Summary
في فحوصات المختبر لقياس تكاثر الفيروس قد تحسنت إلى حد كبير من خلال تطوير فيروسات الحمض النووي الريبي المؤتلف معربا عن luciferase المراسل أو الإنزيمات الأخرى قادرة على تلألؤ بيولوجي. نحن هنا من التفصيل خط أنابيب الفرز الفائق الإنتاجية التي تجمع بين هذه السلالات المؤتلف من الحصبة والفيروسات شكونغنا لعزل الأدوية المضادة للفيروسات واسع الطيف من المكتبات الكيميائية.
Abstract
فيروسات الحمض النووي الريبي هي المسؤولة عن الأمراض التي تصيب الإنسان الرئيسية مثل الانفلونزا والتهاب الشعب الهوائية وحمى الضنك والتهاب الكبد C أو الحصبة. كما أنها تمثل تهديدا الناشئة بسبب زيادة التبادلات في جميع أنحاء العالم والبشر اختراق النظم الإيكولوجية أكثر وأكثر طبيعية. وخير مثال على مثل هذا الوضع الناشئ هو أوبئة فيروس شيكونغونيا من 2005-2006 في المحيط الهندي. تقدمات الأخيرة في فهمنا للمسارات الخلوية السيطرة على تكاثر الفيروس تشير إلى أن المركبات التي تستهدف وظائف الخلية المضيفة، وليس الفيروس نفسه، يمكن أن تمنع لوحة كبيرة من فيروسات الحمض النووي الريبي. وقد تم تحديد بعض المركبات المضادة للفيروسات واسع الطيف مع مضيفه المقايسات الموجهة المستهدفة. ومع ذلك، وقياس تثبيط تكاثر الفيروس في مزارع الخلايا باستخدام الحد من آثار الاعتلال الخلوي بمثابة قراءات لا يزال يمثل استراتيجية الفحص قصوى. وقد مثل شاشات الوظيفية تحسنت كثيرا من خلال تطوير فيروسات المؤتلف معربا عن مراسل الانزيمات كاليفورنياpable من تلألؤ بيولوجي مثل luciferase المراسل. في هذا التقرير، ونحن من التفصيل خط أنابيب الفرز الفائق الإنتاجية، والذي يجمع بين الحصبة المؤتلف والفيروسات شكونغنا مع المقايسات الجدوى الخلوية، لتحديد المركبات مع واسعة الطيف الشخصي المضادة للفيروسات.
Introduction
فيروسات الحمض النووي الريبي هي المسؤولة عن مجموعة كبيرة ومتنوعة من الإصابات البشرية، ويكون لها تأثير كبير على السكان في جميع أنحاء العالم سواء من حيث الصحة العامة والتكلفة الاقتصادية. وقد تم تطوير لقاحات فعالة ضد العديد من فيروسات الحمض النووي الريبي الإنسان، وتستخدم على نطاق واسع كعلاج وقائي. ومع ذلك، لا يزال هناك نقص حاد في الأدوية العلاجية ضد عدوى فيروس الحمض النووي الريبي. في الواقع، لقاحات فعالة ليست متاحة ضد مسببات الأمراض البشرية الرئيسية، مثل فيروس حمى الضنك وفيروس التهاب الكبد C أو الجهاز التنفسي المخلوي الفيروس الإنسان (hRSV). الى جانب ذلك، فيروسات الحمض النووي الريبي هي المسؤولة عن غالبية الأمراض المستجدة، والتي تزايدت وتيرتها بسبب البورصات العالمية وتأثير الإنسان على النظم الايكولوجية. ضد هذا التهديد التي تمثل فيروسات الحمض النووي الريبي، ترسانة العلاجية لدينا محدودة للغاية وغير فعالة نسبيا 1-3. وتقوم العلاجات الحالية أساسا على نوع المؤتلف أنا إنترفيرون (الإنترفيرون α / β) لتحفيز المناعة الفطرية،أو إدارة ريبافيرين. على الرغم من أن طريقة عمل هذا ريبونوكليوزيد التناظرية مثيرة للجدل ويعتمد على آليات مختلفة ربما، وتثبيط IMPDH الخلوية (إينوزين أحادي هيدروجين)، والذي يستنزف حمامات GTP داخل الخلايا، أمر ضروري بشكل واضح 4. ريبافيرين، بالاشتراك مع مضاد للفيروسات الإنترفيرون α، هو العلاج الرئيسي ضد فيروس التهاب الكبد الوبائي C. ومع ذلك، والعلاج الإنترفيرون α / β وريبافيرين هي فعالية فقيرة نسبيا في الجسم الحي ضد معظم الفيروسات الحمض النووي الريبي لأنها حادة كفاءة الإنترفيرون α / β يشير من خلال التعبير عن عوامل الفوعة 5 وغالبا ما يفلتون من ريبافيرين 3. وأضاف هذا إلى حقيقة أن العلاج ريبافيرين يثير قضايا هامة السمية، على الرغم من أنه تمت الموافقة مؤخرا ضد مرض hRSV شديدة مع فوائد مثيرة للجدل 6. في الآونة الأخيرة، وقد تم تسويق بعض العلاجات الفيروس محددة، ولا سيما ضد فيروس الانفلونزا مع س التنميةو مثبطات النورامينيداز 3. ومع ذلك، فإن التنوع الكبير وظهور دائم للفيروسات الحمض النووي الريبي يحول دون تطوير علاجات محددة ضد كل واحد منهم في مستقبل قريب نسبيا. تماما، وهذا يؤكد الحاجة إلى استراتيجيات فعالة لتحديد وتطوير جزيئات مضادة للفيروسات قويا في المستقبل القريب.
