Summary
Объединив родным и сшивания иммунопреципитацию хроматина с высоким разрешением масс-спектрометрии, ChroP подход позволяет препарировать композитный протеомный архитектуру модификаций гистонов, вариантов и не-histonic белков синергизма в функционально различных доменов хроматина.
Abstract
Хроматина является весьма динамичный комплекс белков и нуклеопротеидов сделаны из ДНК и белков, который управляет различными процессами ДНК-зависимой. Структура хроматина и функции в конкретных регионах регулируется местного обогащения гистонов пост-трансляционных модификаций (hPTMs) и вариантов, хроматин-связывающих белков, в том числе факторов транскрипции, и метилирования ДНК. Протеомный характеристика хроматина композиции в различных функциональных областях был до сих пор препятствует отсутствие эффективных протоколов, чтобы обогатить таких доменов на соответствующем чистоты и количества для последующего углубленного анализа методом масс-спектрометрии (МС). Мы описываем здесь недавно разработанный стратегию хроматина протеомики, названный ChroP (CHRO Matin P roteomics), в результате чего препарат иммунопреципитация хроматина используется для изоляции различных регионов хроматина, чьи черты лица, с точки зрения hPTMs, варианты и со-связанные не-histonic белки, являются анализируют методом МС. Проиллюстрируем онре создание ChroP для обогащения и анализа транскрипционно молчащих гетерохроматиновых районов, отмеченной присутствии три-метилирования лизина 9 гистона H3. Результаты, достигнутые продемонстрировать потенциал ChroP в тщательно характеризующий гетерохроматина протеома и доказать это в качестве мощного аналитического стратегии понимания того, как различные белковые детерминанты хроматина взаимодействовать и объединения усилий для установления структурных и функциональных конфигураций Локус-специфичные.
Introduction
Хроматина является весьма динамичный комплекс белков и нуклеопротеидов, который участвует в качестве основного шаблона для всех процессов ДНК-опосредованной. Нуклеосом является основным повторяется единицей хроматина и состоит из белкового октамерных ядра, содержащего две молекулы каждого канонического гистона H2A, H2B, H3 и H4, вокруг которого 147 п.о. из ДНК, обернутой 1,2. Все основные гистоны структуру шаровой области и гибкой N-терминальном "хвосте", которая выступает за нуклеосоме. Одним из основных механизмов для регулирования структуры хроматина и динамику основана на ковалентных пост-трансляционных модификаций (платежные терминалы), которые в основном происходят на N-концах гистонов 3,4. Модификации гистонов может функционировать либо путем изменения структуры более высокого порядка хроматина, изменяя контактов между гистонов ДНК или между нуклеосом, и таким образом контролировать доступность ДНК-связывающих белков (цис механизмов), или действуя как dockinг сайты для регуляторных белков, либо в виде отдельных единиц, или встроенный в мультимерных комплексов. Такие регулирующие белки могут оказывать свою функцию по-разному: путем модуляции экспрессии гена непосредственно (то есть TAF белки), или путем изменения позиционированием нуклеосом (т.е. хроматина комплексов) или путем модификации гистонов другие остатки (т.е. белки с метил-трансферазы или ацетил- трансферазы) (транс механизмы) 5. Наблюдение, что отличие PTM модели кластера в конкретной хроматина локусов привела к разработке гипотезы, что различные модификации в отдельных площадках, могут скоординированных генерировать молекулярную код посредническую функциональное состояние подстилающей ДНК. "Гистонов код гипотеза" получила большой консенсуса в эти годы, но ее экспериментальная проверка была сдерживается техническими ограничениями 6,7.
Протеомика Масс-спектрометрия (МС) на основе сталамощный инструмент для сопоставления гистонов моделей модификации и охарактеризовать хроматина-связывающие белки 8. MS обнаруживает изменение в качестве конкретного Δmass между экспериментальной и теоретической массы пептида. На уровне отдельных гистонов, MS предоставляет непредвзятый и всесторонний метод для сопоставления PTMs, что позволяет обнаруживать новые модификации и выявление взаимодействий между ними 9-14.
В последние годы ряд стратегий были разработаны препарировать протеомный состав хроматина, в том числе характеристики нетронутыми митотических хромосом 15, идентификации растворимых hPTM-связывающих белков 16-18 и выделения и анализа конкретных регионах хроматина (т.е. теломеры) 19,20. Тем не менее, исследование локус-специфических синергии между гистонов PTMs, вариантов и ассоциированных с хроматином белков еще не завершен. Здесь мы описываем новый подход, названный ChroP (CHRO Matin P roteomics) 21, которые мы разработали для эффективного характеризуют функционально различных доменов хроматина. Этот подход адаптируется иммунопреципитацию хроматина (чип), хорошо налаженные протокол, используемый в эпигенетической исследования, для эффективного МС на основе протеомики анализа обогащенного образца. Мы разработали две различные протоколы, в зависимости от типа хроматина, используемого в качестве входных данных и вопроса, адресованного МС; в частности: 1) чип нефиксированной родной хроматина переваренной MNase используется для очистки моно-нуклеосом и препарировать совместно, связывающие hPTMs (N-ChroP); 2) чип сшитого хроматина фрагментированы с помощью ультразвука используется в сочетании с SILAC основе interactomics стратегии, чтобы охарактеризовать все совместно обогащая хроматин-связывающих белков (X-ChroP). Проиллюстрируем здесь сочетание N-и X-ChroP для обогащения и изучения гетерохроматина, используя H3K9me3 в качестве приманки для шагов иммунопреципитации. Использование ChroP может быть продленучиться либо отдельные области на хроматина, или изменения в хроматина состава в пределах одного региона при переходе к другой функционального состояния, тем самым проложив путь к различным приложениям в эпигенетика.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Культура клеток
- Стандартный среда для родной ChIP
- Grow HeLa клеток в модифицированной среде Дульбекко Игла (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% глутамина, 1% Pen / Strep и 10 мМ HEPES рН 7,5.
- SILAC маркировки для сшивания ChIP
- Grow HeLa клетки в SILAC DMEM среде, обедненный из лизина и аргинина, с добавлением 10% диализованной FBS, 1% глутамина, 1% Pen / Strep, 10 мМ HEPES, рН 7,5 и либо легкой L-лизина (Lys 0) и L- аргинин (Арг 0) или их тяжелые коллеги, L-лизин (Lys 8) и L-аргинин (Арг 10) (Материалы Таблица), на конечных концентрациях 73 мг / л и 42 мг / л, соответственно.
- Рост клеток до восьми поколений в SILAC среды, чтобы обеспечить полное изотопно-закодированы аминокислоты включение. Pass клетки каждые два дня, когда они достигают плотность 1,0-1,5 × 10 6 клеток / мл, посев их в переменного токаoncentration из 3 х 10 5 клеток / мл.
- Оценка роста клеток и жизнеспособность в SILAC среды индивидуализировать любую возможную изменение от физиологии, которые могут возникнуть в результате бедной состава SILAC среды; сделать это:
- Осмотрите клетки морфологии у микроскопа каждый день в течение маркировки.
- Граф клеток и кривые роста участок клеток, растущих в SILAC против стандартной среде.
2. Родной хроматина Иммунопреципитация (N-чип)
- Ядра препарат из культивируемых клеток
- Используйте 1-2 х 10 8 немеченые HeLaS3 клеток на эксперименте. Урожай клеток, сделать аликвоты 50 х 10 6 клеток в 50 мл пробирки и центрифуги при 340 мкг в течение 10 мин при 4 ° С, промыть их ледяным PBS.
- Ресуспендируют осадок клеток каждый в 8 мл лизирующего буфера (табл. 1) и инкубируют в течение 10 мин при 4 ° С на вращающемся колесе. Налейте окrefully друг сотовой лизат на сахарозы (табл. 1) и центрифуги в колебательного ротора, в 3270 мкг в течение 20 мин при 4 ° С, чтобы отделить ядра от цитоплазмы.
