Heterochromatine Components MCP. 2013; 12: 64-80. © de Amerikaanse Vereniging voor Biochemie en Moleculaire Biologie. Wij danken Roberta Noberini (Italian Institute of Technology en IEO, Italië) voor het kritisch lezen van het manuscript. TB werk wordt ondersteund door subsidies van de Giovanni Armenise-Harvard Foundation Career Development Program, de Italiaanse Vereniging voor Kankeronderzoek en het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid. MS werk werd ondersteund door een FIRC fellowship.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    DMEM  Lonza BE12-614F
    FBS Invitrogen 10270-106
    SILAC DMEM M-Medical FA30E15086
    Dialyzed FBS Invitrogen 26400-044
    Lysine 0 (12C6 14N2 L-lysine) Sigma Aldrich L8662
    Arginine 0 (12C6 14N4 L-arginine) Sigma Aldrich A6969
    Lysine 8 (13C6 15N2 L-lysine) Sigma Aldrich 68041
    Arginine 10 (13C6 15N4 L-arginine) Sigma Aldrich 608033
    Micrococcal Nuclease Roche 10 107 921 001
    Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets Roche 04 693 132 001
    Spectra/Por 3 dialysis tubing, 3.5K MWCO, 18mm flat width, 50 foot length Spectrumlabs 132720
    QIAquick PCR purification kit QIAGEN 28104
    Anti-Histone H3 tri-methylated K9-ChIP grade Abcam ab8898
    Histone H3 peptide tri-methyl K9  Abcam ab1773
    Dynabeads Protein G Invitrogen 100.04D
    NuPAGE Novex 4-12%                            Bis-Tris Gel  Invitrogen NP0335BOX
    Colloidal Blue Staining Kit Invitrogen LC6025
    LDS Sample Buffer Invitrogen NP0007
    Formaldheyde Sigma Aldrich F8775
    Aceti anhydride-d6 Sigma Aldrich 175641-1G
    Name Company Catalog Number Comments
    Formic Acid Sigma Aldrich 94318-50ML-F
    Iodoacetamide ≥99% (HPLC), crystalline Sigma Aldrich I6125
    DL-Dithiothreitol Sigma Aldrich 43815
    Sequencing Grade Modified Trypsin, Frozen 100 μg (5 × 20 μg) Promega V5113
    Nanospray OD 360μm x ID 75μm, tips ID 8 μm uncoated Pk 5 Microcolumn Srl FS360-75-8-N-5-C15
    ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 µm   15% C Dr. Maisch GmbH r13.aq.
    Carbon extraction disk, 47 mm Agilent Technologies 12145040
    Cation extraction disk Agilent Technologies 66889-U

