Summary
In vitro assays til at måle virus replikation er blevet kraftigt forbedret gennem udvikling af rekombinante RNA-virus, der udtrykker luciferase eller andre enzymer, der kan bioluminescens. Her har vi detalje en high-throughput screening rørledning, der kombinerer disse rekombinante stammer af mæslinger og Chikungunya virus at isolere bredspektrede antivirale fra kemiske biblioteker.
Abstract
RNA-virus er ansvarlig for større menneskelige sygdomme som influenza, bronkitis, denguefeber, Hepatitis C eller mæslinger. De repræsenterer også en ny trussel på grund af øgede verdensomspændende udvekslinger og befolkningsgrupper gennemtrængende flere og flere naturlige økosystemer. Et godt eksempel på en sådan en spirende situation Chikungunyavirus epidemier af 2005-2006 i Det Indiske Ocean. Nylige fremskridt inden for vores forståelse af cellulære mekanismer, der styrer virusreplikation tyder på, at stoffer til værten cellefunktioner, snarere end selve virus, kunne hæmme et stort panel af RNA-virus. Nogle bredspektrede antivirale forbindelser er blevet identificeret med værten målrettede analyser. Men måling af inhiberingen af viral replikation i cellekulturer ved hjælp af reduktion af cytopatiske virkninger som en udlæsning stadig et altoverskyggende screening strategi. Sådanne funktionelle skærme er blevet kraftigt forbedret gennem udviklingen af rekombinante vira, der udtrykker reporterenzymer capable af bioluminescens, såsom luciferase. I nærværende rapport, vi detalje en high-throughput screening rørledning, som kombinerer rekombinante mæslinger og Chikungunya virus med cellulær levedygtighed assays til at identificere forbindelser med en bredspektret antiviral profil.
Introduction
RNA-virus er ansvarlig for en lang række infektioner hos mennesker, og har en enorm indflydelse på befolkningerne i hele verden, både hvad angår den offentlige sundhed og økonomiske omkostninger. Effektive vacciner er blevet udviklet mod flere humane RNA-virus, og er almindeligt anvendt som profylaktiske behandlinger. Imidlertid er der stadig en kritisk mangel på terapeutiske lægemidler mod RNA-virus-infektioner. Faktisk effektive vacciner er ikke tilgængelige mod større humane patogener som dengue-virus, Hepatitis C virus eller humant respiratorisk syncytialvirus (HRSV). Udover, RNA-virus er ansvarlige for størstedelen af nye sygdomme, som er steget i hyppighed på grund af den globale børser og menneskets påvirkning af økologiske systemer. Mod denne trussel, der repræsenterer RNA-vira, vores terapeutiske arsenal er yderst begrænset og relativt ineffektive 1-3. Nuværende behandlinger er hovedsagelig baseret på rekombinant type I interferoner (IFN-α / β) for at stimulere medfødte immunitet,eller administration af ribavirin. Selvom virkningsmekanismen af denne ribonucleosid analog er kontroversiel og formentlig beror på forskellige mekanismer, hæmning af cellulær IMPDH (inosinmonofosfatdehydrogenase), der udtømmer intracellulære GTP puljer, er helt klart afgørende 4.. Ribavirin i kombination med pegyleret IFN-α, er den vigtigste behandling mod hepatitis C-virus. Men IFN-α / β og ribavirin behandlinger er af forholdsvis ringe effektivitet in vivo mod de fleste RNA-vira, som de effektivt stump IFN-α / β signalering gennem ekspression af virulensfaktorer 5 og ofte undslippe ribavirin 3. Det tilføjes, at ribavirin er at hæve vigtige spørgsmål toksicitet, selv om det for nylig blev godkendt mod alvorlig HRSV sygdom med kontroversielle fordele 6.. For nylig har nogle virus-specifikke behandlinger blevet markedsført, især mod influenzavirus med udviklingen of neuraminidasehæmmere 3. Men den store mangfoldighed og permanente fremkomst af RNA-vira til hinder for udviklingen af specifikke behandlinger mod hver af dem i en forholdsvis tæt fremtid. Tilsammen understreger dette behovet for effektive strategier til at identificere og udvikle potente antivirale molekyler i den nærmeste fremtid.