- Откажитесь супернатантов, держать ядерные гранулы и мыть их дважды в ледяной PBS путем центрифугирования, отбросить супернатант в каждой стирки.
- Микрококковой нуклеазы (MNase) пищеварение (малый масштаб) и контроль качества хроматина после переваривания
- Ресуспендируют осадок промывают ядерного в 1 мл буфера пищеварения (табл. 1); разделить на две аликвоты 500 мкл и держать на льду.
- Измерьте оптическую плотность (ОП) при 260 нм аликвоты, разбавляют 1:200 в 0,2% додецилсульфата натрия (SDS). Примечание: OD = 1 соответствует примерно 50 мкг / мл хроматина ДНК. Как правило, начиная с 2 х 10 8 клеток, OD находится в диапазоне 40-60.
- Возьмем 1% от ядер, добавьте MNase фермента до конечной концентрации 0.005 U фермента / мкл ядер и инкубировать при температуре 37 ° С в течение различных упущений времени (0, 10, 20, 40, 60 мин).
- В каждый момент времени, собирают 4 мкл переваренных ядер и добавить 1 мМ ЭДТА, чтобы остановить реакцию MNase. Держите на льду.
- Извлечение образцов ДНК с помощью ПЦР-набора для очистки и элюируют их в 50 мкл ТЕ-буфера (табл. 1).
- Возьмем 20 мкл каждого образца ДНК, добавить 10 мкл загрузочного буфера (табл. 1) и загрузить образцы на 1% (вес / объем) агарозном геле, содержащем бромид этидия, с ПЦР-маркера в качестве контроля размера.
- Проверьте пищеварение оценивая хроматина нуклеосом лестнице произведенный MNase инкубации.
- Выбор оптимального времени для пищеварения, на основе распространенности моно-нуклеосом в препарате. . Обычно для 0,005 U фермента / мкл ядер оптимальное время MNase пищеварения на 60 мин (рис. 1В, левая панель) Примечание: Оптимальное MNase концентрация / время digestiна можно регулировать в зависимости от желаемого типа клеток и от размера нуклеосом участке.
- Large-scale/preparative MNase пищеварение и восстановление растворимых хроматина фракций
- Добавить к каждой аликвоте (см. 2.2.1) 5 мкл MNase, что соответствует конечной концентрации 0,005 U фермента / мкл ядер; аккуратно перемешать и инкубировать при 37 ° С в течение 60 мин (или вообще для оптимизированной промежуток времени, на основе теста малого масштаба).
- Добавить 1 мМ ЭДТА, чтобы остановить реакцию, и держать на льду. Гранул перевариваются ядра путем центрифугирования при 7800 мкг при 4 ° С в течение 10 мин. Перенесите супернатантов (фракция S1) в новую пробирку и хранить при 4 ° C. Примечание: S1 содержит первый растворимой фракции хроматина, включая моно-нуклеосом. Добавьте ингибиторы протеазы (табл. 1).
- Тщательно ресуспендирования гранул в 1 мл буфера для диализа (табл. 1) и диализировать в течение ночи при 4 ° С (Сут прочь диализа трубки составляет 3,5 кДа), в 3 л буфера для диализа, при постоянном умеренном перемешивании. Сбор диализу материал и центрифуги в 7800 мкг в течение 10 мин при 4 ° С. Передача супернатант (S2 фракция) в новую пробирку Эппендорф и хранить при температуре 4 ° C. Примечание: S2 включает ди-до епта-нуклеосом, в зависимости от пищеварения степени MNase.
- Контроль качества хроматина перед иммунопреципитацией
- Возьмем аликвоту, соответствующую 5 мкг S1 и S2 хроматина фракций (количественно, измеряя оптическую плотность при 260 нм в системе NanoDrop). Извлечение ДНК с помощью ПЦР-набора для очистки и элюируют в 50 мкл ТЕ-буфера (табл. 1).
- Возьмем 20 мкл S1 и S2 ДНК, смешать с 10 мкл загрузочного буфера (табл. 1) и загружать их на 1% (вес / объем) агарозном геле. Проверьте качество и эффективность MNase пищеварения путем визуального осмотра нуклеосом лестнице Примечание:. Фракция S1 является высокообогащенный моно-нуклеосом, а доля S2 содержит в основном поли-нуклеосом (рис. 1В, правая панель).
- Инкубационный хроматина с антителом
- Хранить при -20 ° С 50 мкл фракции S1 для последующего анализа масс-спектрометрии.
- Добавить 1 объем ChIP Буфер для разведения (табл. 1), чтобы фракции S1.
- Добавьте антитела против hPTM (или белка), представляющие интерес; инкубировать в течение ночи на вращающемся колесе при 4 ° C. Примечание: Как правило, используют от 10 мкг до 20 мкг антитела на 2 х 10 8 клеток. Оптимальное соотношение между количеством антитела и исходного числа клеток должны быть тщательно установлено в каждом конкретном случае, в зависимости от избытка hPTM / белком, используемым в качестве приманки в образце и на эффективность антител. Оптимизация экспериментального, основаны на следующих тестов:
- Сравните количество hPTM / интересующего белка между входом и проточных (FT,см. 2.7.2) с помощью Вестерн-блоттинга или MS проверить, что иммунопреципитации обогащает значительную часть конкретной области хроматина. Примечание: Как правило, это достигается тогда, когда по крайней мере 50% от приманки hPTM / белок будет исчерпан в FT (рис. 1в) .
- Убедитесь, что иммунопреципитации интерес белок обнаруживается на SDS-PAGE гель, который гарантирует, что достаточное количество материала доступно для анализа MS. Примечание: наличие на геле полос, соответствующих четырех основных гистонов в правильной стехиометрии указывает, что нетронутыми нуклеосома была иммунопреципитировали на N-ChroP (Рисунок 1D). Отсутствие надлежащего стехиометрии, на самом деле, указывающего частичным разрушением / разворачивание нуклеосомы.
- Параллельно готовят белковые G-связанных магнитных шариков (см. п. 2.6).
- Уравновешивание и блокирование Белок G-связанных магнитных шариков
- Равновесие 100 мкл белка G-сочетании магнитные шарики суспензии в блокирующем растворе (таблица 1), трехкратной промывки и инкубации их в течение ночи при 4 ° С на вращающемся колесе. Примечание: После связывающей способности гранул, используют 100 мкл суспензии для 2-20 мкг антитела.
- Вымойте заблокированные бусы раз блокирующим раствором и затем дважды ChIP Буфер для разведения (табл. 1).
- Добавьте 100 мкл блокированных шариков к хроматина образца S1 и инкубировать их на вращающемся колесе при 4 ° С в течение 3 часов. Центрифуга при 340 мкг в течение 1 мин для замедления вращения образца от крышки советов. Положите в магнитном стойки для осаждения бусы.
- Передача супернатант в новую пробирку Эппендорфа. Это поток через (FT), а именно фракция хроматина, что не связывается с антителом.
- Вымойте бисером четырераз в промывочный буфер (табл. 1) увеличения концентрации соли в каждой стирки (75, 125 и 175 мм NaCl).
- Для элюирования иммунопреципитации хроматина, инкубировать бисером в 30 мкл буфера для образцов LDS, с добавлением 50 мМ дитиотреитола (DTT) в течение 5 мин при 70 ° С Отдельные элюированных белков на 4-12% Bis-Tris акриламид SDS-PAGE сборного градиентном геле и окрашивают гель с окрашиванием Кумасси комплект (рис. 1D).
3. Сшивание хроматина Иммунопреципитация (X-чип)
- Сшивание клеток с формальдегидом
- Добавить 0,75% формальдегида в SILAC-меченых клеток, кратко перемешать и инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре. Гасят формальдегид добавлением 125 мМ глицина и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Разделите клетки в 5 х 10 7 аликвоты; промойте их три раза с ледяным PBS путем центрифугирования при 430мкг в течение 5 мин при 4 ° С и отбрасывания супернатантов после каждой промывки. В последней промывки отбросить супернатант и держать шарик. Примечание: После того, как клетки являются сшитыми, они могут храниться при -80 ° С, если не использовали немедленно.
