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Biology

El Enfoque ChroP Combina chip y la espectrometría de masas para diseccionar Locus específicos proteómicos Paisajes de la cromatina

Published: April 11, 2014 doi: 10.3791/51220
Automatic Translation
1, 1
1Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology

Summary

Al combinar nativa y reticular inmunoprecipitación de cromatina con una elevada resolución Espectrometría de Masas, enfoque ChroP permite diseccionar la arquitectura proteómico compuesta de modificaciones de las histonas, variantes y proteínas no histonic sinergizantes en cromatina dominios funcionalmente distintos.

Abstract

La cromatina es un complejo de nucleoproteína altamente dinámico hecho de ADN y las proteínas que controla diversos procesos dependientes de ADN. Estructura de la cromatina y la función a regiones específicas está regulada por el enriquecimiento local de la histona modificaciones después de la traducción (hPTMs) y variantes, proteínas de unión a la cromatina, incluyendo factores de transcripción, y la metilación del ADN. La caracterización proteómico de la composición de la cromatina en las regiones funcionales distintos ha sido hasta ahora obstaculizada por la falta de protocolos eficientes para enriquecer tales dominios en la pureza y cantidad apropiada para el posterior análisis en profundidad por espectrometría de masas (MS). Se describe aquí una estrategia proteómica de la cromatina de nuevo diseño, llamado ChroP (roteomics CHRO Matin P), el cual se utiliza una inmunoprecipitación de la cromatina preparativa para aislar las regiones de cromatina distintos cuyas características, en términos de hPTMs, variantes y co-asociados proteínas no histonic, son analizó por MS. Nos ilustran quere la creación de ChroP para el enriquecimiento y el análisis de las regiones heterochromatic transcripcionalmente silentes, marcada por la presencia de tri-metilación de la lisina 9 de la histona H3. Los resultados obtenidos demuestran el potencial de ChroP en la caracterización de fondo el proteoma heterocromatina y probarlo como una estrategia de análisis de gran alcance para la comprensión de cómo los determinantes de proteínas distintas de la cromatina interactúan y sinergia para establecer configuraciones estructurales y funcionales específicos de locus.

Introduction

La cromatina es un complejo altamente dinámico nucleoproteína que está implicado como molde principal para todos los procesos de ADN mediada. El nucleosoma es la unidad básica repetida de la cromatina y se compone de un núcleo octamérico proteínico que contiene dos moléculas de cada histona H2A canónica, H2B, H3 y H4, alrededor de la cual 147 pb de ADN se envuelven 1,2. Todas las histonas se estructuran como un dominio globular y una "cola" N-terminal flexible que sobresale fuera del nucleosoma. Uno de los principales mecanismos de regulación de la estructura de la cromatina y la dinámica se basa en covalentes modificaciones post-traduccionales (PTMs), que se producen principalmente en los extremos N de las histonas 3,4. Modificaciones de las histonas pueden funcionar ya sea mediante la alteración de la estructura de cromatina de orden superior, cambiando los contactos entre las histonas-ADN o entre nucleosomas, y controlando así la accesibilidad de las proteínas de unión al ADN (mecanismos cis), o actuando como DockInsitios g de proteínas reguladoras, ya sea como unidades individuales, o incrustado en complejos multiméricos. Tales proteínas reguladoras pueden ejercer su función de diferentes maneras: mediante la modulación de la expresión génica directamente (es decir, proteínas TAF), o mediante la alteración de la posicionamiento de nucleosomas (es decir, la remodelación de la cromatina complejos) o mediante la modificación de otros residuos de histonas (es decir, proteínas con metil-transferasa o acetil- actividad transferasa) (mecanismos trans) 5. La observación de que distintos PTM clúster patrones en los loci de la cromatina específica condujo a la elaboración de la hipótesis de que diferentes modificaciones en los sitios distintos pueden sinergizar para generar un código molecular mediar el estado funcional del ADN subyacente. El "código de histonas hipótesis" ha ganado amplio consenso en los próximos años, pero su verificación experimental se ha frenado por limitaciones técnicas 6,7.

Proteómica La espectrometría de masas (MS) con sede en se ha convertido en unpoderosa herramienta para mapear los patrones de modificación de histonas y caracterizar proteínas de unión a la cromatina-8. MS detecta una modificación como Δmass específica entre la masa experimental y teórica de un péptido. A nivel de las histonas individuales, MS proporciona un método imparcial y exhaustiva para mapear PTM, lo que permite la detección de nuevas modificaciones y reveladoras interactúa entre ellos 9-14.

En los últimos años, un número de estrategias han sido desarrolladas para diseccionar la composición proteómico de la cromatina, incluyendo la caracterización de los cromosomas mitóticos intactos 15, la identificación de proteínas de unión a Hptm-solubles 16-18 y el aislamiento y análisis de las regiones específicas de cromatina (es decir telómeros) 19,20. Sin embargo, la investigación de las sinergias locus específicos entre PTM histonas, variantes, y las proteínas asociadas a la cromatina es aún incompleta. Aquí se describe un nuevo enfoque, llamado ChroP (Roteomics matin P CHRO) 21, que hemos desarrollado para caracterizar eficientemente cromatina dominios funcionalmente distintos. Este enfoque se adapta inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP), un protocolo bien establecido utilizado en la investigación epigenética, para el análisis proteómico basado en MS eficiente de la muestra enriquecida. Hemos desarrollado dos protocolos diferentes, dependiendo del tipo de la cromatina utilizado como entrada y la cuestión abordada por MS; en particular: 1) chip de la cromatina nativa no fijado digerido con MNase se emplea para purificar mono-nucleosomas y para diseccionar los hPTMs co-asociando (N-ChroP); 2) chip de la cromatina reticulada fragmentado por sonicación se utiliza en combinación con un interactómica estrategia basada en SILAC para caracterizar todo cromatina co-enriquecer proteínas (X-ChroP) de unión. Se ilustra aquí la combinación de N-y X-ChroP para enriquecer y estudiando heterocromatina, utilizando H3K9me3 como cebo para los pasos de inmunoprecipitación. El uso de ChroP se puede extenderpara estudiar cualquiera de las regiones distintas en la cromatina, o cambios en la composición de la cromatina dentro de la misma región durante la transición a un estado funcional diferente, allanando así el camino para diversas aplicaciones en la epigenética.

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Protocol

1. Cultivo Celular

  1. Medio estándar para chip nativo
    1. Se cultivan las células HeLa en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 1% de glutamina, 1% penicilina / estreptomicina y 10 mM de HEPES, pH 7,5.
  2. SILAC etiquetado para la reticulación de chip
    1. Se cultivan las células HeLa en medio DMEM SILAC, agotado de lisina y arginina, suplementado con 10% de SFB dializados, el 1% de glutamina, 1% penicilina / estreptomicina, 10 mM HEPES pH 7,5 y, o bien la luz L-lisina (Lys 0) y L- arginina (Arg 0) o sus homólogos pesados, L-lisina (Lys 8) y L-arginina (Arg 10) (Tabla de Materiales), a las concentraciones finales de 73 mg / L y 42 mg / L, respectivamente.
    2. Se cultivan las células durante un máximo de ocho generaciones en medio SILAC para garantizar aminoácidos isótopos codificados completas incorporación. Pase células cada dos días, cuando alcanzan una densidad de 1,0 a 1,5 x 10 6 células / ml, la siembra de ellos en aconcentration de 3 x 10 5 células / ml.
    3. Evaluar el crecimiento de las células y la viabilidad en medio SILAC individualizar cualquier posible alteración de la fisiología que pueda resultar de la composición más pobre del medio SILAC; para hacer esto:
      1. Inspeccione visualmente la morfología de células en el microscopio todos los días durante el etiquetado.
      2. Contar las células y las curvas de crecimiento parcela de células que crecen en SILAC frente medio estándar.

