Summary
Ao combinar nativa e reticulação da cromatina imunoprecipitação com alta resolução de Espectrometria de Massa, ChroP abordagem permite a dissecar a arquitectura proteómica composto de histonas modificações, variantes e proteínas não-histonic sinergia na cromatina domínios funcionalmente distintos.
Abstract
Cromatina é um complexo de nucleoproteína altamente dinâmico feitos de DNA e proteínas que controla vários processos dependentes de DNA. A estrutura da cromatina e a função em regiões específicas é regulada pelo local de enriquecimento de histonas modificações pós-tradução (hPTMs) e variantes, proteínas de ligação da cromatina, incluindo factores de transcrição, e a metilação do DNA. A caracterização proteômica da composição da cromatina em regiões funcionais distintas até agora tem sido dificultada pela falta de protocolos eficientes para enriquecer tais domínios na pureza e quantidade adequada para a posterior análise em profundidade por Espectrometria de Massa (MS). Descrevemos aqui uma estratégia proteômica cromatina recém-concebido, chamado ChroP (Chro roteomics matin P), em que a cromatina imunoprecipitação preparativa é usado para isolar regiões de cromatina distintas cujas características, em termos de hPTMs, variantes e co-associados proteínas não histonic, são analisado através de EM. Nós ilustramos elere a criação de ChroP para o enriquecimento e análise das regiões heterocromáticas transcricionalmente silenciosos, marcado pela presença de tri-metilação da lisina 9 na histona H3. Os resultados obtidos demonstram que o potencial de ChroP no completamente caracterizar o proteoma heterocromatina e provar como uma estratégia de análise poderoso para a compreensão de como os determinantes de proteínas distintas da cromatina interagir e sinergizam para estabelecer configurações estruturais e funcionais específicas para um local.
Introduction
Cromatina é um complexo de nucleoproteína altamente dinâmico, que está envolvido como modelo principal para todos os processos mediados por ADN. O nucleossoma é a unidade básica repetida de cromatina e consiste de um núcleo octamérico proteico contendo duas moléculas de cada histona H2A canónica, H2B, H3 e H4, em torno dos quais 147 pb de ADN são enrolados 1,2. Todas as histonas centrais são estruturados como um domínio globular e uma "cauda" N-terminal flexível que se projeta fora do nucleossomo. Um dos principais mecanismos de regulação da estrutura da cromatina e dinâmica é baseado no covalentes modificações pós-traducionais (PTMs), que ocorrem principalmente no terminal N das histonas 3,4. Modificações de histonas pode funcionar tanto alterando a estrutura de ordem mais elevada da cromatina, alterando os contactos entre as histonas-ADN ou entre nucleossomas, e, assim, controlar a acessibilidade de proteínas de ligação de ADN (mecanismos cis), ou actuando como dockinsites de g para proteínas reguladoras, seja como unidades individuais ou incorporados em complexos multiméricas. Tais proteínas reguladoras podem exercer a sua função de diferentes maneiras: por modulando directamente a expressão do gene (ou seja, proteínas TAF), ou através da alteração do posicionamento nucleossoma (isto é, a remodelação da cromatina complexos) ou por modificação de outros resíduos de histonas (isto é, proteínas com metil-transferase, ou acetil- atividade transferase) (mecanismos de trans) 5. A observação de que o aglomerado distinto padrões PTM cromatina em loci específicos conduziu à elaboração da hipótese de que diferentes modificações em locais distintos podem sinergizar a gerar um código molecular mediando o estado funcional do DNA subjacente. A "hipótese código de histonas" ganhou amplo consenso nos próximos anos, mas a sua verificação experimental foi retido por limitações técnicas 6,7.
Proteoma com base em espectrometria de massa (MS) tem emergido como umpoderosa ferramenta para mapear padrões de modificação de histonas e caracterizar proteínas de ligação da cromatina 8. MS detecta uma alteração como uma Δmass específica entre a massa experimental e teórica de um péptido. Ao nível das histonas individuais, MS fornece um método imparcial e abrangente para mapear PTMs, permitindo a detecção de novas modificações e interplays reveladoras entre eles 9-14.
Nos últimos anos, um número de estratégias têm sido desenvolvidas para dissecar a composição proteoma da cromatina, incluindo a caracterização de cromossomas mitóticos intactos 15, a identificação de proteínas de ligação solúveis hPTM 16-18 e o isolamento e a análise das regiões de cromatina específicos (isto é, telômeros) 19,20. No entanto, a investigação das sinergias específicas para um local entre PTMs de histonas, variantes e proteínas associadas à cromatina ainda está incompleta. Aqui, descrevemos uma nova abordagem, denominada ChroP (Chro roteomics matin P) 21, que temos desenvolvido para caracterizar de forma eficiente domínios de cromatina funcionalmente distintas. Esta abordagem adapta imunoprecipitação da cromatina (ChIP), um protocolo bem estabelecida utilizada na investigação epigenética, para a análise do proteoma com base no MS eficiente da amostra enriquecida. Nós desenvolvemos dois protocolos diferentes, dependendo do tipo de cromatina usado como entrada e a pergunta dirigida por MS; em particular: 1) CHIP da cromatina nativa unfixed digerido com MNase é empregado para purificar mono-nucleossomos e dissecar os hPTMs co-associando (N-ChroP); 2) ChIP de cromatina reticulado fragmentadas por sonicação é usado em combinação com uma estratégia baseada no interactomics SILAC caracterizar todos cromatina co-enriquecendo proteínas (X-ChroP) de ligação. Nós ilustramos aqui a combinação de N-e X-ChroP para enriquecer e estudando heterochromatin, usando H3K9me3 como isca para as etapas de imunoprecipitação. O uso de ChroP pode ser estendidoestudar tanto regiões distintas sobre cromatina, ou alterações na composição da cromatina dentro da mesma região durante a transição para um estado funcional diferente, abrindo assim o caminho para diversas aplicações em epigenética.
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Protocol
1. Cultura celular
- Médio padrão para Chip nativa
- Crescer as células HeLa em meio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% de glutamina, 1% de Pen / Strep e 10 mM de HEPES pH 7,5.
- Rotulagem SILAC para reticulação CHIP
- Crescer as células HeLa em meio DMEM, SILAC empobrecido de lisina e arginina, suplementado com 10% de FBS dialisado, glutamina a 1%, 1% de Pen / Strep, 10 mM de HEPES, pH 7,5 e, ou a luz L-lisina (Lys 0) e L- arginina (Arg 0) ou os seus homólogos pesados, L-lisina (Lys 8) e L-arginina (Arg 10) (Tabela Materiais), nas concentrações finais de 73 mg / L e 42 mg / L, respectivamente.
- Cultivar células para até oito gerações em meio SILAC para garantir ácidos aminados completos com código de incorporação de isótopos. Passa células a cada dois dias, quando atingem uma densidade de 1,0-1,5 x 10 6 células / ml, semeando-a aconcentration de 3 x 10 5 células / ml.
- Avaliar as células de crescimento e a viabilidade em meio SILAC individualizar qualquer alteração a partir de fisiologia que pode resultar a partir da composição mais pobre do meio SILAC; para fazer isso:
- Inspecione visualmente células morfologia ao microscópio todos os dias durante a marcação.
- Contagem de células e curvas de crescimento trama de células que crescem em SILAC contra médio padrão.
2. Native imunoprecipitação da cromatina (N-chip)
- Preparação Núcleos de células cultivadas
- Use 1-2 x 10 8 células não marcadas HeLaS3 por experimento. Células colheita, fazem parte alíquota de 50 x 10 6 de células em tubos de 50 ml e centrifugar a 340 xg durante 10 min a 4 ° C, lavá-las com PBS gelado.
- Ressuspender a cada sedimento de células em 8 ml de tampão de lise (Tabela 1) e incubar durante 10 min a 4 ° C sobre uma roda rotativa. Despeje carefully cada lisado celular sobre uma almofada de sacarose (Tabela 1) e de centrifugação num rotor basculante para fora, a 3.270 x g durante 20 min a 4 ° C, para separar os núcleos a partir do citoplasma.
- Descarte sobrenadante, mantenha pelotas nucleares e lavá-los duas vezes em PBS gelado por centrifugação, elimine o sobrenadante em cada lavagem.
- Micrococo Nuclease (MNase) digestão (pequena escala) e controle de qualidade da cromatina após a digestão
- Ressuspender o sedimento nuclear lavadas em 1 ml de tampão de digestão (Tabela 1); dividir em duas alíquotas de 500 ul e manter em gelo.
- Medir a densidade óptica (DO) a 260 nm de uma alíquota, diluiu-se 1:200 em 0,2% de dodecil sulfato de sódio (SDS) Nota:. OD = 1 corresponde a cerca de 50 ug / ml de ADN de cromatina. Tipicamente, a partir de 2 x 10 8 células, o OD está no intervalo de 40-60.
- Tomar 1% de núcleos, adicionar enzima MNase para uma concentração final de 0.005 U de enzima / mL de núcleos e incubar a 37 ° C durante lapsos de tempo diferentes (0, 10, 20, 40, 60 min).
- Em cada ponto de tempo, recolhe 4 ul de núcleos digeridos e adicionar EDTA a 1 mM, para parar a reacção MNase. Mantenha no gelo.
- Extrair amostras de DNA por kit de purificação PCR e elui-las em 50 ul de tampão TE (Tabela 1).
- Tomar 20 ul de cada amostra de DNA, adicionar 10 ul de tampão de carregar (Tabela 1) e carregar as amostras com 1% (w / v) de gel de agarose contendo brometo de etídio, com o marcador de PCR tal como um controlo de tamanho.
- Verifique a digestão avaliar a escada nucleossoma cromatina produzido por MNase incubação.
- Escolher o momento óptimo para a digestão, com base na prevalência de mono-nucleossomas na preparação. . Tipicamente para 0.005 U de enzima / mL de núcleos de o tempo óptimo de digestão MNase é 60 minutos (Figura 1B, painel esquerdo) Nota: O MNase óptima concentração / tempo de digestino pode ser ajustada dependendo do tipo de célula desejado e do tamanho de nucleossomas estiramento.
- Digestão e recuperação de frações de cromatina solúveis Large-scale/preparative MNase
- Adicionar a cada alíquota (ver 2.2.1) 5 ul MNase, correspondente a uma concentração final de 0,005 U de enzima / mL de núcleos; misturar gentilmente e incubar a 37 ° C durante 60 minutos (ou, em geral, para o intervalo de tempo optimizado, com base no teste em pequena escala).
- Adicionar EDTA 1 mM para parar a reacção e manter em gelo. Sedimentar os núcleos digeridos por centrifugação a 7800 xg, a 4 ° C durante 10 min. Transfira os sobrenadantes (fracção S1) em um novo tubo e armazenar a 4 ° C. Nota: S1 contém a primeira fracção solúvel de cromatina, compreendendo mono-nucleossomas. Adicionar os inibidores da protease (Tabela 1).
- Pelotas ressuspender cuidadosamente em 1 ml de tampão de diálise (Tabela 1) e diálise durante a noite a 4 ° C (cut fora do tubo de diálise é de 3,5 kDa), em 3 L Diálise Buffer, com agitação leve constante. Recolher o material dialisado e centrifugar a 7800 x g durante 10 min a 4 ° C. Transferir o sobrenadante (fracção S2) em um novo tubo Eppendorf e armazenar a 4 ° C. Nota: S2 compreende di-EPTA-nucleossomas, dependendo do grau de digestão MNase.
- Controle de Qualidade da cromatina antes de imunoprecipitação
- Tomar uma aliquota correspondente a 5 ng de S1 e S2 fracções de cromatina (quantificado através da medição da densidade óptica a 260 nm em um sistema NanoDrop). Extrair DNA por kit de purificação PCR e eluir em 50 ul de tampão TE (Tabela 1).
- Tomar 20 ul de S1 e S2 de ADN, misturar com 10 mL carregando Buffer (Quadro 1) e carregá-los em 1% (w / v) em gel de agarose. Verifique a qualidade e eficiência da digestão MNase por inspeção visual da escada nucleossomos Nota:. Fração S1 é altamenteenriquecida em mono nucleossomos, enquanto fração S2 contém principalmente poli-nucleossomos (Figura 1B, do painel à direita).
- A incubação com anticorpo de cromatina
- Armazenar a -20 ° C 50 ul da fração S1 para posterior análise Espectrometria de Massa.
- Adicionar 1 volume de ChIP tampão de diluição (Tabela 1) a fracção de S1.
- Adicionar o anticorpo contra o hPTM (ou proteína) de interesse; incubar durante a noite sobre uma roda rotativa, a 4 ° C. Nota: Tipicamente, utilizar 10 ug a 20 ug de anticorpo por 2 x 10 8 células. A relação óptima entre a quantidade de anticorpo e o número inicial de células deve ser cuidadosamente definido caso a caso, dependendo da abundância do hPTM / proteína usada como isco dentro da amostra e para a eficácia do anticorpo. Optimização é experimental, com base nos ensaios seguintes:
- Compare a quantidade de hPTM / proteína de interesse entre a entrada ea flow-through (FT,ver 2.7.2) por Western Blot ou MS para verificar que a imunoprecipitação enriquece uma proporção significativa da cromatina região específica Nota:. Isto é geralmente conseguido quando pelo menos 50% do isco hPTM / proteína é esgotada no FT (Figura 1C) .
- Verificar que a proteína de interesse é imunoprecipitada detectável em gel de SDS-PAGE, o que garante que uma quantidade suficiente de material está disponível para a análise MS Nota:. A presença no gel das bandas correspondentes aos quatro histonas centrais na estequiometria correcta indica que o nucleossoma intacto foi imunoprecipitada por N-ChroP (Figura 1D). Falta de estequiometria adequada é de fato indicativo de uma ruptura parcial / desdobramento do nucleossomo.
- Em paralelo, preparar as acoplados à proteína-G esferas magnéticas (ver 2.6).
- A equilibração e bloqueio acoplados à proteína G-esferas magnéticas
- Equilibrar 100 ul de proteína G-esferas magnéticas acopladas empastar em Solução de Bloqueio (Tabela 1), lavagem três vezes e incubando-os durante a noite a 4 ° C, numa roda rotativa Nota:. Seguindo a capacidade de ligação de grânulos, uso de 100 ul de suspensão durante 2-20 ug de anticorpo.
- Lave as contas bloqueadas, uma vez com solução de bloqueio e, em seguida, duas vezes com Tampão de Diluição ChIP (Tabela 1).
- Adicionar 100 ul de contas bloqueadas para a amostra cromatina S1 e incubar sobre uma roda rotativa, a 4 ° C durante 3 hr. Centrifugar a 340 xg por 1 min para girar a amostra da tampa das dicas. Coloque em um rack magnético para agregar as contas.
- Transferir o sobrenadante para um novo tubo de Eppendorf. Este é o fluxo através da (FT), ou seja, a fracção da cromatina que não se ligou ao anticorpo.
- Lavar as pérolas quatrovezes em Tampão de Lavagem (Tabela 1), aumentando a concentração de sal em cada lavagem (75, 125 e 175 mM de NaCl).
- Para eluir a cromatina imunoprecipitada, incubar as pérolas em 30 ul de tampão de amostra LDS, suplementadas com 50 mM de ditiotreitol (DTT) durante 5 min a 70 ° C. Separam-se as proteínas eluídas em 4-12% Bis-Tris acrilamida SDS-PAGE pré-fundido em gel com gradiente e mancha do gel com o kit de coloração de Coomassie coloidal (Figura 1D).
3. Reticulação imunoprecipitação da cromatina (X-chip)
- A reticulação das células com formaldeído
- Adicionar 0,75% de formaldeído para células marcadas com SILAC, misturar brevemente e incubar durante 10 min à temperatura ambiente. Extingue-se o formaldeído por adição de glicina 125 mM e incuba-se durante 5 minutos à temperatura ambiente.
- Dividir as células em 5 x 10 7 alíquotas; lavar três vezes com PBS gelado por centrifugação a 430xg por 5 min a 4 ° C e descartando o sobrenadante depois de cada lavagem. Na última lavagem, elimine o sobrenadante e manter o sedimento. Observação: Uma vez que as células são reticuladas, elas podem ser armazenadas à temperatura de -80 ° C, se não for usado imediatamente.
- Preparação Núcleos
- Ressuspender a cada sedimento celular em 10 ml de tampão de lise (Tabela 1). Incubar durante 10 min a 4 ° C com rotação. Centrifugar a 430 xg durante 5 min a 4 ° C. Rejeitar o sobrenadante; manter peletes nucleares.
- Ressuspender a cada pelete nuclear em 10 ml de tampão de lavagem (Tabela 1). Incubar à temperatura ambiente durante 10 minutos numa roda rotativa.
- Centrifugar a 430 xg durante 5 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e recolher os sedimentos.
- Ressuspender cada peletes nucleares em 3 ml de Tampão de Incubação ChIP (Tabela 1). Mantenha no gelo.
- Sonicação cromatina e controle de qualidade
- Sonicate ch. romatin a 200 W (ciclos de 30 segundos "on" e 1 min "off"), em um Bioruptor arrefecido, para fragmentar cromatina Nota: o número de ciclos de sonicação e intervalos depende do tipo de célula e da duração média das nucleossomal esticar desejado. Tipicamente, 30 minutos de sonicação são necessários para gerar fragmentos de ADN de 300-500 pb de comprimento, correspondendo a tri-nucleossomas di-e. A escolha do tamanho de fragmentos depende do tipo de domínio cromatina sob investigação.
- Tome 2% da quantidade total, reverter a reticulação por incubação a 65 ° C durante um mínimo de 1 hora em ChIP Tampão de Incubação. Extrair o ADN por kit de purificação de PCR, eluir em 50 ul de tampão TE e carregar o DNA em gel de agarose para verificar a fragmentação da cromatina.
- A incubação com anticorpo de cromatina
- Adicionar 1/10 volume de 10% de Triton X-100 a cromatina sonicado. Centrifugar a 12.000 xg durante 10 min a 4 ° C para sedimentar debris.
- Economize 50 l de entrada a partir de células da cromatina pesados para testar o nível de incorporação de aminoácidos SILAC em células marcadas e para criação de perfis de proteínas.
- Adicionar o anticorpo de escolha para a cromatina pesada e leve restante marcado sonicada e incubar durante a noite a 4 ° C sobre a roda de rotação. No canal de luz, adicionar também uma dobra em excesso do péptido solúvel. Incubar durante a noite a 4 ° C sobre uma roda rotativa Notas:. A condição ideal entre o ug de anticorpo e o material de partida de células é escolhido caso a caso, conforme discutido em 2.5.3. O excesso de molaridade vezes óptima do péptido solúvel em relação ao anticorpo deve ser cuidadosamente titulada caso a caso.
- Isolamento de cromatina utilizando contas magnéticas
- Equilibrar e bloquear acoplados à proteína-G esferas magnéticas, seguindo os passos descritos em 2.6 e usando o chip Incubação Buffer.
- Adicionar 100 ul de bloqueado beads para as amostras de cromatina e incubar numa roda rotativa durante 3 horas a 4 ° C. Centrifugar a 340 xg por 1 min para girar a amostra da tampa das dicas. Coloque em um rack magnético para agregar as contas. O sobrenadante é o fluxo através da (FT), contendo nucleossomas desacoplado. Lavar contas quatro vezes em Tampão de Lavagem (Tabela 1) com o aumento da concentração de sal (duas lavagens a 150 mm e dois de NaCl 300 mM).
- Incubar grânulos em 30 ul de SDS-PAGE Carregando Tampão de amostra (Tabela 1) e durante 25 min a 95 ° C para ambos eluir e des-de reticulação das proteínas imunoprecipitadas. Proteínas separadas em 4-12% Bis-Tris acrilamida SDS-PAGE géis pré-moldados (Figura 3D).
4. Preparação de Amostras Antes MS
- Em Gel digestão de histonas enriquecidos de N-chip
Nota: Durante a digestão de proteínas e de extração de peptídeo etapas cuidarpara minimizar as contaminações de queratina que interferem com a LC-MS/MS, como anteriormente descrito 22, 23.- Cortar fatias de gel correspondentes para as histonas centrais bandas (Figura 1D). De-manchar as peças de gel com 50% de acetonitrila (ACN) em DDH 2 O, alternando-se com 100% de ACN para diminuir o gel. Repita até geles peças são completamente de-coradas e secá-las em uma centrífuga de vácuo.
- Adicionar D-6, anidrido acético 01:09 (v / v) em 1 M de bicarbonato de amónio (NH 4 HCO 3) (tipicamente o volume final é de 60-100 ul) e 3 ul de acetato de sódio (CH3 COONa), como catalisador. Incubar durante 3 horas a 37 ° C, com forte agitação Nota:. A amostra pode gerar bolhas nos primeiros minutos após a montagem da reação: é importante para lidar com cautela e liberar o gás gerado, abrindo de vez em quando os tubos durante a incubação.
- Lavar os pedaços de gel várias vezes wom NH 4 HCO 3, alternam com ACN a percentagem crescente (de 50% a 100%), de modo a eliminar completamente os resíduos de D-6 anidrido acético.
- Encolher os pedaços de gel em 100% ACN; secá-las em uma centrífuga de vácuo para garantir a completa de-hidratação. Pedaços de gel re-hidratado com gelado de 100 ng / mL em 50 mM de solução de tripsina de NH 4 HCO 3 e incubar durante a noite a 37 ° C. Nota: A combinação de modificação química de lisinas utilizando anidrido acético deuterado e digestão com tripsina gera um "Arg- C, como "em gel padrão de digestão das histonas 21,24.
- Descartar o excesso de solução e adicionar um volume de 50 mM NH 4 HCO 3 a cobrir completamente os pedaços de gel; incubar durante a noite a 37 ° C.
- Recolhe péptidos digeridos solúveis em um novo tubo de Eppendorf. Liofiliza péptidos. Ressuspender los em 0,5% de ácido acético acid/0.1% de ácido trifluoroacético (TFA). Dessalinizar e concentrarpeptídeos em uma fase reversa C 18 / Carbono "sanduíche" e cromatografia de troca iônica (SCX) em microcolunas feitos à mão (StageTip) 25.
- Prepare os microcolunas StageTip colocando discos meshworks Teflon contendo C imobilizado 18 / Carbono ("sandwich") e contas em SCX de 200 dicas mL. Obter a "sanduíche", de carregar a C 18 Microcoluna no topo de uma segunda ponta de filtro carregado com carbono Nota:. Os péptidos muito curtos, que não são retidos no filtro de C 18, passar o fluxo de passagem, que é carregada directamente na Dica de carbono, que normalmente capta-los. StageTips SCX pode enriquecer péptidos específicos, tais como H3 (3-8) peptídicas, não eficazmente retida por meio de cromatografia de fase inversa.
- Carga de 50% de peptídeos para o C 18 / Carbono "StageTip sanduíche" e 50% para SCX StageTips. Eluir-los das pontas C 18 / carbono, utilizando 80% ACN/0.5% ac acéticoID e do Tips SCX com hidróxido de amónio a 5% (NH 4 OH) / 30% metanol. Depois de peptídeos liofilização, ressuspender em 0,1% FA e analisar por LC-MS/MS.
- No gel de digestão de proteínas imunopurificados
No gel de digestão das proteínas é levada a cabo como anteriormente descrito 22, com pequenas modificações.- Corte cada pista em dez fatias (Figura 3D) e cada fatia em pequenos cubos de 1 milímetro 3. De-manchar as peças de gel com 50 mM NH 4 HCO 3 etanol / 50% e adicionar etanol absoluto a encolher os géis. Repetir até que os géis são completamente de-coradas.
- Adicionar tampão de redução (tabela 1) para os pedaços de gel durante 1 hora a 56 ° C, seguido pela adição de tampão de alquilação (Tabela 1) durante 45 minutos à temperatura ambiente, no escuro. Lavar e secar as peças em gel centrífuga de vácuo.
- Reidratar os pedaços de gel com gelado de 12,5 ng / mL sol tripsinauição em 50 mM NH 4 HCO 3 e incubar em gelo até a reidratação completa dos pedaços do gel. Retirar tripsina em excesso.
- Adicionar 50 mM NH 4 HCO 3 a cobrir completamente os pedaços de gel. Incubar durante a noite a 37 ° C.
- Colete a parte líquida. Adicionar o tampão de extracção (Tabela 1) para os pedaços de gel; incubar com forte agitação durante 10 minutos à temperatura ambiente. Repita duas vezes.
- Incubar os pedaços de gel em ACN por 10 min, com forte agitação. Repita duas vezes e reunir todos os sobrenadantes.
- Liofilizar os peptídeos. Ressuspender péptidos secos em 0,5% de ácido acético acid/0.1% TFA.
- Dessalgar e concentrar péptidos em fase reversa C 18 StageTip, como descrito 26, 27.
- Eluir peptídeos a partir do C 18 StageTip usando 80% ACN/0.5% de ácido acético. Remover o solvente orgânico por evaporação numa centrífuga de vácuo e ressuspender os péptidos em 0,1% de FA (tipicamente 5-10 &# 181; l), quando estiver pronto para a análise MS.
5. LC-MS Análise
- A análise por cromatografia líquida
- Encher a coluna analítica em 15 centímetros fundido emissor de sílica (75 um de diâmetro interno, diâmetro externo 350 um), utilizando-se em fase reversa (RP) C 18, 3 mM de resina em metanol, a uma pressão constante de hélio (50 bar), utilizando um dispositivo bomba-loader, como descrito anteriormente 28.
- Par o emissor embalado (coluna C 18 RP) directamente para a saída da válvula de 6 portas de HPLC através de um (25 um de diâmetro interno) de comprimento de 20 cm de sílica fundida, sem o uso de pré-coluna ou dispositivo de divisão.
- Carregar os peptídeos digeridos em coluna C 18 RP no fluxo de 500 nl / min, a fase A móvel (0,1% de FA / 5% de ACN em ddH2O).
- Após o carregamento da amostra, separar os péptidos com as seguintes gradientes:
- Aplicar 0-40% de fase móvel B (0,1% FA/99% ACNem ddH2O) em 250 nl / min, mais de 90 min seguido por um gradiente de 40-60% em 10 minutos e 60-80% ao longo de 5 min, por eluição de péptidos derivados a partir de histonas (ver 2).
- Aplicar 0-36% de fase móvel B a 250 nl / min durante 120 minutos, seguido de um gradiente de 36-60% em 10 minutos e 60-80% ao longo de 5 min, por eluição de péptidos derivados de proteínas imunopurificada (ver 3).
- Análise Espectrometria de Massa usando LTQ-FT-ICR-Ultra espectrômetro de massa
- Atuar de aquisição dependente do modo de dados (DDA) para alternar automaticamente entre MS e aquisição MSMS. MS espectros de varrimento total são adquiridos, geralmente na faixa de m / z de 200-1,650, é adquirida com a resolução R = 100.000 a 400 m / z. Os cinco (Top5) íons mais intensos são isolados para a fragmentação no ion trap linear usando uma dissociação induzida por colisão (CID), com um valor-alvo de 5.000.
- Use os parâmetros listados na Tabela 2 for o arquivo de aquisição "Sintonia".
- Defina as configurações de aquisição padrão conforme a lista na tabela 2.
6. Análise de Dados
- Rotular quantificação livre de modificações de histonas co-enriquecidas em domínios de cromatina
- Converta os arquivos brutos adquiridos para arquivos MGF usando software Raw2msm (versão 1.10) 29.
- Procure nas modificações de histonas usando Mascote Deamon (versão 2.2.2), estabelecendo os parâmetros descritos na Tabela 3.
- Na lista de peptídeo saída Mascote, remover peptídeos com pontuação inferior a 15 anos ou com mais de 5 PTMs putativos 29 Nota:. Para cada ID único peptídeo, selecione o peptídeo com a maior pontuação da mascote e filtrar todos os outros peptídeos redundantes com o mesmo ID .
- Construa os cromatogramas de íons extraídos (XIC) para cada precursor correspondente a cada peptídeos modificados, based sobre o valor de m / z, utilizando o QualBrowser. Calcula-se a área sob a curva (AUC) para cada pico (Figura 2A).
- Validar cada peptídeos identificados contendo modificações por inspeção visual dos espectros MS / MS usando o QualBrowser (Figura 2B).
- Calcular a abundância relativa de cada péptido modificado. Calcular o enriquecimento relativo de cada modificação no material de aparas-ed Nota:. Abundância relativa é calculado como a razão entre a AUC de cada peptídeo modificado específica sobre a soma de AUC de todas as formas do mesmo péptido modificados e não modificados, enquanto que em relação enriquecimento como a razão entre a abundância relativa de modificação específica no chip através da entrada (Figura 2C).
- Análise proteômica quantitativa de proteínas co-associado dentro de domínios de cromatina
- Para a identificação e quantificação de proteínas de utilizar o pacote MaxQuant(Http://www. Maxquant.org /) 30. Configure o mecanismo de busca embutido "Andromeda" usando o AndromedaConfig.exe 31 e definir os parâmetros de pesquisa listados na Tabela 3.
- Teste de Incorporação
- Estimar o grau de incorporação de aminoácidos em proteínas pesados na entrada da cromatina pesada marcado, utilizando software MaxQuant, como se segue:
- Defina os parâmetros conforme descrito no ponto 6.2, mas desabilitar a opção de re-quantificar.
- Calcular a percentagem de incorporação de aplicar a seguinte fórmula para proporções de peptídeos não redundantes:. Incorporação (%) = relação (H / L) / proporção (H / L) + 1 × 100 (Figura 3B) Nota: Aceitar apenas se incorporação> 95 %.
- Estimar o grau de incorporação de aminoácidos em proteínas pesados na entrada da cromatina pesada marcado, utilizando software MaxQuant, como se segue:
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Representative Results
Imunoprecipitação da cromatina é uma técnica poderosa usada para perfilar a localização de uma proteína ou de uma modificação da histona ao longo do genoma. Em um equivalente proteômica, chip é seguido por proteômica baseados em MS para identificar qualitativa e quantitativamente os hPTMs, variantes de histonas e proteínas de ligação da cromatina que são imuno juntamente com a modificação ou a proteína de interesse, usado como "isca". Na abordagem de N-ChroP, descrito na Figura 1A, ChIP nativa, em que a cromatina é digerido com MNase (Figura 1B), é usado como entrada para purificar grandes quantidades da cromatina um domínio funcional distinta. Cromatina digerido enriquecido em mono-nucleossomas é incubado com um anticorpo específico e as proteínas imunopurificada são separadas por SDS-PAGE. No exemplo ilustrado, H3K9me3, marcador de cromatina silenciosa 32,33, é usado para configurar a abordagem. A escolha baseia-se no facto de que tanto o seu papel funcionalbem como alguns dos seus interactores proteína está bem descrita. Além disso, um anticorpo altamente específica e eficiente optimizado para a apara está disponível 34, como também confirmada por inspecção visual do gel com Coomassie, onde o nucleossoma intacta, com as histonas centrais na estequiometria correcta, é enriquecido em quantidades adequadas para a MS (Figura 1E ).
A comparação entre a quantidade de H3K9me3 presente no fluxo de passagem (FT) e de entrada (IN), indica que cerca de 50% da região de interesse é imunopurificada, excluindo o risco de erros devido ao enriquecimento de uma sub-população de menor cromatina (Figura 1C). A EM é utilizado para caracterizar a PTMs co-associado dentro dos nucleossomas enriquecidos: cada histona núcleo é digerida utilizando um protocolo concebido ad hoc, a fim de atingir um "Arg-C, como" digestão, em gel de poliacrilamida. De facto, por um lado, Arg-C é a melhor para a protease de análise por MS de hPTMs because produz peptídeos de comprimento ideal; por outro lado, não clivar eficazmente em gel. Para superar esta limitação, o protocolo adaptado explora a alquilação química de lisina conseguida por incubação de bandas de gel de histonas com deutério (D 6) de anidrido acético, seguido por digestão com tripsina. Desde tripsina não pegará D lisinas 3-acetilados, os peptídeos resultantes imita uma mistura "Arg-C como" padrão (Figura 1E).
A adição de um D 3-acetilo a uma lisina produz uma massa delta inequívoca de 45,0294 Daltons, discriminar entre acetilações nativas e adicionados quimicamente em MS. Além disso, D 3-acetilação oferece duas vantagens adicionais que facilitam o discernimento de péptidos modificados isobáricas: primeiro, a alquilação ocorre apenas em lisinas modificadas e mono-metilado, mas não sobre os resíduos de di-e tri-metilados; como tais peptídeos modificados com o mesmo totnúmero al de modificações, mas em arranjos diferentes são diferencialmente decorado pelo conjunto distinto de D grupos 3-acetil que produzem inequívocos turnos m / z. Em segundo lugar, os padrões distintos de D-3 alquilação causar ligeiramente diferentes tempos de retenção em cromatografia líquida em coluna de fase inversa, o que gera um nível adicional de separação para os péptidos modificados isobáricas 21.
Após a validação de todos os hPTMs por inspecção manual dos espectros de MS / MS correspondente (Figura 2B), a quantificação livre rótulo é conseguida em dois passos: em primeiro lugar, calcula-se a abundância relativa de cada modificação usando a intensidade do sinal das espécies não modificados e modificados para o péptido correspondente, medida por meio do cálculo dos cromatogramas iónicos extraídos (XIC) (Figura 2A e 2C, painel superior); segundo, o enriquecimento relativo é calculado como a razão entre a abundância relativa de cada modification na octâmero ChIP-ed e a abundância relativa correspondente de entrada (figura 2C, painel inferior). A análise do H3 (9-17) peptídeo mostra o enriquecimento de di-e tri-metilado K9, com o esgotamento correspondente das formas modificadas e mono-metilado (Figura 2C). Com isso resulta como controlo positivo para a especificidade do anticorpo, a co-associação ou depleção de todas as outras modificações podem ser avaliadas, tanto a nível intra-molecular na mesma H3 e ao nível inter-molecular, em outras histonas co-enriquecidas dentro o mesmo nucleosome. Isto permite o rastreio de hPTMs conversas cruzadas dentro dos domínios H3K9me3, o assim chamado "modificome heterocromatina" (Figura 2D): o enriquecimento significativo de marcadores conhecidos associados ao silenciamento de genes, com o esgotamento correspondente de marcadores relacionados com a activação de genes é observado . Além disso, novas associações são detectados, tais como o enriquecimento de H3K18me1.
Para o rastreio de todas as proteínas co-relacionando dentro de heterocromatina, o chip de reticulação clássica é combinado com SILAC (Stable Isótopos Rotulagem por Aminoácidos em cultura celular) (Figura 3A). No experimento SILAC, a lisina e arginina (forma de luz) são substituídos por seus análogos marcados com isótopos (forma pesada) no meio de cultura. Após a células cultivadas e replicação tanto em luz e meios de pesada, os dois aminoácidos codificados diferencialmente-isótopos são metabolicamente incorporada em proteínas, gerando leves e pesadas formas de proteínas, respectivamente, que são distinguíveis por MS, devido a um Δmass específico. Antes de iniciar um experimento SILAC em grande escala, a eficiência de marcação é avaliada, o cálculo do nível de incorporação, medida como a fração percentual de peptídeos pesadas contra a soma de os pesados e leves, encontrada na amostra apenas pesado rotulados. Incorporação superior a 95% tanto para arginina pesado e eleAvy lisina é necessária para a quantificação exacta de proteína (Figura 3B). Após a reticulação de células pesadas e leves, a cromatina é fragmentado por sonicação. SILAC é usado em conjunto com um ensaio de competição utilizando um excesso de péptido de dobragem H3 solúvel (QTAR K STGG) que carrega o tri-metilação na K9, a fim de discriminar interactores H3K9me3 específicos de fundo. O péptido solúvel é adicionado em excesso de um dos dois experimentos SILAC de chip, em que satura a capacidade de ligação do anticorpo, assim, "a competir para fora" a maioria dos H3K9me3-nucleossomas e, por conseguinte, todos os interactores específicos. No outro canal SILAC, o peptídeo concorrente não é adicionado ao chip eo imunoprecipitação ocorre normalmente. Experimentos SILAC concorrência são normalmente realizadas em duplicata nos chamados "Forward" e "Reverse" formatos, onde a competição com o peptídeo solúvel em excesso está ligado a partir de diae pesada (H) para a luz (L) das amostras de cromatina. Isto resulta em leituras de relação SILAC invertidas complementares, usados para discernir genuíno de ligantes não específicos: proteínas especificamente enriquecido estão presentes com uma intensidade mais elevada, na forma de construção em comparação com a forma de luz (taxa de proteína H / L> 1), na experiência em que o excesso péptido é adicionado ao canal de luz (para a frente) (Figura 4A, painel superior); uma tendência oposta (razão proteína H / L <1) é observado na réplica inversa (Figura 4A, painel inferior). Proteínas cuja intensidade na forma leve e pesada são semelhantes em ambos frente e verso experimentos produzir uma constante relação próxima de 1 e são classificados como fundo (Figura 4B).
A escolha do excesso de dobragem óptima para o péptido solúvel é importante e deve ser ajustado de forma precisa. Normalmente, estabelecemos a proporção correta anticorpo-to-peptídeo realização de um ensaio usi competiçãong diluições em série de excesso de peptídeo e a comparação do nível do "engodo" (hPTM / proteína) entre o chip de controlo positivo, em que o peptídeo não é adicionado, e as diferentes chips de concorrência em série, por western blot ou MS. Geralmente, o excesso de péptido óptima vezes reduz de cerca de 90% a quantidade de hPTM / proteína no material imunoprecipitado. De facto, por um lado, quanto maior for a proporção de proteína obtida, maior será o poder de discriminação de SILAC; por outro lado, um excesso de saturação por o péptido pode desalojar completamente os ligantes específicos do anticorpo, levando assim à ausência de rácios H / L para a quantificação e análise estatística. Para anticorpo H3K9me3 definimos a proporção correta de medir a relação H / L para o QTARK (me3) STGG peptídeo, em um teste de competição realizado em um Forward configurar e levamos este valor como uma medida da eficiência da concorrência (Figura 3C ).
A intersecção da frente umad Reverso experimentos X-chip leva à identificação de 635 proteínas, presentes em ambos os experimentos e quantificadas com pelo menos 2 contagens de razão. O log 2 trama de suas relações H / L representam o chamado "heterochromatome" (Figura 4C), onde os interagentes H3K9me3 genuínos são inequivocamente identificadas como as proteínas presentes no top 40% das distribuições rácio proteínas (quadrante superior direito do o gráfico de dispersão e Figura 4D).
Figura 1: Representação esquemática do fluxo de trabalho N-ChroP A) Esquema de CHIP nativa combinada com a análise MS.. A cromatina de células é digerida com MNase e a fracção enriquecida em mono-nucleossomas (S1) é imunoprecipitado utilizando um anticorpo anti-H3Anticorpo K9me3. Imunopurificada proteínas são separadas por SDS-PAGE e as histonas centrais estão em com um protocolo ad hoc para imitar uma digestão Arg-C digerido em gel. Os péptidos são analisados por nano-LC-MS/MS. PTMs histonas são identificados, validado por inspecção manual dos espectros MS / MS e quantificado B) teste de MNase pequena escala:. ADN resolvido num gel de agarose a 1%, após digestão da cromatina com MNase no lapso de tempo diferente (painel da esquerda); digestão MNase grande escala:. DNA resolvido em um gel de agarose a 1%, após 60 minutos de digestão da cromatina MNase e após a separação da fração S1, contendo mono-nucleossomos de S2 facção, contendo poli-nucleossomos (painel direito) C) Estimativa de enriquecimento / depleção de não modificado, mono-, di-, e tri-K9 metilado no fluxo de passagem (FT) em comparação com a entrada (IN). Histograma representa a média ± SEM de três experiências independentes para cada modificação. D) SDS-PAGE de entrada da cromatina e co-imuno proteínas purificadas: núcleo histonas H3, H4, H2A e H2B são visíveis ao redor e abaixo da banda de 17kDa, com H3 e H2B co-migração (quadrados pretos) E) Cada histona núcleo de ambos os nucleossomos e entrada imuno são quimicamente alkylated usando deuterado (. D 6)-acético-anidrido antes de tratamento com tripsina, a fim de obter uma "Arg-C, como" em gel de digestão. O anidrido 6 D-acético reage com o grupo amino epsilon de lisinas modificadas e mono-metilado, mas não metilado com di-, tri-lisinas metilados e acetilados. Como resultado, a atividade enzimática da tripsina é bloqueado em toda a lisina acetilada nativa e química, produzindo, assim, um "Arg-C como" padrão de digestão. Esta figura foi modificada de 21, usando a Figura 1, Figura S1 e S5 figura como referência. Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 2:. Análise de Espectrometria de Massa da "modificome" H3K9me3 A) espectro de massa de zumbido e cromatogramas iónicos extraídos (XIC) construído no valor de m / z correspondente a 2 + cobra não modificado, mono-, di-, e tri-metilado K9 no H3 (9-17) peptídeo, tanto para amostras de entrada e chip. B) Representante espectros MS / MS usando fragmentação CID. A série b-íon e y-íon permitem definir a seqüência de H3 (9-17) e peptídeo para localizar especificamente o tri-metilação no K9 resíduo. C) Abundância relativa dos diferentes graus de metilação em K9 no H3 ( 9-17) péptido, calculada dividindo a área sob a curva (AUC) de cada péptido modificado pela soma das áreas correspondentes a todos os observados unmodified e formas modificadas do referido péptido, na entrada e ChIP-octâmero ed. Histograma representa a média ± SEM de três experiências independentes para cada modificação (painel superior). O enriquecimento relativo dos methylations K9 em H3 (9-17) péptido. O enriquecimento é expressa como uma razão de log 2 entre a abundância relativa de cada metilação no octâmero ChIP-ed como comparar a entrada. Histograma representa a média ± SEM de três experiências independentes (painel inferior). D) Mapa de calor que resume o enriquecimento de todos os co-hPTMs associando identificados em histona H3, H4 e H2A. Cada linha corresponde a uma modificação diferente (nd não são detectadas modificações). Esta figura foi modificada de 21, usando a Figura 1, Figura 2, Figura 3 e Figura S10 como referência. Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 3: Representação esquemática de X-ChroP fluxo de trabalho A) Esquema de reticulação CHIP combinada com a análise MS.. As células cultivadas em luz e mídia pesada são fixados com entradas de formaldeído e cromatina são fragmentados por sonicação para gerar fragmentos de DNA. Em uma frente criada, a cromatina pesado marcado sonicado é imunoprecipitou usando anticorpo anti-H3K9me3 enquanto a cromatina luz marcado é incubado com o mesmo anticorpo saturado com uma dobra excesso de peptídeo H3 solúvel tendo K9me3. As proteínas imunoprecipitadas a partir de cromatinas pesadas e leves são reunidas, extraídas e separadas por SDS-PAGE. As proteínas são digeridas com tripsina e os péptidos são analisados por nano-LC-MS/MS. B) Eficiência de rotulagem SILAC é monitorizada cálculo da incorporação de Lis pesadosine (Lys8) e arginina (Arg10) em proteínas. Na trama, a mediana da distribuição de densidade de lisina e arginina peptídeos é igual a 0,974 (linha verde) e 0,964 (linha vermelha), respectivamente. C) espectros de massa Zoomed para o valor m / z correspondente da 2 + cobrar tri-metilado K9 no H3 (9-17) peptídeo, tanto para a luz e as formas pesadas, na entrada e chip-ed octâmero. Enquanto na entrada das intensidades de péptido leve e pesada estão próximos de 1, no avanço SILAC ChIP, a intensidade de luz péptido é muito mais baixa do que a do homólogo pesado, indicando assim uma competição eficaz. D) SDS-PAGE da luz (L) e pesada (H) marcados entrada da cromatina e do material co-imunoprecipitada: a pista correspondente ao material de aparas, ed é cortado em fatias de dez (linha preta), enquanto que apenas duas fatias de entrada são analisados por análise do teste de incorporação ( linha azul). Esta figura foi modificada de 21, usando a Figura 4 e Figura S6 como recia. Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 4: análise de Espectrometria de Massa da "interactoma" H3K9me3. A) espectro completo Representante mostrando o par SILAC correspondente a peptídeos e proteínas de HP1 macro-2A: os rácios H / L> 1 no experimento (painéis superiores a prazo), espelhado por um relações H / L <1 na réplica Reversa (painéis inferiores), demonstram o enriquecimento específico destas proteínas em heterochromatin B) espectro completo Representante com SILAC par correspondente ao peptídeo da proteína de um fundo:. relações H / L em direta e reversa repetições são iguais a 1 C) proteínas quantificados. estão distribuindoed em um gráfico de dispersão com base em suas SILAC-rácios entre a frente e experimentos reversa (eixos X e Y, respectivamente); linhas pontilhadas vermelhas representam o top 40% e 30% dos índices de proteína, como indicado. distribuições rácios D) de proteína de entrada (H / L misturado 1:1) (preto), Forward (azul) e reverso (laranja) X-ChroP experiências; linhas pontilhadas vermelhas representam o topo de 40% dos índices de proteína, definidas como cortes para selecionar os interagentes genuínos. Esta figura foi modificada de 21, usando a Figura 5 como referência. Clique aqui para ver imagem ampliada.
| Buffer para a seção 2 | Composição |
| Tampão de Lise | 10% de sacarose, 0,5 mM de EGTA, pH 8,0, NaCl 15 mM, KCl 60 mM, HEPES 15 mM, 0,5% de Triton, PMSF 0,5 mM, DTT 1 mM, 5 mM de NAF, 5 mM de Na 3 VO 4, 5 mM NaButyrate, 5 mg / ml de aprotinina, 5 mg / ml de pepstatina A, 5 mg / ml de Leupeptina |
| Almofada de sacarose | 2 g de sacarose em 20 ml de Tampão de Lise |
| Digestão buffer | 0,32 M de sacarose, 50 mM Tris-HCl pH 7,6, MgCl2 4 mM, CaCl2 a 1 mM, PMSF 0,1 mM |
| Tampão TE | 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM de EDTA |
| Diálise Tampão | 10 mM Tris-HCl pH 7,6, EDTA 1 mM, PMSF 0,5 mM, 5 mM de NAF, 5 mM de Na 3 VO 4, 5 mM NaButyrate, inibidores de protease |
| CHIP tampão de diluição | 100 mM Tris-HCl pH 7,6, 100 mM de NaCl e 10 mM de EDTA |
| Solução de Bloqueio | BSA 0,5% em PBS |
| Tampão de Lavagem | 50 mM Tris-HCl pH 7.6,10 mM EDTA |
| Inibidores da Protease | EDTA livre de inibidores de protease, PMSF 0,5 mM, NAF 5 mM, Na3VO4 5, 5 mM NaButyrate |
| Carregando Tampão | corante laranja de carga, 50% (v / v) de glicerol em H20 |
| Buffer para a seção 3 | Composição |
| Tampão de Lise | 50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, NaCl 140 mM, EDTA 1 mM, 10% glicerol, 0,5% de NP-40, 0,25% de Triton-100, PMSF 0,5 mM, 5 mM de NAF, 5 mM de Na 3 VO 4, 5 mM NaButyrate, 5 mg / ml de aprotinina, 5 mg / ml de pepstatina A, 5 mg / ml de Leupeptina |
| Tampão de Lavagem | 10 mM Tris-HCl pH 8, NaCl 200 mM, EDTA 1 mM, EGTA 0,5 mM, PMSF 0,5 mM, 5 mM de NAF, 5 mM de Na 3 VO 4, 5 mM NaButyrate, 5 mg / ml de aprotinina, 5 mg / ml de Pepstatina A , 5 mg / ml de Leupeptina |
| CHIP Incubação de buffer | 10 mM Tris-HCl pH 8, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, EGTA 0,5 mM, desoxicolato de sódio a 0,1%, lauroylsarcoside de sódio a 0,5%, PMSF 0,5 mM, 5 mM de NAF, 5 mM de Na 3 VO 4, 5 mM NaButyrate, 5mg / ml de aprotinina, 5 mg / ml de pepstatina A, 5 mg / ml de Leupeptina |
| Lavar tampão 2 | 20 mM Tris-HCl pH 7,6, EDTA 2 mM, 0,1% de SDS, 1% Triton-100 |
| Carregando Sample Buffer | 250 mM Tri-HCl pH 8,8, 0,5 M B-mercaptoetanol, 2% de SDS |
| Buffer para a seção 4 | Composição |
| Alquilação de buffer | 55 mM de iodoacetamida em 50 mM NH 4 HCO 3 |
| Redução de buffer | 10 mM de ditiotreitol em 50 mM NH 4 HCO 3 |
| Tampão de Extracção | 30% de ACN e 3% de TFA em ddH 2 0 |
Tabela 1. Composição buffers.
| Ajustando arquivo aquisição | Parâmetros |
| FT sca completon | acumulação de valor-alvo de 1 x 10 6; tempo de enchimento máximo de 1.000 ms |
| MSn TI | acumulação de valor-alvo de 10 x 10 4; tempo máximo de enchimento 150 mseg |
| Definição Aquisição | Parâmetros |
| Tensão Electropulvcrização | 2,4 kV |
| Bainha e fluxo de gás auxiliar | Não |
| Ion transferência temperatura capilar | 200 ° C |
| Exclusão dinâmica | até 500 íons precursores de 60 segundos sobre MSMS |
| Largura massa Exclusão | 10 ppm |
| Energia de colisão normalizada usando o modo de ativação de banda larga | 35% |
| Limiares de seleção de íons | 100 contagens |
| Q Ativação | 0,25 |
| Activtempo ção | 30 ms |
Tabela 2. Configurações ms.
| Pesquisa MASCOR Deamon | Parâmetros | Notas |
| Banco de dados | depende do organismo (isto é, para as células HeLa: base de dados humana, versão 3.68; 87.061 entradas) | |
| Enzima | Arg-C | Arg-C clivam na extremidade C-terminal de todos os resíduos de arginina |
| Modificações variáveis | acetilo (K), oxidação (M), D 3-acetilação (K), metil-D-3 - acetil-(K), dimetil (k), trimetil (K) | acetil [42,010 Da], oxidação [15.995 Da], D3-acetilação [45,0294 Da], metil-D3-acetil [soma de 14,016 Da e 45,0294 Da], dimetil [28,031], trimetil [42,046 Da] |
| Clivagens perdidas | até 2 | |
| Precisão Missa dos íons pais na busca | 10 ppm | |
| Mass-precisão para CID MSMS | 0.5 Da | |
| Pesquisa MaxQuant | Parâmetros | Notas |
| Banco de dados | depende do organismo | |
| Enzima | tripsina / P | Clivagem de tripsina, no C-terminal de todos os resíduos de lisina e de arginina. A pesquisa é executada tendo em conta o facto de que a eficiência de tripsina para clivar a lisina e a arginina é reduzida quando o próximo aminoácido é a prolina (C / P). |
| Modificação fixa | carbamidomethylation | |
| Modificações variáveis | N-acetil (proteína), oxidação (M) | |
| Clivagens perdidas | até 3 | |
| Parâmetros de etiqueta | lys8 e arg10 | |
| Amminoacid máxima rótulo | 3 para a tripsina | |
| Mass-precisão dos íons pai na busca inicial "Andromeda" | 20 ppm | |
| Precisão Missa dos íons pai na principal pesquisa "Andromeda" | 6 ppm | |
| Mass-precisão para CID MSMS | 0.5 Da (seis principais picos per100 Da) | |
| Peptídeo taxas de detecção falsas (FDR) | 0,01 | |
| Proteína taxas de detecção falsas (FDR) | 0,01 | Definindo o FDR para o péptido e proteína a 0,01 significa que ambos os péptidos e as proteínas identificadas são esperados para conter 1% de falsos positivos. Este valor é estimado através de um banco de dados de chamariz alvo |
| Er máxima posteriorprobabilidade ror (PEP) | 1 | PEP é a probabilidade de que um peptídeo indivíduo é um jogo de falsos positivos. PEP igual a 1 em sua configuração significa que todos os peptídeos serão tomadas independentemente do PEP, assim, a filtragem é baseada exclusivamente na FDR. |
| Comprimento mínimo peptídeo | 6 | |
| Número mínimo de péptidos | 2 | |
| Número mínimo de péptidos únicos | 1 | |
| Usando apenas peptídeos não modificados e oxidação (M) / acetil (Proteína N-Term) | activar a opção | Peptídeos com modificações geralmente não devem ser contados para a quantificação de proteínas desde sua abundância podem não refletir a relação entre a proteína correspondente. |
| Contagem mínima relação | 1 | |
| "Combine entre as execuções" | activar a opção |
Tabela 3. De Análise de Dados.
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Discussion
Descrevemos recentemente ChroP, uma estratégia para a caracterização quantitativa em grande escala de componentes proteicos de cromatina. ChroP combina duas abordagens complementares utilizados no campo epigenética, chip e MS, lucrar com os seus pontos fortes e superar suas respectivas limitações. CHIP acoplado ao seqüenciamento de profundidade (CHIP-Seq) permite o mapeamento do genoma de modificações de histonas na resolução de alguns nucleossomos 35. Embora vantajosa para a sua sensibilidade, os ensaios à base de anticorpos são limitados na sua capacidade para distinguir as modificações semelhantes e em dissecar o aspecto combinatória do código histona 36. Por outro lado, enquanto a MS fornece uma análise abrangente e imparcial do hPTMs, isolados e em combinações de 9, até agora tem sido aplicada para a análise da cromatina em massa, com a consequente falta de informação sobre específicas para um local PTMs padrões. Nós empregamos uma versão modificada do chip para isolar funcionalmentedomínios distintos da cromatina e de espectrometria de massa para caracterizar o padrão de histona PTM e as proteínas não especificamente histonic co-enriquecida.
Utilizando N-ChroP, a análise de hPTMs co-associadas com o H3K9me3 revelou um enriquecimento significativo de marcadores associados a cromatina silenciosa, e uma depleção de modificações relacionadas com a cromatina activa. O ajuste dos resultados com estudos anteriores 37 comprovou a robustez da estratégia. Em X-ChroP de domínios H3K9me3, a investigação com base em SILAC das proteínas que interagem com cromatina confirmou algumas interactores anteriormente descritos, validando assim o método.
ChroP apresenta dois principais aspectos originais no que diz respeito às estratégias já disponíveis para investigar a componente proteômica da cromatina: por exemplo, a possibilidade de revelar sinergias inter-moleculares entre modificações de decoração histonas centrais distintas dentro da mesma intacta mono-nucleosome purificado por N-chip; segundo a oportunidade de avaliar a compartimentalização específica de variantes de histonas e subtipos de histonas vinculador. Uma vez que a investigação de variantes de histonas é retido pela falta de reagentes de boa qualidade (ou seja, anticorpos), ChroP surge como a única ferramenta disponível para avaliar a sua localização e papel funcional.
Uma limitação do ChroP em sua atual configurar mentiras em peptide-centric ("bottom-up") abordagem utilizada em MS, com histonas digeridas em peptídeos curtos e conseqüente prejuízo na detecção da conectividade de longa distância entre modificações. Como tal, a conjugação de ChroP com "Bottom-up" análise MS permite uma avaliação parcial do aspecto combinatório do código de histonas. Prevemos que a implementação de estratégias alternativas de MS, como "Middle e Top-Down" para hPTMs mapeamento em peptídeos mais longos (> 20 aa) até em proteínas intactas 38-40, irá superaresta restrição.
Em geral, N-e X-ChroP são altamente complementares, com a possibilidade de se dissecar a complexidade da estrutura da cromatina em domínios funcionalmente distintas, com uma resolução de mono-a oligo-nucleossomas. Prevemos que ChroP será útil também para caracterizar a composição de regiões de cromatina marcadas pela presença de proteínas nucleares não histonic específicas, por exemplo factores de transcrição (TF). Além disso, ChroP pode ser utilizado em estudos funcionais para mapear a composição dinâmica da cromatina em loci específicos sobre várias perturbações, por exemplo, durante a activação global de transcrição. Por estas razões, ChroP surge como uma ferramenta adicional útil no arsenal de estratégias analíticas disponíveis para dissecar a paisagem proteômica da cromatina.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi publicada originalmente em Mol Proteômica celulares. Soldi M. e Bonaldi T. A proteômica Investigação de cromatina domínios funcionais revelou novas sinergias entre Distinct Heterochromatin Componentes MCP. 2013; 12: 64-80. © da Sociedade Americana de Bioquímica e Biologia Molecular. Agradecemos Roberta Noberini (Instituto Italiano de Tecnologia e IEO, Itália) para a leitura crítica do manuscrito. Trabalho TB é apoiada por doações da Fundação Harvard Armenise-Programa de Desenvolvimento de Carreira Giovanni, a Associação Italiana para a Pesquisa do Câncer e do Ministério da Saúde italiano. Trabalho MS foi apoiado por uma bolsa FIRC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Lonza | BE12-614F | |
| FBS | Invitrogen | 10270-106 | |
| SILAC DMEM | M-Medical | FA30E15086 | |
| Dialyzed FBS | Invitrogen | 26400-044 | |
| Lysine 0 (12C6 14N2 L-lysine) | Sigma Aldrich | L8662 | |
| Arginine 0 (12C6 14N4 L-arginine) | Sigma Aldrich | A6969 | |
| Lysine 8 (13C6 15N2 L-lysine) | Sigma Aldrich | 68041 | |
| Arginine 10 (13C6 15N4 L-arginine) | Sigma Aldrich | 608033 | |
| Micrococcal Nuclease | Roche | 10 107 921 001 | |
| Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 04 693 132 001 | |
| Spectra/Por 3 dialysis tubing, 3.5K MWCO, 18mm flat width, 50 foot length | Spectrumlabs | 132720 | |
| QIAquick PCR purification kit | QIAGEN | 28104 | |
| Anti-Histone H3 tri-methylated K9-ChIP grade | Abcam | ab8898 | |
| Histone H3 peptide tri-methyl K9 | Abcam | ab1773 | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 100.04D | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel | Invitrogen | NP0335BOX | |
| Colloidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | |
| LDS Sample Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
| Formaldheyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Aceti anhydride-d6 | Sigma Aldrich | 175641-1G |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Formic Acid | Sigma Aldrich | 94318-50ML-F | |
| Iodoacetamide ≥99% (HPLC), crystalline | Sigma Aldrich | I6125 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 43815 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin, Frozen 100 μg (5 × 20 μg) | Promega | V5113 | |
| Nanospray OD 360μm x ID 75μm, tips ID 8 μm uncoated Pk 5 | Microcolumn Srl | FS360-75-8-N-5-C15 | |
| ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 µm 15% C | Dr. Maisch GmbH | r13.aq. | |
| Carbon extraction disk, 47 mm | Agilent Technologies | 12145040 | |
| Cation extraction disk | Agilent Technologies | 66889-U |
References
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