- Ядра подготовка
- Ресуспендируют каждый осадок клеток в 10 мл лизирующего буфера (табл. 1). Инкубировать в течение 10 мин при 4 ° С с вращением. Центрифуга при 430 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Откажитесь от супернатантов; держать ядерные гранулы.
- Ресуспендируют каждый ядерный осадок в 10 мл промывочного буфера (табл. 1). Инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин на вращающемся колесе.
- Центрифуга при 430 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Откажитесь от супернатантов и собирать шарики.
- Ресуспендируют каждый ядерного гранул в 3 мл ChIP инкубационном буфере (табл. 1). Держите на льду.
- Хроматина ультразвуком и контроль качества
- Разрушать ультразвуком ч. romatin на 200 Вт (циклы 30 сек "на" и 1 мин "выключено"), в охлажденном Bioruptor, чтобы фрагмент хроматин Примечание: количество циклов и ультразвуком интервалы зависит от типа клеток и от средней длины нуклеосомной растянуть лучшего. Как правило, 30 мин ультразвуком необходимы для генерации фрагментов ДНК 300-500 п.н. длины, соответствующей ди-и три-нуклеосом. Выбор размера фрагментов зависит от типа домена хроматина исследуемого.
- Возьмем 2% от общего ввода в обратном сшивание путем инкубации при 65 ° С в течение как минимум 1 ч чип инкубационном буфере. Извлечение ДНК с помощью ПЦР-набора для очистки, элюирования в 50 мкл ТЕ буфера и загружать ДНК на геле агарозы, чтобы проверить фрагментацию хроматина.
- Инкубационный хроматина с антителом
- Добавить 1/10 объема 10% Triton X-100 в ультразвуком хроматина. Центрифуга при 12000 х г в течение 10 мин при 4 ° С для осаждения деБрис.
- Сохранить 50 мкл хроматина ввода от тяжелых клеток для тестирования уровня включения SILAC аминокислот в меченых клеток и для профилирования белка.
- Добавить антитело выбора для оставшейся тяжелой и легкой меченого ультразвуком хроматина и инкубировать в течение ночи при 4 ° С на вращающемся колесе. В светового канала, добавить также избыточное раза растворимого пептида. Инкубируют в течение ночи при 4 ° С на вращающемся колесе Примечания:. Оптимальное состояние между мкг антитела и исходного материала клеток выбирается в каждом конкретном случае, как описано в 2.5.3. Оптимальное избыток раза молярность растворимого пептида в отношении антитела должны быть тщательно титруют в каждом конкретном случае.
- Выделение хроматина с использованием магнитных шариков
- Равновесие и блокировать белок G-связанных магнитных шариков, следуя инструкциям, описанным в 2.6 и используя обломок инкубационного буфера.
- Добавить 100 мкл заблокированных бEADS к образцам хроматина и инкубировать на вращающемся колесе в течение 3 ч при 4 ° С. Центрифуга при 340 мкг в течение 1 мин для замедления вращения образца от крышки советов. Положите в магнитном стойки для осаждения бусы. Верхний слой является поток через (FT), содержащий несвязанных нуклеосом. Вымойте бисером четыре раза в промывочный буфер (табл. 1) с увеличением концентрации соли (два моет при 150 мм и два 300 мм NaCl).
- Инкубировать бусины в 30 мкл SDS-PAGE Загрузка буфере для образцов (табл. 1) и в течение 25 мин при 95 ° С и к элюата и де-сшивки иммунопреципитированных белков. Отдельные белки на 4-12% Bis-Tris акриламида SDS-PAGE гелей сборных (рис. 3D).
4. Подготовка образцов Перед МС
- В гель пищеварения гистонов обогащенных от N-Chip
Примечание: Во время переваривания белков и извлечения пептид шаги заботитьсясвести к минимуму кератиновых загрязнений, которые мешают LC-MS/MS, как описано выше 22, 23.- Ломтики Cut гель соответствующие стержневых гистонов полос (рис. 1D). Де-Пятно гель штук с 50% ацетонитрила (ACN) в DDH 2 O, чередующихся с 100% ACN сокращаться гель. Повторяйте до тех пор гели части не полностью де-окрашенных и высушите их в вакуумной центрифуге.
- Добавить D-6 уксусного ангидрида 1:9 (объем / объем) в 1 М бикарбоната аммония (NH 4 HCO 3) (как правило, конечный объем составляет 60-100 мкл) и 3 мкл ацетата натрия (CH 3 COONa), как катализатор. Выдержите в течение 3 ч при 37 ° С с сильным сотрясением Примечание:. Образец может образования пузырьков в самых первых минут после сборки реакции: это важно обращаться с осторожностью и отпустите газа, образованного, открытие время от времени трубок во время инкубации.
- Промойте гель части несколько раз жIth NH 4 HCO 3, чередуются с ACN на повышение процента (от 50% до 100%), с тем чтобы полностью удалить остатки 6-уксусным ангидридом D.
- Термоусадочная куски геля в 100% ACN; высушить их в вакуумной центрифуге, чтобы обеспечить полное де-гидратации. Re-гидрата штук гель с ледяной 100 нг / мкл раствора трипсина в 50 мМ NH 4 HCO 3 и инкубировать в течение ночи при 37 ° C. Примечание: Сочетание химической модификации лизинов использованием дейтерированный уксусного ангидрида и трипсина пищеварение генерирует "Арг- C нравится "в гель пищеварения картины гистонов 21,24.
- Откажитесь от избытка раствора и добавить объем 50 мМ NH 4 HCO 3, чтобы полностью покрыть кусочки геля; инкубировать в течение ночи при 37 ° С
- Сбор растворимые переваривается пептиды в новую пробирку Эппендорф. Лиофилизировать пептиды. Ресуспендируют их в 0,5%-ной уксусной acid/0.1% трифторуксусной кислоты (TFA). Опреснения и сосредоточитьсяпептиды на обращенной фазой C 18 / Карбон "сэндвич" и ионообменной хроматографии (SCX) на ручной микроколонках (StageTip) 25.
- Подготовьте StageTip Микроколонки, поставив тефлоновые сетчатая структура диски, содержащие иммобилизованные C 18 / Carbon ("сэндвич") и бусы SCX в 200 советов мкл. Получить «сэндвич» по загрузке C 18 микроколоночный на вершине второй наконечник с грузом Угольный фильтр. Примечание: очень короткие пептиды, которые не были предложены на C 18 фильтра, проходят в проточных, который загружается непосредственно на Углерод Совет, который обычно захватывает их. SCX StageTips может обогатить специфические пептиды, такие как H3 (3-8) пептид, не эффективно сохранены хроматографией с обращенной фазой.
- Нагрузка 50% пептидов на C 18 / Carbon "сэндвич StageTip" и 50% на SCX StageTips. Элюции их от Советы C 18 / углерода с использованием 80% ACN/0.5% уксусной переменного токаID и из SCX советы с 5% гидроксидом аммония (NH 4 OH) / 30% метанол. После лиофилизации, ресуспендируйте пептидов в 0,1% FA и анализировать по LC-MS/MS.
- В геле Переваривание иммуноочищенного белков
В гель-переваривание белков проводили, как описано ранее 22, с незначительными изменениями.- Разрежьте каждый переулок в десять ломтиками (рис. 3D) и каждый кусочек в мелких кубиков 1 мм 3. Де-Пятно гель штук с 50 мм NH 4 HCO 3/50% этанола и добавить абсолютный этанол сокращаться гели. Повторяйте до тех пор гели не являются полностью де-окрашенных.
- Добавить буфер уменьшения (табл. 1) на куски геля в течение 1 часа при 56 ° С с последующим добавлением алкилирующего буфера (табл. 1) в течение 45 мин при комнатной температуре, в темноте. Вымойте и высушите геля штук в вакуумной центрифуге.