2. Nativo de inmunoprecipitación de cromatina (N-CHIP)

  1. Preparación núcleos de células cultivadas
    1. Utilice 1-2 x 10 8 células HeLaS3 no marcados por experimento. Las células de la cosecha, hacen parte alícuota de 50 x 10 6 células en tubos de 50 ml y centrifugar a 340 xg durante 10 min a 4 ° C, se lavan con PBS helado.
    2. Resuspender cada sedimento de células en 8 ml de tampón de lisis (Tabla 1) y se incuba durante 10 min a 4 ° C en una rueda giratoria. Vierta carefully cada lisado celular en un colchón de sacarosa (Tabla 1) y se centrifuga en un rotor oscilante, a 3.270 xg durante 20 min a 4 ° C, para separar los núcleos de citoplasma.
    3. Deseche sobrenadantes, mantenga bolitas nucleares y lavar dos veces en helado de PBS por centrifugación, desechar el sobrenadante en cada lavado.
  2. Microcócica nucleasa (MNase) Digestión (pequeña escala) y el control de calidad de la cromatina después de la digestión
    1. Resuspender el sedimento nuclear se lavó en 1 ml de tampón de digestión (Tabla 1); dividir en dos alícuotas de 500 l y mantener en hielo.
    2. Medir la densidad óptica (DO) a 260 nm de una alícuota, diluida 1:200 en 0,2% de dodecil sulfato de sodio (SDS) Nota:. OD = 1 corresponde a aproximadamente 50 mg / ml de ADN de la cromatina. Típicamente, a partir de 2 x 10 8 células, el diámetro exterior está en el intervalo de 40-60.
    3. Tome 1% de los núcleos, añadir enzima MNase a una concentración final de 0.005 U de enzima / l de núcleos y se incuba a 37 ° C durante diferentes lapsos de tiempo (0, 10, 20, 40, 60 min).
    4. En cada punto de tiempo, recoger 4 l de núcleos digeridos y añadir EDTA 1 mM para detener la reacción MNase. Mantener en hielo.
    5. Extraer muestras de ADN mediante el kit de purificación de PCR y se eluye en 50 l tampón TE (Tabla 1).
    6. Tomar 20 l de cada muestra de ADN, añadir 10 l tampón de carga (Tabla 1) y cargar las muestras en 1% (w / v) en gel de agarosa que contiene bromuro de etidio, con marcador de PCR como un control de tamaño.
    7. Compruebe la digestión evaluar la escalera nucleosoma cromatina producido por incubación MNase.
    8. Elige el tiempo óptimo para la digestión, basado en la prevalencia de mono-nucleosomas en la preparación. . Típicamente para 0.005 U de enzima / l de núcleos el momento óptimo de la digestión MNase es 60 min (Figura 1B, panel izquierdo) Nota: El MNase óptimo de concentración / tiempo de Digestien puede ser ajustada dependiendo del tipo de célula deseado y del tamaño de nucleosomas estiramiento.
  3. La digestión y la recuperación de las fracciones solubles cromatina Large-scale/preparative MNase
    1. Añadir a cada parte alícuota (ver 2.2.1) 5 l MNase, correspondiente a una concentración final de 0,005 U de enzima / l de núcleos; mezclar suavemente y se incuba a 37 ° C durante 60 min (o en general para el intervalo de tiempo optimizado, basado en la prueba a pequeña escala).
    2. Añadir EDTA 1 mM para detener la reacción y mantener en hielo. Se precipitan los núcleos digeridos por centrifugación a 7800 xga 4 ° C durante 10 min. Transferir el sobrenadante (fracción S1) en un tubo nuevo y almacenar a 4 ° C. Nota: S1 contiene la primera fracción soluble de la cromatina, que comprende mono-nucleosomas. Añadir los inhibidores de la proteasa (Tabla 1).
    3. Gránulos Resuspender con cuidado en 1 ml de tampón de diálisis (Tabla 1) y se dializa durante la noche a 4 ° C (Cut fuera del tubo de diálisis es de 3,5 kDa), en 3 L Diálisis Buffer, con constante agitación suave. Recoja el material dializado y centrifugar a 7800 xg durante 10 min a 4 ° C. Transferir el sobrenadante (fracción S2) en un nuevo tubo Eppendorf y almacenar a 4 ° C. Nota: S2 comprende di-EPTA-nucleosomas, en función de la medida en la digestión MNase.
  4. Control de calidad de la cromatina antes de inmunoprecipitación
    1. Tomar una alícuota correspondiente a 5 g de S1 y S2 fracciones de cromatina (cuantificado mediante la medición de la DO a 260 nm en un sistema de NanoDrop). Extracto de ADN por el kit de purificación de PCR y se eluye en 50 l tampón TE (Tabla 1).
    2. Tomar 20 l de S1 y S2 de ADN, se mezclan con 10 l tampón de carga (Tabla 1) y cargarlos en 1% (w / v) en gel de agarosa. Compruebe la calidad y la eficiencia de la digestión MNase mediante inspección visual de la escalera nucleosomas Nota:. Fracción S1 es altamenteenriquecida en mono-nucleosomas, mientras que la fracción S2 contiene principalmente poli-nucleosomas (Figura 1B, panel derecho).
  5. La incubación de la cromatina con el anticuerpo
    1. Almacenar a -20 ° C 50 l de fracción S1 para su posterior análisis de espectrometría de masas.
    2. Añadir 1 volumen de tampón de dilución de chip (Tabla 1) a la fracción S1.
    3. Añadir el anticuerpo contra el Hptm (o proteína) de interés; incubar durante la noche en una rueda giratoria a 4 ° C. Nota: Por lo general, utilizar 10 mg a 20 mg de anticuerpo durante 2 x 10 8 células. La relación óptima entre la cantidad de anticuerpo y el número inicial de células debe ajustarse cuidadosamente caso por caso, en función de la abundancia de la / proteína Hptm utilizado como cebo dentro de la muestra y en la eficiencia de anticuerpos. La optimización es experimental, basado en las siguientes pruebas:
      1. Compare la cantidad de Hptm / proteína de interés entre la entrada y de flujo continuo (FT,ver 2.7.2) por Western Blot o MS para verificar que la inmunoprecipitación enriquece una proporción significativa de la región de la cromatina específica Nota:. Esto se consigue generalmente cuando al menos 50% de la carnada Hptm / proteína se agota en el FT (Figura 1C) .
      2. Compruebe que la proteína inmunoprecipitada de interés es detectable en gel de SDS-PAGE, que asegura que una cantidad suficiente de material está disponible para el análisis de MS Nota:. La presencia en el gel de las bandas correspondientes a las cuatro histonas del núcleo en la estequiometría correcta indica que el nucleosoma intacto ha sido inmunoprecipitada por N-ChroP (Figura 1D). La falta de la estequiometría adecuada es, de hecho, indicativo de una interrupción parcial / desplegado del nucleosoma.
    4. Al mismo tiempo, preparar las perlas magnéticas G acoplados de proteína (ver 2.6).
  6. La equilibración y el bloqueo de perlas magnéticas G acoplados a proteínas
  7. Equilibrar 100 l de proteína de perlas magnéticas acopladas-G de la mezcla en disolución de bloqueo (Tabla 1), lavar tres veces y la incubación durante la noche a 4 ° C en una rueda giratoria Nota:. Después de la capacidad de unión de perlas, utilizar 100 l de suspensión para 2-20 mg de anticuerpo.
  8. Lave las cuentas bloqueadas una vez con solución de bloqueo y luego dos veces con chip tampón de dilución (Tabla 1).
  • Aislamiento de la cromatina utilizando perlas magnéticas
    1. Añadir 100 l de perlas bloqueados a la muestra de la cromatina S1 y los incuban en una rueda giratoria a 4 º C durante 3 horas. Centrifugar a 340 xg durante 1 min a girar hacia abajo la muestra de la tapa de la punta. Poner en una rejilla magnética para sedimentar las perlas.
    2. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo Eppendorf. Este es el flujo a través (FT), es decir, la fracción de cromatina que no se unió al anticuerpo.
    3. Lavar las perlas de cuatroveces en Tampón de Lavado (Tabla 1) el aumento de la concentración de sal en cada lavado (75, 125 y NaCl 175 mM).
    4. Para eluir la cromatina inmunoprecipitada, incubar las perlas en 30 l de tampón de muestra de LDS, suplementado con 50 mM de ditiotreitol (DTT) durante 5 min a 70 ° C. Separar las proteínas eluidas en un Bis-Tris acrilamida SDS-PAGE prefabricado en gel con gradiente 4-12% y teñir el gel con el kit de tinción coloidal Coomassie (Figura 1D).

