Summary
Durch die Kombination von nativen und Vernetzungs Chromatinimmunpräzipitation mit hochauflösender Massenspektrometrie ermöglicht ChroP Ansatz, um die Verbund Proteom-Architektur der Histon-Modifikationen, Varianten und Nicht-Histon-Proteine synergizing bei funktionell unterschiedlichen Chromatindomänen sezieren.
Abstract
Chromatin ist ein hochdynamisches Nukleoprotein-Komplex von DNA und Proteinen, die verschiedene DNA-abhängige Prozesse kontrolliert werden. Chromatin-Struktur und Funktion in bestimmten Bereichen durch die lokale Anreicherung von Histon post-translationale Modifikationen (hPTMs) und Varianten, Chromatin-bindende Proteine, einschließlich Transkriptionsfaktoren und DNA-Methylierung reguliert. Die Proteom-Charakterisierung von Chromatin Zusammensetzung an unterschiedlichen Funktionsbereiche wurde bisher durch das Fehlen effizienter Protokolle, um solche Domänen an der entsprechenden Reinheit und Menge für die anschließende eingehende Analyse durch Massenspektrometrie (MS) bereichern behindert. Wir beschreiben hier eine neu gestaltete Chromatin Proteomik Strategie, genannt ChroP (Chro matin roteomics P), wobei ein Präparat Chromatinimmunpräzipitation wird verwendet, um verschiedene Chromatin-Regionen, deren Merkmale in Bezug auf hPTMs, Varianten und Co-assoziierte Nicht-Histon-Proteine zu isolieren, sind MS analysiert. Wir veranschaulichen, erre die Einrichtung von ChroP zur Anreicherung und Analyse von transkriptionell stillen heterochromatischen Regionen, durch die Anwesenheit von Tri-Methylierung von Lysin 9 am Histon H3 markiert. Die erzielten Ergebnisse zeigen das Potenzial der ChroP gründlich Charakterisierung des Proteoms Heterochromatin und beweisen Sie es als ein leistungsfähiges Analyse-Strategie zu verstehen, wie die unterschiedlichen Protein Determinanten von Chromatin interagieren und Synergie zu Locus-spezifischen strukturellen und funktionalen Konfigurationen zu etablieren.
Introduction
Chromatin ist eine hoch dynamische Nukleoproteinkomplex, die als Vorlage für alle primären DNA-vermittelten Prozessen beteiligt ist. Das Nukleosom ist die Grundwiederholungseinheit des Chromatins und besteht aus einem proteinhaltigen oktameren Kern zwei Moleküle jeder kanonischen Histon H2A, H2B, H3 und H4, um die 147 bp DNA gewickelt 1,2 enthält. Alle Core-Histone sind als globuläre Domäne und eine flexible N-terminalen "Schwanz", die außerhalb der Nukleosomen ragt strukturiert. Einer der Hauptmechanismen zur Regulierung Chromatin-Struktur und Dynamik auf kovalente post-translationale Modifikationen (PTM), die hauptsächlich auf den N-Termini von Histonen 3,4 auftreten basiert. Histon-Modifikationen kann entweder durch Änderung der Chromatinstruktur höherer Ordnung, indem die Kontakte zwischen Histon-DNA oder zwischen Nukleosomen, und steuert somit die Zugänglichkeit der DNA-bindenden Proteinen (cis-Mechanismen) funktionieren, oder als DockIn wirkendeng Stellen für regulatorische Proteine, entweder als Einzelgeräte oder in multimere Komplexe eingebettet. Wie regulierende Proteine ihre Funktion in verschiedener Weise ausüben: durch Modulation direkt Genexpression (dh Proteine TAF) oder durch Änderung der Nukleosomen Positionierung (dh Chromatin-Remodeling-Komplexe) oder durch Änderung anderer Histon-Reste (dh Proteine, die mit Methyl-oder Acetyl-Transferase Transferase-Aktivität) (trans-Mechanismen) 5. Die Beobachtung, dass unterschiedliche Muster PTM-Cluster zu bestimmten Chromatin Loci führte zur Ausarbeitung der Hypothese, dass verschiedene Modifikationen an bestimmten Stellen können Synergie, um einen molekularen Code der Vermittlung der Funktionszustand des zugrunde liegenden DNA zu erzeugen. Die "Histon-Code-Hypothese" hat großen Konsens in den Jahren gewonnen, aber seine experimentelle Überprüfung ist wieder durch technische Beschränkungen 6,7 statt.
Massenspektrometrie (MS)-basierte Proteomik als ein hervorleistungsfähiges Werkzeug zur Histon-Modifikation Muster abzubilden und Chromatin-bindende Proteine 8 zu charakterisieren. MS detektiert eine Änderung als eine spezifische Δmass zwischen der experimentellen und theoretischen Masse eines Peptids. Auf der Ebene der einzelnen Histone, bietet MS eine unvoreingenommene und umfassende Methode zur Karte PTMs, so dass die Erkennung von neuen Modifikationen und aufschlussreiche Wechselspiel zwischen ihnen 9-14.
In den letzten Jahren wurde eine Reihe von Strategien entwickelt, um die proteomische Zusammensetzung von Chromatin zu sezieren, einschließlich der Charakterisierung von intakten mitotischen Chromosomen 15, die Identifizierung von löslichen HPTM-bindenden Proteinen 16-18 und die Isolierung und Analyse von spezifischen Chromatin-Bereiche (dh Telomere) 19,20. Allerdings ist die Ermittlung der Ortsspezifische Synergien zwischen Histon PTMs, Varianten und Chromatin-assoziierte Proteine noch unvollständig. Hier beschreiben wir einen neuen Ansatz, mit dem Namen ChroP (Chro matin roteomics P) 21, die wir entwickelt haben, um effizient zu charakterisieren funktionell unterschiedlichen Chromatin-Domänen. Dieser Ansatz passt Chromatinimmunpräzipitation (Chip), eine gut etablierte Protokoll in der epigenetischen Forschung, für die effiziente MS-basierten Proteomanalyse der angereicherten Probe. Wir haben zwei verschiedene Protokolle entwickelt, abhängig von der Art des Chromatins als Eingabe und die Frage gerichtet MS verwendet wird; insbesondere: 1) ChIP von nicht fixierten nativen Chromatin mit MNase verdaut wird eingesetzt, um Mono-Nukleosomen zu reinigen und die Co-Zuordnung hPTMs (N-ChroP) sezieren; 2)-Chips aus vernetzten Chromatin durch Ultraschall fragmentiert wird in Kombination mit einem SILAC Basis Interactomics Strategie, um alle Co-Anreicherung Chromatin-Bindungsproteine (X-ChroP) charakterisieren. Wir veranschaulichen hier die Kombination von N-und X-ChroP zur Anreicherung und Studieren Heterochromatin mit H3K9me3 als Köder für die Immunpräzipitation Schritte. Die Verwendung von ChroP verlängert werdenentweder verschiedene Regionen auf Chromatin, oder Änderungen in der Zusammensetzung des Chromatins innerhalb der gleichen Region während der Übergang zu einem anderen Funktionszustand zu untersuchen, um so den Weg für verschiedene Anwendungen in der Epigenetik.
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Protocol
1. Zellkultur
- Standardmedium für native ChIP
- HeLa-Zellen wachsen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 1% Glutamin, 1% Pen / Strep und 10 mM HEPES, pH 7,5, ergänzt.
- SILAC Kennzeichnung für die Vernetzung ChIP
- HeLa-Zellen wachsen in SILAC DMEM-Medium, Lysin und Arginin verarmt, mit 10% dialysiertem FBS, 1% Glutamin, 1% Pen / Strep, 10 mM HEPES, pH 7,5, und entweder dem Licht L-Lysin (Lys 0) und L-ergänztem Arginin (Arg 0) oder ihre schweren Gegen, L-Lysin (Lys 8) und L-Arginin (Arg 10) (Materials Table), um die Endkonzentrationen von 73 mg / l und 42 mg / L auf.
- Wachsen Zellen, die für bis zu acht Generationen in SILAC Medium, um die vollständige isotopencodierten Aminosäuren Einarbeitung zu gewährleisten. Pass-Zellen alle zwei Tage, wenn sie eine Dichte von 1,0 bis 1,5 x 10 6 Zellen / ml erreichen, Säen sie zu aconcentration von 3 x 10 5 Zellen / ml.
- Bewerten Zellen Wachstum und Rentabilität in SILAC Medium, um jede mögliche Änderung von der Physiologie, die aus der ärmeren Zusammensetzung des SILAC Medium führen kann individualisieren; um dies zu tun:
- Sichtprüfung Zellen jeden Tag am Mikroskop Morphologie während der Etikettierung.
- Zählen von Zellen und Handlung Wachstumskurven von Zellen, die in SILAC gegenüber Standardmedium.
2. Ureinwohner Chromatin Immunopräzipitation (N-Chip)
- Kerne Herstellung von kultivierten Zellen
- Verwenden Sie 1-2 x 10 8 unmarkierten HeLaS3 Zellen pro Experiment. Ernten Sie die Zellen, stellen Aliquot von 50 x 10 6 Zellen in 50 ml Zentrifugenröhrchen und bei 340 g für 10 min bei 4 ° C, waschen Sie sie mit eiskaltem PBS.