Det er trivielt at sige, at et bredt spektrum inhibitor aktive mod et stort panel af RNA-vira ville løse dette problem. Selv om et sådant molekyle er stadig en virusspecialist drøm, vores bedre forståelse af cellulære forsvarsmekanismer og medfødte immunsystem tyder på, at nogle muligheder eksisterer 7,8. Flere akademiske og industrielle laboratorier søger nu molekyler, der stimulerer bestemte facetter af cellulære forsvarsmekanismer eller metaboliske veje til at sløve viral replikation. Selv om sådanne forbindelser, der sandsynligvis vil vise betydelige bivirkninger, vil behandlinger mod akutte virusinfektioner være administrereed for en relativ kort tid, hvilket gør dem acceptable trods nogle potentielle toksicitet på lang sigt. Forskellige strategier er blevet udviklet til at identificere sådanne bredspektrede antivirale molekyler. Nogle forskningsprogrammer sigter mod at finde molekyler, der er målrettet specifikke veje forsvar eller metabolisk. Dette omfatter for eksempel patogen anerkendelse receptorer fremkalder antiviral genekspression 9 og aktiverer antivirale faktorer såsom RNaseL 10 autofagi maskiner til fremme af virus nedbrydning 11 nukleosidsyntesen pathways 12,13 eller apoptotiske kaskader at udfælde død virusinficerede celler 14.. Andre grupper har udviklet fænotypiske skærme, der ikke målrette-baserede 13,15-17. I så fald er antivirale molekyler simpelthen identificeres ved deres evne til at blokere viral replikation i et givet cellulært system. Den generelle antagelse er, at en forbindelse, hæmme 2-3 uafhængige RNA-vira ville have en passende profil til et bredt spectrum antiviralt molekyle. Virkningsmekanismen hit forbindelser udvalgt med sådan en empirisk tilgang alene bestemmes i en anden tid og i sidste ende kan føre til identifikation af nye cellulære mål for antivirale lægemidler. Interessant nok har en retrospektiv analyse af nye lægemidler, der er godkendt af den amerikanske Food and Drug Administration mellem 1999 og 2008 vist, at i almindelighed, sådan fænotypiske screeninger har tendens til at klare sig bedre end målrettede tilgange til at opdage first-in-class lille molekyle narkotika 18 .
Viral replikation i high-throughput cellebaserede assays bestemmes normalt ud fra virus cytopatiske effekter. Celler inficeret og dyrket i 96 - eller 384-brønds plader i nærværelse af testede forbindelser. Efter nogle dage, cellulære lag fikseres og farves med farvestoffer, såsom krystalviolet. Endelig er absorbans bestemmes med en plade læser og forbindelser hæmmer viral replikation identificeres ved deres evne til at bevare cellulære lag from virus-induceret cytopatisk virkning. Alternativt viralt medierede cytopatiske virkninger bedømmes under anvendelse af standard levedygtighed assays, såsom MTS reduktion. Sådanne assays er meget medgørlig og omkostningseffektiv, men lider tre store begrænsninger. Først, de kræver et virus-celle kombination hvor viral replikation er cytopatisk på kun få dage, men det er ikke altid muligt, og dermed opfordrer til alternative tilgange 19. For det andet er de dårligt kvantitativ da de er baseret på et indirekte mål for viral replikation. Endelig kan giftige forbindelser blive scoret som positive hits, og derfor skal fjernes med en tæller skærm måler cellulær levedygtighed. For at overvinde nogle af disse forhindringer har rekombinante vira eller replikoner blevet manipuleret af revers genetik til at udtrykke reporter-proteiner, såsom EGFP eller luciferase fra en yderligere transkriptionsenhed eller i ramme med virale protein-gener (få eksempler 20-23). Når disse vira kopiere, reporter PRoteins produceres sammen med virale proteiner selv. Dette giver en meget kvantitativ analyse for at måle viral replikation og evaluere den inhibitoriske aktivitet af kandidatmolekyler. Dette er især tilfældet for rekombinante vira, der udtrykker luciferase (eller andre enzymer, der kan bioluminescens), eftersom dette reportersystem udviser et bredt dynamikområde med en høj følsomhed og næsten ingen baggrund. Desuden er der ingen excitationslyskilde, hvilket forhindrer interferens med forbindelse fluorescens 24.