    • 3. La reticulación inmunoprecipitación de cromatina (X-CHIP)

    1. La reticulación de las células con formaldehído
      1. Añadir 0,75% de formaldehído a las células marcadas con SILAC, mezclar brevemente e incubar durante 10 min a temperatura ambiente. Se detiene la formaldehído mediante la adición de glicina 125 mM y se incuba durante 5 min a temperatura ambiente.
      2. Dividir celdas de 5 x 10 7 alícuotas; enjuagarlos tres veces con helado de PBS por centrifugación a 430xg durante 5 min a 4 ° C y desechar los sobrenadantes después de cada lavado. En el último lavado, eliminar el sobrenadante y mantener el pellet. Nota: Una vez que las células están reticulados, que se pueden almacenar a -80 ° C, si no se utiliza inmediatamente.
    2. Preparación Núcleos
      1. Resuspender cada sedimento celular en 10 ml de Tampón de Lisis (Tabla 1). Incubar durante 10 min a 4 ° C con rotación. Se centrifuga a 430 × g durante 5 min a 4 ° C. Descartar el sobrenadante; Mantener los gránulos nucleares.
      2. Resuspender cada sedimento nuclear en 10 ml de tampón de lavado (Tabla 1). Incubar a temperatura ambiente durante 10 min en una rueda giratoria.
      3. Se centrifuga a 430 × g durante 5 min a 4 ° C. Descartar el sobrenadante y recoger las bolitas.
      4. Resuspender cada gránulos nucleares en 3 ml de tampón de incubación chip (Tabla 1). Mantener en hielo.
    3. Sonicación cromatina y control de calidad
      1. Sonicar ch. romatin a 200 W (ciclos de 30 segundos "en" y 1 min "off"), en una Bioruptor enfriado, para fragmentar la cromatina Nota: el número de ciclos y los intervalos de sonicación depende del tipo de células y de la duración media de nucleosomal estirar deseada. Típicamente, 30 minutos de sonicación son necesarios para generar fragmentos de ADN de 300-500 pb de longitud, correspondiente a tri-di-y nucleosomas. La elección del tamaño de los fragmentos depende del tipo de dominio de la cromatina bajo investigación.
      2. Tome 2% del total de entrada, invierta el entrecruzamiento de incubación a 65 ° C durante un mínimo de 1 hora en el chip tampón de incubación. Extraer el ADN mediante el kit de purificación de PCR, eluir en 50 l TE Buffer y cargar el ADN en gel de agarosa para comprobar la fragmentación de la cromatina.
    4. La incubación de la cromatina con el anticuerpo
      1. Añadir 1/10 de volumen de 10% de Triton X-100 a la cromatina se sonicó. Centrifugar a 12.000 xg durante 10 min a 4 ° C para sedimentar debris.
      2. Ahorra 50 l de entrada de la cromatina de las células pesados ​​para probar el nivel de incorporación de aminoácidos en SILAC células marcadas y de perfiles de proteínas.
      3. Añadir el anticuerpo de elección a la cromatina restante pesada y ligera marcado se sonicó y se incuba durante la noche a 4 ° C en la rueda giratoria. En el canal de luz, añadir también un exceso de pliegue del péptido soluble. Incubar durante la noche a 4 ° C en una rueda giratoria Notas:. La condición óptima entre la g de anticuerpo y el material de partida de células se elige caso por caso, como se discute en 2.5.3. La óptima exceso de molaridad veces del péptido soluble en respecto al anticuerpo debe valorarse cuidadosamente caso por caso.
    5. Aislamiento de la cromatina utilizando perlas magnéticas
      1. Equilibrar y bloquear cuentas magnéticas G acoplados de proteínas siguiendo los pasos descritos en 2.6 y el uso de chip tampón de incubación.
      2. Añadir 100 l de bloqueado bEADS a las muestras de la cromatina e incubar en una rueda giratoria durante 3 horas a 4 ° C. Centrifugar a 340 xg durante 1 min a girar hacia abajo la muestra de la tapa de la punta. Poner en una rejilla magnética para sedimentar las perlas. El sobrenadante es el flujo a través de (FT), que contiene nucleosomas unidos. Lavar los granos de cuatro veces en Tampón de Lavado (Tabla 1) con el aumento de concentración de sal (dos lavados a 150 mm y de dos en dos de NaCl 300 mM).
      3. Incubar cuentas en 30 l de SDS-PAGE Loading Sample Buffer (Tabla 1) y durante 25 minutos a 95 ° C para ambos originan y de-reticulación de las proteínas inmunoprecipitadas. Proteínas separadas en el 4-12% Bis-Tris acrilamida SDS-PAGE geles prefabricados (Figura 3D).