فمن تافهة القول بأن المانع واسع الطيف فعال ضد فريق كبير من فيروسات الحمض النووي الريبي من شأنه أن يحل هذه المشكلة. على الرغم من أن مثل هذا الجزيء لا يزال حلم عالم الفيروسات، وفهم أفضل لدينا من آليات الدفاع الخلوية ونظام المناعة الفطرية تشير إلى أن بعض الاحتمالات موجودة 7،8. العديد من المختبرات الأكاديمية والصناعية يسعون الآن الجزيئات التي تحفز جوانب محددة من آليات الدفاع الخلوية أو المسارات الأيضية لفظة تكاثر الفيروس. على الرغم من أن هذه المركبات ربما تظهر آثار جانبية كبيرة، وعلاجات ضد الالتهابات الفيروسية الحادة تكون الادارىإد لفترة قصيرة نسبيا، مما يجعلها مقبولة على الرغم من بعض السمية المحتملة على المدى الطويل. وقد وضعت استراتيجيات مختلفة لتحديد مثل هذه واسعة الطيف الجزيئات المضادة للفيروسات. تهدف بعض البرامج البحثية في إيجاد الجزيئات التي تستهدف الدفاع أو التمثيل الغذائي مسارات محددة. وهذا يشمل، على سبيل المثال، المستقبلات الاعتراف الممرض للحصول المضادة للفيروسات التعبير الجيني 9 وتفعيل العوامل المضادة للفيروسات مثل RNaseL 10، والآلات الالتهام الذاتي لتعزيز تدهور الفيروس 11، والتوليف نوكليوزيد مسارات 12،13، أو شلالات أفكارك لترسيب موت الخلايا المصابة بالفيروسات 14. وقد وضعت مجموعات أخرى شاشات المظهرية التي لا تستهدف المستندة 13،15-17. في هذه الحالة، يتم تحديد الجزيئات المضادة للفيروسات ببساطة عن طريق قدرتها على منع تكاثر الفيروس في نظام الهاتف الخلوي معين. الافتراض العام هو أن مركب تثبيط 2-3 فيروسات الحمض النووي الريبي لا علاقة لها سيكون له الشخصى مناسبة ل-SP واسعةectrum جزيء مضاد للفيروسات. يتم تحديد طريقة عمل مركبات ضرب المحدد مع هذا النهج التجريبية فقط في المرة الثانية، وفي نهاية المطاف، قد يؤدي إلى تحديد أهداف الخلوية رواية لمضادات الفيروسات. ومن المثير للاهتمام، وقد أظهرت تحليل بأثر رجعي من الأدوية الجديدة التي وافقت عليها إدارة الغذاء والدواء الأمريكية بين عامي 1999 و 2008 أنه في عام، مثل هذه الفحوصات المظهرية تميل إلى أداء أفضل من النهج القائم على الهدف لاكتشاف أول في فئة المخدرات جزيء صغير 18 .
عادة ما يتم تحديده تكاثر الفيروس في المقايسات خلية مقرها الإنتاجية العالية من الفيروس آثار الاعتلال الخلوي. والخلايا المصابة والمثقف في 96 - أو لوحات 384 جيدا في وجود مركبات اخضعت للاختبار. بعد بضعة أيام، يتم إصلاح الطبقات الخلوية وملطخة الأصباغ مثل الكريستال البنفسجي. أخيرا، يتم تحديد الامتصاصية مع تحديد قارئ لوحة ومركبات تثبيط تكاثر الفيروس عن طريق قدرتها على الحفاظ على الطبقات الخلوية جيئة وذهاباتأثير الاعتلال الخلوي الناجم عن الفيروس م. بدلا من ذلك، يتم تقييم آثار الاعتلال الخلوي بوساطة فيروسي باستخدام فحوصات سلامة قياسية مثل تخفيض MTS. هذه القياسات ليست لين العريكة للغاية وفعالة من حيث التكلفة، ولكن تعاني من القيود الرئيسية الثلاثة. الأولى، فإنها تتطلب مجموعة خلايا الفيروس حيث تكاثر الفيروس هو الاعتلال الخلوي في أيام قليلة فقط ولكن هذا ليس ممكنا دائما، وبالتالي الدعوة إلى النهج البديلة 19. الثانية، فهي الكمي سيئة لأنها تستند إلى مقياس غير مباشر من تكاثر الفيروس. أخيرا، ومركبات سامة يمكن سجل الزيارات كما إيجابية، وبالتالي يجب القضاء مع شاشة العداد قياس الجدوى الخلوية. للتغلب على بعض هذه العقبات، قد تم تصميمها من الفيروسات أو المؤتلف replicons بواسطة الوراثة العكسية للتعبير عن البروتينات المراسل، مثل EGFP أو luciferase المراسل، من وحدة النسخ إضافية أو في الإطار مع جينات البروتين الفيروسي (أمثلة قليلة هي 20-23). عند تكرار هذه الفيروسات، مراسل الأسبوعيةويتم إنتاج oteins جنبا إلى جنب مع البروتينات الفيروسية نفسها. وهذا يوفر مقايسة الكمية جدا لقياس تكاثر الفيروس وتقييم النشاط المثبطة الجزيئات مرشح. هذا صحيح بصفة خاصة للبحث عن الفيروسات المؤتلف معربا عن luciferase المراسل (أو الإنزيمات الأخرى قادرة على تلألؤ بيولوجي) لأن هذا النظام مراسل المعروضات مجموعة واسعة ديناميكية مع حساسية عالية ويكاد لا توجد خلفية هذا. وعلاوة على ذلك، لا يوجد أي مصدر للضوء الإثارة، وبالتالي منع التداخل مع مضان مجمع 24.
هنا، لدينا بروتوكول الإنتاجية العالية من التفصيل لفحص المكتبات الكيميائية لمثبطات واسعة الطيف من فيروسات الحمض النووي الريبي. يتم اختبار المركبات الأولى على الخلايا البشرية المصابة بفيروس الحصبة المؤتلف (MV) معربا عن يراعة luciferase المراسل 25 (rMV2/Luc، الشكل 1، الشاشة الرئيسية). MV ينتمي إلى Mononegavirales النظام، وغالبا ما تعتبر عضوا تنميط فيروس RNA سلبي حبلاوفاق. على هذا النحو، يتم استخدام MV الجينوم كقالب من قبل البلمرة الفيروسية لتجميع جزيئات مرنا ترميز للبروتينات الفيروسية. في سلالة MV المؤتلف دعا rMV2/Luc، وأعرب عن التعبير luciferase المراسل من وحدة النسخ الإضافية تدرج بين P والجينات M (الشكل 2A). في موازاة ذلك، يتم اختبار المركبات السمية على الخلايا البشرية باستخدام كاشف القائم على luciferase المراسل التجارية التي يقيم، من خلال القياس الكمي ATP، وعدد من خلايا نشطة عملية الأيض في الثقافة (الشكل 1، الشاشة الرئيسية). المكتبات الكيميائية بالكامل يمكن فرزهم بسهولة مع هذه المقايسات اثنين من أجل تحديد المركبات التي ليست سامة ومنع بكفاءة MV النسخ المتماثل. ثم، يتم اختبارها إصابات لتثبيط الاستجابة للجرعة من MV النسخ المتماثل، وعدم وجود سمية فضلا عن قدرتها على إضعاف الفيروس شيكونغونيا (CHIKV) التكرار (الشكل 1، وشاشة ثانوية). CHIKV هو عضو في عائلة الفيروسات الطخائية والجينوم هو أبositive منفردة الجديلة جزيء الحمض النووي الريبي. على هذا النحو، فمن لا علاقة لها تماما لالحصبة ومركبات تثبيط كلا MV وCHIKV تقف فرصة كبيرة لمنع لوحة كبيرة من فيروسات الحمض النووي الريبي. يتم تحويل البروتينات ابنيوي CHIKV مباشرة من الجينوم الفيروسي، في حين يتم ترميز البروتينات الهيكلية التي كتبها النسخ والترجمة من جزيء الرنا subgenomic. ويستند لدينا في المختبر تكرار الفحص لCHIKV على سلالة المؤتلف دعا CHIKV / رن، الذي يعبر عن Renilla انزيم luciferase المراسل كجزء المشقوق من polyprotein ابنيوي من خلال إدخال الجين المراسل بين nsP3 وتسلسل nsP4 26 (الشكل 2B). مقياس Renilla luciferase النشاط يسمح للرصد تكاثر الفيروس في مرحلة مبكرة من دورة حياة CHIKV.