Her har vi detalje en high-throughput-protokollen til at screene kemiske biblioteker for bredspektrede inhibitorer af RNA-virus. Forbindelser testes først på humane celler inficeret med et rekombinant mæslingevirus (MV), der udtrykker ildflueluciferase 25 (rMV2/Luc, figur 1, den primære skærm). MV tilhører Mononegavirales orden, og er ofte betragtes som et prototypisk medlem af negativt-strenget RNA-viruses. Som sådan er MV-genomet anvendt som en template med viruspolymerasekomplekset til syntese af mRNA-molekyler, der koder for virale proteiner. I den rekombinante MV stamme kaldet rMV2/Luc er luciferaseekspression udtrykkes fra en yderligere transkriptionsenhed indsættes mellem P-og M-gener (figur 2A). Sideløbende er forbindelser testet for deres toksicitet på humane celler ved hjælp af en kommerciel luciferase-baserede reagens, der vurderer, af ATP kvantificering, antallet af metabolisk aktive celler i kultur (figur 1, den primære skærm). Hele kemiske biblioteker kan let screenes med disse to analyser for at udvælge forbindelser, der ikke er toksiske og effektivt blokerer MV replikation. Derefter hits testes igen for dosis-respons-hæmning af MV replikation, mangel på toksicitet såvel som for deres evne til at forringe Chikungunya virus (CHIKV) replikation (figur 1, sekundær skærm). CHIKV er medlem af Togaviridae familien og dens genom er APositive enkeltstrenget RNA-molekyle. Som sådan, det er helt uden forbindelse med mæslinger og forbindelser hæmmer både MV og CHIKV stå en stor chance for at hæmme et stort panel af RNA-virus. CHIKV strukturelle proteiner er direkte oversat fra det virale genom, mens de strukturelle proteiner kodes af transkription og translation af en subgenomiske mRNA-molekyle. Vores replikation in vitro assay for CHIKV er baseret på en rekombinant stamme kaldet CHIKV / Ren, der udtrykker Renilla luciferase enzym som en spaltet del af det ikke-strukturelle polyprotein ved en insertion af reportergenet mellem NSP3 og nsP4 sekvenser 26 (figur 2B). Målestokken for Renilla luciferaseaktivitet tillader overvågning af viral replikation på det tidlige stadium af CHIKV livscyklus.
Denne high-throughput protokol blev anvendt til hurtigt at identificere forbindelser med en passende profil til bredspektrede antivirale i en kommerciel bibliotek på 10.000 MolecESTEMMELSER beriget for kemisk mangfoldighed. Forbindelser blev hovedsagelig følgende Lipinski herredømme af fem, med molekylvægt, der varierer fra 250 til 600 dalton, og log D-værdier under 5. De fleste af disse molekyler var nye kemiske enheder, der ikke er tilgængelige i andre kommercielle biblioteker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af 96-brønds afledte Plader med forbindelser
- Flyt 96-brønds mor-plader indeholdende 10 mM stamopløsninger af kemiske forbindelser i DMSO fra -20 ° C til stuetemperatur. Fortyndede forbindelser 5x i DMSO til opnåelse af mellemprodukter 96-brønds fortynding plader ved 2 mM. Fortynding er opnået ved at pipettere fem pi i 20 pi DMSO og blanding.