    4. Preparación de la muestra Antes de MS

    1. En la digestión-gel de histonas enriquecidos a partir de N-chip
      Nota: Durante los pasos de digestión de proteínas y extracción de péptidos cuidanpara reducir al mínimo las contaminaciones de queratina que interfieren con LC-MS/MS, como se ha descrito previamente 22, 23.
      1. Cortar rodajas de gel correspondiente a las histonas centrales bandas (Figura 1D). De manchar-las piezas de gel con 50% de acetonitrilo (ACN) en ddH2O, alternando con 100% de ACN para encoger el gel. Repita hasta que se des-teñidos completamente geles piezas y séquelas en una centrífuga de vacío.
      2. Añadir D 6-acético anhídrido 01:09 (v / v) en bicarbonato de amonio 1 M (NH 4 HCO 3) (típicamente el volumen final es de 60-100 l) y 3 l de acetato de sodio (CH3COONa), como catalizador. Incubar durante 3 horas a 37 ° C con fuerte agitación Nota:. La muestra puede generar burbujas en los primeros minutos después de la asamblea de la reacción: es importante manejar con precaución y liberar el gas generado, abriendo de vez en cuando los tubos durante la incubación.
      3. Enjuague las piezas de gel varias veces wITH NH 4 HCO 3, se alternan con ACN al aumento de porcentaje (del 50% al 100%), con el fin de eliminar completamente los residuos de D anhídrido 6-acético.
      4. Reducir las piezas de gel en 100% de ACN; secarlas en una centrífuga de vacío para asegurar una completa de-hidratación. Re-hidrato de piezas de gel con helado de 100 ng / l de solución de tripsina en 50 mM NH 4 HCO 3 y se incuba durante la noche a 37 ° C. Nota: La combinación de la modificación química de lisinas utilizando anhídrido acético deuterado y digestión con tripsina genera un "Arg- C ¿Te gusta "en gel patrón de digestión de las histonas 21,24.
      5. Deseche el exceso de solución y añadir un volumen de 50 mM NH 4 HCO 3 para cubrir completamente las piezas de gel; incubar durante la noche a 37 ° C.
      6. Recoger péptidos digeridos solubles en un nuevo tubo Eppendorf. Liofilizar péptidos. Resuspender en 0,5% acético ácido trifluoroacético acid/0.1% (TFA). Desalar y concentrarpéptidos en una fase inversa C 18 / Carbon "sandwich" y la cromatografía de intercambio iónico (SCX) en microcolumnas hechos a mano (StageTip) 25.
      7. Preparar las microcolumnas StageTip poniendo discos de la malla de teflón que contienen C inmovilizado 18 / Carbon ("sandwich") y perlas SCX en unos 200 l consejos. Obtenga el "sandwich" al cargar el C 18 microcolumna en la parte superior de una segunda punta cargado con filtro de carbón Nota:. Los péptidos muy cortos, que no son retenidas en el filtro C 18, pase el flujo continuo que se carga directamente en el Consejo de carbono, que por lo general los captura. StageTips SCX pueden enriquecer péptidos específicos, tales como H3 (3-8) de péptidos, no retenido de manera eficiente por cromatografía de fase inversa.
      8. Carga el 50% de los péptidos en la C 18 / Carbon "StageTip sandwich" y el 50% en SCX StageTips. Eluir desde los Consejos C 18/80% de carbono utilizando ACN/0.5% ac acéticoIdentificación y desde el Tips SCX con hidróxido de amonio al 5% (NH 4 OH) / 30% de metanol. Después de péptidos liofilización, volver a suspender en 0,1% FA y analizar por LC-MS/MS.
    2. En-gel digestión de proteínas inmunopurificados
      En-gel de la digestión de las proteínas se lleva a cabo como se describió anteriormente 22, con modificaciones menores.
      1. Corte cada carril en diez rebanadas (Figura 3D) y cada rebanada en cubitos de 1 mm 3. De manchar-las piezas de gel con 50 mM NH 4 HCO 3/50% de etanol y añadir etanol absoluto para reducir el tamaño de los geles. Repita hasta que los geles son completamente manchadas de.
      2. Añadir tampón de reducción (Tabla 1) para las piezas de gel durante 1 hora a 56 ° C, seguido por la adición de tampón de alquilación (Tabla 1) durante 45 min a temperatura ambiente, en la oscuridad. Lave y seque las piezas de gel de centrífuga de vacío.
      3. Rehidratar las piezas de gel con helado de 12,5 ng / sol tripsina llución en 50 mM NH 4 HCO 3 e incubar en hielo hasta la rehidratación completa de las piezas de gel. Retire la tripsina en exceso.
      4. Añadir 50 mM NH 4 HCO 3 para cubrir completamente las piezas de gel. Incubar toda la noche a 37 ° C.
      5. Recoge la parte líquida. Añadir el tampón de extracción (Tabla 1) para las piezas de gel; incubar con agitación fuerte durante 10 minutos a temperatura ambiente. Repita dos veces.
      6. Incubar las piezas de gel en ACN durante 10 min con agitación fuerte. Repetir dos veces y poner en común todos los sobrenadantes.
      7. Liofilizar los péptidos. Resuspender péptidos secos en 0,5% acid/0.1 acético% de TFA.
      8. Desalar y concentrar los péptidos en una fase inversa C 18 StageTip, como se ha descrito 26, 27.
      9. Eluir péptidos de la C 18 StageTip usando 80% de ácido acético ACN/0.5%. Se elimina el disolvente orgánico por evaporación en una centrífuga de vacío y resuspender los péptidos en 0,1% FA (típicamente 5-10 y# 181; l), cuando esté listo para el análisis de MS.

    5. LC-MS El análisis

    1. El análisis por cromatografía líquida
      1. Empaque la columna analítica en un 15 cm fusionado emisor de sílice (75 m de diámetro interno, 350 m de diámetro exterior), usando de fase inversa (RP) C18, 3 micras de resina en metanol, a una presión de helio constante (50 bar) utilizando un dispositivo de bomba-cargador, como se ha descrito previamente 28.
      2. Pareja el emisor comprimido (C 18 columna RP) directamente a la salida de la válvula de 6 puertos de la HPLC a través de una larga (25 m de diámetro interno) de 20 cm de sílice fundida sin el uso de pre-columna o dispositivo de reparto.
      3. Cargue los péptidos digeridos en la columna C 18 RP al flujo de 500 nl / min fase móvil A (0,1% FA / 5% de ACN en ddH 2 O).
      4. Después de cargar la muestra, separar los péptidos usando los siguientes gradientes:
        1. Aplicar 0-40% de fase móvil B (0,1% FA/99% ACNen ddH2O) a 250 nl / min durante 90 min seguido de un gradiente de 40-60% en 10 min y 60-80% durante 5 min, para la elución de los péptidos derivados de las histonas (ver 2).
        2. Aplicar 0-36% de fase móvil B al 250 nl / min durante 120 min seguido de un gradiente de 36-60% en 10 min y 60-80% durante 5 min, para la elución de los péptidos derivados de proteínas inmunopurificados (ver 3).
    2. Análisis de espectrometría de masas usando LTQ-FT-ICR-Ultra espectrómetro de masas
      1. Operar en una adquisición de datos que dependen de modo (DDA) para cambiar automáticamente entre la EM y la adquisición MSMS. MS espectros de barrido completo se adquieren, por lo general en el rango de m / z de 200-1,650, se adquiere con la resolución R = 100 000 a 400 m / z. Los cinco (Mejores 5) iones más intensos se aíslan para la fragmentación en la trampa de iones lineal mediante una disociación inducida por colisión (CID) en un valor objetivo de 5000.
      2. Utilice los parámetros indicados en la Tabla 2 for el archivo adquisición "Tuning".
      3. Establezca la configuración de adquisición estándar que se enumeran en la Tabla 2.

    6. Análisis de Datos

    1. Etiquetar libre cuantificación de las modificaciones de histonas co-enriquecidas en dominios de la cromatina
      1. Convertir los archivos RAW adquiridos a archivos MGF utilizando software Raw2msm (versión 1.10) 29.
      2. Buscar en las modificaciones de las histonas utilizando Mascot Deamon (versión 2.2.2), el establecimiento de los parámetros que se describen en la Tabla 3.
      3. En la lista de salida de la mascota del péptido, eliminar péptidos con puntuación inferior a 15 o con más de 5 PTMs putativos 29 Nota:. Para cada sola ID péptido, seleccione el péptido con la puntuación más alta de la mascota y filtrar todos los otros péptidos redundantes con el mismo ID .
      4. Construir los cromatogramas de iones extraídos (XIC) para cada precursor correspondiente a cada péptidos modificados, based en el valor m / z, usando el QualBrowser. Calcular el área bajo la curva (AUC) para cada pico (Figura 2A).
      5. Validar cada péptidos identificados contienen modificaciones por inspección visual de los espectros MS / MS utilizando el QualBrowser (Figura 2B).
      6. Calcular la abundancia relativa para cada péptido modificado. Calcular el enriquecimiento relativo de cada modificación en el material de chip-Nota del editor:. Abundancia relativa se calcula como una relación entre la AUC de cada péptido modificado específico sobre la suma de AUC de todas las formas modificadas y no modificadas de la misma péptido, mientras que en relación enriquecimiento como una proporción de la abundancia relativa de la modificación específica en el chip sobre la entrada (Figura 2C).
    2. Análisis proteómico cuantitativa de las proteínas co-asociado dentro de los dominios de la cromatina
      1. Para las proteínas de identificación y cuantificación utilizan el paquete MaxQuant(Http://www. Maxquant.org /) 30. Configurar el motor de búsqueda integrado "Andromeda" utilizando el AndromedaConfig.exe 31 y establecer los parámetros de búsqueda que se enumeran en la Tabla 3.
    3. Prueba de Incorporación
      1. Estimar el grado de incorporación de aminoácidos en proteínas pesados ​​en la entrada de la cromatina marcado pesado, utilizando el software MaxQuant, de la siguiente manera:
        1. Establezca los parámetros como se describe en el punto 6.2 Desactivación de la opción de re-cuantificar.
        2. Calcular el porcentaje de incorporación de aplicar la siguiente fórmula para ratios de péptidos no redundantes:. Incorporación (%) = relación (H / L) / relación (H / L) + 1 × 100 (Figura 3B) Nota: Aceptar sólo si la incorporación> 95 %.