- Увлажняет куски геля с ледяной 12,5 нг / мкл трипсина зольution в 50 мМ NH 4 HCO 3 и инкубировать на льду до полного регидратации гелевых штук. Удалить трипсин в избытке.
- Добавить 50 мМ NH 4 HCO 3, чтобы полностью покрыть кусочки геля. Выдержите в течение ночи при 37 ° С
- Сбор жидкую часть. Добавьте буфера для экстракции (табл. 1), чтобы гелевых штук; инкубировать с сильным перемешиванием в течение 10 мин при комнатной температуре. Повторите два раза.
- Инкубируйте кусочки геля в ACN в течение 10 мин с сильным перемешиванием. Повторите два раза и объединить все супернатанты.
- Лиофилизации пептиды. Ресуспендируют высушенные пептидов в 0,5% уксусной acid/0.1% TFA.
- Опреснения и сосредоточиться пептиды на обращенной фазой С 18 StageTip, как описано 26, 27.
- Элюции пептидов с С 18 StageTip с использованием 80% ACN/0.5% уксусной кислоты. Удаления органического растворителя путем выпаривания в вакуумной центрифуге и ресуспендируют пептидов в 0,1% FA (обычно 5-10 &# 181; л), когда будете готовы к анализу MS.
5. ЖХ-МС анализ
- Жидкостного хроматографического анализа
- Пакет аналитическую колонку в 15 см кварцевой эмиттера (внутренний диаметр 75 мкм, 350 мкм внешний диаметр), с использованием обращенной фазой (RP) C 18, 3 мкм смолы в метаноле при постоянном давлении гелия (50 бар) с помощью бомба-погрузчик устройство, как описано выше 28.
- Пара упакованы излучатель (C 18 RP колонка) непосредственно на выходе из 6-порт клапана ВЭЖХ через 20-см длиной (внутренний диаметр 25 мкм) плавленого кварца без использования перед колонкой или разделить устройство.
- Загрузите перевариваются пептиды в C 18 колонки RP в потоке 500 Нл / мин подвижной фазы А (0,1% ФА / 5% ACN в DDH 2 O).
- После загрузки образца, отделить пептиды, используя следующие градиенты:
- Применение 0-40% подвижной фазы В (0,1% FA/99% ACNв DDH 2 O) при 250 нл / мин в течение 90 мин с последующим градиентом 40-60% в течение 10 мин и 60-80% в течение 5 мин, дл элюировани пептидов, вытекающих из гистонов (см. 2).
- Применение 0-36% подвижной фазы В при 250 Нл / мин более чем 120 минут с последующим градиентом 36-60% в течение 10 мин и 60-80% в течение 5 мин, дл элюировани пептидов, вытекающих из иммунологически белков (см. 3).
- Масс-спектрометрия анализ с использованием LTQ-FT-ICR-Ультра масс-спектрометра
- Эксплуатация в сбора данных в зависимости от режима (ДВР), чтобы автоматически переключаться между МС и приобретения MSMS. MS полный спектр сканирования приобретаются, как правило, в диапазоне м / г от 200-1,650, приобретается с разрешением R = 100000 при 400 м / г. Пять (TOP5) наиболее интенсивные ионы изолированы фрагментации в линейной ионной ловушки с использованием индуцированные столкновениями диссоциации (CID) на целевой величины 5000.
- Используйте параметры, перечисленные в таблице 2 FOг "Тюнинг" Приобретение файл.
- Установить стандартные настройки приобретения, которые перечислены в таблице 2.
6. Анализ данных
- Этикетка бесплатно количественное модификаций гистонов совместно обогащенных доменов хроматина
- Преобразование приобретенные сырье файлы MGF файлов с помощью программного обеспечения Raw2msm (версия 1.10) 29.
- Поиск модификации гистонов, используя талисмана демон (версия 2.2.2), настройка параметров, описанных в таблице 3.
- На выходе списке пептидной талисман, удалить пептиды с счетом ниже, чем 15 или с более чем 5 предполагаемых PTMs 29 Примечание:. Для каждого отдельного пептида ID, выберите пептид с наибольшим количеством очков талисман и отфильтровать все другие избыточные пептиды с таким же ID .
- Построить извлеченные ионные хроматограммы (XIC) для каждого предшественника, соответствующего каждые модифицированных пептидов, барельефред от величины м / г, используя QualBrowser. Вычислить площадь под кривой (AUC) для каждого пика (рис. 2а).
- Подтвердить каждого идентифицированного пептиды, содержащие изменения от визуального осмотра спектров MS / MS, использующих QualBrowser (рис. 2б).
- Рассчитать относительное содержание для каждого модифицированного пептида. Вычислите относительную обогащение каждого изменения в чипе-е изд материала Примечание:. Относительная численность рассчитывается как соотношение между AUC каждого конкретного модифицированного пептида над суммой AUC всех модифицированных и немодифицированных форм одного и того же пептида, в то время как относительная обогащение как отношение относительного содержания конкретной модификации в чипе, над сигналами (рис. 2С).
- Количественный протеомный анализ белков совместно связаны в доменов хроматина
- Для белков идентификации и количественного использовать пакет MaxQuant(Http://www. Maxquant.org /) 30. Настройте встроенную поисковую систему "Андромеда", используя AndromedaConfig.exe 31 и установите параметры поиска, перечисленные в таблице 3.
- Тест Включение
- Оцените степень включения тяжелых аминокислот в белках в тяжелой меченных ввода хроматина, используя MaxQuant программного обеспечения, а именно:
- Установите параметры, как описано в 6.2, но отключение режим повторной количественной.
- Рассчитать процент инкорпорации применяя следующую формулу для неизбыточных отношений пептидных:. Объединение (%) = соотношение (Н / L) / соотношение (В / Н) + 1 × 100 (рис. 3В) Примечание: Принимаем только если включение> 95 %.
- Оцените степень включения тяжелых аминокислот в белках в тяжелой меченных ввода хроматина, используя MaxQuant программного обеспечения, а именно:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Иммунопреципитации хроматина является мощным средством используется для профилирования локализацию белка или модификации гистонов вдоль генома. В протеомики эквиваленте, чип следует протеомики MS основе определить качественно и количественно в hPTMs, варианты гистонов и хроматина-связывающие белки, которые иммунопреципитировали вместе с модификацией или интерес белка, используемые в качестве "приманки". В подходе N-ChroP, изложенные на фиг.1А, родной чип, в котором хроматин, расщепленную MNase (фиг.1В), используется в качестве ввода для очистки от массы хроматина отчетливый функциональный домен. Дайджестом хроматин, обогащенный моно-нуклеосом инкубируют с специфического антитела и белки иммунологически разделены SDS-PAGE. В примере, показанном, H3K9me3, маркер молчания хроматина 32,33, используется для настройки подход. Выбор основан на том, что оба его функциональной роли в качествеа также некоторые из его белков interactors хорошо описываются. Кроме того, высоко специфичным и эффективным антитело оптимизирован для чипа доступны 34, как подтверждается визуального осмотра геля кумасси, где нетронутыми нуклеосом, с основными гистонов в правильной стехиометрии, обогащенной в соответствующих количествах для MS (рис. 1D ).
Сравнение между количеством H3K9me3 присутствующего в проточных (FT) и ввода (IN) показывает, что около 50% области интереса иммуноочищенного, исключая риск ошибок, связанных обогащения незначительной субпопуляции хроматина (рис. 1С). MS используется для характеристики PTMs совместно связаны в обогащенных нуклеосом: каждое ядро гистонов переваривается с использованием протокола разработан специальный в целях достижения "Arg-C как" пищеварения, в полиакриламидном геле. В самом деле, с одной стороны Arg-C является лучшим протеазы для MS анализа hPTMs Bоскольку она производит пептиды оптимальной длины; с другой стороны, она не расщепляет эффективно в геле. Чтобы преодолеть это ограничение, наша учетом протокол использует химическую алкилирование лизина, достигнутый путем инкубации гель полосы гистонов с дейтерированном (D 6) уксусной ангидридом с последующим усвоением трипсина. С трипсин не расщепляет D 3-ацетилированных лизины полученные пептиды смеси имитирует "Арг-C, как" образец (рис. 1E).