- Afpipetteres 1 pi fra fortynding plader i tørre brønde hvidt, stregkode vævsdyrkningsplader med 96 brønde. Dette første sæt af datterceller plader (D1) vil blive anvendt til at evaluere toksiciteten af forbindelserne ved en endelig koncentration på 20 uM. Opbevar datterceller plader ved -20 ° C indtil brug.
- Fortynd forbindelser igen 1:10 pipettering 4 pi fra udvanding plader i 36 pi DMSO og blanding. Afpipetteres 1 pi i tørre brønde hvidt, flad bund, stregkode vævskultur plader med 96 brønde. Dette andet sæt af datterceller plader (D2), vil blive anvendt til at evaluere inhibering af MV replication af forbindelser ved en slutkoncentration på 2 uM. Opbevar datterceller plader ved -20 ° C indtil brug.
2.. Udarbejdelse af cellekulturer til Bestem Compound Toksicitet
- Grow HEK 293T-celler ved 37 ° C og 5% CO2 i Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) med stabiliseret L-glutamin og suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS), streptomycin (100 ug / ml) og penicillin (100 IE / ml). Cellerne passeres ved trypsinisering hver 4-5 dage og fortyndet 1:10 i en frisk kolbe. Cellerne skal være i log fase til eksperimenter.
- På dagen for eksperimentet inddrive celler ved trypsinbehandling og udføre celletælling. Pellet-celler ved centrifugering og resuspendere dem på 3 x 10 5 celler / ml i dyrkningsmedium. Overvej, at 12,5 ml cellesuspension er nødvendige for hver screening plade.
- Overfør celler til et trug, og dispensere 100 pi af cellesuspension i D1 plader indeholdende spidse kemisk kompounds. Cell suspension inden truget er jævnligt rystes for at undgå bundfældning.
- Spike kontrol brønde A1, C1, E1, G1, A12, C12, E12 og G12 med 1 pi DMSO. Tilsvarende brønde vil blive brugt som reference for levende celler (ingen toksicitet). Spike kontrolfordybninger B1, D1, F1, H1, B12, D12, F12 og H12 med 1 ml af DMSO og 2,5 pi af en 0,5% IGEPAL løsning til at dræbe celler. Tilsvarende brønde vil blive brugt som reference for døde celler (høj toksicitet).
- Cellerne inkuberes i 24 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
3.. Fremstilling af cellekulturer inficeret med rMV2/Luc
- Grow og gendanne celler som beskrevet i 2.1 og 2.2. Igen, resuspender cellerne ved 3 x 10 5 celler / ml i dyrkningsmedium. Overvej, at 12,5 ml cellesuspension er nødvendige for hver screening plade.
- Valgfrit: supplement dyrkningsmedium med uridin ved 20 pg / ml.
Bemærk: I forbindelse med screening af kemiske biblioteker for viral replication inhibitorer forekommer det, at forbindelser rettet mod tidlige trin i pyrimidinbiosyntese pathway ofte isoleres 13,16,27,28. Tilsætning af uridin til dyrkningsmedium anvendes til at foretage sådanne antivirale molekyler. Faktisk er det gendanner effektivt viral replikation, når opstrøms enzymer pyrimidin biosyntesevejen er blokeret. - Spar 01:10 af celle suspension kontrolbrønde med ikke-inficerede celler, og fortsæt til infektion med resterende volumen.
- Optø passende mængde rMV2/Luc stamopløsning. MV stamopløsninger er normalt ved 10 6 -10 8 infektiøse partikler per ml. Kulturen skal være inficeret med 0,1 infektiøse partikler af rMV2/Luc pr målceller, hvilket svarer til 0,1 multiplicitet af infektion (MOI). Bemærk: rMV2/Luc er afledt af MV-vaccine (Schwarz-stamme) og manipuleret i en BSL2 miljø.
- Tilsæt virus til cellesuspensionen og blandes forsigtigt. Overfør inficerede celler til et trug, og dosere 100pi af inficeret cellesuspension i kolonne 2 til 11 af D2-plader indeholdende spidse kemiske forbindelser. Cell suspension inden truget er jævnligt blandes forsigtigt.