- Resuspendieren jeder Zellpellet in 8 ml Lysepuffer (Tabelle 1) und Inkubation für 10 min bei 4 ° C auf einem rotierenden Rad. Gießen Sie ca.refully jedem Zelllysat auf einem Saccharose-Kissen (Tabelle 1) und die Zentrifuge in einem Ausschwingrotor bei 3.270 × g für 20 min bei 4 ° C, um Kerne von Zytoplasma zu trennen.
- Überstände verwerfen, halten Kernpellets und zweimal waschen Sie sie in eiskaltem PBS durch Zentrifugation, Überstand verwerfen bei jedem Waschgang.
- Mikrokokken-Nuclease (MNase) Verdauung (Klein) und Qualitätskontrolle von Chromatin nach der Verdauung
- Resuspendieren gewaschen Kernpellet in 1 ml Aufschlusspuffer (Tabelle 1); teilen in zwei Aliquots von 500 ul und auf Eis zu halten.
- Die optische Dichte (OD) bei 260 nm eines Aliquots, 1:200 verdünnt in 0,2% Natriumdodecylsulfat (SDS). Hinweis: OD = 1 entspricht etwa 50 &mgr; g / ml von Chromatin-DNA. Typischerweise ausgehend von 2 x 10 8 Zellen, ist die OD im Bereich von 40-60.
- Nehmen 1% Kerne, fügen MNase Enzym bis zu einer Endkonzentration von 0.005 U Enzym / &mgr; l der Zellkerne und bei 37 ° C für verschiedene Zeitspannen (0, 10, 20, 40, 60 min).
- Zu jedem Zeitpunkt, sammeln 4 ul der verdauten Kerne und fügen Sie 1 mM EDTA, um die MNase Reaktion zu stoppen. Halten Sie auf dem Eis.
- Extrahieren von DNA-Proben durch PCR Purification Kit und eluieren sie in 50 &mgr; l TE-Puffer (Tabelle 1).
- Nehmen Sie 20 ul jeder DNA-Probe, mit 10 ul Ladepuffer (Tabelle 1) und laden Sie die Proben auf 1% (w / v) Agarose-Gel mit Ethidiumbromid mit PCR-Marker als Größenkontrolle.
- Überprüfen Sie die Verdauung der Bewertung der Chromatin Nukleosomen Leiter von MNase Inkubation produziert.
- Wählen des optimalen Zeitpunkts für die Verdauung, bezogen auf die Prävalenz von Nukleosomen in Mono-Zubereitung. . Typisch für 0.005 U Enzym / ul der Kerne der optimale Zeitpunkt der MNase Verdauung ist 60 min (Abbildung 1B, links) Hinweis: Die optimale Konzentration MNase / Uhrzeit der Verdaulichkeitauf je nach dem gewünschten Zelltyp und von der Größe der Nukleosomen Strecke eingestellt werden.
- Large-scale/preparative MNase Verdauung und Verwertung von Chromatin löslichen Fraktionen
- Hinzufügen zu jedem Aliquot (siehe 2.2.1) 5 ul MNase, entsprechend einer Endkonzentration von 0,005 U Enzym / &mgr; l der Zellkerne; Vorsichtig mischen und bei 37 ° C für 60 Minuten (oder im allgemeinen für die optimierte Zeitintervall, bezogen auf das im kleinen Maßstab).
- 1 mM EDTA, um die Reaktion zu stoppen und auf Eis zu halten. Pellet die verdauten Kerne durch Zentrifugation bei 7.800 × g bei 4 ° C für 10 min. Die Überstände (Fraktion S1) in ein neues Röhrchen und Lagern bei 4 º C. Bemerkung: S1 enthält das erste lösliche Fraktion von Chromatin, das Mono Nukleosomen. Fügen Sie die Proteaseinhibitoren (Tabelle 1).
- Vorsichtig resuspendieren Pellets in 1 ml Dialyse-Puffer (Tabelle 1) und Dialyse über Nacht bei 4 ° C (cut off der Dialyseschlauch ist 3,5 kDa), in 3 l Dialysepuffer, mit konstantem leichtem Rühren. Dialysierte Material sammeln und Zentrifuge bei 7.800 × g für 10 min bei 4 ° C Den Überstand (S2 Fraktion) in einem neuen Eppendorf-Röhrchen und Lagern bei 4 º C. Bemerkung: S2 umfasst Di-bis epta-Nukleosomen, je nach Ausmaß der Verdauung MNase.
- Qualitätskontrolle von Chromatin vor Immunpräzipitation
- Einen aliquoten entsprechend 5 ug S1 und S2 Chromatin Fraktionen (durch Messung der OD bei 260 nm in einem ND-System quantifiziert). Extrahieren DNA durch PCR Purification Kit und Eluieren in 50 ul TE-Puffer (Tabelle 1).
- Nehmen Sie 20 ul S1 und S2 DNA, mit 10 ul Ladepuffer (Tabelle 1) mischen und laden Sie sie auf 1% (w / v) Agarose-Gel. Prüfen Sie die Qualität und Effizienz der MNase Verdauung durch visuelle Inspektion der Nukleosomen Leiter. Hinweis: Fraktion S1 ist hochin Mono-Nukleosomen angereichert, während S2 Fraktion enthält hauptsächlich poly-Nukleosomen (1B, rechts).
- Inkubation von Chromatin mit Antikörper
- Lagerung bei -20 ° C 50 ul S1-Fraktion für die anschließende Massenspektrometrie-Analyse.
- 1 Volumen ChIP Verdünnungspuffer (Tabelle 1), um Bruch S1.
- Hinzufügen des Antikörpers gegen das HPTM (oder Protein) von Interesse; Inkubation über Nacht auf einem rotierenden Rad bei 4 º C. Bemerkung: Normalerweise verwenden 10 ug bis 20 ug des Antikörpers für 2 x 10 8 Zellen. Das optimale Verhältnis zwischen der Menge an Antikörper und Ausgangszellen Nummer muss sorgfältig von Fall zu Fall festgelegt werden, abhängig von der Fülle der HPTM / Protein als Köder in der Probe verwendet, und auf dem Antikörper Effizienz. Optimierung ist experimentell, basierend auf den folgenden Kriterien:
- Vergleichen Sie die Menge der Hauptmann / Protein von Interesse zwischen Ein-und Durchfluss (FT,siehe 2.7.2) durch Western Blot oder MS, ob die Immunpräzipitation bereichert einen erheblichen Anteil der spezifischen Chromatin Region. Hinweis: Dies wird im allgemeinen erreicht, wenn mindestens 50% der HPTM / Protein-Köder im FT (Fig. 1C) abgereichert .
- Überprüfen Sie, dass die immun Protein von Interesse auf SDS-PAGE-Gel, das gewährleistet, dass eine ausreichende Menge an Material ist für die MS-Analyse zur Verfügung nachweisbar. Hinweis: Die Anwesenheit auf dem Gel der Bands, die den vier Core-Histone an der richtigen Stöchiometrie zeigt an, dass das intakte Nukleosomen wurde von N-ChroP (1D) immunpräzipitiert worden. Mangel an der richtigen Stöchiometrie ist in der Tat, der eine partielle Unterbrechung / Entfaltung der Nukleosomen.
- Parallel dazu bereiten die G-Protein-gekoppelten magnetischen Beads (siehe 2.6).
- Die Gleichgewichtseinstellung und Blockierung von Protein G-gekoppelten magnetischen Beads
- Ins Gleichgewicht 100 ul von Protein G-gekoppelten magnetischen Beads Gülle in Blocking Solution (Tabelle 1), dreimaliges Waschen und Inkubation über Nacht bei 4 ° C auf einem rotierenden Rad. Hinweis: Nach der Bindungskapazität von Perlen, verwenden 100 ul von Gülle für 2-20 ug Antikörper.
- Mit Blocking Solution und dann zweimal mit ChIP Verdünnungspuffer (Tabelle 1) Waschen Sie die Perlen einmal blockiert.
- 100 l blockiert Perlen S1 Chromatin Probe und Inkubation sie auf einem rotierenden Rad bei 4 ° C für 3 Stunden. Zentrifugieren bei 340 g für 1 min aus dem Deckel der Tipps Spin-Down der Probe. Legen Sie in einem magnetischen Rack, um die Perlen zu pelletieren.
- Den Überstand in ein neues Eppendorf-Röhrchen. Dies ist die Strömung durch (FT), nämlich der Anteil des Chromatins, die nicht an den Antikörper gebunden haben.
- Waschen der Kügelchen viermal in Waschpuffer (Tabelle 1) Erhöhung der Salzkonzentration bei jedem Waschgang (75, 125 und 175 mM NaCl).
- Um die immun Chromatin eluieren, brüten die Perlen in 30 ul LDS-Probenpuffer mit 50 mM Dithiothreitol (DTT) für 5 min ergänzt bei 70 ° C Trennen Sie die eluierten Proteine auf einem 4-12% Bis-Tris-Acrylamid-SDS-PAGE-Fertig Gradient Gel und färben das Gel mit kolloidalem Coomassie-Färbung Kit (Abbildung 1D).
3. Vernetzung Chromatin Immunopräzipitation (X-ChIP)
- Vernetzung der Zellen mit Formaldehyd
- In 0,75% Formaldehyd zu SILAC-markierten Zellen, kurz mischen und Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur. Abschrecken der Formaldehyd durch Zugabe von 125 mM Glycin und Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur.