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    Representative Results

    Inmunoprecipitación de la cromatina es una poderosa técnica utilizada para el perfil de la localización de una proteína o una modificación de las histonas a lo largo del genoma. En una proteómica equivalente, chip es seguido por la proteómica basadas en MS para identificar cualitativa y cuantitativamente los hPTMs, variantes de las histonas y las proteínas de unión a la cromatina que se inmunoprecipitaron junto con la modificación o la proteína de interés, utilizados como "cebo". En el enfoque N-ChroP, se indica en la figura 1A, chip nativo, en el que la cromatina se digiere con MNase (Figura 1B), se utiliza como entrada para limpiarnos de mayor cromatina un dominio funcional distinta. Cromatina digerido enriquecida en mono-nucleosomas se incuba con un anticuerpo específico y las proteínas inmunopurificados se separan por SDS-PAGE. En el ejemplo ilustrado, H3K9me3, marcador de la cromatina silenciosa 32,33, se utiliza para establecer el enfoque. La elección se basa en el hecho de que tanto su papel funcional comoasí como algunos de sus interactores proteínas están bien descritos. Por otra parte, un anticuerpo altamente específico y eficaz optimizado para el chip está disponible 34, como también confirmado por inspección visual del gel de Coomassie, donde el nucleosoma intacta, con las histonas del núcleo en la estequiometría correcta, se enriquece en cantidades apropiadas para la EM (Figura 1D ).

    La comparación entre la cantidad de H3K9me3 presente en el flujo a través (FT) y de entrada (IN) indica que aproximadamente el 50% de la región de interés se inmunopurificó, excluyendo el riesgo de un sesgo debido al enriquecimiento de una sub-población de menor cromatina (Figura 1C). MS se emplea para caracterizar la PTM co-asociado dentro de los nucleosomas enriquecidos: cada núcleo de histonas es digerido usando un protocolo diseñado ad hoc con el fin de lograr una "Arg-C como" la digestión, en gel de poliacrilamida. De hecho, por un lado Arg-C es la mejor de la proteasa para el análisis de MS de hPTMs Bebido que produce péptidos de longitud óptima; por otra parte, que no escinde eficientemente en gel. Para superar esta limitación, nuestro protocolo adaptado explota la alquilación química de lisina logrado mediante la incubación de bandas de gel de histonas con deuterado (D 6) de anhídrido acético, seguido de digestión con tripsina. Desde tripsina no escinde D lisinas 3-acetilados, los péptidos miméticos mezcla resultante una "Arg-C como" patrón (Figura 1E).

    La adición de un resto D 3-acetil a una lisina produce una masa Delta inequívoca de 45,0294 Daltons, discriminar entre acetilaciones nativas y añadido químicamente en la EM. Por otra parte, D 3-acetilación ofrece dos ventajas adicionales que facilitan el discernimiento de péptidos modificados isobáricas: primero, la alquilación se produce sólo en lisinas no modificados y mono-metilado, pero no en los residuos de di-y tri-metilado; como tales péptidos modificados que lleva el mismo total número de modificaciones, pero en diferentes arreglos son diferencialmente decoradas por conjunto distinto de grupos D 3-acetil que producen inequívocos turnos m / z. En segundo lugar, distintos patrones de D 3-alquilación causan ligeramente diferentes tiempos de retención en cromatografía líquida en columna de fase inversa, que generan un nivel adicional de separación para los péptidos modificados isobáricas 21.

    Después de la validación de todos los hPTMs por la inspección manual de la correspondiente espectros MS / MS (Figura 2B), la cuantificación libre de etiqueta se logra en dos pasos: primero, se calcula la abundancia relativa de cada modificación usando la intensidad de señal de las especies no modificados y modificados para el péptido correspondiente, medida a través del cálculo de los cromatogramas de iones extraídos (XIC) (Figura 2A y 2C, panel superior); segundo, el enriquecimiento relativo se calcula como una relación entre la abundancia relativa de cada modification en el octámero chip-ed y el correspondiente abundancia relativa de la entrada (Figura 2 C, panel inferior). El análisis de la H3 (9-17) péptido muestra el enriquecimiento de di-y tri-metilado K9, con el agotamiento correspondiente de las formas no modificadas y mono-metilado (Figura 2C). Con esto se traduce como control positivo de la especificidad del anticuerpo, la co-asociación o el agotamiento de todos los demás modificaciones se pueden evaluar, tanto a nivel intra-molecular en la misma H3 como a nivel inter-molecular, en otras histonas co enriquecido dentro la misma nucleosoma. Esto permite que la proyección de hPTMs cruzadas habla dentro de los dominios H3K9me3, el llamado "modificome heterocromatina" (Figura 2D): se observa el enriquecimiento significativo de los marcadores conocidos asociados con el silenciamiento de genes, con el agotamiento correspondiente de marcadores ligados con la activación de genes . Además, nuevas asociaciones se detectan tales como el enriquecimiento de H3K18mE1.

    Para la detección de todas las proteínas co-asocian dentro de la heterocromatina, el chip de reticulación clásica se combina con SILAC (isótopos estables Etiquetado por los aminoácidos en cultivo celular) (Figura 3A). En el experimento SILAC, la lisina y arginina (forma leve) se reemplazan con sus análogos marcados con isótopos pesados ​​(forma) en el medio de cultivo. A las células cultivadas y replicación en luz y medios pesados, los dos aminoácidos isótopos codificados diferencialmente se incorporan metabólicamente en proteínas, generando ligeras y pesadas formas de proteínas, respectivamente, que se distinguen por la EM, debido a un Δmass específico. Antes de iniciar un experimento de SILAC a gran escala, se evaluó la eficiencia de marcaje, calcular el nivel de incorporación, medida como la fracción de porcentaje de péptidos pesados ​​en comparación con la suma de los pesados ​​y ligeros, que se encuentra en la muestra sólo pesada marcado. Incorporación superior al 95% tanto para la arginina pesada y élSe requiere Avy lisina para la cuantificación de proteínas precisa (Figura 3B). Después de la reticulación de las células pesadas y ligeras, la cromatina se fragmenta por sonicación. SILAC se utiliza en conjunción con un ensayo de competición usando un exceso pliegue de péptido H3 solubles (QTAR K LTGG) que lleva tri-metilación en K9 con el fin de discriminar interactores específicos H3K9me3 de fondo. El péptido soluble se añade en exceso a uno de los dos experimentos chip SILAC, donde se satura la capacidad de unión del anticuerpo, por lo tanto "competir a cabo" la mayoría de los H3K9me3-nucleosomas y, en consecuencia, todos los interactores específicos. En el otro canal de SILAC, el péptido que compiten no se añade al chip y la inmunoprecipitación se lleva a cabo normalmente. Experimentos SILAC de la competencia normalmente se realizan por duplicado en los formatos denominada "Forward" y "Reverse", donde la competencia con el péptido soluble exceso se cambia de the pesada (H) a los de luz (L) muestras de la cromatina. Esto resulta en lecturas de relación de SILAC complementarias invertidas, utilizados para discernir genuina de aglutinantes no específicos: proteínas enriquecidos específicamente están presentes con una mayor intensidad en la forma pesada en comparación con la forma de luz (relación de la proteína H / L> 1) en el experimento donde el exceso péptido se añade al canal de luz (Forward) (Figura 4A, panel superior); una tendencia opuesta (relación proteína H / L <1) se observa en la réplica inversa (Figura 4A, panel inferior). Las proteínas cuya intensidad en forma pesada y ligera son similares tanto en marcha adelante y atrás experimentos producen una relación estrecha constante a 1 y se clasifican como fondo (Figura 4B).

    La elección del exceso de pliegue óptima para el péptido soluble es importante y debe ser sintonizado con precisión. Por lo general, nos propusimos la proporción correcta-anticuerpo-péptido para realizar un ensayo de usi competenciang de diluciones en serie de exceso de péptido y comparar el nivel de la "cebo" (Hptm / proteína) entre el chip de control positivo, donde no se añade el péptido, y los diferentes chips de competencia de serie, de Western Blot o MS. Generalmente, el péptido óptima veces en exceso reduce de aproximadamente el 90% de la cantidad de Hptm / proteína en el material inmunoprecipitado. De hecho, por una parte, cuanto mayor sea la proporción de proteína obtenido, mayor será el poder de discriminación de SILAC; Por otro lado, una saturación excesiva por el péptido puede desalojar completamente los ligantes específicos a partir del anticuerpo, lo que conduce a la falta de proporciones H / L para la cuantificación y el análisis estadístico. Para anticuerpo H3K9me3 definimos la proporción correcta midiendo la relación H / L para la (me3) LTGG péptido QTARK, en una prueba de la competencia llevada a cabo en un Forward establecimos y tomamos este valor como una medida de la eficiencia de la competencia (Figura 3C ).

    La intersección de la Reenviar und inversa experimentos X-chip conduce a la identificación de 635 proteínas, presentes en ambos experimentos y cuantificados con al menos 2 recuentos de relación. El registro de 2 parcela de sus relaciones H / L representa el llamado "heterochromatome" (Figura 4 C), donde los interactores genuinos H3K9me3 se identifican inequívocamente como las proteínas presentes en el top 40% de las distribuciones de la relación de las proteínas (cuadrante superior derecho del el gráfico de dispersión y la Figura 4D).

    Figura 1
    Figura 1: Esquema del flujo de trabajo N-ChroP A) Esquema de chip nativo combinado con el análisis de MS.. La cromatina de las células se digiere con MNase y la fracción enriquecida en mono-nucleosomas (S1) se immunoprecipitated utilizando un anti-H3Anticuerpo K9me3. Proteínas inmunopurificados se separan por SDS-PAGE y las histonas centrales son en gel digerido con un protocolo ad hoc para imitar una digestión Arg-C. Los péptidos se analizaron por nano-LC-MS/MS. PTM histonas son identificadas, validadas por la inspección manual de MS / MS espectros y cuantificado B) Prueba MNase pequeña escala:. ADN se resolvieron en un gel de agarosa al 1% después de la digestión de la cromatina con MNase a diferentes intervalos de tiempo (izquierda); digestión MNase gran escala:. ADN resolvió en un gel de agarosa al 1% después de 60 minutos de digestión MNase cromatina y después de la separación de la fracción S1, que contiene mono-nucleosomas de S2 facción, que contiene poli-nucleosomas (panel derecho) C) Estimación de enriquecimiento / agotamiento de no modificada, mono-, di-, y tri-metilado K9 en flujo a través (FT) en comparación a la de entrada (IN). Histograma representa la media ± SEM de tres experimentos independientes para cada modificación. D) SDS-PAGE de entrada de la cromatina y co-inmuno proteínas purificadas: core histonas H3, H4, H2A y H2B son visibles alrededor y por debajo de la banda de 17 kDa, con H3 y H2B co-migración (cuadrados negros) E) Cada núcleo de histonas de ambos nucleosomas inmunoprecipitadas y de entrada se alquilan químicamente usando deuterado (. D 6)-acético-anhídrido antes de tratamiento con tripsina, con el fin de obtener una "Arg-C como" en la digestión en gel. El anhídrido 6 D-acético reacciona con el grupo épsilon amino de las lisinas no modificados y mono-metilado pero no con di-metilado, lisinas tri-metilado y acetilados. Como resultado, la actividad enzimática de la tripsina se encuentra bloqueado en todo lisina acetilada nativa y química, produciendo de este modo un "Arg-C como" patrón de digestión. Esta cifra se ha modificado a partir de 21, usando la Figura 1, Figura S1 y Figura S5 como referencia. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

    "Fo: keep-together.within-page =" always "> Figura 2
    Figura 2:. Análisis de espectrometría de masas de la "modificome" H3K9me3 A) los espectros de masas con zoom y cromatogramas de iones extraídos (XIC) construido en el valor m / z correspondiente de la 2 + cargar sin modificar, mono-, di-, y tri-metilado K9 en el H3 (9-17) péptido, tanto para muestras de entrada y CHIP. B) Representante MS / MS espectros utilizando fragmentación CID. La serie B de iones de e y de iones permiten definir la secuencia de H3 (9-17) péptido y para localizar específicamente la tri-metilación K9 en residuo. C) la abundancia relativa de los diferentes grados de metilación en K9 en el H3 ( 9-17) péptido, que se estima dividiendo el área bajo la curva (AUC) de cada péptido modificado por la suma de las áreas correspondientes a todos observó unmodified y formas modificadas de ese péptido, en el octámero de entrada y chip-ed. Histograma representa la media ± SEM de tres experimentos independientes para cada modificación (panel superior). Enriquecimiento relativo de metilaciones K9 en H3 (9-17) péptido. El enriquecimiento se expresa como una relación de registro de 2 entre la abundancia relativa de cada uno de metilación en el octámero chip-ed como comparar a la entrada. Histograma representa las medias ± SEM de tres experimentos independientes (panel inferior). D) Mapa de calor que resume el enriquecimiento de todos hPTMs co-asociando identificados en la histona H3, H4 y H2A. Cada fila corresponde a una modificación diferente (nd no se detectan modificaciones). Esta cifra se ha modificado a partir de 21, usando la Figura 1, Figura 2, Figura 3 y Figura S10 como referencia. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.


    Figura 3: Esquema del X-ChroP flujo de trabajo A) Esquema de reticulación chip combinado con el análisis de MS.. Las células cultivadas en luz y medios pesados ​​se fijan con formaldehído insumos y la cromatina se fragmentaron mediante ultrasonidos para generar fragmentos de ADN. En un Forward configurado, la cromatina marcado pesada sonicado se inmunoprecipitó utilizando anticuerpo anti-H3K9me3 mientras que la cromatina luz marcado se incuba con el mismo anticuerpo saturado con un exceso de pliegue solubles péptido H3 teniendo K9me3. Las proteínas inmunoprecipitadas de cromatinas pesada y ligera se reunieron, se extrajeron y se separaron por SDS-PAGE. Las proteínas se digieren con tripsina y los péptidos son analizados por nano-LC-MS/MS. B) Eficiencia de etiquetado SILAC se controla el cálculo de la incorporación de Lys pesadosine (Lys8) y arginina (Arg10) en las proteínas. En la trama, la mediana de la distribución de lisina y arginina péptidos densidad es igual a 0,974 (línea verde) y 0.964 (línea roja), respectivamente. C) los espectros de masas con el zoom en el valor m / z correspondiente de la tri-metilado 2 + cobrar K9 en el H3 (9-17) péptido, tanto para la luz y las formas pesadas, en la entrada y octámero chip-ed. Mientras que en la entrada de las intensidades de péptido pesada y ligera están cerca de 1, en ​​el Forward SILAC chip, la intensidad de la luz péptido es mucho menor que la de la contraparte pesada, lo que indica una competencia eficiente. D) SDS-PAGE de la luz (L) y pesada (H) etiquetados de entrada de la cromatina y de material co-inmunoprecipitado: el carril correspondiente al material de chip-ed se corta en rodajas de diez (línea negro), mientras que sólo dos rebanadas de entrada se analizan para el análisis de prueba de incorporación ( línea azul). Esta cifra se ha modificado a partir de 21, usando la Figura 4 y la Figura S6 como rerencia. Haz clic aquí para ver la imagen más grande.