- I kolonne 1 og 12, dispensere 100 pi ikke-inficerede celler en brønd på to. Inficerede celler dispenseres i andre brønde.
- Cellerne inkuberes i 24 timer ved 37 ° C og 5% CO2.
4.. Luciferaseaktivitet Foranstaltninger og Data Analysis
- Fjern D1-plader fra inkubatoren, og bestemme cellulær levedygtighed ved tilsætning af 50 pi luciferase-baserede levedygtighed reagens direkte til dyrkningsbrønde. Blandes og inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur. Læse plader med et luminometer. Integration er indstillet på 100 ms per brønd.
- Fjern D2 pladerne fra inkubatoren, og bestemme luciferaseaktivitet ved tilsætning af 50 ul luciferasesubstrat direkte til dyrkningsbrønde. Inkuber i 6 minutter ved stuetemperatur, og læse plader med et luminometer som beskrebed ovenfor.
- Beregne en Z'-faktor for hver D1 plade af toksicitet assay til at berettige kvaliteten af skærmen 29. Z '= 1-3 * (σ + + σ-) / (μ + - μ-), hvor μ + og σ + svarer til hjælp af luminescens og standardafvigelser for HEK-293T celler med DMSO alene (ingen toksicitet), og μ-og σ-er midler til luminescens og standardafvigelser for dyrkningsbrønde behandlet med IGEPAL at dræbe celler. Z 'forventes at være over 0,5, eller den tilsvarende plade kasseres.
- Indstil toksicitet tærskel μ + / 2. Kassér forbindelser med luminescens værdier under denne cut-off (figur 3A).
- Beregne en Z'-faktor for hver D2 plade af antiviral assay. Her μ + og σ + svarer til hjælp af luminescens og standardafvigelser for inficerede celler dyrket med DMSO alene, og μ-og σ-er midler til luminescens og standardafvigelser for ikke-inficerede celler. Igen, plader med Z & #39; værdier under 0,5 kasseres.
- Beregn hæmning af viral replikation som følger: Procent inhibering = (μ + - luciferaseaktivitet for forbindelse X) / (μ + - μ-) * 100. Indstil hæmning tærskel på 75%, og vælg forbindelser, der både reducerer luminescens værdier under denne cut-off (figur 3B), og der ikke er toksiske i henhold til kriterierne i 4.4.
5.. Sekundære skærm for Toksicitet og Bredspektret antiviral aktivitet
- Gør 01:02 seriefortyndinger for hvert hit forbindelse i DMSO, startende fra 500 um til 4 pM (8 fortyndinger). Fyld hvid, stregkoder vævskulturplader med 50 pi dyrkningsmedium. Tilsæt 1 pi af hver forbindelse fortynding i dyrkningsbrønde. Gentag to gange for at have 3 dyrkningsplader med dobbelte serielle fortyndinger for hvert hit forbindelse.
- Forbered 37,5 ml af en HEK-293T cellesuspension ved 6 x 10 5 celler / ml i dyrkningsmedium som beskrevet ovenfor (i punkt 2.1 og 2.2). Doser 2x 12,5 ml i Falcon-rør og inficere celler med enten rMV2/Luc ved MOI = 0,1 eller rekombinant CHIKV udtrykker Renilla luciferase (CHIKV / Ren) ved MOI = 0.2. Bland ved at vende.
Bemærk: CHIKV / Ren er afledt af en vildtype-stamme af CHIKV og derfor bør manipuleres på en BSL3 miljø. Pladerne kan flyttes fra BSL3 til BSL1 når Renilla substratet er blevet tilføjet til dyrkningsbrønde (se nedenfor). - Dispensér 50 pi-inficerede, rMV2/Luc-infected eller CHIKV / Ren-inficerede celler i kultur plader indeholdende serielle fortyndinger af hit-forbindelser. Inkuber 24 timer ved 37 ° C.