- Teilen Sie Zellen in 5 x 10 7 Aliquots; spülen Sie sie dreimal mit eiskaltem PBS durch Zentrifugation bei 430g für 5 min bei 4 º C und Verwerfen des Überstandes nach jedem Waschen. Bei der letzten Wäsche, Überstand verwerfen und das Pellet zu halten. Hinweis: Wenn Zellen vernetzt sind, können sie bei -80 ° C gelagert werden, wenn sie nicht sofort verwendet werden.
- Kerne Vorbereitung
- Resuspendieren jeder Zellpellet in 10 ml Lysis-Puffer (Tabelle 1). Inkubation für 10 min bei 4 ° C unter Rotation. Zentrifuge bei 430 × g für 5 min bei 4 ° C. Die Überstände verwerfen; Kernpellets halten.
- Resuspendieren jedes Kernpellet in 10 ml Waschpuffer (Tabelle 1). Inkubieren bei Raumtemperatur für 10 min auf einem rotierenden Rad.
- Zentrifuge bei 430 × g für 5 min bei 4 ° C. Die Überstände verwerfen und sammeln die Pellets.
- Resuspendieren jeweils Kernpellets in 3 ml ChIP Inkubationspuffer (Tabelle 1). Halten Sie auf dem Eis.
- Chromatin Beschallung und Qualitätskontrolle
- Ultraschallbad ch. romatin bei 200 W (Zyklen von 30 Sekunden "an" und 1 min "aus"), in einem gekühlten Bioruptor, Chromatin-Fragment Anmerkung: Die Anzahl der Zyklen und Beschallung Intervallen abhängig vom Zelltyp und von der durchschnittlichen Länge der nukleosomalen strecken gewünscht. Typischerweise 30 min Ultraschallbehandlung notwendig sind, um DNA-Fragmente von 300-500 bp zu erzeugen, in Längen, entsprechend di-und tri-Nukleosomen. Die Wahl der Größe der Fragmente hängt von der Art der Chromatin-Domäne untersucht.
- Nehmen Sie 2% der Gesamteingangs, kehren Sie die Vernetzung durch Inkubation bei 65 ° C für mindestens 1 Stunde in ChIP Inkubationspuffer. Extrahieren Sie die DNA durch PCR Purification Kit, Elution in 50 ul TE-Puffer und laden Sie die DNA auf Agarose-Gel auf Chromatin Fragmentierung zu überprüfen.
- Inkubation von Chromatin mit Antikörper
- 1/10 Volumen 10% Triton X-100 zu beschallenden Chromatin. Zentrifuge bei 12.000 × g für 10 min bei 4 ° C pelletiert deBris.
- Sparen Sie 50 ul von Chromatin Eingabe von schweren Zellen, die für die Prüfung der Aufnahme Niveau SILAC Aminosäuren in markierten Zellen und für Protein-Profiling.
- In den Antikörper der Wahl, um die verbleibende schwere und leichte beschriftet beschallt Chromatin und Inkubation über Nacht bei 4 ° C auf dem sich drehenden Rad. Im Lichtkanal, fügen Sie auch einen Überschuss fache des löslichen Peptid. Inkubation über Nacht bei 4 ° C auf einem rotierenden Rad. Hinweise: Der optimale Zustand zwischen der ug Antikörper und dem Ausgangsmaterial der Zellen wird von Fall zu Fall entschieden, wie in 2.5.3 diskutiert. Der optimale Überschuß fach Molarität der löslichen Peptid in bezug auf die Antikörper muß sorgfältig von Fall titriert Fall.
- Isolierung von Chromatin mit magnetischen Beads
- Ins Gleichgewicht und Block G-Protein-gekoppelten magnetischen Beads, indem Sie die in 2.6 beschriebenen Schritten und mit ChIP Inkubationspuffer.
- 100 l blockiert bEADS Chromatin Proben und Inkubation auf einem rotierenden Rad für 3 h bei 4 ° C. Zentrifugieren bei 340 g für 1 min aus dem Deckel der Tipps Spin-Down der Probe. Legen Sie in einem magnetischen Rack, um die Perlen zu pelletieren. Der Überstand ist der Fluss durch (FT), enthaltend ungebundenes Nukleosomen. Wasch Perlen viermal in Waschpuffer (Tabelle 1) mit zunehmender Salzkonzentration (zwei Waschungen mit 150 mm und zwei mit 300 mM NaCl).
- Perlen inkubieren in 30 ul SDS-PAGE-Loading-Probenpuffer (Tabelle 1) und für 25 min bei 95 ° C sowohl eluieren und de-Vernetzungs immunpräzipitierten Proteine. Separate Proteine auf 4-12% Bis-Tris-Acrylamid-SDS-PAGE vorgefertigten Gelen (Abbildung 3D).
4. Probenvorbereitung Vor der MS
- In-Gel Verdauung von Histonen aus N-ChIP angereichert
Hinweis: Während der Proteinverdauung und Peptid-Extraktionsschritte kümmernKeratin Verunreinigungen, die mit LC-MS/MS stören, wie zuvor beschrieben, 22, 23 zu minimieren.- Schnitt Gelstücke entsprechend der Core-Histone Bänder (Fig. 1D). De-färben die Gel-Stücke mit 50% Acetonitril (ACN) in ddH2O, abwechselnd mit 100% ACN, das Gel schrumpft. Wiederholen, bis Gele Stücke sind komplett entfärbt und trocknen Sie sie in einer Vakuumzentrifuge.
- Hinzufügen D 6-Essigsäureanhydrid 1.09 (v / v) in 1 M Ammoniumbicarbonat (NH 4 HCO 3) (in der Regel das Endvolumen 60-100 &mgr; l) und 3 &mgr; l Natriumacetat (CH 3 COONa), als Katalysator. Inkubation für 3 Stunden bei 37 ° C mit starken Erschütterungen. Hinweis: Die Probe kann Blasen in den ersten Minuten nach der Montage der Reaktion zu erzeugen: es wichtig, mit Vorsicht handhaben und lösen das erzeugte Gas, Öffnung von Zeit zu Zeit die Röhren während der Inkubation.
- Spülen Sie die Gel-Stücke mehrmals with NH 4 HCO 3, wechseln sich mit ACN bei steigenden Prozentsatz (50% bis 100%), um vollständig zu beseitigen Rückstände von D 6-Essigsäureanhydrid.
- Schrumpf die Gelstücke in 100% ACN; trocknet sie in einer Vakuumzentrifuge, um vollständige Dehydratisierung zu gewährleisten. Re-Gel-Stücke mit eiskaltem 100 ng / ul Trypsin-Lösung in 50 mM NH 4 HCO 3 und Inkubation über Nacht bei 37 ° C. Hinweis: Die Kombination der chemischen Modifikation von Lysinen mit deuterierten Essigsäureanhydrid und Trypsin Verdauung erzeugt ein "Arg- C wie "In-Gel Verdauungsmuster von Histonen 21,24.
- Entsorgen Sie die überschüssige Lösung und fügen Sie ein Volumen von 50 mM NH 4 HCO 3, um die Gelstücke vollständig abdecken; Inkubieren über Nacht bei 37 ° C.
- Sammeln löslich verdauten Peptide in einem neuen Eppendorf-Röhrchen. Lyophilisieren Peptiden. Resuspendieren sie in 0,5% Essigsäure acid/0.1% Trifluoressigsäure (TFA). Desalt und konzentrierenPeptide auf einem Reversed Phase C 18 / Carbon "Sandwich" und Ionenaustausch-Chromatographie (SCX) auf handgeschöpftem Mikrosäulen (StageTip) 25.
- Bereiten Sie die StageTip Mikrosäulen indem Geflecht Festplatten mit Teflon immobilisiert C 18 / Kohlenstoff ("Sandwich") und SCX-Perlen in einem 200-ul-Tipps. Beziehen Sie die "Sandwich" durch das Laden der C 18 Mikrosäule auf einem zweiten Spitze mit Kohlefilter geladen. Hinweis: Die sehr kurze Peptide, die nicht auf der C-18-Filter zurückgehalten werden, übergeben in der Durchfluss, die direkt auf geladen Carbon Spitze, die in der Regel hält sie. SCX StageTips können spezifische Peptide, wie H3 (3-8)-Peptid, nicht effizient durch Umkehrphasenchromatographie gehalten bereichern.
- Last 50% der Peptide auf den C 18 / Carbon "Sandwich StageTip" und 50% auf SCX StageTips. Eluiere sie von den C 18 / Carbon-Tipps mit 80% ACN/0.5% iger acid und der SCX Tipps mit 5% Ammoniumhydroxid (NH 4 OH) / 30% Methanol. Nach der Lyophilisation resuspendieren Peptide in 0,1% FA und mittels LC-MS/MS analysiert.
- In-Gel-Verdau von Proteinen immun
In-Gel-Verdauung der Proteine erfolgt, wie zuvor beschrieben 22 durchgeführt, mit geringfügigen Modifikationen.- Schneiden Sie jede Spur in zehn Scheiben (3D) und jede Scheibe in kleine Würfel von 1 mm 3. De-färben die Gelstücke mit 50 mM NH 4 HCO 3/50% Ethanol und fügen absolutem Ethanol um die Gele schrumpfen. Wiederholen, bis die Gele komplett de-gefärbt.
- Hinzufügen Reduktionspuffer (Tabelle 1) mit den Gelstückchen für 1 h bei 56 ° C, gefolgt von der Zugabe von Alkylierungs-Puffer (Tabelle 1) für 45 min bei Raumtemperatur im Dunkeln. In Vakuumzentrifuge Waschen und trocknen Sie die Gel-Stücke.
- Rehydrate die Gelstücke mit eiskaltem 12,5 ng / ul Trypsin-Solution in 50 mM NH 4 HCO 3 und Inkubation auf Eis bis zur vollständigen Rehydrierung der Gel-Stücke. Entfernen Trypsin im Übermaß.
- In 50 mM NH 4 HCO 3, um die Gel-Stücke vollständig zu bedecken. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C.
- Sammeln Sie die flüssige Teil. Hinzufügen des Extraktionspuffer (Tabelle 1), um das Gel Stücke; Inkubieren unter starkem Rühren für 10 min bei Raumtemperatur. Zweimal wiederholen.
- Die Gelstücke in ACN Inkubation für 10 min unter starkem Rühren. Zweimal wiederholen und alle Überstände zu bündeln.
- Lyophilisieren die Peptide. Resuspendieren getrocknet Peptide in 0,5% Essigsäure acid/0.1% TFA.
- Entsalzen und konzentrieren Peptide auf einem Reversed Phase C 18 StageTip, wie beschrieben, 26, 27.
- Eluiere Peptide aus dem C 18 StageTip mit 80% ACN/0.5% Essigsäure. Entfernen des organischen Lösungsmittels durch Verdampfung in einer Vakuumzentrifuge und Resuspendieren der Peptide in 0,1% FA (typischerweise 5-10 &# 181; l), wenn Sie bereit sind, um die MS-Analyse.
5. LC-MS-Analyse
- Flüssigkeitschromatographie-Analyse
- Pack die Analysesäule in einem 15 cm Quarzglasstrahler (Innendurchmesser 75 &mgr; m, 350 &mgr; m Außendurchmesser) unter Verwendung von Umkehrphasen-(RP) C-18, 3 &mgr; m Harz in Methanol, bei einer konstanten Heliumdruck (50 bar) unter Verwendung eines Bombe-loader-Gerät, wie zuvor 28 beschrieben.
- Koppeln der Emitter verpackt (C18 RP-Säule) direkt mit dem Auslass des 6-Wege-Ventil der HPLC durch eine 20 cm lange (25 &mgr; m Innendurchmesser) Quarzglas ohne Vorsäule oder Spaltvorrichtung.
- Laden der verdauten Peptide C18 RP-Säule bei einem Durchsatz von 500 Nl / min mobile Phase A (0,1% FA / 5% ACN in ddH 2 O).
- Nach dem Laden der Probe, trennen Sie die Peptide mit den folgenden Gradienten:
- Wenden 0-40% mobile Phase B (0,1% FA/99% ACNin ddH 2 O) in 250 nl / min über 90 min, gefolgt von einem Gradienten von 40-60% in 10 min 60-80% in 5 min, für die Elution von Peptiden, die aus Histonen (siehe 2).
- Wenden 0-36% mobile Phase B bei 250 nl / min über 120 min, gefolgt von einem Gefälle von 36-60% in 10 min und 60-80% innerhalb von 5 min für die Elution von Peptiden, die aus immun Proteine (siehe 3).
- Massenspektrometrie-Analyse mit LTQ-FT-ICR-Massenspektrometer-Ultra-
- Betreiben Sie in einem datenabhängigen Erwerb (DDA)-Modus automatisch zwischen MS und MSMS Erwerb wechseln. MS Scan-Spektren von 200-1,650 erworben, typischerweise in der m / z-Bereich wird mit einer Auflösung von R = 100.000 bei 400 m / z erworben. Die fünf (Top5) intensivsten Ionen werden zur Fragmentierung in der linearen Ionenfalle isoliert unter Verwendung einer stoßinduzierten Dissoziation (CID) auf einem Sollwert von 5000.
- Verwenden Sie die in Tabelle 2 aufgeführten Parameter for das "Tuning" Erwerb Datei.
- Stellen Sie die Standard-Einstellungen Nahme, wie in Tabelle 2 aufgeführt.
6. Datenanalyse
- Beschriften Sie kostenlos Quantifizierung von Histon-Modifikationen in Chromatindomänen Zusammenarbeit bereichert
- Konvertieren Sie die erworbenen Raw-Dateien, um Dateien mit mgf Raw2msm-Software (Version 1.10) 29.
- Suche die Histon-Modifikationen mit Maskottchen-Deamon (Version 2.2.2), die Einstellung der in Tabelle 3 beschriebenen Parameter.
- Auf der Maskottchen-Ausgang Peptid Liste entfernen Peptide mit Score von weniger als 15 oder mehr als 5 mutmaßlichen PTMs 29. Hinweis: Für jedes einzelne Peptid-ID, wählen Sie das Peptid mit der höchsten Punktzahl Maskottchen und filtern alle anderen redundanten Peptide mit gleicher ID .
- Konstruieren Sie die extrahierten Ionenchromatogramme (XIC) für jeden Vorläufer entsprechend alle modifizierten Peptide, based auf der m / z-Wert, mit dem QualBrowser. Berechnen der Fläche unter der Kurve (AUC) für jeden Peak (siehe Abbildung 2A).
- Validierung jeder identifizierten Peptide, die Modifikationen durch visuelle Inspektion der MS / MS-Spektren unter Verwendung des QualBrowser (2B).
- Berechnen Sie die relative Häufigkeit für jeden modifizierte Peptid. Der relative Anreicherung von jeder Änderung in dem Chip-ten Material. Hinweis: relative Häufigkeit als ein Verhältnis zwischen der AUC jeder spezifischen modifizierten Peptids über die Summe der AUC aller modifizierten und unmodifizierten Formen des gleichen Peptids, berechnet, während die relativen Anreicherung als Verhältnis der relativen Häufigkeit der spezifischen Änderung in dem Chip über den Eingang (Fig. 2C).
- Quantitative Proteomik-Analyse von Proteinen innerhalb von Chromatin-Domänen zusammen verbunden
- Für Proteine, Identifizierung und Quantifizierung verwenden MaxQuant Paket(Http://www. Maxquant.org /) 30. Konfigurieren Sie die integrierte Suchmaschine "Andromeda" mit dem AndromedaConfig.exe 31 und stellen Sie die in Tabelle 3 aufgeführt Suchmaske.
- Incorporation Test
- Schätzen Sie den Grad der Aufnahme von Schwer Aminosäuren in Proteine in schwer markierten Chromatin-Eingang, mit MaxQuant Software wie folgt:
- Stellen Sie die wie in 6.2 beschrieben, aber das Deaktivieren der Option Wieder quantifizieren Parameter.
- Berechnen Sie die prozentuale Aufnahme folgender Formel zu nicht-redundanten Peptid-Verhältnisse:. Incorporation (%) = Verhältnis (H / L) / Verhältnis (H / L) + 1 x 100 (3B) Hinweis: Nehmen Sie nur dann, wenn Einarbeitung> 95 %.
- Schätzen Sie den Grad der Aufnahme von Schwer Aminosäuren in Proteine in schwer markierten Chromatin-Eingang, mit MaxQuant Software wie folgt:
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Representative Results
Chromatinimmunpräzipitation ist eine leistungsfähige Technik verwendet, um die Lokalisation eines Proteins oder eines Histonmodifikation entlang des Genoms Profil. In einem Äquivalent Proteomik ist der Chip von MS-basierte Proteomik gefolgt, um qualitativ und quantitativ die hPTMs, Histonvarianten und Chromatin-bindende Proteine, die mit der Modifikation oder Protein von Interesse immunpräzipitiert werden, als "Köder" verwendet, zu identifizieren. In der N-ChroP Ansatz in 1A Amerikaner Chip, in dem Chromatin ist mit MNase (Abbildung 1B) verdaut dargelegt, wird als Eingang verwendet, um von Groß Chromatin eine deutliche Funktionsbereich zu reinigen. Verdaut Chromatin Nukleosomen in Mono-angereichert ist mit einem spezifischen Antikörper inkubiert und die Proteine immungereinigt werden durch SDS-PAGE getrennt. In dem dargestellten Beispiel H3K9me3, Marker der stillen Chromatin 32,33, wird eingestellt, bis das Vorgehen. Die Auswahl basiert auf der Tatsache, dass sowohl die funktionelle Rolle alssowie einige seiner Protein-Interaktoren sind gut beschrieben. Darüber hinaus ist eine hochspezifische und effiziente Antikörper für Chip optimiert verfügbar 34 als auch durch visuelle Inspektion des Gels mit Coomassie, wobei die intakten Nukleosomen, die Core-Histone in der richtigen Stöchiometrie wird in geeigneten Mengen für die MS (1D angereichert bestätigt ).
Der Vergleich zwischen der Menge des H3K9me3 in der Durchfluss (FT) und Eingang (IN) vorliegt zeigt, dass etwa 50% der Region von Interesse immun, ohne die Gefahr einer Verzerrung durch die Anreicherung eines kleinen Subpopulation Chromatin (Abbildung 1C). MS verwendet wird, um die PTM Charakterisierung innerhalb der angereicherten Nukleosomen Zusammenarbeit verbunden: jeder Kern Histon unter Verwendung einer Ad-hoc-Protokoll, um eine "Arg-C, wie" Verdauung, in Polyacrylamidgel erreichen verdaut. In der Tat einerseits Arg C-Protease ist die beste für MS-Analyse hPTMs beil es produziert Peptide optimale Länge; Auf der anderen Seite ist es nicht effizient in Gel zu spalten. Um diese Einschränkung zu überwinden, unsere maßgeschneiderten Protokoll nutzt die chemische Alkylierung von Lysin durch Inkubation von Histon-Gel-Banden mit deuteriertem (D 6)-Essigsäureanhydrid, gefolgt von Trypsin Verdauung erreicht. Da Trypsin nicht spalten D 3-acetylierten Lysine, die resultierenden Peptide Mischung imitiert ein "Arg-C wie" Muster (1E).
Die Zugabe einer D 3-Acetyl-Rest zu einem Lysin produziert eine eindeutige Delta Masse von 45,0294 Dalton Unterscheidung zwischen nativen und chemisch hinzugefügt Acetylierung in MS. Darüber hinaus bietet D 3-Acetylierung zwei weitere Vorteile, die die Unterscheidung der isobaren modifizierte Peptide zu erleichtern: Erstens erfolgt die Alkylierung nur unmodifizierte und Mono-methylierte Lysine, aber nicht auf Di-und Tri-methylierte Reste; als solche modifizierten Peptide mit dem gleichen total Reihe von Änderungen, aber in verschiedenen Arrangements sind differentiell durch unterschiedliche Menge von D 3-Acetyl-Gruppen, die eindeutig m / z Verschiebungen erzeugen eingerichtet. Zweite, unterschiedliche Muster von D 3-Alkylierung verursachen leicht unterschiedliche Verweilzeiten in der Flüssigchromatographie an Umkehrphasensäule, die eine weitere Stufe der Trennung isobaren modifizierten Peptide 21 zu erzeugen.
Nach der Validierung aller hPTMs durch manuelle Inspektion der entsprechenden MS / MS-Spektren (Abbildung 2B), wird das Etikett kostenlos Quantifizierung in zwei Schritten: Zuerst berechnen wir die relative Häufigkeit von jeder Änderung mit der Signalintensität der unmodifizierten und modifizierten Spezies für das entsprechende Peptid, durch die Berechnung der extrahierten Ionenchromatogrammen (XIC), (2A und 2C, oberes Feld) gemessen wird; Zweitens ist die relative Anreicherung als Verhältnis zwischen der relativen Menge jedes modificatio geschätztenn in der ChIP-ed Oktamer und die entsprechende relative Häufigkeit von Eingang (2C, unteres Bild). Die Analyse der H3 (9-17)-Peptid zeigt die Anreicherung von di-und tri-methylierten K9, mit dem entsprechenden Verarmung der unmodifizierten und Mono-methylierte Form (Abbildung 2C). Damit ergibt sich als Positivkontrolle für die Antikörper-Spezifität kann der Co-Verein oder Abreicherung von allen anderen Änderungen bewertet werden, sowohl auf inner molekularer Ebene auf der gleichen H3 und auf der inter-molekularen Ebene, auf andere Co-angereicherten Histone innerhalb das gleiche Nukleosomen. Dies ermöglicht das Screening von hPTMs Übersprechen innerhalb der H3K9me3 Domänen, die so genannte "Heterochromatin modificome" (Fig. 2D) wird der signifikante Anreicherung von bekannten Markern mit Gen-Silencing zugeordnet, mit dem entsprechenden Verarmung der Marker mit Gen-Aktivierung verbunden beobachtet . Darüber hinaus werden neue Vereine wie die Anreicherung von H3K18m erkannte1.
Um für alle Proteine co-assoziierende im Heterochromatin Bildschirm wird die klassische Vernetzung Chip mit SILAC (Stable Isotope Kennzeichnung von Aminosäuren in Zellkultur), kombiniert (Abbildung 3A). In der SILAC Experiment werden die Lysin und Arginin (leichte Form) mit ihren isotopenmarkierten Analoga (schwere Form) im Kulturmedium ersetzt. Bei Zellen gezüchtet und Replikation in leichte und schwere Medien, sind die beiden unterschiedlich isotopen codierten Aminosäuren in Proteine eingebaut metabolisch, Lichterzeugung und schwere Formen der Proteine bzw. die unterscheidbar von MS sind, aufgrund einer spezifischen Δmass. Vor dem Start einer groß angelegten SILAC Experiment wird die Markierungseffizienz bewertet, die Berechnung der Einarbeitung Niveau, gemessen als prozentuale Anteil von Schwer Peptide gegenüber der Summe der schweren und leichten diejenigen, die nur schwer markierte Probe gefunden. Incorporation überlegen 95% für die schweren Arginin und eravy Lysin ist für eine genaue Quantifizierung von Proteinen (3B) erforderlich. Nach der Vernetzung von schweren und leichten Zellen wird Chromatin durch Ultraschall fragmentiert. SILAC wird in Verbindung mit einem Wettbewerb Assay mit einem Überschuss von löslichen fach H3-Peptid (K Qtar StGG), die Tri-Methylierung auf K9, um spezifische Interaktoren von H3K9me3 Hintergrund zu unterscheiden trägt eingesetzt. Die löslichen Peptid wird im Überschuß eines der beiden SILAC ChIP-Experimente, in denen sie die Bindungsfähigkeit des Antikörpers, also "konkurrierenden out" die Mehrheit der H3K9me3-Nukleosomen und dementsprechend alle spezifischen Interaktoren Sättigung zugegeben. In der anderen SILAC Kanal wird das konkurrierende Peptid nicht auf den Chip gegeben und die Immunpräzipitation erfolgt normalerweise. SILAC-Wettbewerb Experimente sind in der Regel in zweifacher Ausfertigung in so genannte "Forward" und "Reverse"-Formate, in denen die Konkurrenz mit dem überschüssigen löslichen Peptid von th schaltet geführtE schweren (H) zu den Licht (L) Chromatin-Proben. Dies führt umgekehrt komplementären Verhältnis SILAC Positionsanzeigen für anspruchsvolle echte von unspezifischen Bindemittel eingesetzt: Proteine spezifisch angereichert mit einer höheren Intensität in der schweren Form vor im Vergleich mit der Lichtform (Protein-Verhältnis H / L> 1) in dem Experiment sind, wo Über Peptid an den Lichtkanal (Forward) (4A, obere Tafel) gegeben; ein entgegengesetzter Trend (Protein-Verhältnis H / L <1) ist in der Reverse-Replik (Abbildung 4A, unteres Bild) beobachtet. Proteine, deren Intensität in der schweren und leichten Form sind ähnlich in der Vorwärts-und Rückwärts Experimente erzeugen ein konstantes Verhältnis nahe 1 und werden als Hintergrund (4B) klassifiziert.
Die Wahl der optimalen Überschuß fache für den löslichen Peptid ist wichtig und muß genau eingestellt werden. In der Regel setzen wir die richtigen Antikörper-to-Peptid-Anteil Durchführung einer Kompetitionsassay using serielle Verdünnungen von überschüssigem Peptid und Vergleichen der Ebene der "Köder" (Hauptmann / Protein) zwischen der positiven Steuerchip, wobei das Peptid nicht hinzugefügt wird, und die verschiedenen Serien Wettbewerb Chips, durch Western-Blot-oder MS. Im allgemeinen reduziert der etwa 90% der optimale Überschuß fache der Menge an Peptid HPTM / Protein in der immunpräzipitierten Materials. In der Tat, auf der einen Seite, je größer die Protein-Verhältnis erhalten wird, je höher die Unterscheidungskraft der SILAC; Andererseits kann ein zu hoher Sättigung durch das Peptid vollständig die spezifischen Bindemittel vom Antikörper zu vertreiben, so fehlt H / L-Verhältnisse für die Quantifizierung und die statistische Analyse führt. Für H3K9me3 Antikörper definierten wir das richtige Verhältnis durch die Messung der H / L-Verhältnis für das QTARK (ME3) StGG Peptid, in einem Wettbewerb in einem Testvortrag und wir haben diesen Wert als Maß für die Effizienz Wettbewerb (3C ).
Der Schnittpunkt der Zukunfts einx-Chip-Experimenten Rückwärts führt zur Identifizierung von 635 Proteinen in beiden Versuchen vorhanden und mit mindestens 2 Zählungen Verhältnis quantifiziert. Das Protokoll 2 Grundstück ihrer H / L-Verhältnisse stellen die so genannten "heterochromatome" (4C), wo die echten H3K9me3 Interaktoren sind eindeutig als den in den Top 40% der Proteine Verhältnis Distributionen (oberen rechten Quadranten des vorhandenen Proteine identifiziert das Streudiagramm und 4D).
Abbildung 1: Schematische Darstellung der N-ChroP Workflow A) Schema der Amerikaner Chip kombiniert mit MS-Analyse.. Chromatin aus Zellen mit MNase und der Anteil an mono Nukleosomen (S1) angereichert ist, unter Verwendung eines Anti-H3 immunpräzipitiert verdautK9me3 Antikörper. Immungereinigten Proteine werden durch SDS-PAGE getrennt und Histone sind im Gel verdaut mit einem Ad-hoc-Protokoll, um eine Arg-C-Verdau imitieren. Peptide werden durch Nano-LC-MS/MS analysiert. Histone PTMs identifiziert werden, durch manuelle Inspektion von MS / MS-Spektren validiert und quantifiziert B) im kleinen Maßstab MNase Test:. DNA auf einem 1% Agarose-Gel nach Chromatin Verdauung mit MNase zu verschiedenen Zeitablauf (links) gelöst; Groß MNase Verdauung:. DNA auf einem 1% Agarose-Gel nach 60 Minuten MNase Chromatin Verdauung und nach der Trennung der S1-Fraktion beschlossen, die Mono-Nukleosomen von S2-Fraktion, die Poly-Nukleosomen (rechts) C) Schätzung der Anreicherung / Abreicherung von unmodifizierten, Mono-, Di-und Tri-methylierten K9 in Durchfluss (FT) im Vergleich zum Eingang (IN). Histogramm stellt den Mittelwert ± SEM von drei unabhängigen Experimenten für jede Änderung. D) SDS-PAGE von Chromatin Eingangs-und Co-Immuno gereinigten Proteinen: Histone H3, H4, H2A und H2B sichtbar um und unterhalb der 17 kDa-Band, mit H3 und H2B Co-migrierenden (schwarze Quadrate) E) Jeder Kern Histon von beiden immun Nukleosomen und Eingabe sind chemisch alkylierten mit deuteriertem (. D 6)-Essigsäure-Anhydrid vor Trypsin-Behandlung, um eine "Arg-C wie" in Gel-Verdauung zu erhalten. Der D 6-Essigsäureanhydrid reagiert mit dem Epsilon-Aminogruppe von unmodifizierten und Mono-methylierte Lysine, aber nicht mit Di-methyliert, Tri-methylierte und acetylierte Lysinreste. Als Ergebnis wird die enzymatische Aktivität von Trypsin auf alle nativen und chemisch acetylierten Lysin blockiert, wodurch ein "Arg-C wie" Verdauungsmuster. Diese Zahl hat sich von 21 geändert wurde, anhand von Abbildung 1, Abbildung S1 und Abbildung S5 als Referenz. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
Figur 2:. Massenspektrometrie-Analyse des H3K9me3 "modificome" A) Gezoomte Massenspektren und extrahiert Ionenchromatogrammen (XIC) an der entsprechenden m / z-Wert konstruiert die 2 + aufladen unmodifizierten Mono-, Di-und Tri-methylierten K9 in der H3 (9-17)-Peptid, sowohl für Eingangs-und Chip-Proben. B) Vertreter MS / MS-Spektren mit CID-Fragmentierung. Die b-und y-Ionen-Ionen-Reihe zu ermöglichen, die Sequenz von H3 (9-17)-Peptid zu definieren und insbesondere die Lokalisierung tri-K9-Methylierung an Rückstand. C) relative Häufigkeit der verschiedenen Grad der Methylierung an der H3-K9 ( 9-17)-Peptid, indem die Fläche unter der Kurve (AUC) für jeden modifizierten Peptids durch die Summe der Flächen, die allen geschätzten beobachteten unmodified und modifizierte Formen dieser Peptide, in der Eingangs-und ChIP-ED Octamer. Histogramm stellt den Mittelwert ± SEM von drei unabhängigen Experimenten für jede Modifikation (oberes Feld). Relative Anreicherung von K9-Methylierungen in H3 (9-17)-Peptid. Die Anreicherung ist als log 2 Verhältnis zwischen der relativen Menge jedes Methylierung im Chip-ED Octamer als im Vergleich zu Eingangs ausgedrückt. Histogramm stellt die Mittelwerte ± SEM aus drei unabhängigen Experimenten (unteres Bild). D) Heatmap Zusammenfassung der Anreicherung von allen auf Histon H3, H4 und H2A identifiziert Co-Zuordnung hPTMs. Jede Zeile entspricht einer anderen Modifikation (nd werden nicht erkannt Änderungen). Diese Zahl hat sich von 21 geändert wurde, anhand von Abbildung 1, Abbildung 2, Abbildung 3 und Abbildung S10 als Referenz. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
Abbildung 3: Schematische Darstellung der X-ChroP Workflow A) Schema der Vernetzung ChIP kombiniert mit MS-Analyse.. Zellen in leichte und schwere Medien gewachsen sind fest mit Formaldehyd und Chromatin-Eingänge werden durch Ultraschall fragmentiert, um DNA-Fragmente zu generieren. In einer Forward-Einrichtung wird das beschallt schwer markierten Chromatin mit Anti-H3K9me3 Antikörper, während das Licht-markierten Chromatin mit dem gleichen Antikörper mit einem Überschuss von löslichen fach H3 Peptid, das K9me3 gesättigten inkubiert immunpräzipitiert. Immunpräzipitierte Proteine aus schweren und leichten Chromatin werden gesammelt, extrahiert und durch SDS-PAGE getrennt. Proteine werden mit Trypsin verdaut und Peptide werden durch Nano-LC-MS/MS. Analysiert B) Effizienz von SILAC Kennzeichnung ist die Berechnung der Aufnahme von Schwer lys überwachtine (Lys8) und Arginin (Arg10) in Proteine. In der Handlung, gleich 0.974 (grüne Linie) und 0.964 (rote Linie) auf. C) Vergrößerte Massenspektren bei der entsprechenden m / z-Wert des 2 + berechnen tri-methyliert ist der Median von Lysin und Arginin Peptide Dichteverteilung K9 in der H3 (9-17)-Peptid, sowohl für leichte und schwere Formen, in Ein-und ChIP-ed Oktamer. Während im Eingangs die Intensitäten von schweren und leichten Peptid sind in der Nähe ein, in der Vorwärts SILAC CHIP, ist die Intensität des Lichts Peptid viel niedriger als die der schweren Gegenstück, was auf einen effizienten Wettbewerb. D) SDS-PAGE von Licht (L) und schweren (H) gekennzeichnet Chromatin-Eingang und der Ko-immunpräzipitiert Material: die Fahrspur, die der ChIP-ed Material wird in zehn Scheiben (schwarze Linie) geschnitten, während nur zwei Scheiben Eingang zum Einbau Test-Analyse (analysiert blaue Linie). Diese Zahl hat sich von 21 geändert wurde, mit Abbildung 4 und Abbildung S6 als ReKonferenz. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
Abbildung 4: Massenspektrometrie Analyse der H3K9me3 "Interaktom". A) Repräsentative volle Spektren, die den SILAC-Paar entspricht Peptide von HP1 und Makro-2A-Proteine: die Verhältnisse H / L> 1 in der Vorwärts-Experiment (obere Felder), von einem Verhältnis H / L <1 in der Reverse-Replik gespiegelt (untere Felder), zeigen die spezifische Anreicherung dieser Proteine in Heterochromatin B) Vertreter volle Spektren mit SILAC-Paar entsprechend Peptid aus einem Protein Hintergrund:. H / L-Verhältnisse in Vorwärts-und Rückwärts Wiederholungen gleich 1 C) Quantifizierte Proteinen. sind distributed in einem Streudiagramm auf der Grundlage ihrer SILAC-Verhältnisse in Vorwärts-und Rückwärts-Experimente (x-und y-Achse sind); rot gestrichelten Linien den oberen 40% und 30% der Protein-Verhältnissen, wie angegeben. D) Protein-Verhältnisse Ausschüttungen aus Eingang (H / L-Verhältnis 1:1) (schwarz), Forward (blau) und Rücklauf (orange) X-ChroP Experimente; rot gestrichelten Linien den oberen 40% der Protein-Verhältnissen, wie Cutoffs gesetzt, um die echte Interaktoren zu wählen. Diese Zahl hat sich von 21 geändert wurde, mit 5 als Referenz. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
| Puffer für Abschnitt 2 | Zusammensetzung |
| Lysepuffer | 10% Saccharose, 0,5 mM EGTA, pH 8,0, 15 mM NaCl, 60 mM KCl, 15 mM HEPES, 0,5% Triton, 0,5 mM PMSF, 1 mM DTT, 5 mM NAF, 5 mM Na 3 VO 4, 5 mM NaButyrate, 5 mg / ml Aprotinin, 5 mg / ml Pepstatin A, 5 mg / ml Leupeptin |
| Saccharose-Kissen | 2 g Saccharose in 20 ml Lysispuffer |
| Digestion Buffer | 0,32 M Saccharose, 50 mM Tris-HCl pH 7,6, 4 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 0,1 mM PMSF |
| TE-Puffer | 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA |
| Dialysepuffer | 10 mM Tris-HCl pH 7,6, 1 mM EDTA, 0,5 mM PMSF, 5 mM NAF, 5 mM Na 3 VO 4, 5 mM NaButyrate, Protease-Inhibitoren-Cocktail |
| ChIP Verdünnungspuffer | 100 mM Tris HCl pH 7,6, 100 mM NaCl und 10 mM EDTA |
| Blocking Solution | 0,5% BSA in PBS |
| Waschpuffer | 50 mM Tris-HCl pH 7.6,10 mM EDTA |
| Protease-Inhibitoren | EDTA-freie Protease-Inhibitoren-Cocktail, 0,5 mM PMSF, 5 mM NAF, 5 mM Na3VO4, 5 mM NaButyrate |
| Ladepuffer | Orange Ladefarbstoff, 50% (v / v) Glycerin in H20 |
| Puffer für Abschnitt 3 | Zusammensetzung |
| Lysepuffer | 50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% Glycerin, 0,5% NP-40, 0,25% Triton-100, 0,5 mM PMSF, 5 mM NAF, 5 mM Na 3 VO 4, 5 mM NaButyrate, 5 mg / ml Aprotinin, 5 mg / ml Pepstatin A, 5 mg / ml Leupeptin |
| Waschpuffer | 10 mM Tris-HCl pH 8, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 0,5 mM PMSF, 5 mM NAF, 5 mM Na 3 VO 4, 5 mM NaButyrate, 5 mg / ml Aprotinin, 5 mg / ml Pepstatin A , 5 mg / ml Leupeptin |
| ChIP Inkubationspuffer | 10 mM Tris-HCl pH 8, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,5 mM EGTA, 0,1% Natriumdesoxycholat, 0,5% Natrium lauroylsarcoside, 0,5 mM PMSF, 5 mM NAF, 5 mM Na 3 VO 4, 5 mM NaButyrate, 5mg / ml Aprotinin, 5 mg / ml Pepstatin A, 5 mg / ml Leupeptin |
| Waschpuffer 2 | 20 mM Tris-HCl pH 7,6, 2 mM EDTA, 0,1% SDS, 1% Triton-100 |
| Loading Sample Buffer | 250 mM Tris-HCl pH 8,8, 0,5 M b-Mercaptoethanol, 2% SDS |
| Puffer für Abschnitt 4 | Zusammensetzung |
| Alkylierung Buffer | 55 mM Jodacetamid in 50 mM NH 4 HCO 3 |
| Reduction Buffer | 10 mM Dithiothreitol in 50 mM NH 4 HCO 3 |
| Extraktionspuffer | 30% ACN und 3% TFA in ddH 2 0 |
Tabelle 1. Puffer Zusammensetzung.
| Tuning Erwerb Datei | Parameter |
| FT Voll scan | Akkumulation Zielwert 1 x 10 6; maximale Abfüllzeit 1000 ms |
| IT-MSn | Akkumulation Zielwert 10 x 10 4; maximale Befüllungszeit 150 ms |
| Erwerb Einstellung | Parameter |
| Elektrospannung | 2,4 kV |
| Mantel-und Hilfsgasstrom | Nicht |
| Ionentransferkapillare Temperatur | 200 ° C |
| Dynamische Ausschluss | bis zu 500 Vorläuferionen für 60 sec bei MSMS |
| Ausschluss Masse Breite | 10 ppm |
| Normierte Kollisionsenergie mit Breitbandaktivierungsmodus | 35% |
| Ionenauswahlschwellen | 100 zählt |
| Aktivierung q | 0,25 |
| Activation Zeit | 30 msec |
Tabelle 2. MS-Einstellungen.
| Mascor Deamon Suche | Parameter | Aufzeichnungen |
| Datenbank | hängt auf den Organismus (dh für HeLa-Zellen: Mensch-Datenbank, Version 3.68, 87.061 Einträge) | |
| Enzym | Arg-C | Arg-C spalten an der C-terminalen Argininreste aller |
| Variable Änderungen | Acetyl-(K), Oxidation (M), D 3-Acetylierung (K), Methyl-D 3 - Acetyl (K), Dimethylsulfoxid (k), Trimethylaluminium (K) | Acetyl-[42,010 Da], Oxidation [15.995 Da], D3-Acetylierung [45,0294 Da], Methyl-D3-Acetyl [Summe von 14,016 Da und 45,0294 Da], Dimethylsulfoxid [28,031], Trimethyl [42,046 Da] |
| Verpasste Spaltungen | bis zu 2 | |
| Die Massengenauigkeit der Elternionen bei der Suche | 10 ppm | |
| Massengenauigkeit für CID MSMS | 0,5 Da | |
| MaxQuant Suche | Parameter | Aufzeichnungen |
| Datenbank | abhängig von dem Organismus | |
| Enzym | Trypsin / P | Trypsin spaltet an dem C-Terminus aller Lysin-und Argininresten. Die Suche wird ausgeführt unter in Betracht, daß die Effizienz von Trypsin zu Lysin und Arginin spaltet reduziert wird, wenn die nächste Aminosäure Prolin (/ P). |
| Fest Modifikation | Carbamidomethylierung | |
| Variable Änderungen | N-Acetyl-(Protein), Oxidation (M) | |
| Verpasste Spaltungen | bis zu 3 | |
| Label-Parameter | Lys8 und Arg10 | |
| Maximale Etiketten amminoacid | 3 für Trypsin | |
| Massengenauigkeit der Elternionen in der Anfangs "Andromeda"-Suche | 20 ppm | |
| Die Massengenauigkeit der Elternionen in der Haupt "Andromeda"-Suche | 6 ppm | |
| Massengenauigkeit für CID MSMS | 0,5 Da (sechs Top-Spitzen per100 Da) | |
| Peptide False Discovery Raten (FDR) | 0,01 | |
| Protein falsch Entdeckung Raten (FDR) | 0,01 | Einstellen des FDR für Peptid-und Protein auf 0,01 bedeutet, daß beide Peptide und Proteine identifiziert werden voraussichtlich 1% falsch positiver enthalten. Dieser Wert wird mit einem Ziel-Köder-Datenbank geschätzt |
| Maximale hinteren error Wahrscheinlichkeit (PEP) | 1 | PEP ist die Wahrscheinlichkeit, dass ein Individuum Peptid ist ein falsch positives Spiel. PEP gleich 1 in Ihrer Einstellung bedeutet, dass alle Peptide wird unabhängig von der PEP genommen werden somit Filterung erfolgt ausschließlich auf der Grundlage FDR. |
| Mindestpeptidlänge | 6 | |
| Mindestanzahl von Peptiden | 2 | |
| Mindestanzahl von einzigartigen Peptiden | 1 | |
| Mit nur unmodifizierte Peptide und Oxidation (M) / Acetyl-(Protein-N-Term) | aktivieren Sie die Option | Peptide mit Modifikationen sollen in der Regel nicht für die Proteinquantifizierung gezählt werden, da ihre Fülle nicht das Verhältnis des entsprechenden Proteins widerspiegeln. |
| Mindestverhältnis Zahl | 1 | |
| "Match zwischen den Läufen" | aktivieren Sie die Option |
Tabelle 3. Datenanalyse.
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Discussion
Wir haben kürzlich ChroP, eine quantitative Strategie für die großtechnische Charakterisierung der Proteinkomponenten von Chromatin. ChroP vereint zwei komplementäre Ansätze in der epigenetischen Bereich verwendet, Chip-und MS, profitieren von ihren Stärken und Überwindung ihrer jeweiligen Beschränkungen. ChIP tief Sequenzierung (ChIP-Seq) gekoppelt ermöglicht die genomweite Kartierung der Histon-Modifikationen bei der Auflösung von wenigen 35 Nukleosomen. Obwohl ihre Empfindlichkeit von Vorteil, sind Antikörper-basierte Assays in ihrer Fähigkeit, ähnliche Modifikationen unterscheiden und in der Zerlegung des kombinatorischen Aspekt der Histon-Code 36 beschränkt. Auf der anderen Seite, während MS bietet eine umfassende und unvoreingenommene Analyse der hPTMs, einzeln und in Kombinationen 9, hat es bisher auf die Analyse der Groß Chromatin angewendet wurde, mit daraus resultierenden Mangel an Informationen über die Locus-spezifischen PTMs prasselt. Wir beschäftigen eine modifizierte Version des ChIP funktionell zu isolierenverschiedene Chromatindomänen und Massenspektrometrie, um die Histon PTM Muster und die nicht-Histon-Proteine spezifisch charakterisieren Co-angereichert ist.
Durch die Verwendung von N-ChroP die Analyse der hPTMs mit H3K9me3 Zusammenarbeit zugeordnet ergab eine signifikante Anreicherung von Markern mit stillen Chromatin assoziiert und eine Abreicherung von Modifikationen mit aktivem Chromatin assoziiert. Die Vereinbarung dieser Ergebnisse mit früheren Studien 37 erwies sich die Robustheit der Strategie. In X-ChroP H3K9me3 von Domains, die SILAC-basierte Untersuchung der Chromatin-interagierenden Proteinen bestätigt einige bisher beschriebenen Interaktionspartner, wodurch die Methode validiert.
ChroP präsentiert zwei Haupt ursprünglichen Aspekte in Bezug auf die Strategien bereits zur Verfügung, um die Proteom-Komponente des Chromatins zu untersuchen: zum Beispiel die Möglichkeit, intermolekularen Synergien zwischen unterschiedlichen Modifikationen Dekoration Histone innerhalb der gleichen intakt Mono-nucl zeigeneosome durch N-ChIP gereinigt; Sekunden die Chance, um die spezifische Kompartimentierung von Histon-Varianten und Linker-Histon-Subtypen zu beurteilen. Da die Untersuchung von Histon-Varianten, die durch den Mangel an guter Qualität Reagenzien (dh Antikörper) zurückgehalten wird, entsteht ChroP als einzigartiges Werkzeug zur Verfügung, um ihre Lage und funktionelle Rolle zu beurteilen.