    Figura 4
    Figura 4: Análisis de espectrometría de masas de los "interactome" H3K9me3. A) espectros completo Representante muestra la SILAC par correspondiente a los péptidos de HP1 y proteínas macro-2A: las proporciones H / L> 1 en el experimento (paneles superiores Forward), reflejado por un relaciones H / L <1 en la réplica inversa (paneles inferiores), demostrar el enriquecimiento específico de estas proteínas en la heterocromatina B) espectro completo Representante con SILAC par correspondiente al péptido de la proteína de un fondo:. relaciones H / L en avance y retroceso réplicas son iguales a 1 C) proteínas cuantificados. son distributed en un gráfico de dispersión en función de sus SILAC-ratios en Adelante y experimentos temporales (ejes X e Y, respectivamente); líneas de puntos rojos representan la parte superior del 40% y el 30% de los ratios de proteínas, tal como se indica. cocientes D) Proteínas distribuciones de entrada (H / L mezclado 1:1) (negro), Adelante (azul) y marcha atrás (naranja) X-ChroP experimentos; líneas de puntos rojos representan la parte superior del 40% de proteína ratios, establecidos como puntos de corte para seleccionar los interactores genuinos. Esta cifra se ha modificado a partir de 21, usando la Figura 5 como referencia. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

    Buffer para la sección 2 Composición
    Tampón de Lisis 10% de sacarosa, 0,5 mM de EGTA, pH 8,0, NaCl 15 mM, 60 mM de KCl, 15 mM de HEPES, 0,5% de Triton, PMSF 0,5 mM, DTT 1 mM, 5 mM de NAF, 5 mM de Na 3 VO 4, 5 mM NaButyrate, 5 mg / ml de aprotinina, 5 mg / ml de pepstatina A, 5 mg / ml de leupeptina
    Colchón de sacarosa 2 g de sacarosa en 20 ml de Tampón de Lisis
    Tampón de digestión 0,32 M de sacarosa, 50 mM de Tris-HCl, pH 7,6, MgCl2 4 mM, CaCl2 1 mM, 0,1 mM de PMSF
    Tampón TE 10 mM de Tris-HCl, pH 7,5, EDTA 1 mM
    Diálisis Buffer 10 mM de Tris-HCl, pH 7,6, EDTA 1 mM, PMSF 0,5 mM, 5 mM de NAF, 5 mM de Na 3 VO 4, 5 mM NaButyrate, inhibidores de la proteasa cóctel
    Chip tampón de dilución 100 mM de Tris HCl, pH 7,6, NaCl 100 mM y EDTA 10 mM
    Solución Bloqueante BSA al 0,5% en PBS
    Tampón de Lavado MM de Tris-HCl 50 mM EDTA pH 7.6,10
    Inhibidores de la proteasa EDTA libre de inhibidores de la proteasa cóctel, PMSF 0,5 mM, 5 mM NAF, 5 mM Na3VO4, 5 mM NaButyrate
    Loading Buffer tinte de color naranja de carga, 50% (v / v) de glicerol en H20
    Buffer para la sección 3 Composición
    Tampón de Lisis 50 mM de HEPES-KOH pH 7,5, NaCl 140 mM, EDTA 1 mM, 10% de glicerol, 0,5% de NP-40, 0,25% de Triton-100, PMSF 0,5 mM, 5 mM de NAF, 5 mM de Na 3 VO 4, 5 mM NaButyrate, 5 mg / ml de aprotinina, 5 mg / ml de pepstatina A, 5 mg / ml de leupeptina
    Tampón de Lavado MM de Tris-HCl 10 pH 8, NaCl 200 mM, EDTA 1 mM, EGTA 0,5 mM, PMSF 0,5 mM, 5 mM de NAF, 5 mM de Na 3 VO 4, 5 mM NaButyrate, 5 mg / ml de aprotinina, 5 mg / ml de pepstatina A , 5 mg / ml de leupeptina
    Chip tampón de incubación MM de Tris-HCl 10 pH 8, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, EGTA 0,5 mM, 0,1% de desoxicolato de sodio, 0,5% lauroylsarcoside de sodio, PMSF 0,5 mM, 5 mM de NAF, 5 mM de Na 3 VO 4, 5 mM de NaButyrate, 5mg / ml de aprotinina, 5 mg / ml de pepstatina A, 5 mg / ml de leupeptina
    Tampón de Lavado 2 20 mM de Tris-HCl, pH 7,6, EDTA 2 mM, 0,1% de SDS, 1% de Triton-100
    Tampón de carga de muestra MM de Tri-HCl 250 pH 8,8, 0,5 M B-mercaptoetanol, 2% de SDS
    Buffer para la sección 4 Composición
    Alquilación Buffer 55 mM yodoacetamida en 50 mM NH 4 HCO 3
    Reducción Buffer 10 mM ditiotreitol en 50 mM NH 4 HCO 3
    Extraction Buffer 30% de TFA ACN y 3% en ddH 2 0

    Tabla 1. Buffers Composición.

    Sintonizar archivo adquisición Parámetros
    FT sca completon la acumulación de valor objetivo 1 x 10 6; tiempo máximo de llenado 1.000 ms
    Msn la acumulación de valor objetivo 10 x 10 4; tiempo máximo de llenado de 150 ms
    Ajuste de Adquisición Parámetros
    Tensión Electrospray 2,4 kV
    Vaina y el flujo de gas auxiliar No
    Transferencia Ion temperatura del capilar 200 ° C
    Exclusión dinámico hasta 500 iones precursores para 60 seg a MSMS
    Ancho de masa Exclusión 10 ppm
    Energía de colisión normalizada mediante el modo de activación de banda ancha 35%
    Ion umbrales de selección 100 cuentas
    Q Activación 0.25
    Activtiempo ación 30 ms

    Tabla 2. Configuración MS.

    MASCOR Deamon búsqueda Parámetros Notas
    Base de datos depende del organismo (es decir, para las células HeLa: base de datos humana, versión 3.68; 87.061 entradas)
    Enzima Arg-C Arg-C escinden en el extremo C-terminal de todos los residuos de arginina
    Modificaciones de variables acetilo (K), la oxidación (M), D 3-acetilación (K), metil-D 3 - acetil (K), dimetil (k), trimetil (K) acetil [42.010 Da], la oxidación [15.995 Da], D3-acetilación [45.0294 Da], metil-D3-acetil [suma de 14.016 Da y 45.0294 Da], dimetil [28.031], trimetil [42.046 Da]
    Divisiones perdidas hasta 2
    Precisión en masa de los iones de padres en la búsqueda 10 ppm
    Mass-precisión para la CID MSMS 0.5 Da
    Búsqueda MaxQuant Parámetros Notas
    Base de datos depende del organismo
    Enzima tripsina / P La tripsina rompe en el extremo C-terminal de todos los residuos de lisina y arginina. La búsqueda se realiza teniendo en cuenta el hecho de que la eficiencia de la tripsina para escindir la lisina y la arginina se reduce cuando el siguiente aminoácido es la prolina (/ P).
    Modificación fijo carbamidomethylation
    Modificaciones de variables N-acetil (proteína), la oxidación (M)
    Divisiones perdidas hasta 3
    Parámetros de la etiqueta lys8 y ARG10
    Amminoacid máximo de etiqueta 3 para la tripsina
    Mass-precisión de los iones primarios en la búsqueda inicial "Andromeda" 20 ppm
    Precisión en masa de los iones de padres en la búsqueda principal "Andromeda" 6 ppm
    Mass-precisión para la CID MSMS 0.5 Da (seis principales picos per100 Da)
    Tasas de falso descubrimiento de péptidos (FDR) 0.01
    Tasas de falso descubrimiento de proteínas (FDR) 0.01 Ajuste de la FDR para el péptido y la proteína de 0,01 significa que se espera que ambos péptidos y proteínas identificadas para contener 1% de falsos positivos. Este valor se calcula usando una base de datos de destino-señuelo
    Er máxima posteriorprobabilidad ror (PEP) 1 PEP es la probabilidad de que un péptido individual es una correspondencia de falsos positivos. PEP igual a 1 en su entorno significa que todos los péptidos se tomarán con independencia de la PEP por lo tanto el filtrado se basa exclusivamente en el FDR.
    La longitud mínima del péptido 6
    Número mínimo de péptidos 2
    Número mínimo de péptidos únicos 1
    Usando sólo los péptidos no modificados y la oxidación (M) / acetil (proteína N-Term) activar la opción Los péptidos con modificaciones deben generalmente no se contarán para la cuantificación de proteínas ya que su abundancia no puede reflejar la proporción de la proteína correspondiente.
    Recuento mínima proporción 1
    "Coincide entre ejecuciones" activar la opción

    Tabla 3. Análisis de Datos.

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    Discussion

    Recientemente hemos descrito ChroP, una estrategia cuantitativa para la caracterización a gran escala de los componentes de la proteína de la cromatina. ChroP combina dos enfoques complementarios utilizados en el campo epigenética, CHIP y MS, aprovechando sus fortalezas y superar sus respectivas limitaciones. Chip acoplado a la secuenciación profunda (ChIP-Seq), permite el mapeo de todo el genoma de las modificaciones de histonas en la resolución de unos 35 nucleosomas. Aunque ventajosa por su sensibilidad, ensayos basados ​​en anticuerpos están limitados en su capacidad para distinguir modificaciones similares y en la disección el aspecto combinatorio de la código de histonas 36. Por otro lado, mientras que MS ofrece un análisis exhaustivo e imparcial de hPTMs, individualmente y en combinaciones de 9, que hasta el momento ha sido aplicado al análisis de la cromatina a granel, con la consiguiente falta de información sobre locus específicos PTMs patrones. Contamos con una versión modificada del chip para aislar funcionalmentecromatina dominios distintos y la espectrometría de masas para caracterizar los patrones PTM histonas y las proteínas no histonic específicamente co-enriquecidos.

    Mediante el uso de N-ChroP, el análisis de hPTMs co-asociados con la H3K9me3 reveló un enriquecimiento significativo de los marcadores asociados con cromatina silenciosa, y un agotamiento de modificaciones asociadas con cromatina activa. El acuerdo de estos resultados con estudios previos 37 demostró la solidez de la estrategia. En X-ChroP de dominios H3K9me3, la investigación basada en la SILAC de las proteínas de la cromatina-que interactúan confirmó algunos interactores descritos anteriormente, validando así el método.

    ChroP presenta dos aspectos principales originales en cuanto a las estrategias que ya están disponibles para investigar el componente proteómico de la cromatina: por ejemplo, la posibilidad de revelar sinergias inter-moleculares entre las modificaciones que decoran las histonas básico distintas dentro de la misma intacta mono-nucleosome purificada por N-chip; segundo la oportunidad de evaluar la compartimentación específico de histonas variantes y subtipos de histonas enlazador. Dado que la investigación de las variantes de las histonas se ve limitado por la falta de reactivos de buena calidad (es decir, anticuerpos), ChroP emerge como la herramienta única disponible para evaluar su ubicación y el papel funcional.

    Una limitación de ChroP en su actual establecido mentiras en el enfoque centrado en el péptido ("bottom-up") que se utiliza en la EM, con las histonas digerido en péptidos cortos y el consiguiente deterioro en la detección de la conectividad de larga distancia entre las modificaciones. Como tal, la conjugación de ChroP con "Bottom-up" MS análisis permite una evaluación parcial del aspecto combinatorio del código de histonas. Prevemos que la aplicación de las estrategias alternativas de EM, como el "Oriente-y Top-Down" para el mapeo hPTMs en péptidos más largos (> 20 bis) hasta de proteínas intactas 38-40, va a superareste sistema de seguridad.

    En general, N-y X-ChroP son altamente complementarias, con la posibilidad de la disección de la complejidad de la estructura de la cromatina en dominios funcionalmente distintos, con una resolución de mono-a oligo-nucleosomas. Predecimos que ChroP será útil también para caracterizar la composición de las regiones de cromatina marcados por la presencia de proteínas nucleares no histonic específicos, por ejemplo factores de transcripción (TFS). Además, ChroP puede ser empleado en estudios funcionales para mapear la composición dinámica de la cromatina en loci específicos en diversas perturbaciones, por ejemplo durante la activación transcripcional mundial. Por estas razones, ChroP surge como una herramienta adicional útil en el arsenal de estrategias de análisis disponibles para diseccionar el paisaje proteómico de la cromatina.

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    Disclosures

    No hay conflictos de interés declarado.

    Acknowledgments

    Esta investigación fue publicada originalmente en Mol Proteómica Celular. Soldi M. y Bonaldi T. La investigación proteómico de la cromatina dominios funcionales Revela Nuevos establecer sinergias entre Distinct Heterocromatina Componentes MCP. 2013; 12: 64-80. © la Sociedad Americana de Bioquímica y Biología Molecular. Damos las gracias a Roberta Noberini (Instituto Italiano de Tecnología y la OEI, Italia) para la lectura crítica del manuscrito. Trabajo TB es apoyado por becas de la Armenise-Harvard Programa Giovanni Fundación de Desarrollo de Carrera, la Asociación Italiana para la Investigación del Cáncer y el Ministerio de Sanidad italiano. MS trabajo fue apoyado por una beca FIRC.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    DMEM  Lonza BE12-614F
    FBS Invitrogen 10270-106
    SILAC DMEM M-Medical FA30E15086
    Dialyzed FBS Invitrogen 26400-044
    Lysine 0 (12C6 14N2 L-lysine) Sigma Aldrich L8662
    Arginine 0 (12C6 14N4 L-arginine) Sigma Aldrich A6969
    Lysine 8 (13C6 15N2 L-lysine) Sigma Aldrich 68041
    Arginine 10 (13C6 15N4 L-arginine) Sigma Aldrich 608033
    Micrococcal Nuclease Roche 10 107 921 001
    Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets Roche 04 693 132 001
    Spectra/Por 3 dialysis tubing, 3.5K MWCO, 18mm flat width, 50 foot length Spectrumlabs 132720
    QIAquick PCR purification kit QIAGEN 28104
    Anti-Histone H3 tri-methylated K9-ChIP grade Abcam ab8898
    Histone H3 peptide tri-methyl K9  Abcam ab1773
    Dynabeads Protein G Invitrogen 100.04D
    NuPAGE Novex 4-12%                            Bis-Tris Gel  Invitrogen NP0335BOX
    Colloidal Blue Staining Kit Invitrogen LC6025
    LDS Sample Buffer Invitrogen NP0007
    Formaldheyde Sigma Aldrich F8775
    Aceti anhydride-d6 Sigma Aldrich 175641-1G
    Name Company Catalog Number Comments
    Formic Acid Sigma Aldrich 94318-50ML-F
    Iodoacetamide ≥99% (HPLC), crystalline Sigma Aldrich I6125
    DL-Dithiothreitol Sigma Aldrich 43815
    Sequencing Grade Modified Trypsin, Frozen 100 μg (5 × 20 μg) Promega V5113
    Nanospray OD 360μm x ID 75μm, tips ID 8 μm uncoated Pk 5 Microcolumn Srl FS360-75-8-N-5-C15
    ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 µm   15% C Dr. Maisch GmbH r13.aq.
    Carbon extraction disk, 47 mm Agilent Technologies 12145040
    Cation extraction disk Agilent Technologies 66889-U

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    Bioquímica número 86 de la cromatina histonas modificaciones posteriores a la traducción (hPTMs) la epigenética la espectrometría de masas la proteómica SILAC inmunoprecipitación de la cromatina histonas variantes chromatome hPTMs cruzadas conversaciones
    El Enfoque ChroP Combina chip y la espectrometría de masas para diseccionar Locus específicos proteómicos Paisajes de la cromatina
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    Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP… More

    Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin. J. Vis. Exp. (86), e51220, doi:10.3791/51220 (2014).

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