وقد استخدم هذا البروتوكول الإنتاجية العالية لتحديد المركبات بسرعة مع لمحة مناسبة لمضادات الفيروسات واسع الطيف في مكتبة تجارية من 10،000 molecالمخصب ules للتنوع الكيميائية. مركبات كانوا يتبعون أساسا حكم يبينسكي من خمسة، مع الأوزان الجزيئية تتراوح 250-600 دالتون، وتسجيل القيم D أقل من 5. وكان معظم هذه الجزيئات كيانات كيميائية جديدة غير متوفرة في المكتبات التجارية الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد 96 جيدا لوحات مركبات مع ابنة
- نقل لوحات الأم 96 جيدا تحتوي على 10 ملي الحلول الأسهم من المركبات الكيميائية في DMSO من -20 درجة مئوية إلى درجة حرارة الغرفة. تمييع المركبات 5X في DMSO المتوسطة للحصول على لوحات التخفيف 96 جيدا في 2 مم. ويتحقق التخفيف من قبل pipetting 5 ميكرولتر في 20 ميكرولتر من DMSO والاختلاط.
- ماصة 1 ميكرولتر من لوحات التخفيف في الآبار الجافة البيضاء، وزراعة الأنسجة شريط مشفر لوحات 96 جيدا. هذه أول مجموعة من لوحات ابنة (D1) سيتم استخدامها لتقييم سمية المركبات عند تركيز النهائي من 20 ميكرومتر. لوحات ابنة تخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- تمييع مركبات أخرى 01:10 بواسطة pipetting 4 ميكرولتر من لوحات التخفيف في 36 ميكرولتر من DMSO والاختلاط. ماصة 1 ميكرولتر في الآبار الجافة من البيض، مسطحة القاع، وزراعة الأنسجة شريط مشفر 96 بئرا لوحات. هذه المجموعة الثانية من لوحات ابنة (D2) سيتم استخدامها لتقييم تثبيط MV replicatioن من قبل المركبات بتركيز نهائي من 2 ميكرومتر. لوحات ابنة تخزينها في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
2. التحضير للثقافات الخليوي لتحديد سمية المركب
- تنمو الخلايا HEK-293T عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 في تعديل متوسطة النسر Dulbecco و(DMEM) مع استقرت L-الجلوتامين وتستكمل مع 10٪ الجنين مصل العجل (FCS)، الستربتوميسين (100 ميكروغرام / مل)، والبنسلين (100 وحدة دولية / مل). و passaged الخلايا عن طريق trypsinization كل 4-5 أيام، والمخففة 01:10 في قارورة جديدة. يجب أن تكون الخلايا في مرحلة سجل للتجارب.
- في يوم من التجربة، واستعادة الخلايا عن طريق trypsinization وأداء العد الخلية. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي، و resuspend لهم في 3 × 10 5 خلية / مل في مستنبت. نعتبر أن 12.5 مل من تعليق خلية مطلوبة من أجل كل لوحة الفرز.
- نقل الخلايا إلى الحوض الصغير، والاستغناء عن 100 ميكرولتر من تعليق خلية في لوحات تحتوي على D1 ارتفعت كومبو الكيميائيةجهاز الأمم المتحدة الإنمائي. يتم تحريكها تعليق خلية داخل الحوض بشكل منتظم لتجنب الترسيب.
- ارتفاع تحكم الآبار A1، C1، E1، G1، A12، C12، E12 وG12 مع 1 ميكرولتر من DMSO. وسوف تستخدم الآبار المقابلة كمرجع للخلايا الحية (أي سمية). ارتفاع تحكم الآبار B1، D1، F1، H1، B12، D12، F12 وH12 مع 1 ميكرولتر من DMSO و 2.5 ميكرولتر من حل IGEPAL 0.5٪ لقتل الخلايا. وسوف تستخدم الآبار المقابلة كمرجع للخلايا الميتة (سمية عالية).
- احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
3. التحضير للثقافات الخلية المصابة بواسطة rMV2/Luc
- تنمو واستعادة الخلايا كما هو موضح في 2.1 و 2.2. مرة أخرى، Resuspend الخلايا في 3 × 10 5 خلية / مل في مستنبت. نعتبر أن 12.5 مل من تعليق خلية مطلوبة من أجل كل لوحة الفرز.
- اختياري: ملحق الثقافة المتوسطة مع يوريدين في 20 ميكروغرام / مل.
ملاحظة: عند فحص المكتبات الكيميائية لreplicatio الفيروسيةن مثبطات، يبدو أن المركبات التي تستهدف الخطوات في وقت مبكر من البيريميدين الحيوي مسار كثيرا ما عزل 13،16،27،28. يستخدم إضافة إلى يوريدين مستنبت لتصفية مثل هذه الجزيئات المضادة للفيروسات. في الواقع، وهذا يعيد بكفاءة تكاثر الفيروس عندما يتم حظر الانزيمات المنبع من البيريميدين الحيوي المسار. - حفظ 1:10 من تعليق خلية للآبار مراقبة مع الخلايا غير المصابة، والمضي قدما للإصابة مع حجم المتبقية.
- ذوبان الجليد على حجم مناسب من rMV2/Luc محلول المخزون. حلول الأسهم MV وعادة ما تكون في 10 6 -10 8 الجسيمات المعدية لكل مل. يجب أن تكون مصابة الثقافة مع 0.1 جزيئات معدية من rMV2/Luc في الخلايا المستهدفة، والتي تتطابق مع 0.1 تعدد العدوى (وزارة الداخلية). ملاحظة: مشتق من لقاح rMV2/Luc MV (سلالة شوارتز) ويتم التلاعب في بيئة BSL2.