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184, 868-871 (1974).
    2. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
    3. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
    4. Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Res. 21, 381-395 (2011).
    5. Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers. Nat Struct Mol Biol. 14, 1025-1040 (2007).
    6. Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293, 1074-1080 (2001).
    7. Spotswood, H. T., Turner, B. M. An increasingly complex code. J Clin Invest. 110, 577-582 (2002).
    8. Soldi, M., Cuomo, A., Bremang, M., Bonaldi, T. Mass spectrometry-based proteomics for the analysis of chromatin structure and dynamics. Int J Mol Sci. 14, 5402-5431 (2013).
    9. Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry. J Proteomics. 75, 3419-3433 (2012).
    10. Britton, L. M., Gonzales-Cope, M., Zee, B. M., Garcia, B. A. Breaking the histone code with quantitative mass spectrometry. Expert Rev Proteomics. 8, 631-643 (2011).
    11. Taverna, S. D., et al. Long-distance combinatorial linkage between methylation and acetylation on histone H3 N termini. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2086-2091 (2007).
    12. Garcia, B. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 11, 66-73 (2007).
    13. Villar-Garea, A., Imhof, A. The analysis of histone modifications. Biochim Biophys Acta. 1764, 1932-1939 (2006).
    14. Plazas-Mayorca, M. D., et al. One-pot shotgun quantitative mass spectrometry characterization of histones. J Proteome Res. 8, 5367-5374 (2009).
    15. Ohta, S., et al. The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics. Cell. 142, 810-821 (2010).
    16. Vermeulen, M., et al. Selective anchoring of TFIID to nucleosomes by trimethylation of histone H3 lysine 4. Cell. 131, 58-69 (2007).
    17. Vermeulen, M., et al. Quantitative interaction proteomics and genome-wide profiling of epigenetic histone marks and their readers. Cell. 142, 967-980 (2010).
    18. Bartke, T., et al. Nucleosome-interacting proteins regulated by DNA and histone methylation. Cell. 143, 470-484 (2010).
    19. Dejardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic Loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
    20. Lambert, J. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A novel proteomics approach for the discovery of chromatin-associated protein networks. Mol Cell Proteomics. 8, 870-882 (2009).
    21. Soldi, M., Bonaldi, T. The proteomic investigation of chromatin functional domains reveals novel synergisms among distinct heterochromatin components. Mol Cell Proteomics. 12, 764-780 (2013).
    22. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 1, 2856-2860 (2006).
    23. Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal Chem. 68, 850-858 (1996).
    24. Bonaldi, T., Regula, J. T., Imhof, A. The use of mass spectrometry for the analysis of histone modifications. Methods Enzymol. 377, 111-130 (2004).
    25. Cuomo, A., Moretti, S., Minucci, S., Bonaldi, T. SILAC-based proteomic analysis to dissect the "histone modification signature" of human breast cancer cells. Amino Acids. 41, 387-399 (2011).
    26. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nat Protoc. 2, 1896-1906 (2007).
    27. Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Anal Chem. 75, 663-670 (2003).
    28. Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Mol Cell Proteomics. 3, 608-614 (2004).
    29. Jung, H. R., Pasini, D., Helin, K., Jensen, O. N. Quantitative mass spectrometry of histones H3.2 and H3.3 in Suz12-deficient mouse embryonic stem cells reveals distinct, dynamic post-translational modifications at Lys-27 and Lys-36. Mol Cell Proteomics. 9, 838-850 (2010).
    30. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26, 1367-1372 (2008).
    31. Cox, J., et al. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. J Proteome Res. 10, 1794-1805 (2011).
    32. Lachner, M., O'Carroll, D., Rea, S., Mechtler, K., Jenuwein, T. Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins. Nature. 410, 116-120 (2001).
    33. Bannister, A. J., et al. Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain. Nature. 410, 120-124 (2001).
    34. Ram, O., et al. Combinatorial patterning of chromatin regulators uncovered by genome-wide location analysis in human cells. Cell. 147, 1628-1639 (2011).
    35. Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129, 823-837 (2007).
    36. Beck, H. C. Mass spectrometry in epigenetic research. Methods Mol Biol. 593, 263-282 (2010).
    37. Ernst, J., Kellis, M. Discovery and characterization of chromatin states for systematic annotation of the human genome. Nat Biotechnol. 28, 817-825 (2010).
    38. Tipton, J. D., et al. Analysis of intact protein isoforms by mass spectrometry. J Biol Chem. 286, 25451-25458 (2011).
    39. Young, N. L., et al. High throughput characterization of combinatorial histone codes. Mol Cell Proteomics. 8, 2266-2284 (2009).
    40. Boyne, M. T. 2nd, Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. Precise characterization of human histones in the H2A gene family by top down mass spectrometry. J Proteome Res. 5, 248-253 (2006).

    Tags

    Biochemie chromatine histon post-translationele modificaties (hPTMs) epigenetica massaspectrometrie proteomics SILAC chromatine immunoprecipitatie histon-varianten chromatome hPTMs cross-gesprekken
    De ChroP aanpak combineert chip en massaspectrometrie te ontleden Locus-specifieke Proteomic Landschappen van Chromatin
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP… More

    Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin. J. Vis. Exp. (86), e51220, doi:10.3791/51220 (2014).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter