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Biology

ChroP दृष्टिकोण chromatin का ठिकाना विशिष्ट प्रोटिओमिक परिदृश्य काटना चिप और मास स्पेक्ट्रोमेट्री जोड़ती

Published: April 11, 2014 doi: 10.3791/51220
Automatic Translation
1, 1
1Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology

Summary

देशी संयोजन और उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ chromatin immunoprecipitation crosslinking करके, ChroP दृष्टिकोण histone संशोधनों, वेरिएंट और कार्यात्मक अलग chromatin डोमेन में तालमेल न histonic प्रोटीन की समग्र प्रोटिओमिक वास्तुकला काटना में सक्षम बनाता है.

Abstract

Chromatin विभिन्न डीएनए निर्भर प्रक्रियाओं को नियंत्रित करता है कि डीएनए और प्रोटीन से बना एक अत्यधिक गतिशील nucleoprotein जटिल है. विशिष्ट क्षेत्रों में chromatin संरचना और समारोह प्रतिलेखन कारक है, और डीएनए मेथिलिकरण सहित histone बाद translational संशोधनों (hPTMs) और वेरिएंट, chromatin बाध्यकारी प्रोटीन की स्थानीय संवर्धन द्वारा नियंत्रित किया जाता है. विशिष्ट कार्यात्मक क्षेत्रों में chromatin संरचना की प्रोटिओमिक लक्षण वर्णन अब तक मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) द्वारा बाद में गहराई से विश्लेषण के लिए उपयुक्त पवित्रता और राशि में इस तरह के डोमेन को समृद्ध करने के लिए कुशल प्रोटोकॉल के अभाव के कारण बाधा उत्पन्न किया गया. हम कर रहे हैं, यहाँ एक प्रारंभिक chromatin immunoprecipitation जिसका सुविधाओं, hPTMs के संदर्भ में, वेरिएंट और सह जुड़े गैर histonic प्रोटीन अलग chromatin क्षेत्रों को अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है जिससे ChroP (Chro मतीन पी roteomics) नामक एक नए डिजाइन chromatin प्रोटिओमिक्स रणनीति, का वर्णन एमएस द्वारा विश्लेषण किया गया. हम वह उदाहरण देकर स्पष्ट करनाhistone H3 पर लाइसिन 9 की त्रिकोणीय मेथिलिकरण की उपस्थिति द्वारा चिह्नित transcriptionally चुप heterochromatic क्षेत्रों के संवर्धन और विश्लेषण, के लिए ChroP की स्थापना कर रहे हैं. प्राप्त परिणामों को अच्छी तरह से हेट्रोक्रोमैटिन proteome निस्र्पक और chromatin के विशिष्ट प्रोटीन निर्धारकों बातचीत और ठिकाना विशिष्ट संरचनात्मक और कार्यात्मक विन्यास की स्थापना के लिए तालमेल कायम कैसे को समझने के लिए एक शक्तिशाली विश्लेषणात्मक रणनीति के रूप में यह साबित करने में ChroP की क्षमता प्रदर्शित करता है.

Introduction

Chromatin सभी डीएनए की मध्यस्थता की प्रक्रिया के लिए प्राथमिक टेम्पलेट के रूप में शामिल है कि एक अत्यधिक गतिशील nucleoprotein जटिल है. nucleosome chromatin की बुनियादी दोहराया इकाई है और डीएनए के 147 बीपी 1,2 लिपटे रहे हैं, जो चारों ओर प्रत्येक विहित histone H2A, H2B, H3 और एच 4, के दो अणुओं से युक्त प्रोटीन octameric कोर के होते हैं. सभी कोर histones एक गोलाकार डोमेन और nucleosome बाहर protrudes कि एक लचीला एन टर्मिनल "पूंछ" के रूप में संरचित कर रहे हैं. Chromatin संरचना और गतिशीलता को विनियमित करने के लिए प्रमुख तंत्र में से एक मुख्य रूप से histones 3,4 के एन टर्मिनी पर होते हैं जो सहसंयोजक बाद translational संशोधनों (PTMs) पर आधारित है. Histone संशोधनों histones डीएनए के बीच या nucleosomes के बीच संपर्कों को बदलकर, उच्च आदेश chromatin संरचना में फेरबदल, और इस प्रकार डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन (सीआईएस तंत्र) की पहुंच को नियंत्रित करने से या तो कार्य कर सकते हैं, या dockin के रूप में अभिनय द्वारानियामक प्रोटीन के लिए, या तो एकल इकाइयों, या multimeric परिसरों में एम्बेडेड के रूप में जी साइटों. इस तरह के विनियमन प्रोटीन विभिन्न तरीकों से अपनी समारोह लागू कर सकते हैं: सीधे जीन अभिव्यक्ति (यानी ट्रेजरी प्रोटीन) modulating द्वारा, या nucleosome स्थिति (यानी chromatin परिसरों remodeling) बदलकर या अन्य histone अवशेष (मिथाइल ट्रांस्फ़्रेज़ या साथ यानी प्रोटीन एसिटाइल संशोधित करके ट्रांस्फ़्रेज़ गतिविधि) (ट्रांस तंत्र) 5. विशिष्ट chromatin loci में अलग PTM पैटर्न क्लस्टर अलग साइटों पर विभिन्न संशोधनों अंतर्निहित डीएनए के कार्यात्मक राज्य में मध्यस्थता एक आणविक कोड उत्पन्न करने के लिए तालमेल कायम हो सकता है कि परिकल्पना के विस्तार के लिए नेतृत्व कि अवलोकन. "Histone कोड परिकल्पना" के वर्षों में बड़े आम सहमति हासिल की है लेकिन इसके प्रयोगात्मक सत्यापन तकनीकी सीमाओं 6,7 द्वारा वापस आयोजित किया गया है.

मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) आधारित प्रोटिओमिक्स एक के रूप में उभरा हैशक्तिशाली उपकरण histone संशोधन पैटर्न नक्शा करने के लिए और chromatin बाध्यकारी प्रोटीन 8 चिह्नित करने के लिए. एमएस एक पेप्टाइड की प्रायोगिक और सैद्धांतिक जन के बीच एक विशिष्ट Δmass के रूप में एक संशोधन का पता लगाता है. व्यक्तिगत histones के स्तर पर, एमएस उन्हें 9-14 के बीच नए संशोधनों और खुलासा interplays का पता लगाने की अनुमति, PTMs नक्शा करने के लिए एक निष्पक्ष और व्यापक तरीका प्रदान करता है.

हाल के वर्षों में, रणनीतियों के एक नंबर बरकरार mitotic क्रोमोसोम 15, घुलनशील hPTM बाध्यकारी प्रोटीन 16-18 की पहचान और विशिष्ट chromatin क्षेत्रों का अलगाव और विश्लेषण के लक्षण वर्णन सहित chromatin की प्रोटिओमिक रचना काटना करने के लिए विकसित किया गया है (यानी telomeres) 19,20. हालांकि, histone PTMs, वेरिएंट, और chromatin जुड़े प्रोटीन के बीच ठिकाना विशिष्ट सहक्रियाओं की जांच अभी भी अधूरी है. यहाँ, हम (ChroP नाम के एक नए दृष्टिकोण का वर्णनहम कुशलतापूर्वक कार्यात्मक अलग chromatin डोमेन चिह्नित करने के लिए विकसित किया है कि Chro मतीन पी roteomics) 21,. यह दृष्टिकोण समृद्ध नमूने के कुशल एमएस आधारित प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए chromatin immunoprecipitation (चिप), epigenetic अनुसंधान में इस्तेमाल एक अच्छी तरह से स्थापित प्रोटोकॉल, adapts. हम निवेश और एमएस द्वारा संबोधित प्रश्न के रूप में इस्तेमाल chromatin के प्रकार पर निर्भर करता है, दो अलग अलग प्रोटोकॉल विकसित किया है; विशेष रूप से: MNase साथ पचा unfixed देशी chromatin की 1) चिप मोनो nucleosomes शुद्ध करने के लिए और सह जोड़ hPTMs (एन ChroP) काटना कार्यरत है; 2) sonication द्वारा खंडित Crosslinked chromatin की चिप प्रोटीन (एक्स ChroP) बाध्यकारी सभी सह समृद्ध बनाने chromatin चिह्नित करने के लिए एक SILAC आधारित interactomics रणनीति के साथ संयोजन में प्रयोग किया जाता है. हम यहाँ immunoprecipitation कदम के लिए चारे के रूप में H3K9me3 का उपयोग, हेट्रोक्रोमैटिन को समृद्ध और अध्ययन के लिए एन और एक्स ChroP के संयोजन वर्णन. ChroP का उपयोग बढ़ाया जा सकता हैइस प्रकार epigenetics में विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए रास्ता साफ अलग chromatin पर क्षेत्रों, या एक अलग कार्यात्मक राज्य के संक्रमण के दौरान एक ही क्षेत्र के भीतर chromatin संरचना में परिवर्तन या तो अध्ययन करने के लिए.

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Protocol

1. सेल संस्कृति

  1. देशी चिप के लिए मानक माध्यम
    1. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 1% Glutamine, 1% पेन / Strep और 10 मिमी HEPES पीएच 7.5 के साथ पूरक Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) में HELA कोशिकाओं बढ़ो.
  2. चिप crosslinking के लिए SILAC लेबलिंग
    1. 10% dialyzed FBS, 1% Glutamine, 1% पेन / Strep, 10 मिमी HEPES पीएच 7.5 और प्रकाश एल lysine (लिस 0) और एल या तो साथ पूरक लाइसिन और arginine के समाप्त SILAC DMEM मध्यम में HELA कोशिकाओं, बढ़ो arginine (Arg 0) या उनके भारी समकक्षों, एल Lysine (लिस 8) और एल arginine (Arg 10) (सामग्री तालिका), क्रमशः 73 मिलीग्राम / एल और 42 मिलीग्राम / एल, के अंतिम सांद्रता में.
    2. पूरा आइसोटोप कोडित अमीनो एसिड समावेश सुनिश्चित करने के लिए SILAC माध्यम में आठ पीढ़ियों के लिए कोशिकाओं को विकसित. वे एसी में उन्हें बोने, 1.0-1.5 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक घनत्व पर पहुँचने पर, हर दो दिन कोशिकाओं दर्राoncentration 5 10 एक्स 3 की कोशिकाओं / एमएल.
    3. SILAC मध्यम के गरीब रचना से हो सकता है कि शरीर क्रिया विज्ञान से किसी भी संभावित परिवर्तन व्यक्तित्व प्रदान करने SILAC माध्यम से कोशिकाओं के विकास और व्यवहार्यता का मूल्यांकन; ऐसा करने के लिए:
      1. दिखने में कोशिकाओं लेबलिंग के दौरान हर दिन खुर्दबीन पर आकारिकी का निरीक्षण किया.
      2. मानक मध्यम बनाम SILAC में बढ़ कोशिकाओं की कोशिकाओं और साजिश विकास घटता गणना.

2. निवासी chromatin immunoprecipitation (एन चिप)

  1. संवर्धित कोशिकाओं से नाभिक तैयारी
    1. प्रयोग प्रति 1-2 x 10 8 unlabeled HeLaS3 कोशिकाओं का प्रयोग करें. हार्वेस्ट कोशिकाओं, 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 340 XG पर 50 मिलीलीटर ट्यूब और अपकेंद्रित्र में 50 x 10 6 कोशिकाओं की विभाज्य कर ठंडा पीबीएस के साथ उन्हें धो लो.
    2. 8 मिलीलीटर lysis बफर (1 टेबल) में प्रत्येक सेल गोली Resuspend और एक घूर्णन पहिया पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेते हैं. सीए डालोrefully प्रत्येक सेलुलर cytoplasm से नाभिक अलग करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 3270 XG पर एक स्विंग बाहर रोटर, में एक सुक्रोज तकिया (1 टेबल) और अपकेंद्रित्र पर lysate.
    3. , Supernatants त्यागें परमाणु छर्रों रखने के लिए और प्रत्येक धोने में सतह पर तैरनेवाला त्यागें, centrifugation द्वारा ठंडा पीबीएस में दो बार उन्हें धोने.
  2. Micrococcal Nuclease (MNase) पाचन (छोटे पैमाने) और पाचन के बाद chromatin की गुणवत्ता नियंत्रण
    1. 1 मिलीलीटर पाचन बफर (1 टेबल) में धोया परमाणु गोली Resuspend; 500 μl के दो aliquots में विभाजित है और बर्फ पर रख.
    2. एक विभाज्य की 260 एनएम ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) को मापने, 0.2% सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) में 1:200 पतला नोट:. आयुध डिपो = 1 chromatin डीएनए के बारे में 50 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर से मेल खाती है. आमतौर पर, 2 एक्स 10 8 कोशिकाओं से शुरू, ओवर ड्राफ्ट 40-60 की रेंज में है.
    3. , नाभिक के 1% लो 0 के अंतिम एकाग्रता के लिए MNase एंजाइम जोड़ें.005 यू एंजाइम / नाभिक के μl और अलग समय चूकों (0, 10, 20, 40, 60 मिनट) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
    4. हर समय बिंदु पर, पच नाभिक के 4 μl इकट्ठा करने और MNase प्रतिक्रिया को रोकने के लिए 1 मिमी EDTA जोड़ें. बर्फ पर रखें.
    5. पीसीआर शुद्धि किट से डीएनए के नमूने निकालने और 50 μl ते बफर (1 टेबल) में उन्हें elute.
    6. , प्रत्येक डीएनए नमूने के 20 μl लो बफर (1 टेबल) लोड हो रहा है 10 μl जोड़ें और 1% पर नमूने लोड (w / v) एक आकार नियंत्रण के रूप में पीसीआर मार्कर के साथ ethidium ब्रोमाइड, जिसमें agarose जेल.
    7. MNase ऊष्मायन द्वारा उत्पादित chromatin nucleosome सीढ़ी का मूल्यांकन पाचन की जाँच करें.
    8. तैयारी में मोनो nucleosomes के प्रसार पर आधारित, पाचन के लिए इष्टतम समय चुनें. . आमतौर पर MNase पाचन की इष्टतम समय 60 मिनट (चित्रा 1 बी, बाएं पैनल) है नाभिक के एंजाइम / μl के 0,005 यू के लिए नोट: digesti का इष्टतम MNase एकाग्रता / समयपर वांछित सेल प्रकार पर और nucleosomes खिंचाव के आकार के आधार पर समायोजित किया जा सकता है.
  3. Large-scale/preparative MNase पाचन और घुलनशील chromatin अंशों की वसूली
    1. प्रत्येक विभाज्य जोड़ें नाभिक के एंजाइम / μl के 0,005 यू के अंतिम एकाग्रता के लिए इसी 5 μl MNase (2.2.1 देखें); धीरे मिश्रण और (छोटे पैमाने पर परीक्षण के आधार पर अनुकूलित समय अंतराल के लिए या सामान्य रूप में,) 60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
    2. प्रतिक्रिया बंद करो और बर्फ पर रखने के लिए 1 मिमी EDTA जोड़ें. 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 7800 XG पर centrifugation द्वारा पचा नाभिक गोली. एक नया ट्यूब में supernatants (अंश S1) हस्तांतरण और 4 डिग्री सेल्सियस नोट में स्टोर: S1 मोनो nucleosomes शामिल chromatin की पहली घुलनशील अंश शामिल हैं. प्रोटीज अवरोधक (1 टेबल) जोड़ें.
    3. ध्यान resuspend 1 मिलीलीटर डायलिसिस बफर (1 टेबल) में छर्रों और 4 डिग्री सेल्सियस (सी में रात भर dialyzeडायलिसिस ट्यूब का बंद यूटी) 3.5 केडीए है, लगातार हल्के सरगर्मी के साथ 3 एल डायलिसिस बफर में. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 7800 XG पर dialyzed सामग्री और अपकेंद्रित्र लीजिए एक नया Eppendorf ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला (S2 अंश) हस्तांतरण और 4 डिग्री सेल्सियस नोट में स्टोर: S2 शामिल MNase पाचन सीमा के आधार पर EPTA-nucleosomes, डि लिए.
  4. Immunoprecipitation पहले chromatin की गुणवत्ता नियंत्रण
    1. (एक NanoDrop प्रणाली में 260 एनएम आयुध डिपो को मापने के द्वारा मात्रा) S1 और S2 chromatin अंशों की 5 ग्राम को इसी एक विभाज्य ले लो. पीसीआर शुद्धि किट से डीएनए निकालने और 50 μl ते बफर (1 टेबल) में elute.
    2. , S1 और S2 डीएनए के 20 μl लो बफर (1 टेबल) लोड हो रहा है 10 μl के साथ मिश्रण और (w / v) agarose जेल 1% पर उन्हें लोड. गुणवत्ता और nucleosomes सीढ़ी के दृश्य निरीक्षण से MNase पाचन की दक्षता की जांच करें ध्यान दें:. अंश S1 अत्यधिक हैअंश S2 मुख्य रूप से पाली nucleosomes (चित्रा 1 बी, सही पैनल) होता है, जबकि मोनो nucleosomes में समृद्ध.
  5. एंटीबॉडी के साथ chromatin की ऊष्मायन
    1. -20 डिग्री सेल्सियस बाद मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए S1 अंश के 50 μl में स्टोर.
    2. अंश S1 चिप कमजोर पड़ने बफर (तालिका 1) के 1 मात्रा में जोड़ें.
    3. ब्याज की hPTM (या प्रोटीन) के खिलाफ एंटीबॉडी जोड़ें; 4 डिग्री सेल्सियस नोट पर एक घूर्णन पहिया पर रातोंरात सेते: आमतौर पर, 2 एक्स 10 8 कोशिकाओं के लिए 10 ग्राम एंटीबॉडी के ग्राम से 20 का उपयोग करें. एंटीबॉडी की राशि और शुरू कोशिकाओं संख्या के बीच इष्टतम अनुपात को ध्यान से नमूना भीतर चारे के रूप में इस्तेमाल किया hPTM / प्रोटीन की बहुतायत पर और एंटीबॉडी दक्षता पर निर्भर करता है, मामले ने मामला सेट किया जाना चाहिए. अनुकूलन निम्नलिखित परीक्षण के आधार पर, प्रयोगात्मक है:
      1. इनपुट और प्रवाह के माध्यम से (एफटी के बीच ब्याज की hPTM / प्रोटीन की राशि की तुलनाimmunoprecipitation विशिष्ट chromatin क्षेत्र की एक महत्वपूर्ण अनुपात को समृद्ध करती है, इसकी पुष्टि करने के लिए वेस्टर्न ब्लाट या एमएस द्वारा 2.7.2) देखने नोट:. hPTM / प्रोटीन चारा के कम से कम 50% एफटी (चित्रा 1C) में समाप्त हो गया है जब यह आम तौर पर हासिल की है .
      2. ब्याज की immunoprecipitated प्रोटीन सामग्री के लिए पर्याप्त मात्रा में एमएस विश्लेषण के लिए उपलब्ध है जो सुनिश्चित करता है एसडीएस पृष्ठ जेल, पर detectable है कि जाँच करें नोट:. सही stoichiometry पर चार कोर histones को इसी बैंड की जेल पर उपस्थिति बरकरार nucleosome एन ChroP (चित्रा -1) द्वारा immunoprecipitated गया है कि इंगित करता है. उचित stoichiometry की कमी nucleosome का खुलासा एक आंशिक व्यवधान / का संकेत वास्तव में है.
    4. समानांतर में, (2.6 देखें) प्रोटीन जी युग्मित चुंबकीय मोती तैयार करते हैं.
  6. संतुलन और प्रोटीन जी युग्मित चुंबकीय मोतियों के अवरुद्ध
  7. के लिए घोल के 100 μl का उपयोग, मोती के बंधन क्षमता इस प्रकार है:. प्रोटीन की 100 μl संतुलित जी युग्मित चुंबकीय मोतियों समाधान (1 टेबल), तीन बार धोने और एक घूर्णन पहिया पर 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात उन्हें incubating नोट रोकने में घोल एंटीबॉडी के 2-20 ग्राम.
  8. चिप कमजोर पड़ने बफर (तालिका 1) के साथ दो बार तो अवरुद्ध समाधान और के साथ एक बार अवरुद्ध मोती धो लें.
  • चुंबकीय मोतियों का उपयोग chromatin का अलगाव
    1. S1 chromatin नमूना को अवरुद्ध मोतियों की 100 μl जोड़ें और 3 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक घूर्णन पहिया पर उन्हें सेते हैं. सुझावों के ढक्कन से नमूना नीचे स्पिन करने के लिए 1 मिनट के लिए 340 XG पर अपकेंद्रित्र. मोती गोली एक चुंबकीय रैक में डाल दिया.
    2. एक नया Eppendorf ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला. यह (एफटी) के माध्यम से प्रवाह, एंटीबॉडी के लिए बाध्य नहीं किया था कि chromatin की अर्थात् अंश है.
    3. मोती चार धो लेंप्रत्येक धोने (75, 125 और 175 मिमी NaCl) में नमक एकाग्रता बढ़ती बफर (तालिका 1) धुलाई में बार.
    4. Immunoprecipitated chromatin elute करने के लिए, 70 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 50 मिमी dithiothreitol (डीटीटी) के साथ पूरक एलडीएस नमूना बफर के 30 μl में मोती सेते एक 4-12% बीआईएस-tris acrylamide एसडीएस पृष्ठ पूर्व डाली ढाल जेल पर eluted प्रोटीन को अलग किया और कोलाइडयन Coomassie धुंधला किट (चित्रा -1) के साथ जेल दाग.

    • 3. Crosslinking chromatin immunoprecipitation (एक्स चिप)

    1. Formaldehyde के साथ कोशिकाओं के crosslinking
      1. संक्षेप में मिश्रण है और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं, SILAC लेबल की कोशिकाओं को 0.75% formaldehyde जोड़ें. 125 मिमी ग्लाइसिन जोड़कर formaldehyde बुझा लेते हैं और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सेते हैं.
      2. 5 10 x 7 aliquots में कोशिकाओं के विभाजन; 430 पर centrifuging द्वारा उन्हें ठंडा पीबीएस के साथ तीन बार कुल्ला5 4 डिग्री सेल्सियस न्यूनतम और प्रत्येक धोने के बाद supernatants discarding के लिए XG. पिछले धोने में, सतह पर तैरनेवाला त्यागें और गोली रखने के लिए. नोट: कोशिकाओं Crosslinked होते ही तुरंत इस्तेमाल नहीं करते हैं, तो वे, -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है.
    2. नाभिक तैयारी
      1. 10 मिलीलीटर lysis बफर (1 टेबल) में प्रत्येक सेल गोली Resuspend. रोटेशन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेते हैं. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 430 XG पर अपकेंद्रित्र Supernatants त्यागें; परमाणु छर्रों रखना.
      2. बफर (तालिका 1) वॉशिंग 10 मिलीलीटर में प्रत्येक परमाणु गोली Resuspend. एक घूर्णन पहिया पर 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
      3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 430 XG पर अपकेंद्रित्र Supernatants त्यागें और छर्रों इकट्ठा.
      4. 3 मिलीलीटर चिप ऊष्मायन बफर (1 टेबल) में प्रत्येक परमाणु छर्रों Resuspend. बर्फ पर रखें.
    3. Chromatin sonication और गुणवत्ता नियंत्रण
      1. Sonicate चर्चा. 200 डब्ल्यू एक ठंडा Bioruptor में ("बंद" और 1 मिनट के "पर" 30 सेकंड के चक्र), chromatin टुकड़ा करने पर romatin नोट: चक्र और sonication अंतराल की संख्या सेल प्रकार पर और nucleosomal की औसत लंबाई पर निर्भर करता है वांछित खिंचाव. आमतौर पर, sonication के 30 मिनट डि और त्रिकोणीय nucleosomes के लिए इसी लंबाई में 300-500 बीपी के डीएनए टुकड़े उत्पन्न करने के लिए आवश्यक हैं. टुकड़े आकार के विकल्प जांच के तहत chromatin डोमेन के प्रकार पर निर्भर करता है.
      2. चिप ऊष्मायन बफर में 1 घंटा की एक न्यूनतम के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन द्वारा crosslinking रिवर्स, कुल इनपुट के 2% ले. , पीसीआर शुद्धि किट से डीएनए निकालने 50 μl ते बफर में elute और chromatin विखंडन की जांच करने के लिए agarose जेल पर डीएनए लोड.
    4. एंटीबॉडी के साथ chromatin की ऊष्मायन
      1. Sonicated chromatin के लिए 10% ट्राइटन X-100 के 1/10 मात्रा में जोड़ें. गोली 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 12,000 XG पर अपकेंद्रित्र डेbris.
      2. लेबल कोशिकाओं में SILAC अमीनो एसिड का समावेश स्तर के परीक्षण के लिए और प्रोटीन की रूपरेखा के लिए भारी कोशिकाओं से chromatin इनपुट के 50 μl बचाओ.
      3. शेष भारी और प्रकाश लेबल sonicated chromatin को चुनाव के एंटीबॉडी जोड़ें और घूर्णन पहिया पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं. प्रकाश चैनल में भी घुलनशील पेप्टाइड की एक अतिरिक्त गुना जोड़ें. एक घूर्णन पहिया पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते नोट्स:. 2.5.3 में चर्चा के रूप में एंटीबॉडी के माइक्रोग्राम और कोशिकाओं की प्रारंभिक सामग्री के बीच इष्टतम स्थिति, मामले ने मामले को चुना है. एंटीबॉडी के संबंध में घुलनशील पेप्टाइड का इष्टतम अतिरिक्त गुना molarity ध्यान से मामले ने मामले titrated किया जाना चाहिए.
    5. चुंबकीय मोतियों का उपयोग chromatin का अलगाव
      1. संतुलित करना और 2.6 में वर्णित चरणों का पालन करने और चिप ऊष्मायन बफर का उपयोग करके प्रोटीन जी युग्मित चुंबकीय मोती ब्लॉक.
      2. अवरुद्ध ख के 100 μl जोड़ेंchromatin के नमूने लिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए एक घूर्णन पहिया पर सेते ईएडीएस सुझावों के ढक्कन से नमूना नीचे स्पिन करने के लिए 1 मिनट के लिए 340 XG पर अपकेंद्रित्र. मोती गोली एक चुंबकीय रैक में डाल दिया. सतह पर तैरनेवाला अनबाउंड nucleosomes युक्त, (एफटी) के माध्यम से प्रवाह है. धो बढ़ती नमक एकाग्रता (दो 150 मिमी washes और 300 मिमी NaCl पर दो) के साथ बफर (तालिका 1) धोने में चार बार मोती.
      3. Elute और de-Crosslink immunoprecipitated प्रोटीन दोनों को 95 डिग्री सेल्सियस पर 30 μl एसडीएस पृष्ठ लोड नमूना बफर (1 टेबल) में और 25 मिनट के लिए मोती सेते हैं. अलग प्रोटीन 4-12% बीआईएस-tris acrylamide एसडीएस पृष्ठ पूर्व डाली जैल (चित्रा 3 डी) पर.

    पिछले एमएस करने के लिए 4. नमूना तैयार

    1. में जेल एन चिप से समृद्ध histones की पाचन
      नोट: प्रोटीन पाचन और पेप्टाइड निष्कर्षण कदम ख्याल रखना दौरानपहले 22, 23 के रूप में वर्णित, LC-MS/MS के साथ हस्तक्षेप कि केरातिन संदूषण को कम करने के लिए.
      1. कट जेल स्लाइस कोर histones बैंड (चित्रा -1) के लिए इसी. जेल हटना करने के लिए 100% ACN के साथ बारी, DDH 2 ओ में 50% acetonitrile (ACN) के साथ जेल टुकड़े de-दाग. जैल टुकड़े पूरी तरह से de-दाग रहे हैं जब तक दोहराएँ और एक वैक्यूम अपकेंद्रित्र में उन्हें सूखी.
      2. डी 6 एसिटिक जोड़ें एनहाइड्राइड 01:09 (v / v) 1 एम अमोनियम बाइकार्बोनेट में (एनएच 4 HCO 3) (आमतौर पर अंतिम मात्रा 60-100 μl है) और कतैलिस्ट के रूप में 3 μl सोडियम एसीटेट (सीएच 3 COONa),. मजबूत झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए सेते नोट:. नमूना प्रतिक्रिया की सभा के बाद बहुत पहले मिनट में बुलबुले उत्पन्न हो सकता है: यह महत्वपूर्ण सावधानी के साथ संभाल और उत्पन्न गैस, समय समय पर खोलने ट्यूब जारी करने के लिए ऊष्मायन के दौरान.
      3. कई बार डब्ल्यू जेल टुकड़े कुल्लाith एनएच 4 HCO 3, पूरी तरह से डी 6 एसिटिक एनहाइड्राइड के अवशेषों को खत्म करने के क्रम में बढ़ती प्रतिशत (50% से 100% तक) में ACN के साथ वैकल्पिक,.
      4. 100% ACN में जेल टुकड़े हटना; पूरा de-जलयोजन सुनिश्चित करने के लिए एक वैक्यूम अपकेंद्रित्र में उन्हें सूखी. Deuterated एसिटिक एनहाइड्राइड और trypsin पाचन का उपयोग lysines की रासायनिक संशोधन के संयोजन उत्पन्न करता है एक "Arg-: ठंडा 100 एनजी / 50mm एनएच 4 HCO 3 में trypsin समाधान μl और 37 डिग्री सेल्सियस नोट पर रातोंरात सेते साथ फिर से हाइड्रेट जेल टुकड़े histones 21,24 की जेल पाचन पैटर्न में "की तरह सी.
      5. अतिरिक्त समाधान त्यागें और पूरी तरह से जेल टुकड़े को कवर करने के लिए 50 मिमी एनएच 4 HCO 3 की मात्रा जोड़ने; 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते
      6. एक नया Eppendorf ट्यूब में घुलनशील पचा पेप्टाइड्स लीजिए. पेप्टाइड्स Lyophilize. 0.5% एसिटिक acid/0.1% trifluoracetic एसिड (TFA) में resuspend. फीका बनाना और ध्यान केंद्रितएक उलट चरण हाथ से बनाया microcolumns पर 18 सी / कार्बन "सैंडविच" और आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी (SCX) (StageTip) 25 पर पेप्टाइड्स.
      7. एक 200 μl सुझावों में स्थिर सी 18 / कार्बन ("सैंडविच") और SCX मोती युक्त Teflon meshwork डिस्क डालने से StageTip microcolumns तैयार करें. कार्बन फिल्टर के साथ भरी हुई एक दूसरा सिरा के शीर्ष पर 18 सी microcolumn लोड करके "सैंडविच" प्राप्त ध्यान दें:. 18 सी फिल्टर पर बनाए रखा नहीं कर रहे हैं कि बहुत ही कम पेप्टाइड्स, सीधे पर लोड किया जाता है कि प्रवाह के माध्यम से में पारित आम तौर पर उन्हें कब्जा जो कार्बन युक्ति. SCX StageTips ऐसे H3 के रूप में विशिष्ट पेप्टाइड्स, कुशलता से उलट चरण क्रोमैटोग्राफी द्वारा बनाए रखा नहीं (3-8) पेप्टाइड, समृद्ध कर सकते हैं.
      8. SCX StageTips पर 18 सी / कार्बन "सैंडविच StageTip" और 50% पर लोड पेप्टाइड्स के 50%. 80% ACN/0.5% एसिटिक एसी का उपयोग सी 18 / कार्बन टिप्स से उन्हें Eluteआईडी और 5% अमोनियम हाइड्रॉक्साइड के साथ SCX टिप्स (एनएच 4 OH) / 30% मेथनॉल से. 0.1% एफए में lyophilization, resuspend पेप्टाइड्स के बाद और LC-MS/MS द्वारा विश्लेषण.
    2. Immunopurified प्रोटीन का में जेल पाचन
      प्रोटीन के अलावा जेल पाचन मामूली संशोधनों के साथ, पहले से वर्णित 22 के रूप में किया जाता है.
      1. दस स्लाइस (चित्रा 3 डी) में प्रत्येक लेन और 1 मिमी 3 के छोटे क्यूब्स में प्रत्येक टुकड़ा काट दिया. 50 मिमी एनएच 4 HCO 3/50% इथेनॉल के साथ जेल टुकड़े de-दाग और जैल हटना करने के लिए पूर्ण इथेनॉल जोड़ें. जैल पूरी तरह से de-दाग रहे हैं जब तक दोहराएँ.
      2. अंधेरे में कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए alkylation बफर (तालिका 1) के अलावा द्वारा पीछा 56 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए जेल टुकड़े करने के लिए कमी बफर (तालिका 1) जोड़ें. वैक्यूम अपकेंद्रित्र में जेल टुकड़े धो और सूखी.
      3. ठंडा 12.5 एनजी / μl trypsin सोल के साथ जेल टुकड़े rehydrate50 मिमी एनएच 4 HCO 3 में ution और जेल टुकड़े का पूरा रिहाइड्रेशन तक बर्फ पर सेते हैं. अधिक trypsin निकालें.
      4. पूरी तरह से जेल टुकड़े को कवर करने के लिए 50 मिमी एनएच 4 HCO 3 जोड़ें. 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते
      5. तरल भाग लीजिए. जेल टुकड़े करने के निष्कर्षण बफर (तालिका 1) जोड़ें; कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए मजबूत आंदोलन के साथ सेते हैं. दो बार दोहराएँ.
      6. मजबूत आंदोलन के साथ 10 मिनट के लिए ACN में जेल टुकड़े सेते हैं. दो बार दोहराएँ और सभी supernatants पूल.
      7. पेप्टाइड्स Lyophilize. 0.5% एसिटिक acid/0.1% TFA में सूखे पेप्टाइड्स Resuspend.
      8. फीका बनाना और 26, 27 में वर्णित के रूप में, एक उलट चरण सी 18 StageTip पर पेप्टाइड्स ध्यान केंद्रित.
      9. 80% ACN/0.5% एसिटिक एसिड का उपयोग सी 18 StageTip से पेप्टाइड्स Elute. एक वैक्यूम अपकेंद्रित्र में वाष्पन द्वारा कार्बनिक विलायक निकालें और 0.1% एफए (आमतौर पर 5-10 और में पेप्टाइड्स resuspend# 181; एल), जब एमएस विश्लेषण करने के लिए तैयार है.

    5. नियंत्रण रेखा एमएस विश्लेषण

    1. लिक्विड क्रोमैटोग्राफी विश्लेषण
      1. एक का उपयोग कर एक निरंतर हीलियम दबाव (50 बार) पर रिवर्स चरण (आरपी) 18 सी, मेथनॉल में 3 माइक्रोन राल, का उपयोग कर, एक 15 सेमी जुड़े सिलिका emitter (75 माइक्रोन भीतरी व्यास, 350 माइक्रोन बाहरी व्यास) में विश्लेषणात्मक स्तंभ पैक बम लोडर डिवाइस, पहले 28 में वर्णित के रूप में.
      2. युगल सीधे एक 20 सेमी लंबी (25 माइक्रोन भीतरी व्यास) के माध्यम से HPLC 6 बंदरगाह वाल्व की दुकान को पैक emitter (18 सी आर पी स्तंभ) पूर्व स्तंभ या विभाजन उपकरण का उपयोग कर के बिना सिलिका जुड़े हुए.
      3. 500 NL / मिनट मोबाइल चरण एक (DDH में 0.1% एफए / 5% ACN 2 हे) के प्रवाह में 18 सी आर पी स्तंभ में पचा पेप्टाइड्स लोड करें.
      4. नमूना लोड करने के बाद निम्न ढ़ाल का उपयोग कर पेप्टाइड्स अलग:
        1. 0-40% मोबाइल चरण बी (0.1% FA/99% ACN लागू करें250 NL / मिनट पर DDH 2 ओ) में histones से पाने पेप्टाइड्स के क्षालन के लिए 5 मिनट पर 10 मिनट और 60-80%, में 40-60% की एक ढाल के द्वारा पीछा किया पर 90 मिनट (2) देखें.
        2. Immunopurified प्रोटीन से पाने पेप्टाइड्स के क्षालन के लिए 5 मिनट पर 10 मिनट और 60-80%, (3 देखें) में 36-60% की एक ढाल के द्वारा पीछा 250 NL / मिनट पर 120 मिनट में 0-36% मोबाइल चरण बी लागू करें.
    2. LTQ फुट आईसीआर अल्ट्रा मास स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण
      1. स्वचालित रूप से एमएस और MSMS अधिग्रहण के बीच स्विच करने के लिए एक डेटा पर निर्भर अधिग्रहण (डीडीए) मोड में संचालित. एमएस पूर्ण स्कैन स्पेक्ट्रा 200-1,650 से आम तौर पर एम / जेड श्रेणी में, अर्जित कर रहे हैं, 400 मी / z पर संकल्प आर = 1,00,000 साथ अधिग्रहण कर लिया है. पाँच (TOP5) सबसे तीव्र आयनों 5,000 का लक्ष्य मूल्य पर एक टक्कर प्रेरित पृथक्करण (सीआईडी) का उपयोग रैखिक आयन जाल में विखंडन के लिए अलग कर रहे हैं.
      2. तालिका 2 के लिए में सूचीबद्ध पैरामीटर का प्रयोग करेंआर "ट्यूनिंग" अधिग्रहण फ़ाइल.
      3. 2 तालिका में सूचीबद्ध के रूप में मानक अधिग्रहण सेटिंग्स सेट.

    6. डेटा विश्लेषण

    1. Chromatin डोमेन में सह समृद्ध histone संशोधनों से मुक्त मात्रा का ठहराव लेबल
      1. का अधिग्रहण कच्चे फाइलों Raw2msm सॉफ्टवेयर (संस्करण 1.10) 29 का उपयोग एमजीएफ फाइल करने के लिए कनवर्ट करें.
      2. तालिका 3 में वर्णित मानकों की स्थापना, शुभंकर deamon (संस्करण 2.2.2) का उपयोग कर histone संशोधनों खोजें.
      3. शुभंकर उत्पादन पेप्टाइड सूची में, 15 से कम स्कोर के साथ या 5 से अधिक ख्यात PTMs 29 के साथ पेप्टाइड्स हटाने नोट:. प्रत्येक एकल पेप्टाइड आईडी के लिए, उच्चतम शुभंकर स्कोर के साथ पेप्टाइड का चयन करें और एक ही आईडी के साथ अन्य सभी अनावश्यक पेप्टाइड्स बाहर फिल्टर .
      4. बस, हर संशोधित पेप्टाइड्स के लिए इसी प्रत्येक अग्रदूत के लिए निकाले आयन chromatograms (XIC) का निर्माणQualBrowser उपयोग कर रहा हूँ / Z मूल्य, पर एड. प्रत्येक शिखर (2A चित्रा) के लिए वक्र (नीलामी) के तहत क्षेत्र की गणना.
      5. QualBrowser (चित्रा 2 बी) का उपयोग एमएस / एमएस स्पेक्ट्रा के दृश्य निरीक्षण द्वारा संशोधनों युक्त पहचान पेप्टाइड्स मान्य करें.
      6. प्रत्येक संशोधित पेप्टाइड के लिए रिश्तेदार बहुतायत की गणना. चिप एड सामग्री में प्रत्येक संशोधन के रिश्तेदार संवर्धन की गणना नोट:. रिश्तेदार बहुतायत एक ही पेप्टाइड के सभी संशोधित और असंशोधित रूपों की नीलामी की राशि में प्रत्येक विशिष्ट संशोधित पेप्टाइड की नीलामी के बीच एक अनुपात के रूप में गणना की है, जबकि रिश्तेदार इनपुट (चित्रा -2) पर चिप में विशिष्ट संशोधन के रिश्तेदार बहुतायत के अनुपात के रूप संवर्धन.
    2. प्रोटीन की मात्रात्मक प्रोटिओमिक विश्लेषण chromatin डोमेन के भीतर सह जुड़े
      1. प्रोटीन के लिए पहचान और मात्रा का ठहराव MaxQuant पैकेज का उपयोग(Http://www. Maxquant.org /) 30. AndromedaConfig.exe 31 का उपयोग में निर्मित खोज इंजन "एंड्रोमेडा" कॉन्फ़िगर और 3 तालिका में सूचीबद्ध खोज मानकों सेट.
    3. निगमन परीक्षण
      1. निम्नानुसार MaxQuant सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, भारी लेबल chromatin इनपुट में प्रोटीन में भारी अमीनो एसिड के समावेश की डिग्री अनुमान है:
        1. 6.2 में वर्णित है, लेकिन फिर से यों विकल्प को निष्क्रिय करने के रूप में मानकों सेट.
        2. निगमन गैर बेमानी पेप्टाइड अनुपात को निम्नलिखित फार्मूला लागू करने प्रतिशत की गणना:. निगमन (%) = अनुपात (एच / एल) / अनुपात (एच / एल) + 1 × 100 (3B चित्रा) नोट: स्वीकारें केवल अगर समावेश> 95 %.

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    Representative Results

    Chromatin immunoprecipitation जीनोम साथ एक प्रोटीन या एक histone संशोधन का स्थानीयकरण प्रोफ़ाइल करने के लिए प्रयोग किया जाता है एक शक्तिशाली तकनीक है. एक प्रोटिओमिक्स बराबर में, चिप, ब्याज के संशोधन या प्रोटीन के साथ मिलकर immunoprecipitated "चारा" के रूप में उपयोग किया जाता है कि गुणात्मक और मात्रात्मक hPTMs, histone वेरिएंट और chromatin बाध्यकारी प्रोटीन की पहचान करने के लिए एमएस आधारित प्रोटिओमिक्स द्वारा पीछा किया जाता है. एन ChroP दृष्टिकोण में, chromatin MNase (चित्रा 1 बी) से पच जाता है जिसमें चित्रा 1 ए, देशी चिप में उल्लिखित, एक अलग कार्यात्मक डोमेन chromatin थोक से शुद्ध करने के लिए निवेश के रूप में प्रयोग किया जाता है. मोनो nucleosomes में समृद्ध पचा chromatin एक विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ incubated है और immunopurified प्रोटीन एसडीएस पृष्ठ से अलग हो रहे हैं. सचित्र उदाहरण में, H3K9me3, मूक chromatin 32,33 के मार्कर, दृष्टिकोण स्थापित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. चुनाव तथ्य पर आधारित है कि दोनों के रूप में अपने कार्य भूमिकाइसकी प्रोटीन interactors की कुछ अच्छी तरह से वर्णित हैं साथ ही. भी बरकरार nucleosome, सही stoichiometry पर कोर histones साथ, एमएस (चित्रा -1 के लिए उचित मात्रा में समृद्ध है, जहां Coomassie जेल के दृश्य निरीक्षण, द्वारा की पुष्टि के रूप में इसके अलावा, चिप के लिए अनुकूलित एक अत्यंत विशिष्ट और कुशल एंटीबॉडी, 34 उपलब्ध है ).

    प्रवाह के माध्यम से (एफटी) और इनपुट (IN) में मौजूद H3K9me3 की राशि के बीच तुलना की एक नाबालिग उप आबादी के संवर्धन के कारण एक पूर्वाग्रह के जोखिम को छोड़कर, ब्याज के क्षेत्र के बारे में 50% immunopurified इंगित करता है कि chromatin (चित्रा 1C). प्रत्येक कोर histone polyacrylamide जेल में पाचन, "जैसे Arg सी" एक को प्राप्त करने के क्रम में तदर्थ रूप से डिजाइन एक प्रोटोकॉल का उपयोग पच जाता है: एमएस समृद्ध nucleosomes भीतर सह जुड़े PTMs चिह्नित करने के लिए कार्यरत है. वास्तव में, एक हाथ पर Arg सी hPTMs बी के एमएस विश्लेषण के लिए सबसे अच्छा प्रोटीज हैecause यह इष्टतम लंबाई की पेप्टाइड्स का उत्पादन; दूसरी ओर, यह जेल में कुशलतापूर्वक फोड़ना नहीं है. इस सीमा को पार करने के लिए, हमारे अनुरूप प्रोटोकॉल trypsin पाचन द्वारा पीछा deuterated (डी 6) एसिटिक एनहाइड्राइड, साथ histone जेल बैंड incubating द्वारा प्राप्त लाइसिन की रासायनिक alkylation कारनामे. Trypsin डी 3 acetylated lysines, जिसके परिणामस्वरूप पेप्टाइड्स मिश्रण mimics पैटर्न (चित्रा 1E) एक "की तरह Arg-C" फोड़ना नहीं करता है.

    एक लाइसिन करने के लिए एक डी 3 एसिटाइल आधा भाग के अलावा एमएस में देशी और रासायनिक गयी acetylations के बीच भेदभाव, 45.0294 Daltons की एक स्पष्ट डेल्टा जन पैदा करता है. इसके अलावा, डी 3 एसिटिलीकरण समदाब रेखीय संशोधित पेप्टाइड्स के प्रभेद की सुविधा है कि दो अतिरिक्त लाभ प्रदान करता है: पहला, alkylation लेकिन नहीं डि और त्रिकोणीय methylated अवशेषों पर, केवल असंशोधित और मोनो methylated lysines पर होता है; इस तरह संशोधित पेप्टाइड्स एक ही मुन्ना असर के रूप मेंअल संशोधनों की संख्या है, लेकिन विभिन्न व्यवस्थाओं में विभिन्न प्रकार से स्पष्ट मी / z पाली का उत्पादन करने वाले डी 3 एसिटाइल समूहों की अलग सेट से सजाया जाता है. दूसरा, डी 3 alkylation के विशिष्ट पैटर्न समदाब रेखीय संशोधित पेप्टाइड्स 21 के लिए जुदाई का एक अतिरिक्त स्तर उत्पन्न जो रिवर्स चरण स्तंभ, पर तरल क्रोमैटोग्राफी में थोड़ा अलग प्रतिधारण बार कारण.

    इसी एमएस / एमएस स्पेक्ट्रा (चित्रा 2 बी) के मैनुअल निरीक्षण की सभी hPTMs के सत्यापन के बाद, लेबल मुक्त मात्रा का ठहराव दो चरणों में हासिल की है: सबसे पहले, हम असंशोधित और संशोधित प्रजातियों के संकेत तीव्रता का उपयोग कर प्रत्येक संशोधन के रिश्तेदार बहुतायत गणना निकाले आयन chromatograms (XIC) की गणना (2A चित्रा और -2 सी, ऊपरी पैनल) के माध्यम से मापा इसी पेप्टाइड, के लिए; दूसरा, रिश्तेदार संवर्धन प्रत्येक modificatio के रिश्तेदार बहुतायत के बीच एक अनुपात के रूप में अनुमान लगाया गया हैn चिप एड octamer और इनपुट (चित्रा -2, कम पैनल) से इसी रिश्तेदार बहुतायत में. H3 का विश्लेषण (9-17) पेप्टाइड असंशोधित और मोनो methylated रूपों (चित्रा -2) की इसी कमी के साथ, डि और त्रिकोणीय methylated K9 के संवर्धन से पता चलता है. इस एंटीबॉडी विशिष्टता के लिए सकारात्मक नियंत्रण परिणामों के साथ, सह संघ या अन्य सभी संशोधनों की कमी के भीतर अन्य सह समृद्ध histones पर, एक ही H3 पर इंट्रा आणविक स्तर पर और अंतर - आणविक स्तर पर, दोनों का आकलन किया जा सकता है एक ही nucleosome. जीन मुंह बंद करने के साथ जुड़े जाना जाता मार्करों के महत्वपूर्ण संवर्धन, जीन सक्रियण के साथ जुड़ा हुआ मार्कर की इसी कमी के साथ मनाया जाता है: इस hPTMs H3K9me3 डोमेन के भीतर पार वार्ता की स्क्रीनिंग, तथाकथित "हेट्रोक्रोमैटिन modificome" (चित्रा 2 डी) की अनुमति देता है . इसके अलावा, उपन्यास संघों ऐसे H3K18m के संवर्धन के रूप में पहचान कर रहे हैंE1.

    हेट्रोक्रोमैटिन भीतर सह जोड़ सभी प्रोटीन के लिए स्क्रीन, शास्त्रीय crosslinking चिप (सेल संस्कृति में एमिनो एसिड से स्थिर आइसोटोप लेबलिंग) SILAC के साथ संयुक्त है (चित्रा 3). SILAC प्रयोग में, लाइसिन और arginine (प्रकाश फार्म) संवर्धन माध्यम में उनके isotopically लेबल analogs (भारी प्रपत्र) के साथ बदल रहे हैं. प्रकाश और भारी मीडिया दोनों में वृद्धि हुई है और प्रतिकृति कोशिकाओं पर, दो विभिन्न आइसोटोप इनकोडिंग अमीनो एसिड पाचन के कारण एक विशिष्ट Δmass एमएस से अलग पहचाना जाता है कि क्रमशः प्रोटीन का प्रकाश और भारी रूपों,,, सृजन, प्रोटीन में शामिल कर रहे हैं. एक बड़े पैमाने पर SILAC प्रयोग शुरू करने से पहले, लेबलिंग दक्षता केवल भारी लेबल के नमूने में पाया भारी और प्रकाश लोगों की राशि, बनाम भारी पेप्टाइड्स का प्रतिशत अंश के रूप में मापा समावेश स्तर की गणना, मूल्यांकन किया जाता है. भारी arginine और वह दोनों के लिए 95% से बेहतर निगमनAvy लाइसिन सटीक प्रोटीन मात्रा का ठहराव (3B चित्रा) के लिए आवश्यक है. भारी और प्रकाश कोशिकाओं के crosslinking के बाद, chromatin sonication द्वारा खंडित है. SILAC पृष्ठभूमि से विशिष्ट H3K9me3 interactors भेदभाव करने के क्रम में K9 पर त्रिकोणीय मेथिलिकरण भालू कि घुलनशील H3 पेप्टाइड (QTAR कश्मीर STGG) की एक अतिरिक्त गुना का उपयोग कर एक प्रतियोगिता परख के साथ संयोजन के रूप में प्रयोग किया जाता है. घुलनशील पेप्टाइड यह एंटीबॉडी के बंधन क्षमता है, इस प्रकार, तदनुसार, सभी विशिष्ट interactors H3K9me3-nucleosomes के बहुमत "बाहर प्रतिस्पर्धा" और संतृप्त जहां दो SILAC चिप प्रयोगों में से एक को अतिरिक्त में जोड़ा जाता है. अन्य SILAC चैनल में होड़ पेप्टाइड चिप से जोड़ा गया है और immunoprecipitation सामान्य रूप से जगह लेता नहीं है. SILAC प्रतियोगिता प्रयोगों आमतौर पर अतिरिक्त घुलनशील पेप्टाइड के साथ प्रतिस्पर्धा वें से बंद है जहां तथाकथित "आगे" और "रिवर्स" स्वरूपों में दो प्रतियों में प्रदर्शन कर रहे हैंई प्रकाश (एल) chromatin के नमूने लिए (एच) भारी. इस unspecific बाँधने से असली समझदार के लिए इस्तेमाल किया उल्टे पूरक SILAC अनुपात readouts, में यह परिणाम है: विशेष रूप से समृद्ध प्रोटीन प्रयोग में प्रकाश फॉर्म (प्रोटीन अनुपात एच / एल> 1) के साथ तुलना में भारी रूप में एक उच्च तीव्रता के साथ मौजूद हैं, जहां अतिरिक्त पेप्टाइड प्रकाश चैनल (फॉरवर्ड) (चित्रा -4 ए, ऊपरी पैनल) में जोड़ा जाता है; एक विपरीत प्रवृत्ति (प्रोटीन अनुपात एच / एल <1) रिवर्स प्रतिकृति (चित्रा -4 ए, कम पैनल) में मनाया जाता है. जिसका तीव्रता भारी और हल्के रूप में फॉरवर्ड दोनों में समान हैं और रिवर्स प्रयोगों 1 के लिए एक स्थिर अनुपात करीब उत्पादन और पृष्ठभूमि (चित्रा 4 बी) के रूप में वर्गीकृत किया जाता है प्रोटीन.

    घुलनशील पेप्टाइड के लिए इष्टतम अतिरिक्त गुना का चुनाव महत्वपूर्ण है और सही ढंग से परिचित होना चाहिए. आमतौर पर, हम एक प्रतियोगिता परख USI प्रदर्शन सही एंटीबॉडी से पेप्टाइड अनुपात सेटअतिरिक्त पेप्टाइड के धारावाहिक dilutions एनजी और वेस्टर्न ब्लाट या एमएस द्वारा पेप्टाइड नहीं जोड़ा जाता है, जहां सकारात्मक नियंत्रण चिप के बीच "चारा" (hPTM / प्रोटीन),, और विभिन्न धारावाहिक प्रतियोगिता चिप्स, के स्तर की तुलना. आम तौर पर, इष्टतम अतिरिक्त गुना पेप्टाइड के बारे में 90% की immunoprecipitated सामग्री में hPTM / प्रोटीन की मात्रा कम कर देता है. वास्तव में, एक हाथ पर, बड़ा प्राप्त प्रोटीन अनुपात, SILAC का भेदभाव शक्ति उच्चतर; दूसरी ओर, पेप्टाइड द्वारा एक अत्यधिक संतृप्ति इस प्रकार मात्रा का ठहराव और सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए एच / एल अनुपात लापता करने के लिए अग्रणी, पूरी तरह से एंटीबॉडी से विशिष्ट बाँधने को बेदखल कर सकते हैं. H3K9me3 एंटीबॉडी के लिए हम QTARK (ME3) STGG पेप्टाइड के लिए एच / एल अनुपात को मापने के द्वारा सही अनुपात परिभाषित एक फॉरवर्ड में किए गए एक प्रतियोगिता परीक्षा में स्थापित किया है और हम प्रतियोगिता दक्षता (चित्रा -3 सी के एक उपाय के रूप में यह मान लिया ).

    आगे एक के चौराहेएक्स चिप प्रयोगों उल्टा घ दोनों प्रयोगों में मौजूद है और कम से कम 2 अनुपात की गिनती के साथ मात्रा निर्धारित 635 प्रोटीन की पहचान की जाती है. उनके एच / एल अनुपात की प्रवेश 2 प्लॉट वास्तविक H3K9me3 interactors असंदिग्ध रूप से प्रोटीन अनुपात वितरण के शीर्ष 40% के (ऊपरी सही चक्र के भीतर मौजूद प्रोटीन के रूप में पहचाने जाते हैं जहां तथाकथित "heterochromatome" (चित्रा 4C), का प्रतिनिधित्व तितर बितर साजिश और चित्रा 4D).

    चित्रा 1
    चित्रा 1:. एन ChroP कार्यप्रवाह एमएस विश्लेषण के साथ संयुक्त देशी चिप की एक) योजना के योजनाबद्ध देखें. कोशिकाओं से chromatin MNase और मोनो nucleosomes (S1) में समृद्ध अंश एक विरोधी H3 का उपयोग immunoprecipitated है से पच जाता हैK9me3 एंटीबॉडी. Immunopurified प्रोटीन एसडीएस पृष्ठ से अलग कर दिया और कोर histones जेल पचा एक Arg सी पाचन नकल करने के लिए एक तदर्थ प्रोटोकॉल के साथ में कर रहे हैं. पेप्टाइड्स nano-LC-MS/MS से विश्लेषण कर रहे हैं. Histone PTMs एमएस / एमएस स्पेक्ट्रा का मार्गदर्शन निरीक्षण द्वारा मान्य और मात्रा निर्धारित, पहचान कर रहे हैं बी) लघु MNase टेस्ट:. अलग समय चूक (बाएं पैनल) में MNase साथ chromatin पाचन के बाद एक 1% agarose जेल पर हल डीएनए; बड़े पैमाने MNase पाचन:. डीएनए संवर्धन के सी) आकलन पाली nucleosomes (सही पैनल) युक्त, S2 गुट से मोनो nucleosomes युक्त, MNase chromatin पाचन के 60 मिनट के बाद और S1 अंश की जुदाई के बाद एक 1% agarose जेल पर हल / असंशोधित की कमी, मोनो, डि, और प्रवाह के माध्यम से में त्रिकोणीय methylated K9 (एफटी) निवेश (IN) की तुलना में. हिस्टोग्राम प्रत्येक संशोधन chromatin इनपुट और सह इम्युनो की. डी) एसडीएस पृष्ठ के लिए तीन स्वतंत्र प्रयोगों से औसत ± SEM का प्रतिनिधित्व करता है शुद्ध प्रोटीन:. कोर H3, H4, H2A और H2B histones immunoprecipitated nucleosomes और इनपुट दोनों से प्रत्येक कोर histone (का उपयोग deuterated रासायनिक alkylated हैं दिखाई चारों ओर और 17kDa बैंड नीचे, H3 और H2B सह पलायन (काला) वर्ग ई) के साथ कर रहे हैं जेल पाचन में "की तरह Arg सी" एक प्राप्त करने के लिए, उपचार trypsin पहले डी 6) एसिटिक-एनहाइड्राइड. डी 6 एसिटिक एनहाइड्राइड असंशोधित और मोनो methylated lysines की एप्सिलॉन अमीनो समूह के साथ प्रतिक्रिया नहीं बल्कि डि methylated, methylated-त्रि और acetylated lysines साथ. नतीजतन, trypsin के enzymatic गतिविधि इस प्रकार पाचन पैटर्न "की तरह Arg सी" एक उत्पादन, सभी देशी और रासायनिक acetylated लाइसिन पर अवरुद्ध है. यह आंकड़ा संदर्भ के रूप में चित्रा 1, चित्रा S1 और चित्रा S5 का उपयोग कर, 21 से संशोधित किया गया है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

    "के लिए: रखने together.within पृष्ठ =" हमेशा "> चित्रा 2
    चित्रा 2:. की इसी मी / z मूल्य पर निर्माण मास स्पेक्ट्रोमेट्री H3K9me3 "modificome" एक के विश्लेषण) जू़म जन स्पेक्ट्रा और निकाले आयन chromatograms (XIC) 2 + चार्ज असंशोधित, मोनो, डि, और त्रिकोणीय methylated H3 में K9 (9-17) पेप्टाइड, दोनों इनपुट और चिप के नमूने लिए. बी) प्रतिनिधि एमएस / एमएस स्पेक्ट्रा सीआईडी ​​विखंडन का उपयोग कर. बी आयन और Y-आयन श्रृंखला (H3 के अनुक्रम (9-17) पेप्टाइड को परिभाषित करने के लिए और विशेष रूप से K9 छाछ. सी पर त्रिकोणीय मेथिलिकरण स्थानीय बनाना) H3 में K9 पर मेथिलिकरण के विभिन्न डिग्री के रिश्तेदार बहुतायत की अनुमति 9-17) पेप्टाइड, सभी को इसी क्षेत्रों की राशि से प्रत्येक संशोधित पेप्टाइड की वक्र (नीलामी) के तहत क्षेत्र को विभाजित करके अनुमानित unmodifi मनायाएड और इनपुट और चिप एड octamer में कि पेप्टाइड की संशोधित रूपों,. हिस्टोग्राम प्रत्येक संशोधन (ऊपरी पैनल) के लिए तीन स्वतंत्र प्रयोगों से ± SEM के औसत का प्रतिनिधित्व करता है. H3 (9-17) पेप्टाइड में K9 methylations के सापेक्ष संवर्धन. संवर्धन निवेश करने के लिए की तुलना के रूप में चिप एड octamer में प्रत्येक मेथिलिकरण के रिश्तेदार बहुतायत के बीच एक लॉग 2 अनुपात के रूप में व्यक्त किया जाता है. Histone H3, H4 और H2A पर पहचान सब सह जोड़ hPTMs के संवर्धन सारांश हिस्टोग्राम तीन स्वतंत्र प्रयोगों (कम पैनल) से ± SEM के मूविंग का प्रतिनिधित्व करता है. डी) हीटमैप. प्रत्येक पंक्ति एक अलग संशोधन (एन डी संशोधनों का पता नहीं कर रहे हैं) से मेल खाती है. यह आंकड़ा चित्रा 1, चित्रा 2, संदर्भ के रूप में चित्रा 3 और चित्रा S10 उपयोग कर, 21 से संशोधित किया गया है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.


    चित्रा 3:. एमएस विश्लेषण के साथ संयुक्त चिप crosslinking की एक्स ChroP कार्यप्रवाह ए) योजना के योजनाबद्ध देखें. Formaldehyde और chromatin आदानों डीएनए टुकड़े उत्पन्न करने के लिए sonication द्वारा खंडित कर रहे हैं के साथ प्रकाश और भारी मीडिया में विकसित कोशिकाओं तय कर रहे हैं. एक आगे की स्थापना में, sonicated भारी लेबल chromatin प्रकाश लेबल chromatin K9me3 असर घुलनशील H3 पेप्टाइड की एक अतिरिक्त गुना से संतृप्त एक ही एंटीबॉडी के साथ incubated है जबकि विरोधी H3K9me3 एंटीबॉडी का उपयोग immunoprecipitated है. भारी और प्रकाश chromatins से immunoprecipitated प्रोटीन, जमा निकाली और एसडीएस पृष्ठ से अलग हो रहे हैं. SILAC लेबलिंग का) प्रोटीन trypsin के साथ पचा रहे हैं और पेप्टाइड्स nano-LC-MS/MS. बी से विश्लेषण कर रहे हैं क्षमता भारी LYS के समावेश की गणना नजर रखी हैine (Lys8) और arginine (Arg10) प्रोटीन में. साजिश में, लाइसिन और arginine पेप्टाइड्स घनत्व वितरण का औसत क्रमश: 0.974 (ग्रीन लाइन) और 0.964 (लाल रेखा),. सी) 2 + चार्ज त्रिकोणीय methylated की इसी मी / z मूल्य पर जू़म जन स्पेक्ट्रा के बराबर है दोनों प्रकाश और इनपुट और चिप एड octamer में भारी रूपों, के लिए H3 में K9 (9-17) पेप्टाइड,. इनपुट में भारी और प्रकाश पेप्टाइड की तीव्रता फॉरवर्ड SILAC चिप में, 1 के करीब हैं, वहीं प्रकाश पेप्टाइड की तीव्रता इस प्रकार एक कुशल प्रतियोगिता का संकेत है, भारी समकक्ष से एक के मुकाबले काफी कम है. प्रकाश डी) एसडीएस पृष्ठ (एल) और भारी (एच) chromatin इनपुट लेबल और सह immunoprecipitated सामग्री की: इनपुट के केवल दो स्लाइस समावेश परीक्षण विश्लेषण (के लिए विश्लेषण कर रहे हैं जबकि चिप एड सामग्री के लिए इसी लेन, दस स्लाइस (काला लाइन) में कटौती कर रहा है नीली रेखा). यह आंकड़ा फिर से के रूप में चित्रा 4 और चित्रा S6 का उपयोग कर, 21 से संशोधित किया गया हैसम्मेलन. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

    चित्रा 4
    चित्रा 4: H3K9me3 "interactome" मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण. ए) HP1 से पेप्टाइड्स और मैक्रो-2A प्रोटीन को इसी SILAC जोड़ी दिखा प्रतिनिधि पूर्ण स्पेक्ट्रा: रिवर्स प्रतिकृति में एक के अनुपात एच / एल <1 से नजर आता अनुपात फॉरवर्ड प्रयोग (ऊपरी पैनल में एच / एल> 1), (कम पैनल), हेट्रोक्रोमैटिन में इन प्रोटीनों की विशिष्ट संवर्धन का प्रदर्शन बी) SILAC जोड़ी एक पृष्ठभूमि प्रोटीन से पेप्टाइड को इसी के साथ प्रतिनिधि पूर्ण स्पेक्ट्रा:. मात्रा निर्धारित प्रोटीन) आगे में एच / एल अनुपात और replicates 1 सी के बराबर हैं उल्टा. distribut हैंउनके आगे में SILAC-अनुपात और (क्रमशः एक्स और वाई अक्ष,) रिवर्स प्रयोगों पर आधारित एक तितर बितर साजिश में एड; लाल बिंदीदार लाइनों के रूप में संकेत, शीर्ष 40% और प्रोटीन के अनुपात के 30% का प्रतिनिधित्व करते हैं. इनपुट से डी) प्रोटीन के अनुपात वितरण (एच / एल) काला () 01:01 मिलाया, फॉरवर्ड (नीला) और रिवर्स (नारंगी) एक्स ChroP प्रयोगों; लाल बिंदीदार लाइनों वास्तविक interactors चयन करने के लिए cutoffs के रूप में सेट प्रोटीन अनुपात, के शीर्ष 40% का प्रतिनिधित्व करते हैं. यह आंकड़ा संदर्भ के रूप में चित्रा 5 का उपयोग कर, 21 से संशोधित किया गया है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

    धारा 2 के लिए बफर रचना
    Lysis बफर 10% sucrose, 0.5 मिमी EGTA 8.0 पीएच, 15 मिमी NaCl, 60 मिमी KCl, 15 मिमी HEPES, 0.5% ट्राइटन, 0.5 मिमी PMSF, 1 मिमी डीटीटी, 5 मिमी NAF, 5 मिमी ना 3 वीओ 4, 5 मिमी NaButyrate, 5 मिलीग्राम / एमएल Aprotinin, 5 मिलीग्राम / एमएल Pepstatin ए, 5 मिलीग्राम / एमएल Leupeptin
    सुक्रोज तकिया Lysis बफर के 20 मिलीलीटर में 2 जी सुक्रोज
    पाचन बफर 0.32 एम sucrose, 50 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 7.6, 4 मिमी 2 MgCl, 1 मिमी CaCl2, 0.1 मिमी PMSF
    ते बफर 10 मिमी Tris-एचसीएल 7.5 पीएच, 1 मिमी EDTA
    डायलिसिस बफर 10 मिमी Tris-एचसीएल 7.6 पीएच, 1 मिमी EDTA, 0.5 मिमी PMSF, 5 मिमी NAF, 5 मिमी ना 3 वीओ 4, 5 मिमी NaButyrate, protease inhibitors के कॉकटेल
    चिप कमजोर पड़ने बफर 100 मिमी Tris एचसीएल 7.6 पीएच, 100 मिमी NaCl और 10 मिमी EDTA
    अवरुद्ध समाधान पीबीएस में बीएसए 0.5%
    बफर धोने 50 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 7.6,10 मिमी EDTA
    Protease inhibitors EDTA मुक्त protease inhibitors के कॉकटेल, 0.5 मिमी PMSF, 5 मिमी NAF, 5 मिमी Na3VO4, 5mm NaButyratई
    बफर लोड हो रहा है एच 20 में नारंगी लोड हो रहा है डाई, 50% (v / v) ग्लिसरॉल
    धारा 3 के लिए बफर रचना
    Lysis बफर 50 मिमी HEPES-KOH 7.5 पीएच, 140 मिमी NaCl, 1 मिमी EDTA, 10% ग्लिसरॉल, 0.5% एनपी 40, 0.25% ट्राइटन-100, 0.5 मिमी PMSF, 5 मिमी NAF, 5 मिमी ना 3 वीओ 4, 5 मिमी NaButyrate, 5 मिलीग्राम / एमएल Aprotinin, 5 मिलीग्राम / एमएल Pepstatin ए, 5 मिलीग्राम / एमएल Leupeptin
    बफर धोने 10 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 8, 200 मिमी NaCl, 1 मिमी EDTA, 0.5 मिमी EGTA, 0.5 मिमी PMSF, 5 मिमी NAF, 5 मिमी ना 3 वीओ 4, 5 मिमी NaButyrate, 5 मिलीग्राम / एमएल Aprotinin, 5 मिलीग्राम / एमएल Pepstatin एक , 5 मिलीग्राम / एमएल Leupeptin
    चिप ऊष्मायन बफर 10 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 8, 100 मिमी NaCl, 1 मिमी EDTA, 0.5 मिमी EGTA, 0.1% सोडियम deoxycholate, 0.5% सोडियम lauroylsarcoside, 0.5 मिमी PMSF, 5 मिमी NAF, 5 मिमी ना 3 वीओ 4, 5 मिमी NaButyrate, 5मिलीग्राम / एमएल Aprotinin, 5 मिलीग्राम / एमएल Pepstatin ए, 5 मिलीग्राम / एमएल Leupeptin
    बफर 2 धुलाई 20 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 7.6, 2 मिमी EDTA, 0.1% एसडीएस, 1% ट्राइटन-100
    लोड हो रहा है नमूना बफर 250 मिमी त्रिकोणीय एचसीएल पीएच 8.8, 0.5 एम बी mercaptoethanol, 2% एसडीएस
    धारा 4 के लिए बफर रचना
    Alkylation बफर 55 मिमी 50 मिमी एनएच 4 HCO 3 में iodoacetamide
    कमी बफर 10 मिमी 50 मिमी एनएच 4 HCO 3 में dithiothreitol
    निष्कर्षण बफर DDH 2 में 30% ACN और 3% TFA 0

    तालिका 1. बफ़र संरचना.

    अधिग्रहण फ़ाइल ट्यूनिंग पैरामीटर्स
    एफटी पूर्ण एससीएn संचय लक्ष्य मूल्य 1 एक्स 10 6; अधिकतम भरने समय 1000 मिसे
    आईटी एमएसएन संचय लक्ष्य मूल्य 10 x 10 4; अधिकतम भरने समय 150 मिसे
    अधिग्रहण की स्थापना पैरामीटर्स
    Electrospray वोल्टेज 2.4 केवी
    म्यान और सहायक गैस प्रवाह नहीं
    आयन हस्तांतरण केशिका तापमान 200 डिग्री सेल्सियस
    गतिशील बहिष्कार MSMS पर 60 सेकंड के लिए 500 अग्रदूत आयनों
    बहिष्करण जन चौड़ाई 10 पीपीएम
    चौड़े बैंड सक्रियण मोड का उपयोग सामान्यीकृत टक्कर ऊर्जा 35%
    आयन चयन थ्रेसहोल्ड 100 मायने रखता है
    सक्रियण क्यू 0.25
    Activसमझना समय 30 मिसे

    तालिका 2. एमएस सेटिंग्स.

    Mascor deamon खोज पैरामीटर्स नोट्स
    डेटाबेस (:; 87,061 प्रविष्टियों मानव डाटाबेस को संस्करण 3.68 यानी HELA कोशिकाओं के लिए) जीव पर निर्भर करता है
    किण्वक Arg-C सभी arginine अवशेषों के सी टर्मिनल पर Arg सी फोड़ना
    चर संशोधनों एसिटाइल (कश्मीर), ऑक्सीकरण (एम), डी 3 एसिटिलीकरण (कश्मीर), मिथाइल-D 3 - एसिटाइल (कश्मीर), डाइमिथाइल (कश्मीर), trimethyl (कश्मीर) एसिटाइल [42.010 दा], ऑक्सीकरण [15.995 दा], डी 3-एसिटिलीकरण [45.0294 दा], मिथाइल-D3-एसिटाइल [14.016 दा और 45.0294 दा का योग], डाइमिथाइल [28.031], trimethyl [42.046 दा]
    मिस्ड चोली 2 से ऊपर
    खोज में माता पिता के आयनों की जन सटीकता 10 पीपीएम
    सीआईडी ​​MSMS के लिए बड़े पैमाने पर सटीकता 0.5 दा
    MaxQuant खोज पैरामीटर्स नोट्स
    डेटाबेस जीव पर निर्भर करता है
    किण्वक trypsin / पी सभी लाइसिन और arginine अवशेषों के सी टर्मिनल पर trypsin cleaves. खोज खाते में trypsin की दक्षता लाइसिन फोड़ना और अगले अमीनो एसिड प्रोलाइन (/ पी) है जब arginine कम हो जाता है कि इस तथ्य को लेने से किया जाता है.
    निश्चित संशोधन carbamidomethylation
    चर संशोधनों N-acetyl (प्रोटीन), ऑक्सीकरण (एम)
    मिस्ड चोली 3 करने के लिए ऊपर
    लेबल मापदंडों lys8 और arg10
    अधिकतम लेबल amminoacid Trypsin के लिए 3
    प्रारंभिक "एंड्रोमेडा" खोज में माता पिता के आयनों का बड़े पैमाने पर सटीकता 20 पीपीएम
    मुख्य "एंड्रोमेडा" खोज में माता पिता के आयनों की जन सटीकता 6 पीपीएम
    सीआईडी ​​MSMS के लिए बड़े पैमाने पर सटीकता 0.5 दा (दा per100 छह शीर्ष चोटियों)
    पेप्टाइड झूठे खोज दर (एफडीआर) 0.01
    प्रोटीन झूठे खोज दर (एफडीआर) 0.01 0.01 तक पेप्टाइड और प्रोटीन के लिए एफडीआर स्थापना की पहचान की दोनों पेप्टाइड और प्रोटीन झूठी सकारात्मक की 1% को रोकने के लिए उम्मीद कर रहे हैं कि इसका मतलब है. यह मान एक लक्ष्य फंदा डेटाबेस का उपयोग कर अनुमान लगाया गया है
    अधिकतम पीछे एरआतंक विरोधी संभाव्यता (पीईपी) 1 पीईपी एक व्यक्ति पेप्टाइड एक झूठी सकारात्मक मैच है कि संभावना है. अपनी सेटिंग में 1 के बराबर पीईपी सभी पेप्टाइड्स इस प्रकार छानने एफडीआर पर विशेष रूप से आधारित है पर ध्यान दिए बिना स्फूर्ति से लिया जा सकेगा.
    न्यूनतम पेप्टाइड लंबाई 6
    पेप्टाइड्स की न्यूनतम संख्या 2
    अद्वितीय पेप्टाइड्स की न्यूनतम संख्या 1
    केवल असंशोधित पेप्टाइड्स और ऑक्सीकरण (एम) का प्रयोग / एसिटाइल (प्रोटीन एन टर्म) विकल्प को सक्रिय उनकी बहुतायत इसी प्रोटीन का अनुपात शामिल न हो क्योंकि संशोधनों के साथ पेप्टाइड्स आम तौर पर प्रोटीन मात्रा का ठहराव के लिए नहीं गिना जाना चाहिए.
    न्यूनतम अनुपात गिनती 1
    "रन के बीच मैच" विकल्प को सक्रिय

    तालिका 3. डेटा विश्लेषण.

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    Discussion

    हमने हाल ही में ChroP, chromatin के प्रोटीन घटकों के बड़े पैमाने लक्षण वर्णन के लिए एक मात्रात्मक रणनीति का वर्णन किया है. ChroP epigenetic क्षेत्र में इस्तेमाल दो पूरक दृष्टिकोण, चिप और एमएस, अपनी ताकत से profiting और उनके संबंधित सीमाओं पर काबू पाने को जोड़ती है. गहरी अनुक्रमण (चिप seq) के लिए युग्मित चिप कुछ nucleosomes 35 के प्रस्ताव पर histone संशोधनों के जीनोम चौड़ा मैपिंग की अनुमति देता है. उनकी संवेदनशीलता के लिए फायदेमंद है, एंटीबॉडी आधारित assays के समान संशोधनों भेद करने के लिए अपनी क्षमता में और histone कोड 36 की मिश्रित पहलू विदारक में सीमित कर रहे हैं. एमएस hPTMs, अकेले और संयोजन 9 में से एक व्यापक और निष्पक्ष विश्लेषण प्रदान करता है, जबकि दूसरी ओर, यह अब तक ठिकाना विशिष्ट PTMs patters पर जानकारी के फलस्वरूप कमी के साथ, थोक chromatin का विश्लेषण करने के लिए लागू किया गया है. हम कार्यात्मक को अलग करने के लिए चिप का एक संशोधित संस्करण को रोजगारhistone PTM पैटर्न और गैर histonic प्रोटीन चिह्नित करने के लिए अलग chromatin डोमेन और मास स्पेक्ट्रोमेट्री विशेष रूप से सह समृद्ध.

    एन ChroP का उपयोग करके, H3K9me3 साथ सह जुड़े hPTMs का विश्लेषण चुप chromatin के साथ जुड़े मार्करों की एक महत्वपूर्ण संवर्धन, और सक्रिय chromatin के साथ जुड़े संशोधनों की कमी का पता चला. पिछले अध्ययनों 37 के साथ इन परिणामों के समझौते रणनीति की मजबूती साबित हुई. H3K9me3 डोमेन की एक्स ChroP में chromatin बातचीत प्रोटीन की SILAC आधारित जांच, जिससे विधि मान्य कुछ पहले से वर्णित interactors की पुष्टि की.

    ChroP chromatin की प्रोटिओमिक घटक जांच करने के लिए पहले से ही उपलब्ध रणनीतियों के संबंध में दो मुख्य मूल पहलुओं को प्रस्तुत करता है: उदाहरण के लिए, एक ही बरकरार मोनो Nucl भीतर अलग कोर histones सजा संशोधनों के बीच अंतर - आणविक synergisms प्रकट करने के लिए संभावनाएन चिप द्वारा शुद्ध eosome; histone वेरिएंट और linker histone उपप्रकार की विशिष्ट compartmentalization का आकलन करने के लिए दूसरा मौका. Histone वेरिएंट की जांच के लिए अच्छी गुणवत्ता अभिकर्मकों (यानी एंटीबॉडी) की कमी से वापस आयोजित किया जाता है, ChroP उनके स्थान और कार्यात्मक भूमिका का आकलन करने के लिए उपलब्ध अनूठे उपकरण के रूप में उभर रहे हैं.

    इसके वर्तमान में ChroP की एक सीमा कम पेप्टाइड्स और संशोधनों के बीच लंबी दूरी की कनेक्टिविटी का पता लगाने में फलस्वरूप हानि में पचा histones साथ, एमएस में इस्तेमाल पेप्टाइड केंद्रित ("नीचे अप") दृष्टिकोण में झूठ की स्थापना की. जैसे, "नीचे अप" एमएस विश्लेषण के साथ ChroP के विकार histone कोड के मिश्रित पहलू का आंशिक मूल्यांकन परमिट. हम इस तरह अब पेप्टाइड्स पर hPTMs मानचित्रण के लिए "मध्य और ऊपर से नीचे" के रूप में वैकल्पिक एमएस रणनीतियों, (> 20 एए) ऊपर बरकरार प्रोटीन पर करने के लिए 38-40, के कार्यान्वयन को दूर करेंगे कि कल्पनाइस संयम.

    कुल मिलाकर, एन और एक्स ChroP मोनो को oligo-nucleosomes के एक संकल्प के साथ, कार्यात्मक अलग डोमेन पर chromatin संरचना की जटिलता विदारक की संभावना के साथ, अत्यधिक पूरक हैं. हम ChroP उदाहरण प्रतिलेखन कारक (TFS) के लिए, विशिष्ट गैर histonic परमाणु प्रोटीन की उपस्थिति द्वारा चिह्नित chromatin क्षेत्रों की संरचना करने के लिए चिह्नित भी उपयोगी हो जाएगा भविष्यवाणी. इसके अलावा, ChroP वैश्विक transcriptional सक्रियण के दौरान उदाहरण के लिए, विभिन्न perturbations पर विशिष्ट loci में chromatin के गतिशील संरचना मैप करने के लिए कार्यात्मक अध्ययन में नियोजित किया जा सकता. इन कारणों के लिए, ChroP chromatin की प्रोटिओमिक परिदृश्य काटना उपलब्ध विश्लेषणात्मक रणनीतियों के शस्त्रागार में एक अतिरिक्त उपयोगी उपकरण के रूप में उभर रहे हैं.

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    Disclosures

    ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

    Acknowledgments

    इस शोध मूल रूप से मॉल सेल प्रोटिओमिक्स में प्रकाशित हुआ था. Soldi एम. और chromatin कार्यात्मक डोमेन की Bonaldi टी. प्रोटिओमिक जांच भिन्न हेट्रोक्रोमैटिन अवयव एमसीपी के बीच उपन्यास Synergisms का पता चलता है. 2013; 64-80: 12. © जैव रसायन और आणविक जीवविज्ञान के लिए अमेरिकन सोसायटी. हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए रोबर्टा Noberini (प्रौद्योगिकी और IEO के इतालवी संस्थान, इटली) धन्यवाद. टीबी काम गियोवन्नी Armenise-हार्वर्ड फाउंडेशन कैरियर विकास कार्यक्रम, कैंसर रिसर्च और स्वास्थ्य के इतालवी मंत्रालय के लिए इतालवी एसोसिएशन से अनुदान द्वारा समर्थित है. एमएस काम एक एफआईआरसी फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    DMEM  Lonza BE12-614F
    FBS Invitrogen 10270-106
    SILAC DMEM M-Medical FA30E15086
    Dialyzed FBS Invitrogen 26400-044
    Lysine 0 (12C6 14N2 L-lysine) Sigma Aldrich L8662
    Arginine 0 (12C6 14N4 L-arginine) Sigma Aldrich A6969
    Lysine 8 (13C6 15N2 L-lysine) Sigma Aldrich 68041
    Arginine 10 (13C6 15N4 L-arginine) Sigma Aldrich 608033
    Micrococcal Nuclease Roche 10 107 921 001
    Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets Roche 04 693 132 001
    Spectra/Por 3 dialysis tubing, 3.5K MWCO, 18mm flat width, 50 foot length Spectrumlabs 132720
    QIAquick PCR purification kit QIAGEN 28104
    Anti-Histone H3 tri-methylated K9-ChIP grade Abcam ab8898
    Histone H3 peptide tri-methyl K9  Abcam ab1773
    Dynabeads Protein G Invitrogen 100.04D
    NuPAGE Novex 4-12%                            Bis-Tris Gel  Invitrogen NP0335BOX
    Colloidal Blue Staining Kit Invitrogen LC6025
    LDS Sample Buffer Invitrogen NP0007
    Formaldheyde Sigma Aldrich F8775
    Aceti anhydride-d6 Sigma Aldrich 175641-1G
    Name Company Catalog Number Comments
    Formic Acid Sigma Aldrich 94318-50ML-F
    Iodoacetamide ≥99% (HPLC), crystalline Sigma Aldrich I6125
    DL-Dithiothreitol Sigma Aldrich 43815
    Sequencing Grade Modified Trypsin, Frozen 100 μg (5 × 20 μg) Promega V5113
    Nanospray OD 360μm x ID 75μm, tips ID 8 μm uncoated Pk 5 Microcolumn Srl FS360-75-8-N-5-C15
    ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 µm   15% C Dr. Maisch GmbH r13.aq.
    Carbon extraction disk, 47 mm Agilent Technologies 12145040
    Cation extraction disk Agilent Technologies 66889-U

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    ChroP दृष्टिकोण chromatin का ठिकाना विशिष्ट प्रोटिओमिक परिदृश्य काटना चिप और मास स्पेक्ट्रोमेट्री जोड़ती
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    Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP… More

    Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin. J. Vis. Exp. (86), e51220, doi:10.3791/51220 (2014).

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