- إضافة الفيروس إلى تعليق خلية والمزيج بلطف. نقل الخلايا المصابة إلى الحوض الصغير، والاستغناء 100ميكرولتر من تعليق الخلية المصابة في الأعمدة من 2 إلى 11 لوحات D2 تحتوي على مركبات كيميائية ارتفعت. تعليق خلية داخل الحوض يتم خلط بانتظام بلطف.
- في العمودين 1 و 12، الاستغناء 100 ميكرولتر من الخلايا غير المصابة جيدا على اثنين. يتم الاستغناء الخلايا المصابة في الآبار الآخرين.
- احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
4. تدابير luciferase النشاط وتحليل البيانات
- إزالة لوحات D1 من الحاضنة، وتحديد الجدوى الخلوية من خلال إضافة 50 ميكرولتر من القائم luciferase المراسل الجدوى كاشف مباشرة إلى آبار الثقافة. خلط واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قراءة لوحات مع luminometer. تم تعيين الوقت التكامل في 100 ميللي ثانية لكل بئر.
- إزالة لوحات D2 من الحاضنة، وتحديد luciferase النشاط من خلال إضافة 50 ميكرولتر من الركيزة luciferase المراسل مباشرة إلى آبار الثقافة. احتضان لمدة 6 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وقراءة لوحات مع luminometer كما descriسرير أعلاه.
- حساب عامل Z'عن كل لوحة D1 للمقايسة سمية لتبرير نوعية الشاشة 29. Z '= 1-3 * (σ + + σ) / (μ + - μ)، حيث μ + σ + وتتوافق مع الوسائل من التألق والانحرافات المعيارية للخلايا كلوة-293T مع DMSO وحده (أي سمية)، وμ وσ هي وسيلة من التألق والانحرافات المعيارية للآبار ثقافة التعامل مع IGEPAL لقتل الخلايا. ومن المتوقع Z 'أن يكون فوق 0.5، أو يتم تجاهل وحة المقابلة.
- تعيين عتبة السمية في μ + / 2. تجاهل مركبات مع القيم التلألؤ تحت هذا الوقف (الشكل 3A).
- حساب عامل Z'عن كل لوحة D2 للمقايسة المضادة للفيروسات. هنا، μ + σ + وتتوافق مع الوسائل من التألق والانحرافات المعيارية للخلايا المصابة مثقف مع DMSO وحده، وμ وσ هي وسيلة من التألق والانحرافات المعيارية للخلايا غير المصابة. مرة أخرى، لوحات مع Z & #39؛ يتم تجاهل القيم أقل من 0.5.
- حساب تثبيط تكاثر الفيروس على النحو التالي: النسبة المئوية للتثبيط = (μ + - luciferase النشاط لمجمع X) / (μ + - μ) * 100. تعيين عتبة 75٪ في تثبيط، وتحديد المركبات التي تحد من القيم التلألؤ تحت هذا الوقف (الشكل 3B) ليست سامة وفقا لمعايير وصفها في 4.4.
5. الشاشة الثانوية للسمية واسع الطيف المضادة للفيروسات آخر
- جعل 1:2 التخفيفات التسلسلي لكل ضرب المركب في DMSO، بدءا من 500 ميكرومتر إلى 4 ميكرومتر (8 التخفيفات). ملء الأبيض، والأنسجة لوحات الثقافة شريط مشفر مع 50 ميكرولتر من مستنبت. إضافة 1 ميكرولتر من كل تخفيف المركب في الآبار الثقافة. كرر مرتين لدينا 3 لوحات الثقافة مع التخفيفات المسلسل مكررة لكل مركب ضرب.
- إعداد 37.5 مل من تعليق خلية كلوة-293T في 6 × 10 5 خلية / مل في مستنبت كما هو موضح أعلاه (2.1 و 2 في.2). الاستغناء 2X 12.5 مل في أنابيب الصقر وتصيب الخلايا مع rMV2/Luc إما في وزارة الداخلية = 0.1 أو CHIKV المؤتلف معربا عن Renilla luciferase المراسل (CHIKV / رن) في وزارة الداخلية = 0.2. مزيج من قبل قلب.
ملاحظة: مشتق CHIKV / رن من سلالة من النوع البري من CHIKV وبالتالي ينبغي التلاعب في بيئة BSL3. يمكن نقل لوحات من BSL3 لBSL1 مرة واحدة تمت إضافة Renilla الركيزة لآبار الثقافة (انظر أدناه). - الاستغناء 50 ميكرولتر من / الخلايا غير المصابة، rMV2/Luc-infected، أو CHIKV رن المصابة في لوحات الثقافة التي تحتوي على التخفيفات التسلسلي للمركبات ضرب. احتضان 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.
- إضافة 50 ميكرولتر من يراعة luciferase المراسل الركيزة لتحديد النشاط يراعة luciferase في الآبار rMV2/Luc-infected. إضافة 50 ميكرولتر من الركيزة luciferase المراسل Renilla لتحديد Renilla luciferase النشاط في CHIKV / آبار رن المصابة. أخيرا، إضافة 50 ميكرولتر من القائم luciferase المراسل جدوى الفحص الكاشف إلى الخلايا غير المصابة لتحديد الجدوى الخلوية.
- بيانات مؤامرة (فايجوري 4) وتحديد تركيزات المركب التي تمنع ضرب MV وتكرار CHIKV بنسبة 50٪. تجاهل المجمع تظهر بعض السمية في هذا الاختبار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
خط الأنابيب هذا الفحص تعتمد أولا على اختيار المركبات التي تمنع تكرارها وMV لا تظهر أي سمية الخلوية كبيرة (الشكل 1، الشاشة الرئيسية). فإنه يستفيد من فحوصات على أساس luciferase المراسل لتحديد السمية الخلوية وتثبيط تكاثر الفيروس. جميع الخطوات pipetting لاقتناء والبيانات لا يمكن أن يؤديها في وضع الإنتاجية العالية مع منصة الروبوتية.
ويتم تقييم السمية الخلوية من المركبات باستخدام جدوى الفحص القائم على luciferase المراسل أن يقيم عدد من الخلايا الحية في ثقافة تقوم على القياس الكمي لاعبي التنس المحترفين الحاضر، والتي تتطابق مع خلايا نشطة عملية الأيض. بسبب الأكسدة وسيفيرين بواسطة luciferase المراسل هو ATP تعتمد، إشارة التلألؤ يتناسب طرديا مع ATP الخلوية التي تقدمها الخلايا الحية. الشكل 3A يظهر نتائج لوحة واحدة فحص ممثل. كما هو متوقع، كانت القيم luciferase النشاط واضح للغاية قياس آثافةإد في آبار المراقبة التي تتضمن إما الخلايا الحية أو الخلايا الميتة قتل مع IGEPAL. تم تعيين عتبة تجريبيا في μ + / 2 لتصفية مركبات تظهر بعض السمية الخلوية وفي هذه الحالة، تم تجاهل 21 مركبات من هذه اللوحة. في موازاة ذلك، يتم قياس نشاط مضاد للفيروسات باستخدام rMV2/Luc، سلالة المؤتلف من MV معربا عن luciferase المراسل (الشكل 2). وتستخدم خلايا كلوة-293T الإنسان لأنها حساسة للغاية للإصابة MV. ونتيجة لذلك، luciferase النشاط في الآبار ثقافة المصابة عالية جدا (200-300 × 10 3 وحدات luciferase النشاط في آبار المراقبة). هذا يوفر مجموعة ديناميكية كبيرة تسهل اختيار مثبطات تكرار MV. الشكل 3B يظهر النتائج التي تم الحصول عليها لممثل واحد لوحة الفرز. مستعمل أربع مركبات تكاثر الفيروس بأكثر من 75٪ في هذا المثال تم تحديد و.
أخيرا، المركبات التي ليست سامة وسجلالإيجابية في تكرار الفحص الفيروسي يتم اختيار (3A الشكل و3B). يتحدد على نصف تركيز المثبطة القصوى (IC50) على كلا MV وCHIKV، وهما فيروسات الحمض النووي الريبي لا علاقة لها (الشكل 1، وشاشة ثانوية). يتم تحديد النشاط المضادة للفيروسات من المركبات ضرب باستخدام سلالات الفيروس المؤتلف معربا إما اليراع (rMV2/Luc) أو Renilla (CHIKV / رن) luciferase المراسل. الشكل 4A و 4B تظهر منحنيات تثبيط ممثل عن MV وتكرار CHIKV، على التوالي. وتستخدم هذه المنحنيات لتحديد IC50s من المركبات ضرب. في موازاة ذلك، وأكد عدم وجود السمية الخلوية من المركبات المحددة في التجربة الجرعة والاستجابة باستخدام فحص جدوى القائمة على luciferase المراسل هو موضح أعلاه (الشكل 4C). الجدول 1 يظهر القيم IC50 لMV وتكرار CHIKV على مجموعة من 13 غير مركبات سامة تحديد من مكتبة الكيميائي للجزيئات 10،000. هذه كومبوجهاز الأمم المتحدة الإنمائي هي الرواية سواء من حيث التركيب الكيميائي والنشاط البيولوجي. بعض من هذه الجزيئات المشتركة التشابه الهيكلية، ويمكن جمعها في ثلاث عائلات كيميائية متميزة. كمرجع، وتظهر القيم IC50 تم الحصول عليها مع brequinar أيضا في الجدول 1. Brequinar هو المانع من نازعة dihydroorotate، الانزيم الرابع من مسار البيريميدين الحيوي، مع نشاط مضاد للفيروسات قويا في المختبر 30،31. عند النظر في القيم IC50، أمر أقل من واحد من حجم فصل هذا الجزيء إشارة من الفعالية الأكثر نشاطا حددها الفرز. أنشئ هذا النشاط المضادة للفيروسات قوي من المركبات المحددة.
الشكل 1. ملخص من خط الانابيب الفرز. اليسار لوحة يظهر عشاشة rimary حيث يتم اختيار مركبات لعدم وجود السمية والقدرة على منع MV النسخ المتماثل. اللوحة اليمنى يظهر على الشاشة الثانوية حيث يتم تأكيد النشاط المضادة للفيروسات من المركبات المحدد، ويتم تحديد قدرتها على منع تكرار CHIKV. وتعتبر المركبات التي تمنع بكفاءة MV وCHIKV دون أي سمية كبيرة باسم مثبطات اسعة الطيف المحتملة من فيروسات الحمض النووي الريبي. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الشكل 2. منظمة الجينوم من فيروسات الحمض النووي الريبي يحمل الجين المؤتلف luciferase المراسل. (A) rMV2/Luc: يتم عرض MV-بالمعنى السلبي الحمض النووي الريبي الجينوم مع 'نهاية 3 على اليسار، مع ستة جيناتوأشار في حروف وكما هو مبين المستطيلات البيضاء. يتم إدراج الترميز وحدات إضافية لالنسخي الجين مراسل P بين الجينات وM وكما هو مبين مستطيل أصفر (B) CHIKV / رن: يتم عرض CHIKV-RNA إيجابية بمعنى الجينوم لها مع نهاية توج 5'على اليسار، مع إطار القراءة المفتوح ترميز البروتينات غير الهيكلية الأربعة (nsP1-4). اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الشكل 3. نتائج الممثل لأحد 96 لوحة جيدا الفرز. (أ) القيم luciferase المراسل الحصول عليها مع القائم luciferase المراسل جدوى الفحص. الأعمدة 1 و 12 تتوافق مع ضوابط بديلة مع DMSO وحده ("+"؛ لا سمية) أو IGEPAL ("-"؛ TOXI عالية المدينة). اللون الأزرق هو تسليط الضوء المركبات التي تعتبر يست سامة وفقا لتركيزات ATP المكتشفة في الآبار الثقافة، في حين الآبار الأبيض تتوافق مع المركبات السامة (القيم luciferase المراسل <12203 × 10 3) (ب) القيم التي تم الحصول عليها مع الخلايا luciferase المراسل rMV2/Luc-infected. الأعمدة 1 و 12 تتوافق مع ضوابط بديلة، أي الخلايا HEK-293T غير المصابة ("-") أو خلايا rMV2/Luc-infected تعامل مع DMSO وحده ("+"). لكل مركب اختبار، وهذا الرقم يظهر كل من إشارة luciferase المراسل التلألؤ والنسبة المئوية للتثبيط النسبية للسيطرة على الآبار. ويسلط الضوء على المركبات تثبيط إشارة التلألؤ بأكثر من 75٪ في الأصفر أو الأخضر تبعا إذا كانت تعتبر سامة أم لا كما هو محدد في الفقرة (أ). وبالتالي، واللون الأخضر يظهر المركبات التي تمنع ضرب MV تكرار ولا تؤثر الجدوى الخلوية.ر = "_blank"> اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الشكل 4. النشاط المضادة للفيروسات الجرعة والاستجابة وسمية المركبات C864، C648 C062 و. أصيب (A) خلايا كلوة-293T مع rMV2/Luc سلالة من MV معربا عن luciferase المراسل (وزارة الداخلية = 0.1)، وحضنت مع جرعات متزايدة من C864، C648، C062 أو DMSO وحدها. بعد 24 ساعة، تم تحديد التعبير luciferase المراسل. * يشير إلى أن الموانع luciferase المراسل المرصودة كانت ذات دلالة إحصائية مع جميع المركبات الثلاث (قيم ع <0.05). (B) والخلايا المصابة HEK-293T مع CHIKV / رن سلالة من CHIKV معربا عن Renilla luciferase المراسل (وزارة الداخلية = 0.2)، وحضنت مع زيادة جرعة من C864، C648، C062 أو DMSO وحدها. بعد 24 ساعة، تم تحديد Renilla luciferase المراسل التعبير. * يشير احصاءالموانع كبيرة أتوماتيكيا مع جميع المركبات الثلاث (قيم ع <0.05). وحضنت الخلايا (C) HEK-293T مع جرعات متزايدة من C864، C648، C062 أو DMSO وحدها. كعنصر تحكم لسمية، واستكملت الثقافات الخلية مع 2.5 ميكرولتر من حل IGEPAL 0.5٪. بعد 24 ساعة، تم تحديد عدد من الخلايا الحية باستخدام luciferase المراسل القائم على جدوى الفحص. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
| العائلة الكيميائية | مركب | MV (IC50 ميكرومتر) | CHIKV (IC50 ميكرومتر) | CC50 (ميكرومتر) |
| 1 | C864 | 0.6 | 0.6 | > 5 |
| 1 | C877 | 0.2 | 0.2 | > 5 |
| 1 | C957 | 1.2 | 1.2 | > 5 |
| 1 | C963 | 1.2 | 0.9 | > 5 |
| 1 | C967 | 1.7 | 1.6 | > 5 |
| 1 | C348 | 0.25 | 0.3 | > 5 |
| 1 | C265 | 0.25 | 0.3 | > 5 |
| 1 | C270 | 0.5 | 0.5 > 5 | |
| 1 | C350 | 0.4 | 0.5 | > 5 |
| 2 | C646 | 0.16 | 0.15 | > 5 |
| 2 | C814 | 1.9 | 1.1 | > 5 |
| 2 | C648 | 0.7 | 0.4 | > 5 |
| 3 | C062 | 1 | 1.2 | > 5 |
| Brequinar | 0.04 | 0.04 | > 5 |
الجدول 1. النشاط المضادة للفيروسات والسمسة من 13مركبات مختارة من مكتبة الكيميائية الأصلية. يتم التعبير عن النتائج على القيم IC50 لتثبيط MV أو تكرار CHIKV. تم العثور على القيم CC50> 5 ميكرومتر لجميع المركبات في التجارب الجرعة والاستجابة من الشاشة الثانوية. ولكن عتبة مرشح التسجيل لcytoxicity من الشاشة الرئيسية تشير إلى أن القيم CC50، بل هي> 20 ميكرومتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويهدف خط أنابيب الفحص وصفها هنا في اختيار مركبات مع لمحة مناسبة باسم مثبطات واسعة الطيف من فيروسات الحمض النووي الريبي. ، وسجل أي تثبيط MV تكرار متفوقة على 75٪، و 40 مركبات (0.4٪) إيجابية عندما تم فحص مكتبة من 10،000 مركبات مع هذا البروتوكول وطبقت معايير التصفية المذكورة آنفا. الى جانب ذلك، أظهرت نصفهم تقريبا من بعض السمية في القائم luciferase المراسل جدوى الفحص، وتم تجاهل لهذا السبب. أخيرا، تم اختبارها من اثني عشر من الزيارات متاحة بسهولة في كمية أكبر. هذه مجموعة صغيرة تم اختبارها بسهولة لكل من سمية الخلوية وتثبيط تكاثر الفيروس ضد MV وCHIKV في التجارب الجرعة والاستجابة (الشكل 4). وأكد النشاط المضادة للفيروسات لجميع المركبات المحدد، وكان معدل ضرب الهوية العامة لفحص خط الانابيب هذا 1.3 ‰. هذه النتيجة هي مشابهة جدا لنتائج التي تم الحصول عليها من قبل مجموعات أخرى مختلفة مع الإنتاجية العاليةفحوصات الفرز القائم على النسخ المتماثل لمضادات الفيروسات 27،32، ويندرج في نطاق المتوقع لفحوصات المظهري خلية القاعدة في العام (1-5 ‰ 33). ومع ذلك، فإن معدل ضرب تعتمد بشكل كبير على كل من مكتبة المجمع التي يتم فرزهم وعتبات مرشح التهديف، والتي يمكن تعديلها تبعا لالشخصى البيانات التي تم جمعها. هنا، تم تحديد تجريبيا العتبات التي تم اختيارها لتثبيط MV تكرار والسمية الخلوية، وكان من المقرر المفاضلة للحصول على رقم لين العريكة من الزيارات التي يمكن اختبارها بسهولة في الشاشة الثانوية ضد CHIKV.
في الشاشة الرئيسية، تم اختبار المركبات على حد سواء قدرتها على منع تكرار MV وعدم وجود سمية الخلوية. تم تحديد النشاط المضادة للفيروسات عند تركيز 2 ميكرومتر على الخلايا rMV2/Luc-infected في حين تم تحديد السمية الخلوية في 20 ميكرومتر. تم العثور على هذه الإعدادات لتحديد قيمة تجريبية مباشرة للمركبات مع ارتفاع المضادةالنشاط الفيروسي نسبة إلى سمية الخلوية. بالإضافة إلى ذلك، تم إجراء الشاشة الرئيسية في وجود يوريدين. في الواقع، تشير المنشورات الحديثة أن مركبات تستهدف الخطوات في وقت مبكر من البيريميدين الحيوي مسار كثيرا ما معزولة عندما تبحث عن مثبطات الحمض النووي الريبي الفيروسات 13،16،27،28. على وجه الخصوص، وقد وجدت مجموعات بحثية تبحث عن الجزيئات المضادة للفيروسات مثبطات نازعة dihydroorotate، الانزيم الرابع من هذا المسار الأيضي 31. يوريدين في مستنبت بكفاءة عبر يكمل لتثبيط هذا الإنزيم، وبالتالي يعيد تكاثر الفيروس. في هذه الطريقة، يتم استبعاد المركبات التي تمنع تكرار MV من خلال تثبيط البيريميدين الحيوي مسار مباشرة من الفعالية المضادة للفيروسات. أخيرا، تم العثور على عامل Z'أن تكون منهجية أعلاه 0.5، مما يدل على متانة عالية ونوعية الفحص.
في موازاة ذلك، تم تحديد السمية الخلوية باستخدام throughpu عاليةر على أساس مقايسة luciferase المراسل أن يحدد عدد الخلايا النشطة في عملية الأيض ثقافة تقوم على القياس الكمي لاعبي التنس المحترفين. في كل لوحة الفحص، تم إضافة IGEPAL في آبار المراقبة للسمية. هذا غير تغيير طبيعة، المنظفات غير الأيونية لديه ميزة بقتل بكفاءة جميع أنواع الخلايا غير وجه التحديد دون التأثير على نشاط انزيم luciferase المراسل. كان Z'عامل منهجي أعلاه 0.5 أكثر من 125 لوحات، مما يدل على متانة عالية ونوعية الفحص. واحد الحد من هذه السمية الخلوية مقايسة هو التكلفة العالية نسبيا. كما مقايسة بديلة لتحديد الجدوى الخلوية، وقد استخدمت بعض الجماعات خطوط الخلايا معربا عن luciferase المراسل جوهري من التحوير مستقرة 34. في مثل هذه المقايسات، ومن المتوقع أن ينخفض مركبات سامة أو حتى قمع التعبير luciferase المراسل عندما تؤثر الجدوى الخلوية. وضعنا مؤخرا خط الخلية مستقرة معربا عن luciferase المراسل على الإنترفيرون β التحفيز 35، وكان يستخدم هذا الخط خلية لاختبار آرaining مجموعة من 80 مركبات للسمية الخلوية. من المستغرب، وكان معامل الارتباط (CC) بين هذا الاختبار والفحص على أساس الجدوى luciferase المراسل المذكورة أعلاه منخفضة نسبيا (CC = 0.67). في الواقع، العديد من المركبات ضعاف luciferase المراسل التعبير عن التحوير، بينما كان ATP الأيض تتأثر. من المحتمل أن تؤثر على الوظائف الخلوية مثل إشارات الخلية، النسخ الجيني أو ترجمة البروتين، والتي سوف يضعف أيضا التعبير الجيني الخلوية بعض المركبات المضادة للفيروسات واسع الطيف. رغم عدم وجود نظام الفرز مثالية للبقاء الخلوية، هو في خطر أن ترشيح مركبات سامة على أساس الخلوية التعبير الجيني من المحتمل أن تؤدي إلى استبعاد الجزيئات المضادة للفيروسات الحسنة النية.
يهدف الشاشة الثانوية في تأسيس النشاط المضادة للفيروسات من المركبات اختيارها ضد اثنين من الفيروسات الحمض النووي الريبي لا علاقة لها تماما، في حين أن تحديد بدقة IC50s بهم. ومن المثير للاهتمام، وينبغي أن يكون لاحظت أن انزيم luciferase المراسلمثبطات يمكن سجل خطأ ما ايجابيات في مقايسة rMV2/Luc لكن سيتم تصفيتها من هذا القبيل، ايجابيات كاذبة عن طريق الشاشة الثانوية عند اختباره لتثبيط CHIKV / رن. في الواقع، rMV2/Luc وCHIKV / رن تعبير عن يراعة وRenilla luciferase المراسل، على التوالي، وهذه الانزيمات اثنين لا علاقة لها وتحفيز التفاعلات الكيميائية المختلفة. والمركبات التي تمنع مراسل luciferase يراعة من rMV2/Luc في الشاشة الرئيسية لا تظهر أي نشاط ضد CHIKV / رن وسيتم التخلص منها، وبالتالي منع اختيارهم الخاطئ كما الأدوية المضادة للفيروسات. بشكل غير متوقع، كما منعت كل 13 مشاهدات الابتدائي منع تكرار MV CHIKV في هذه الشاشة الثانوية. هذا ليس الحال دائما كما تم عزل عدد قليل من مثبطات MV محددة عند فحص مكتبات أخرى (لا تظهر البيانات). وعلاوة على ذلك، ومركبات اختيارها مشاركة التشابه الهيكلي ويمكن تصنيفها في الأسر الكيميائية ثلاثة فقط (الجدول 1). المركبات الكيميائية داخل الأسرة ربما لديها نفس النمط من موارد الوراثية الحيوانية على، وبالتالي يمكن اعتبار النظير من نفس الكيان الكيميائية. هذا يضع في منظور حقيقة أن جميع المركبات اختيار 13 مستعمل كلا MV وتكرار CHIKV. ومع ذلك، يمكن لهذه النتائج تشير أيضا إلى أن أكثر تواترا ويتم تحديد الأدوية المضادة للفيروسات واسع الطيف من مثبطات الفيروس محددة. الرشيد وراء هذه الفرضية هو أنه على الرغم من خصوصيات واضحة، وكلها فيروسات الحمض النووي الريبي تعتمد على نفس الوظائف الخلوية الأساسية لتكرار مثل آلات الريباسي، الهيكل الخلوي أو الميتوكوندريا كمصدر للطاقة. هذه هي وحدات وظيفية الأنظمة الجزيئية المعقدة، والتي توفر لوحة كبيرة نسبيا من الأهداف المحتملة لمضادات الفيروسات واسعة الطيف. في المقابل، هناك فقط مجموعة محدودة من العوامل الفيروسية أو الخلوية التي تمثل أهدافا مناسبة لرفع مثبطات الفيروس محددة. في المستقبل، ينبغي لوحات جديدة من الأدوية المضادة للفيروسات التي حددها الفحص المظهري توفير البيانات اللازمة لتأكيد أو إبطال هذه الفرضية.
ق = "jove_content"> وكما، ومركبات معزولة المذكورة أعلاه كان لمحة مناسبة للمثبطات واسعة الطيف من فيروسات الحمض النووي الريبي مع عدة تظهر القيم IC50 أقل من 1 ميكرومتر في كل من MV والمقايسات تكرار CHIKV. وهذه تحتاج إلى تأكيد أكثر مع المقايسات تكاثر الفيروس التقليدية، بما في ذلك تدابير لذرية الفيروس في supernatants الثقافة. سوف النشاط المضادة للفيروسات من المركبات اختيارها أيضا لابد من تأكيد على لوحة أكبر بكثير من فيروسات الحمض النووي الريبي. في الختام، هذه المركبات تمثل نقطة انطلاق ممتازة لتطوير الأدوية الخاصة بهم، مع تظاهرة النشاط المضادة للفيروسات في النماذج الحيوانية العدوى كهدف أساسي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
نشكر الدكتور إيف ل جانين لتعليقاته واقتراحات مثمرة. نود أن نشكر سمو جاد للتشيك / رن وC. Combredet لها الدعم التقني. وأيد هذا العمل من قبل معهد باستور والمركز الوطني للبحوث العلميه (CNRS)، والمعهد الوطني للسانتيه إت دي لا بحوث MEDICALE (INSERM)، ومعهد كارنو - باستور علل Infectieuses (STING برنامج لبوف وHM- L)، والوكالة الوطنية صب لا بحوث (ANR-RPIB، STING برنامج 2.0 إلى بوف)، و "CONSEIL الجهوي كوت إيل دو فرانس" (مشروع المكتبة الكيميائية والمنح رقم 06-222 I / R وأنا 09-1739 / R إلى HM-L). وأيد العمل على CHIKV / رن من قبل ArbOAS مشروع (منحة ANR-2010-INTB 1601-1602).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freedom EVO platform | TECAN | Robotic platform | |
| 96-well polystyrene cell culture microplates, white | Greiner Bio One | 655083 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7570 | Luciferase-based viability assay |
| Bright-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2610 | Reagent containing firefly luciferase substrate |
| Renilla-Glo luciferase Assay System | Promega | E2710 | Reagent containing Renilla luciferase substrate |
| Britelite plus Reporter Gene Assay System | Perkin-Elmer | 6016761 | Reagent containing firefly luciferase substrate. Can be used as an alternative to Brigh-Glo reagent to determine luciferase activity. |
References
- De Clercq, E. Antiviral drugs in current clinical use. J Clin Virol. 30, 115-133 (2004).
- Debing, Y., Jochmans, D., Neyts, J. Intervention strategies for emerging viruses: use of antivirals. Curr Opin Virol. , (2013).
- Leyssen, P., De Clercq, E., Neyts, J. Molecular strategies to inhibit the replication of RNA viruses. Antiviral Res. 78, 9-25 (2008).
- Leyssen, P., Balzarini, J., De Clercq, E., Neyts, J. The predominant mechanism by which ribavirin exerts its antiviral activity in vitro against flaviviruses and paramyxoviruses is mediated by inhibition of IMP dehydrogenase. J Virol. 79, 1943-1947 (2005).
- Wang, B. X., Fish, E. N. The yin and yang of viruses and interferons. Trends Immunol. 33, 190-197 (2012).
- Empey, K. M., Peebles, R. S., Kolls, J. K. Pharmacologic advances in the treatment and prevention of respiratory syncytial virus. Clin Infect Dis. 50, 1258-1267 (2010).
- Tan, S. L., Ganji, G., Paeper, B., Proll, S., Katze, M. G. Systems biology and the host response to viral infection. Nat Biotechnol. 25, 1383-1389 (2007).
- Prussia, A., Thepchatri, P., Snyder, J. P., Plemper, R. K. Systematic Approaches towards the Development of Host-Directed Antiviral Therapeutics. Int J Mol Sci. 12, 4027-4052 (2011).
- Connolly, D. J., O'Neill, L. A. New developments in Toll-like receptor targeted therapeutics. Curr Opin Pharmacol. , (2012).
- Thakur, C. S., et al. Small-molecule activators of RNase L with broad-spectrum antiviral activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9585-9590 (2007).
- Shoji-Kawata, S., et al. Identification of a candidate therapeutic autophagy-inducing peptide. Nature. 494, 201-206 (2013).
- Hoffman, E. S., Smith, R. E., Renaud, R. C. From the analyst's couch: TLR-targeted therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 4, 879-880 (2005).
- Bonavia, A., et al. Identification of broad-spectrum antiviral compounds and assessment of the druggability of their target for efficacy against respiratory syncytial virus (RSV). Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 6739-6744 (2011).
- Rider, T. H., et al. Broad-spectrum antiviral therapeutics. PLoS One. 6, (2011).
- Krumm, S. A., et al. Potent host-directed small-molecule inhibitors of myxovirus RNA-dependent RNA-polymerases. PLoS One. , (2011).
- Hoffmann, H. H., Kunz, A., Simon, V. A., Palese, P., Shaw, M. L. Broad-spectrum antiviral that interferes with de novo pyrimidine biosynthesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5777-5782 (2011).
- Harvey, R., et al. GSK983: a novel compound with broad-spectrum antiviral activity. Antiviral Res. 82, 1-11 (2009).
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nat Rev Drug Discov. 10, 507-519 (2011).
- Jochmans, D., Leyssen, P., Neyts, J. A novel method for high-throughput screening to quantify antiviral activity against viruses that induce limited CPE. J Virol Methods. 183, 176-179 (2012).
- Puig-Basagoiti, F., et al. High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery. Antimicrob Agents Chemother. 49, 4980-4988 (2005).
- Panchal, R. G., et al. Development of high-content imaging assays for lethal viral pathogens. J Biomol Screen. 15, 755-765 (2010).
- Pohjala, L., et al. Inhibitors of alphavirus entry and replication identified with a stable Chikungunya replicon cell line and virus-based assays. PLoS One. 6, (2011).
- Zou, G., Xu, H. Y., Qing, M., Wang, Q. Y., Shi, P. Y. Development and characterization of a stable luciferase dengue virus for high-throughput screening. Antiviral Res. 91, 11-19 (2011).
- Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology. Chem Biol. 17, 646-657 (2010).
- Komarova, A. V., et al. Proteomic analysis of virus-host interactions in an infectious context using recombinant viruses. Mol Cell Proteomics. , (2011).
- Henrik Gad, H., et al. The E2-E166K substitution restores Chikungunya virus growth in OAS3 expressing cells by acting on viral entry. Virology. 434, 27-37 (2012).
- Wang, Q. Y., et al. Inhibition of dengue virus through suppression of host pyrimidine biosynthesis. J Virol. 85, 6548-6556 (2011).
- Smee, D. F., Hurst, B. L., Day, C. W. D282, a non-nucleoside inhibitor of influenza virus infection that interferes with de novo pyrimidine biosynthesis. Antivir Chem Chemother. 22, 263-272 (2012).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).
- Qing, M., et al. Characterization of dengue virus resistance to brequinar in cell culture. Antimicrob Agents Chemother. 54, 3686-3695 (2010).
- Munier-Lehmann, H., Vidalain, P. O., Tangy, F., Janin, Y. L. On dihydroorotate dehydrogenases and their inhibitors and uses. J Med Chem. 56, 3148-3167 (2013).
- Yoon, J. J., et al. High-throughput screening-based identification of paramyxovirus inhibitors. J Biomol Screen. 13, 591-608 (2008).
- Maréchal, E., Roy, S., Lafanechère, L. Chemogenomics and Chemical Genetics: A User's Introduction for Biologists, Chemists and Informaticians. , Springer. (2011).
- Gentzsch, J., et al. Hepatitis C virus complete life cycle screen for identification of small molecules with pro- or antiviral activity. Antiviral Res. 89, 136-148 (2011).
- Caignard, G., et al. The V protein of Tioman virus is incapable of blocking type I interferon signaling in human cells. PLoS One. 8, (2013).