Добавление D 3-ацетил группы к лизина производит однозначный дельта массу 45,0294 Дальтон, различия между носителями и химически добавили acetylations в MS. Кроме того, D 3-ацетилирование предлагает два дополнительных преимущества, которые облегчают различения изобарных модифицированных пептидов: во-первых, алкилирования происходит только на немодифицированных и моно-метилированы лизинов, но не на ди-и три-метилированных остатков; как такие модифицированные пептиды с тем же малышаль ряд модификаций, но в разных механизмов дифференциально украшен определенный набор D 3-ацетил групп, которые производят однозначные м / Z сдвиги. Во-вторых, различные модели D 3-алкилирования вызвать немного разные времена удерживания в жидкостной хроматографии на обращенной фазе на колонке, которые генерируют дополнительный уровень разделения для изобарных модифицированных пептидов 21.
После проверки всех hPTMs по ручной проверки соответствующего МС / МС спектров (рис. 2В), метка бесплатно количественное достигается в два этапа: сначала мы вычисляем относительное обилие каждой модификации с использованием интенсивности сигнала немодифицированных и модифицированных видов для соответствующего пептида, измеренной с помощью расчета извлеченных ионные хроматограммы (Xic) (рис. 2а и 2в, верхняя панель); во-вторых, относительное обогащение оценивается как отношение между относительным содержанием каждого modificatioп в чип-е изд октамера и соответствующей относительной численности от входного (рис. 2C, нижней панели). Анализ H3 (9-17) пептид показывает обогащение ди-и три-метилированных K9, с соответствующим истощения немодифицированных и моно-метилированный форм (рис. 2в). При этом приводит в качестве положительного контроля для антител специфичности, совместное объединение или истощение всех других модификаций может быть оценена, как на внутри-молекулярном уровне в тот же Н3 и в меж-молекулярном уровне, на других со-обогащенных гистонов в пределах то же самое нуклеосома. Это позволяет скрининг hPTMs поперечные переговоров в областях H3K9me3, так называемый "гетерохроматина modificome" (рис. 2D): значительное обогащение известных маркеров, связанных с молчания генов, с соответствующим истощения маркеров, связанных с активацией генов наблюдается . Кроме того, новые ассоциации обнаружены такие как обогащение H3K18me1.
На экран для всех белков совместно ассоциирующих в гетерохроматина, классическая сшивание чип сочетается с SILAC (стабильного изотопа маркировки аминокислотами в клеточной культуре) (рис. 3А). В эксперименте SILAC, лизин и аргинин (легкая форма) заменяются на их изотопно-меченных аналогов (тяжелая форма) в культивирования среды. По клеток, выращенных и репликации в обоих легких и тяжелых СМИ, два дифференциально изотопов в кодировке аминокислоты метаболически включены в белки, создавая легкие и тяжелые формы белков, соответственно, которые различимы РС, в связи с определенной Δmass. Перед началом крупномасштабной SILAC эксперимент, эффективность маркировки оценивается, расчета уровня регистрации, измеренный как процент доли тяжелых пептидов по сравнению с суммой тяжелых и легких те, найденного в только тяжелых надписью образца. Включение превосходит 95% как для тяжелой аргинина и онAvy лизин требуется для точного количественного определения белка (фиг. 3B). После сшивания тяжелых и легких элементов, хроматин фрагментированы с помощью ультразвука. SILAC используется в сочетании с конкурентном анализе с использованием избыточного раза растворимого H3 пептида (QTAR K STGG), который несет три-метилирование на K9 для того, чтобы различать конкретные interactors H3K9me3 от фона. Растворимый пептид добавляется в избытке к одному из двух экспериментов SILAC чип, где он насыщает связывающую способность антитела, таким образом, "конкурирующий из" большинство H3K9me3-нуклеосом и, соответственно, все конкретные interactors. В другом SILAC канала, конкурирующих пептид не добавил к чипу и иммунопреципитацию происходит нормально. SILAC-конкурс эксперименты, как правило, выполняется в двух экземплярах, так называемой "вперед" и "Реверс" форматов, где конкуренция с избытком растворимой пептида перехода с гоэ тяжелые (Н) к свету (L) образцов хроматина. Это приводит к инвертированных комплементарных соотношение SILAC отсчетов, используемых для требовательных подлинной от неспецифических связующих: белки, обогащенные специально присутствуют с более высокой интенсивности в тяжелой форме по сравнению с легкой формы (соотношение белок H / L> 1) в эксперименте, где избыток пептид добавляется в световом канале (вперед) (рис. 4а, верхняя панель); противоположная тенденция (отношение белок / Н <1) наблюдается в обратном реплики (рис. 4А, нижняя панель). Белки интенсивность которых в тяжелой и легкой форме схожи в прямом и обратном направлении эксперименты обеспечить постоянную соотношении близком к 1, и классифицируются в качестве фона (рис. 4В).
Выбор оптимальной избыточного складки на растворимого пептида имеет важное значение и должен быть настроен точно. Обычно мы принимаем правильное соотношение антитело-на-пептида выполняя конкурентном анализе USIнг серийные разведения избыточного пептида и сравнивая уровень "приманки" (hPTM / белок) между положительным стружкодробление, где пептид не добавляют, и различных чипов серийный конкуренции, по Вестернблоттинга или MS. Как правило, оптимальный избыток пептид раза снижает около 90% объема hPTM / белка в иммунопреципитации материала. В самом деле, с одной стороны, чем больше отношение белок, полученный, тем выше сила различения SILAC; С другой стороны, избыточное насыщение пептида может выгнать полностью специфические связывающие вещества из антитела, что приводит к пропуску H / L коэффициенты для количественного и статистического анализа. Для H3K9me3 антитела мы определили правильное соотношение, измеряя отношение H / L для QTARK (ME3) STGG пептида, в тесте конкурса, проведенного в прямом настроить и мы взяли это значение в качестве меры эффективности конкуренции (рис. 3C ).
Пересечение переслатьг Реверс X-Chip эксперименты приводит к идентификации 635 белков, присутствующих в обоих экспериментах и количественно, по крайней мере 2 отсчета отношение. Журнал 2 участок их отношений H / L представляют собой так называемую "heterochromatome" (рис. 4в), где подлинные interactors H3K9me3 однозначно идентифицирован как белков, присутствующих в верхнем 40% распределений отношения белки (верхний правый квадрант из сюжет разброс и рис 4D).
Рисунок 1: Схема рабочего процесса N-ChroP) схема базовую микросхему в сочетании с анализом MS.. Хроматина из клеток переваривали с MNase и фракцию, обогащенную моно-нуклеосом (S1) иммунопреципитации с использованием анти-H3K9me3 антитела. Иммунологически белки разделены SDS-PAGE и стержневых гистонов в гель-расщепленную специальной протокола для имитации Arg-C пищеварение. Пептиды анализируются nano-LC-MS/MS. Гистоновые платежные терминалы будут определены, подтверждено ручного досмотра MS / MS спектров и количественно Б) Малая тест MNase:. ДНК разделяли на 1% агарозном геле после хроматина переваривания MNase при различных промежуток времени (слева); крупномасштабное MNase пищеварения:. ДНК разделяли на 1% агарозном геле после 60 минут MNase хроматина пищеварения и после разделения S1 фракции, содержащие моно-нуклеосом от S2 фракции, содержащие поли-нуклеосом (правая панель) C) Оценка обогащения / Истощение немодифицированный, моно-, ди-и три-метилированный K9 в проточных (FT) по сравнению с входа (IN). Гистограмма представляет собой среднюю ± SEM из трех независимых экспериментов для каждой модификации. D) SDS-PAGE хроматина входа и со-иммуно очищенные белки: стержневых гистонов H3, H4, H2A и H2B могут видеть вокруг и ниже зоны 17kDa, с H3 и H2B совместно мигрирующей (черные квадраты) E) Каждое ядро гистонов с обеих иммунопреципитированных нуклеосом и ввода химически алкилировали, используя дейтерированный (. D 6) уксусной ангидридом до обработки трипсином, чтобы получить "Arg-C как" гель в пищеварении. 6-уксусный ангидрид D реагирует с аминогруппой Эпсилон немодифицированных и моно-метилированного лизина, но не с ди-метилированный, три-метилированный и ацетилированные лизина. В результате ферментативная активность трипсина блокируется по всей нативного и химической ацетилированного лизина, таким образом производя "Arg-C как" пищеварения шаблона. Эта цифра была изменена с 21 на Рисунок 1, Рисунок S1 и рисунок S5 в качестве ссылки. Нажмите сюда, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 2:. Масс-спектрометрия анализ H3K9me3 "modificome" A) Увеличенный масс-спектры и извлеченные ионные хроматограммы (XIC) построен в соответствующее значение м / г от 2 + взимать без изменений, моно-, ди-и три-метилированным K9 в H3 (9-17) пептид, как для входных и чип образцов. Б) представитель МС / МС спектры с помощью фрагментации CID. Серия б-ионные и у-ионные позволяют определить последовательность H3 (9-17) пептида и локализовать специально на три-метилирование на K9 остатка. C) Относительная численность различными степенями метилирования на K9 в H3 ( 9-17) пептид, оценивается путем деления площади под кривой (AUC) каждого модифицированного пептида на сумму областях, соответствующих всем наблюдалось unmodifiред и модифицированные формы этого пептида, во входной и чип-е изд октамера. Гистограмма представляет собой среднее ± SEM из трех независимых экспериментов для каждой модификации (верхняя панель). Относительная обогащение K9 метилирования в H3 (9-17) пептидов. Обогащение выражается как отношение журнал 2 между относительной численности каждой метилирования в чипе-е изд октамера как по сравнению с входом. Гистограмма представляет средние ± SEM из трех независимых экспериментов (нижняя панель). D) Тепловая карта подведения обогащению всех со-ассоциирующих hPTMs выявленных на гистона H3, H4 и H2A. Каждая строка соответствует различной модификации (й не обнаружены изменения). Эта цифра была изменена с 21 на Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3 и Рисунок S10 как ссылки. Нажмите сюда, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 3: Схема X-ChroP рабочий процесс A) Схема сшивания ChIP в сочетании с анализом мс.. Клетки, выращенные в легкой и тяжелой СМИ фиксируются с формальдегидом и хроматина входы фрагментированы с помощью ультразвука для получения фрагментов ДНК. В передней установки, обрабатывали ультразвуком тяжелый меченных хроматин иммунопреципитации с использованием анти-антитела H3K9me3 в то время как светло-меченый хроматин инкубируют с тем же антителом насыщенным с избыточным раза растворимого H3 пептида, несущего K9me3. Иммунопреципитированные белки из тяжелых и легких chromatins объединяют, экстрагируют и выдел ют SDS-PAGE. Белки перевариваются трипсином и пептиды анализируют nano-LC-MS/MS. B) Эффективность SILAC маркировки контролируется расчета включение тяжелых ЛисНИС (Lys8) и аргинин (Arg10) в белки. В сюжете, медиана распределения плотности лизина и аргинина пептиды равна 0,974 (зеленая линия) и 0,964 (красная линия) соответственно. C) Увеличенный масс-спектров в соответствующее значение м / г по три-метилированным 2 + взимать K9 в H3 (9-17) пептид, как для легких и тяжелых форм, на входе и чип-е изд октамера. В то время как на входе интенсивности тяжелой и легкой пептида близки к 1, в прямом SILAC Чип, интенсивность света пептида значительно ниже, чем у тяжелого коллегой, что говорит о наличии эффективной конкуренции. D) SDS-PAGE света (L) и тяжелые (Н) помечены вход хроматина и совместное иммунопреципитации материала: пер соответствующий чип-е изд материала вырезается в десяти ломтиками (черная линия), в то время как только два ломтика входе анализируются для анализа тестового инкорпорации ( синяя линия). Эта цифра была изменена с 21, используя рисунках 4 и S6 как реинтерференции. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 4: Масс-спектрометрия анализ H3K9me3 "интерактома". А) представитель полный спектр показывая SILAC-пару, соответствующую пептидов из HP1 и макро-2A белков: отношения H / L> 1 в прямом эксперименте (верхние панели), зеркальные по соотношениях H / L <1 в обратном реплики (нижние панели), демонстрируют определенную обогащение этих белков в гетерохроматина В) представитель фамилия спектры с SILAC-пару, соответствующую пептида от одного фона белка:. H / L отношения в прямом и обратном повторности равны 1 С) количественно белков. являются раздачиред в точечной диаграммы на основе их SILAC-коэффициентов в прямом и обратном экспериментов (осей х и у, соответственно); красные пунктирные линии представляют собой верхнюю 40% и 30% коэффициенты белка, как указано. коэффициенты D) Белковые дистрибутивы, начиная с входа (H / L смешивают 1:1) (черный), вперед (синий) и обратного (оранжевый) X-ChroP эксперименты; красные пунктирные линии представляют собой верхнюю 40% соотношения белков, установленных в качестве отключений для выбора подлинные interactors. Эта цифра была изменена с 21 на Рисунок 5 в качестве ссылки. Нажмите сюда, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Буфер для раздела 2 | Состав |
Лизирующего буфера | 10% сахарозы, 0,5 мМ EGTA, рН 8,0, 15 мМ NaCl, 60 мМ KCl, 15 мМ HEPES, 0,5% Тритон, 0,5 мМ PMSF, 1 мМ DTT, 5 мМ NaF, 5 мМ Na 3 VO 4, 5 мМ NaButyrate, 5 мг / мл апротинина, 5 мг / мл пепстатина, 5 мг / мл лейпептина |
Сахарозы подушке | 2 г сахарозы в 20 мл лизирующего буфера |
Пищеварение буфера | 0,32 М сахароза, 50 мМ Трис-HCl рН 7,6, 4 мМ MgCl2, 1 мМ CaCl2, 0,1 мМ PMSF |
TE буфера | 10 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 1 мМ ЭДТА |
Буфера для диализа | 10 мМ Трис-HCl рН 7,6, 1 мМ ЭДТА, 0,5 мМ PMSF, 5 мМ NaF, 5 мМ Na 3 VO 4, 5 мМ NaButyrate, ингибиторы протеазы коктейль |
ЧИП Буфер для разведения | 100 мМ трис-HCl рН 7,6, 100 мМ NaCl и 10 мМ ЭДТА |
Блокировка решение | БСА 0,5% в PBS |
Промывочный буфер | 50 мМ Трис-HCl рН 7.6,10 мМ ЭДТА |
Ингибиторы протеазы | ЭДТА без ингибиторы протеазы коктейль, 0,5 мМ ФМСФ, 5 мМ NAF, 5 мМ Na3VO4, 5 мМ NaButyratе |
Загрузка буфера | оранжевый краситель нагрузка, 50% (об / об) глицерина в H20 |
Буфер для раздела 3 | Состав |
Лизирующего буфера | 50 мМ HEPES-KOH, рН 7,5, 140 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 10% глицерина, 0,5% NP-40, 0,25% Triton-100, 0,5 мМ PMSF, 5 мМ NaF, 5 мМ Na 3 VO 4, 5 мМ NaButyrate, 5 мг / мл апротинина, 5 мг / мл пепстатина, 5 мг / мл лейпептина |
Промывочный буфер | 10 мМ Трис-HCl рН 8, 200 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,5 мМ EGTA, 0,5 мМ PMSF, 5 мМ NaF, 5 мМ Na 3 VO 4, 5 мМ NaButyrate, 5 мг / мл апротинина, 5 мг / мл пепстатина , 5 мг / мл лейпептина |
ЧИП Инкубационный буфер | РН 10 мМ Трис-HCl 8, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,5 мМ EGTA, 0,1% дезоксихолат натрия, 0,5% lauroylsarcoside натрия, 0,5 мМ PMSF, 5 мМ NaF, 5 мМ Na 3 VO 4, 5 мМ NaButyrate, 5мг / мл апротинина, 5 мг / мл пепстатина, 5 мг / мл лейпептина |
Промывочного буфера 2 | 20 мМ Трис-HCl рН 7,6, 2 мМ EDTA, 0,1% SDS, 1% Тритон-100 |
Загрузка Образец Буфер | 250 мМ рН Tri-HCl 8,8, 0,5 М б-меркаптоэтанола, 2% SDS |
Буфер для раздела 4 | Состав |
Алкилирование буфера | 55 мм иодацетамида в 50 мМ NH 4 HCO 3 |
Буфер Снижение | 10 мМ дитиотреитолу в 50 мМ NH 4 HCO 3 |
Добыча буфера | 30% ACN и 3% ТФК в DDH 2 0 |
Таблица 1. Буферы Состав.
Тюнинг файл приобретения | Параметры |
FT полный SCAн | Целевое значение накопления 1 х 10 6; Максимальное время наполнения 1000 мс |
ИТ MSn | Целевое значение накопления 10 х 10 4; Максимальное время наполнения 150 мсек |
Установка Приобретение | Параметры |
Электроспрей напряжение | 2.4 кВ |
Оболочка и вспомогательного потока газа | Нет |
Ион передача температура капиллярной | 200 ° C |
Динамический исключение | до 500 ионы-предшественники в течение 60 секунд после МСМ |
Ширина Исключение массы | 10 частей на миллион |
Нормализованная энергия столкновения использовании режима активации широкополосный | 35% |
Пороги выбора Ion | 100 отсчетов |
Активация д | 0.25 |
ActivВремя Ation | 30 мсек |
Таблица 2. Настройки MS.
Поиск Mascor Deamon | Параметры | Примечания |
База данных | зависит от организма (т.е. для HeLa клеток: базы данных человеческого, версия 3.68; 87061 записей) | |
Фермент | Арг-C | Arg-C расщепляют на С-конце всех остатков аргинина |
Переменные модификации | ацетил (K), окисление (М), 3-D ацетилирование (К), метил-D 3 - ацетил (K), диметилсульфоксид (к), триметил (K) | ацетил [42,010 Da], окисление [15,995 Da], D3-ацетилирование [45,0294 Da], метил-D3-ацетил [сумма 14,016 Da и 45,0294 Да], диметил [28,031], триметил [42,046 Da] |
Пропущенные расколы | до 2 | |
Массовая точность ионов материнских в поиске | 10 частей на миллион | |
Масса-точность для CID МСМ | 0,5 Da | |
MaxQuant поиск | Параметры | Примечания |
База данных | зависит от организма | |
Фермент | трипсин / P | Трипсин расщепляет на С-конце всех остатков лизина и аргинина. Поиск осуществляется принимая во внимание тот факт, что эффективность трипсина расщеплять лизина и аргинина уменьшается, когда следующий аминокислота представляет собой пролин (/ P). |
Исправлена модификация | carbamidomethylation | |
Переменные модификации | N-ацетил (белок), окисление (M) | |
Пропущенные расколы | до 3 | |
Параметры маркировки | Lys8 и arg10 | |
Максимальная amminoacid этикетки | 3 для трипсина | |
Масса-точность родительских ионов в исходной "Андромеда" поиск | 20 частей на миллион | |
Массовая точность ионов материнских в главном "Андромеда" поиск | 6 частей на миллион | |
Масса-точность для CID МСМ | 0,5 Da (шесть топ пики per100 Da) | |
Пептидные ставки ложные обнаружения (FDR) | 0.01 | |
Белковые ставки ложные обнаружения (FDR) | 0.01 | Установка ФДС для пептида и белка в 0,01 означает, что обе пептиды и белки, определенные, как ожидается, содержат 1% от ложных срабатываний. Это значение определяется с использованием базы данных целевой приманки |
Максимальная задняя эвероятность ROR (PEP) | 1 | PEP вероятность того, что человек пептид является ложным срабатыванием матч. PEP равен 1 в обстановке означает, что все пептиды будут приниматься независимо от PEP, таким образом, фильтрация основана исключительно на FDR. |
Минимальная длина пептида | 6 | |
Минимальное количество пептидов | 2 | |
Минимальное количество уникальных пептидов | 1 | |
Используя только немодифицированные пептиды и окисление (M) / ацетил (белок N-Term) | активировать опцию | Пептиды с изменениями как правило не будут считать белка количественного, так как их обилие может не отражать соотношение количества соответствующего белка. |
Минимальная Количество отношение | 1 | |
"Подходим между запусками" | активировать опцию |
Таблица 3. Анализ данных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы недавно описал ChroP, количественную стратегию масштабного характеристики белковых компонентов хроматина. ChroP сочетает в себе два взаимодополняющих подходов, используемых в эпигенетической области, Чип и магистра, прибыль от их сильных и преодоления их соответствующие ограничения. ЧИП связан с глубокой последовательности (чип-Seq) позволяет генома отображение модификаций гистонов в разрешении нескольких нуклеосом 35. Хотя выгодно их чувствительности, анализы на основе антител ограничены в их способности отличать подобные модификации и рассечения комбинаторный аспект кода гистона 36. С другой стороны, в то время как MS обеспечивает полную и объективную анализ hPTMs, поодиночке и комбинаций 9, он до сих пор применяется для анализа объемных хроматина, с последующим отсутствием информации о локус-специфических PTMs скороговорки. Мы используем модифицированную версию чипа, чтобы изолировать функциональноспециально ко обогащенный различные домены хроматина и масс-спектрометрии для характеристики моделей гистонов PTM и не-histonic белки.
С помощью N-ChroP, анализ hPTMs совместно, связанных с H3K9me3 выявлено значительное обогащение маркеров, связанных с тихим хроматина, и истощение, связанных с изменениями активного хроматина. Согласие этих результатов с предыдущими исследованиями, 37 доказал надежность стратегии. В X-ChroP из H3K9me3 доменов, SILAC основе исследование хроматина взаимодействующих белков подтвердил некоторые ранее описанных interactors, тем самым проверки метода.
ChroP представляет две основные оригинальные аспекты в отношении стратегий уже имеющихся исследовать протеомный компонент хроматина: например, возможность выявить межмолекулярных синергизм между изменениями, украшающих различных стержневых гистонов в пределах одного неповрежденного моно-Nucleosome очищают N-Chip; Второй шанс для оценки конкретной компартментализацию вариантов гистонов и линкерных гистонов подтипы. Поскольку исследование вариантов гистонов сдерживается отсутствием хорошего качества реагентов (т.е. антитела), ChroP выступает как уникальный инструмент, доступный для оценки их расположение и функциональную роль.
Одним из ограничений ChroP в его текущее настроить ложь в пептид-ориентированных ("снизу-вверх") подхода, используемого в MS, с гистонов перевариваются в коротких пептидов и, как следствие, ухудшения в обнаружении связи на дальние расстояния между модификациями. Таким образом, сопряжение ChroP с "снизу-вверх" анализа MS позволяет частичную оценку комбинаторной аспекте кода гистона. Мы предполагаем, что реализация альтернативных стратегий MS, таких как "Ближнего и сверху-вниз» для hPTMs отображения на длинных пептидов (> 20 аа) до на интактных белков 38-40, преодолеетэто сдержанность.
В целом, N-и Х-ChroP хорошо дополняют друг друга, с возможностью рассекает сложность структуры хроматина в функционально различных доменов, с разрешением моно-к олиго-нуклеосом. Мы предполагаем, что ChroP будет полезна также для характеристики состава хроматина областей, обозначенных присутствии специфических не-histonic ядерных белков, для факторов транскрипции пример (TFS). Кроме того, ChroP могут быть использованы в функциональных исследований для отображения динамического состав хроматина в конкретной локусов от различных возмущений, например, во время глобального активации транскрипции. По этим причинам, ChroP возникает в качестве дополнительного полезного инструмента в арсенале аналитических стратегий, доступных препарировать протеомный ландшафт хроматина.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Это исследование было впервые опубликована в Mol Cell протеомики. Soldi М. и Bonaldi Т. Протеомный Исследование хроматина функциональных областей показывает Novel синергизм среди Отдельное гетерохроматина Компоненты MCP. 2013; 12: 64-80. © Американское общество по биохимии и молекулярной биологии. Мы благодарим Роберта Noberini (Итальянский технологический институт и НОО, Италия) за критическое прочтение рукописи. Работа ТБ поддерживается грантами Armenise Гарвард-Foundation Программы Джованни Career Development, итальянской ассоциации по исследованию рака и Министерства здравоохранения Италии. MS Работа выполнена при поддержке стипендии FIRC.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
DMEM | Lonza | BE12-614F | |
FBS | Invitrogen | 10270-106 | |
SILAC DMEM | M-Medical | FA30E15086 | |
Dialyzed FBS | Invitrogen | 26400-044 | |
Lysine 0 (12C6 14N2 L-lysine) | Sigma Aldrich | L8662 | |
Arginine 0 (12C6 14N4 L-arginine) | Sigma Aldrich | A6969 | |
Lysine 8 (13C6 15N2 L-lysine) | Sigma Aldrich | 68041 | |
Arginine 10 (13C6 15N4 L-arginine) | Sigma Aldrich | 608033 | |
Micrococcal Nuclease | Roche | 10 107 921 001 | |
Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 04 693 132 001 | |
Spectra/Por 3 dialysis tubing, 3.5K MWCO, 18mm flat width, 50 foot length | Spectrumlabs | 132720 | |
QIAquick PCR purification kit | QIAGEN | 28104 | |
Anti-Histone H3 tri-methylated K9-ChIP grade | Abcam | ab8898 | |
Histone H3 peptide tri-methyl K9 | Abcam | ab1773 | |
Dynabeads Protein G | Invitrogen | 100.04D | |
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel | Invitrogen | NP0335BOX | |
Colloidal Blue Staining Kit | Invitrogen | LC6025 | |
LDS Sample Buffer | Invitrogen | NP0007 | |
Formaldheyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
Aceti anhydride-d6 | Sigma Aldrich | 175641-1G |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Formic Acid | Sigma Aldrich | 94318-50ML-F | |
Iodoacetamide ≥99% (HPLC), crystalline | Sigma Aldrich | I6125 | |
DL-Dithiothreitol | Sigma Aldrich | 43815 | |
Sequencing Grade Modified Trypsin, Frozen 100 μg (5 × 20 μg) | Promega | V5113 | |
Nanospray OD 360μm x ID 75μm, tips ID 8 μm uncoated Pk 5 | Microcolumn Srl | FS360-75-8-N-5-C15 | |
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 µm 15% C | Dr. Maisch GmbH | r13.aq. | |
Carbon extraction disk, 47 mm | Agilent Technologies | 12145040 | |
Cation extraction disk | Agilent Technologies | 66889-U |
References
- Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184, 868-871 (1974).
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260 (1997).
- Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, 693-705 (2007).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Res. 21, 381-395 (2011).
- Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers. Nat Struct Mol Biol. 14, 1025-1040 (2007).
- Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293, 1074-1080 (2001).
- Spotswood, H. T., Turner, B. M. An increasingly complex code. J Clin Invest. 110, 577-582 (2002).
- Soldi, M., Cuomo, A., Bremang, M., Bonaldi, T. Mass spectrometry-based proteomics for the analysis of chromatin structure and dynamics. Int J Mol Sci. 14, 5402-5431 (2013).
- Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry. J Proteomics. 75, 3419-3433 (2012).
- Britton, L. M., Gonzales-Cope, M., Zee, B. M., Garcia, B. A. Breaking the histone code with quantitative mass spectrometry. Expert Rev Proteomics. 8, 631-643 (2011).
- Taverna, S. D., et al. Long-distance combinatorial linkage between methylation and acetylation on histone H3 N termini. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2086-2091 (2007).
- Garcia, B. A., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Characterization of histones and their post-translational modifications by mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 11, 66-73 (2007).
- Villar-Garea, A., Imhof, A. The analysis of histone modifications. Biochim Biophys Acta. 1764, 1932-1939 (2006).
- Plazas-Mayorca, M. D., et al. One-pot shotgun quantitative mass spectrometry characterization of histones. J Proteome Res. 8, 5367-5374 (2009).
- Ohta, S., et al. The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics. Cell. 142, 810-821 (2010).
- Vermeulen, M., et al. Selective anchoring of TFIID to nucleosomes by trimethylation of histone H3 lysine 4. Cell. 131, 58-69 (2007).
- Vermeulen, M., et al. Quantitative interaction proteomics and genome-wide profiling of epigenetic histone marks and their readers. Cell. 142, 967-980 (2010).
- Bartke, T., et al. Nucleosome-interacting proteins regulated by DNA and histone methylation. Cell. 143, 470-484 (2010).
- Dejardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic Loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
- Lambert, J. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. A novel proteomics approach for the discovery of chromatin-associated protein networks. Mol Cell Proteomics. 8, 870-882 (2009).
- Soldi, M., Bonaldi, T. The proteomic investigation of chromatin functional domains reveals novel synergisms among distinct heterochromatin components. Mol Cell Proteomics. 12, 764-780 (2013).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 1, 2856-2860 (2006).
- Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels. Anal Chem. 68, 850-858 (1996).
- Bonaldi, T., Regula, J. T., Imhof, A. The use of mass spectrometry for the analysis of histone modifications. Methods Enzymol. 377, 111-130 (2004).
- Cuomo, A., Moretti, S., Minucci, S., Bonaldi, T. SILAC-based proteomic analysis to dissect the "histone modification signature" of human breast cancer cells. Amino Acids. 41, 387-399 (2011).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nat Protoc. 2, 1896-1906 (2007).
- Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Anal Chem. 75, 663-670 (2003).
- Olsen, J. V., Ong, S. E., Mann, M. Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues. Mol Cell Proteomics. 3, 608-614 (2004).
- Jung, H. R., Pasini, D., Helin, K., Jensen, O. N. Quantitative mass spectrometry of histones H3.2 and H3.3 in Suz12-deficient mouse embryonic stem cells reveals distinct, dynamic post-translational modifications at Lys-27 and Lys-36. Mol Cell Proteomics. 9, 838-850 (2010).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26, 1367-1372 (2008).
- Cox, J., et al. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. J Proteome Res. 10, 1794-1805 (2011).
- Lachner, M., O'Carroll, D., Rea, S., Mechtler, K., Jenuwein, T. Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins. Nature. 410, 116-120 (2001).
- Bannister, A. J., et al. Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain. Nature. 410, 120-124 (2001).
- Ram, O., et al. Combinatorial patterning of chromatin regulators uncovered by genome-wide location analysis in human cells. Cell. 147, 1628-1639 (2011).
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129, 823-837 (2007).
- Beck, H. C. Mass spectrometry in epigenetic research. Methods Mol Biol. 593, 263-282 (2010).
- Ernst, J., Kellis, M. Discovery and characterization of chromatin states for systematic annotation of the human genome. Nat Biotechnol. 28, 817-825 (2010).
- Tipton, J. D., et al. Analysis of intact protein isoforms by mass spectrometry. J Biol Chem. 286, 25451-25458 (2011).
- Young, N. L., et al. High throughput characterization of combinatorial histone codes. Mol Cell Proteomics. 8, 2266-2284 (2009).
- Boyne, M. T. 2nd, Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. Precise characterization of human histones in the H2A gene family by top down mass spectrometry. J Proteome Res. 5, 248-253 (2006).