Eine Einschränkung des ChroP in seiner aktuellen Lügen gesetzt in der Peptid-centric ("Bottom-up")-Ansatz in MS verwendet wird, mit Histonen in kurze Peptide und die daraus folgende Beeinträchtigung bei der Erfassung der Langstrecken-Verbindung zwischen Änderungen verdaut. Als solche ist die Konjugation mit ChroP "Bottom-up"-MS-Analyse ermöglicht eine teilweise Prüfung der kombinatorischen Aspekt der Histon-Code. Wir sehen, dass die Umsetzung von alternativen MS Strategien, wie "Middle-und Top-Down" für hPTMs Mapping auf längere Peptide (> 20 aa) bis auf intakte Proteine 38-40, überwundenDiese Zurückhaltung.
Insgesamt, N-und X-ChroP ergänzen sich sehr gut mit der Möglichkeit der Zerlegung der Komplexität der Chromatinstruktur bei funktionell unterschiedlichen Domänen, mit einer Auflösung von Mono-Oligo-Nukleosomen. Wir sagen voraus, dass ChroP nützlich ist auch die Zusammensetzung der Chromatin-Regionen durch die Anwesenheit von bestimmten nicht-Histon-Proteine markiert Kern charakterisieren, beispielsweise Transkriptionsfaktoren (TF). Zusätzlich kann ChroP in Funktionsstudien verwendet werden, um die dynamische Zusammensetzung von Chromatin während der globalen Transkriptionsaktivierung Karte an bestimmten Loci von verschiedenen Störungen, zum Beispiel. Aus diesen Gründen ergibt sich ChroP als zusätzliches nützliches Werkzeug im Arsenal der analytischen Strategien zur Verfügung, um die Proteom-Landschaft des Chromatins zu sezieren.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde ursprünglich in Mol Cell Proteomics veröffentlicht. Soldi M. und T. Bonaldi Die Proteomik Untersuchung der Chromatin Funktions Domains enthüllt Novel Synergismen zwischen Distinct Heterochromatin-Komponenten MCP. 2013; 12: 64-80. © die amerikanische Gesellschaft für Biochemie und Molekularbiologie. Wir danken Roberta Noberini (Italian Institute of Technology und IEO, Italien) für das kritische Lesen des Manuskripts. TB Arbeit wird durch Zuschüsse aus dem Giovanni Armenise Harvard-Stiftung Career Development Program, der italienischen Vereinigung für Krebsforschung und dem italienischen Gesundheitsministerium unterstützt. MS Arbeit wurde durch ein Stipendium FIRC unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Lonza | BE12-614F | |
| FBS | Invitrogen | 10270-106 | |
| SILAC DMEM | M-Medical | FA30E15086 | |
| Dialyzed FBS | Invitrogen | 26400-044 | |
| Lysine 0 (12C6 14N2 L-lysine) | Sigma Aldrich | L8662 | |
| Arginine 0 (12C6 14N4 L-arginine) | Sigma Aldrich | A6969 | |
| Lysine 8 (13C6 15N2 L-lysine) | Sigma Aldrich | 68041 | |
| Arginine 10 (13C6 15N4 L-arginine) | Sigma Aldrich | 608033 | |
| Micrococcal Nuclease | Roche | 10 107 921 001 | |
| Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 04 693 132 001 | |
| Spectra/Por 3 dialysis tubing, 3.5K MWCO, 18mm flat width, 50 foot length | Spectrumlabs | 132720 | |
| QIAquick PCR purification kit | QIAGEN | 28104 | |
| Anti-Histone H3 tri-methylated K9-ChIP grade | Abcam | ab8898 | |
| Histone H3 peptide tri-methyl K9 | Abcam | ab1773 | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 100.04D | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel | Invitrogen | NP0335BOX | |
| Colloidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | |
| LDS Sample Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| Formaldheyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Aceti anhydride-d6 | Sigma Aldrich | 175641-1G |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Formic Acid | Sigma Aldrich | 94318-50ML-F | |
| Iodoacetamide ≥99% (HPLC), crystalline | Sigma Aldrich | I6125 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 43815 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin, Frozen 100 μg (5 × 20 μg) | Promega | V5113 | |
| Nanospray OD 360μm x ID 75μm, tips ID 8 μm uncoated Pk 5 | Microcolumn Srl | FS360-75-8-N-5-C15 | |
| ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 µm 15% C | Dr. Maisch GmbH | r13.aq. | |
| Carbon extraction disk, 47 mm | Agilent Technologies | 12145040 | |
| Cation extraction disk | Agilent Technologies | 66889-U |
References
- Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184, 868-871 (1974).
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Res. 21, 381-395 (2011).
- Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers. Nat Struct Mol Biol. 14, 1025-1040 (2007).
- Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293, 1074-1080 (2001).
- Spotswood, H. T., Turner, B. M. An increasingly complex code. J Clin Invest. 110, 577-582 (2002).
- Soldi, M., Cuomo, A., Bremang, M., Bonaldi, T. Mass spectrometry-based proteomics for the analysis of chromatin structure and dynamics. Int J Mol Sci. 14, 5402-5431 (2013).
- Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry. J Proteomics. 75, 3419-3433 (2012).
- Britton, L. M., Gonzales-Cope, M., Zee, B. M., Garcia, B. A. Breaking the histone code with quantitative mass spectrometry. Expert Rev Proteomics. 8, 631-643 (2011).
- Taverna, S. D., et al. Long-distance combinatorial linkage between methylation and acetylation on histone H3 N termini. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2086-2091 (2007).
- Garcia, B. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 11, 66-73 (2007).
- Villar-Garea, A., Imhof, A. The analysis of histone modifications. Biochim Biophys Acta. 1764, 1932-1939 (2006).
- Plazas-Mayorca, M. D., et al. One-pot shotgun quantitative mass spectrometry characterization of histones. J Proteome Res. 8, 5367-5374 (2009).
- Ohta, S., et al. The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics. Cell. 142, 810-821 (2010).
- Vermeulen, M., et al. Selective anchoring of TFIID to nucleosomes by trimethylation of histone H3 lysine 4. Cell. 131, 58-69 (2007).
- Vermeulen, M., et al. Quantitative interaction proteomics and genome-wide profiling of epigenetic histone marks and their readers. Cell. 142, 967-980 (2010).
- Bartke, T., et al. Nucleosome-interacting proteins regulated by DNA and histone methylation. Cell. 143, 470-484 (2010).
- Dejardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic Loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
- Lambert, J. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A novel proteomics approach for the discovery of chromatin-associated protein networks. Mol Cell Proteomics. 8, 870-882 (2009).
- Soldi, M., Bonaldi, T. The proteomic investigation of chromatin functional domains reveals novel synergisms among distinct heterochromatin components. Mol Cell Proteomics. 12, 764-780 (2013).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 1, 2856-2860 (2006).
- Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal Chem. 68, 850-858 (1996).
- Bonaldi, T., Regula, J. T., Imhof, A. The use of mass spectrometry for the analysis of histone modifications. Methods Enzymol. 377, 111-130 (2004).
- Cuomo, A., Moretti, S., Minucci, S., Bonaldi, T. SILAC-based proteomic analysis to dissect the "histone modification signature" of human breast cancer cells. Amino Acids. 41, 387-399 (2011).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nat Protoc. 2, 1896-1906 (2007).
- Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Anal Chem. 75, 663-670 (2003).
- Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Mol Cell Proteomics. 3, 608-614 (2004).
- Jung, H. R., Pasini, D., Helin, K., Jensen, O. N. Quantitative mass spectrometry of histones H3.2 and H3.3 in Suz12-deficient mouse embryonic stem cells reveals distinct, dynamic post-translational modifications at Lys-27 and Lys-36. Mol Cell Proteomics. 9, 838-850 (2010).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26, 1367-1372 (2008).
- Cox, J., et al. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. J Proteome Res. 10, 1794-1805 (2011).
- Lachner, M., O'Carroll, D., Rea, S., Mechtler, K., Jenuwein, T. Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins. Nature. 410, 116-120 (2001).
- Bannister, A. J., et al. Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain. Nature. 410, 120-124 (2001).
- Ram, O., et al. Combinatorial patterning of chromatin regulators uncovered by genome-wide location analysis in human cells. Cell. 147, 1628-1639 (2011).
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129, 823-837 (2007).
- Beck, H. C. Mass spectrometry in epigenetic research. Methods Mol Biol. 593, 263-282 (2010).
- Ernst, J., Kellis, M. Discovery and characterization of chromatin states for systematic annotation of the human genome. Nat Biotechnol. 28, 817-825 (2010).
- Tipton, J. D., et al. Analysis of intact protein isoforms by mass spectrometry. J Biol Chem. 286, 25451-25458 (2011).
- Young, N. L., et al. High throughput characterization of combinatorial histone codes. Mol Cell Proteomics. 8, 2266-2284 (2009).
- Boyne, M. T. 2nd, Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. Precise characterization of human histones in the H2A gene family by top down mass spectrometry. J Proteome Res. 5, 248-253 (2006).