- Der tilsættes 50 ul af ildflue-luciferase-substrat for at bestemme ildflueluciferaseaktivitet i rMV2/Luc-infected brønde. Der tilsættes 50 ul af Renilla luciferasesubstrat at bestemme Renilla luciferase aktivitet i CHIKV / Ren-inficerede brønde. Endelig tilsættes 50 pi luciferase-baserede levedygtighed assayreagens til ikke-inficerede celler til at bestemme cellulær levedygtighed.
- Plot data (FiGure 4) og bestemme ramt sammensatte koncentrationer, der hæmmer MV og CHIKV replikation med 50%. Se bort sammensatte viser nogle toksicitet i denne analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne screening rørledning er først om udvælgelse af stoffer, som hæmmer MV replikation og viser ikke nogen signifikant cellulær toksicitet (figur 1, den primære skærm). Det drager fordel af luciferase-assays til at bestemme cellulær toksicitet og inhibering af viral replikation. Alle pipetteringstrin og dataopsamling kan udføres i en high-throughput indstilling med en robot platform.
Cellulær toksicitet af forbindelserne vurderes ved anvendelse af en luciferase-baserede levedygtighedsassay, der vurderer antallet af levende celler i kultur er baseret på kvantificering af ATP til stede, hvilket svarer til metabolisk aktive celler. Fordi luciferin oxidation med luciferase ATP afhængige, luminescence signal er direkte proportional med cellulær ATP fra levende celler. Figur 3A viser resultater for en repræsentant afskærmningsplade. Som forventet, meget tydelige luciferaseaktivitet værdier var målbareed i kontrolfordybninger der indeholdt enten levende celler eller døde celler dræbt med IGEPAL. Threshold er empirisk fastsat til μ + / 2 for at bortfiltrere forbindelser viser nogle cellulær toksicitet og i det foreliggende tilfælde, blev 21 forbindelser fra denne plade kasseres. Sideløbende antiviral aktivitet målt ved hjælp af rMV2/Luc en rekombinant stamme af MV udtrykker luciferase (figur 2). Humane HEK-293T celler anvendes, fordi de er meget følsomme over for MV-infektion. Som et resultat, luciferaseaktivitet i inficerede dyrkningsbrønde er meget høj (200-300 x 10 3 luciferaseaktivitet enheder i kontrolbrønde). Dette giver et stort dynamikområde, der letter valget af MV replikation inhibitorer. Figur 3B viser repræsentative resultater opnået for en afskærmningsplade. Fire forbindelser hæmmede viral replikation med mere end 75% i dette eksempel og blev udvalgt.
Endelig kan forbindelser, der ikke er giftigt og scoretpositive i den virale replikation assay vælges (figur 3A og 3B). Deres halvmaksimal hæmmende koncentration (IC50) bestemmes på både MV og CHIKV, som er to uafhængige RNA-vira (figur 1, sekundær skærm). Antiviral aktivitet af hit-forbindelser bestemmes ved hjælp af rekombinante virusstammer enten udtrykker ildflue (rMV2/Luc) eller Renilla (CHIKV / Ren) luciferase. 4A og 4B viser repræsentative inhiberingskurver for MV og CHIKV replikation, hhv. Disse kurver anvendes til at bestemme IC50 af hit-forbindelser. Sideløbende manglen på cellulær toksicitet af udvalgte forbindelser bekræftet i en dosis-respons eksperiment ved hjælp af luciferase-baserede levedygtighedsassay beskrevet ovenfor (figur 4C). Tabel 1 viser IC50-værdierne for MV og CHIKV replikation på et sæt af 13 ikke- -giftige forbindelser identificeret fra et kemisk bibliotek af 10.000 molekyler. Disse komponenterunds er hidtil ukendte, både hvad angår kemisk struktur og biologisk aktivitet. Nogle af disse molekyler delte strukturelle ligheder og kan samles i tre forskellige kemiske familier. Som reference er IC50-værdier opnået med brequinar også vist i tabel 1. Brequinar hæmmer dihydroorotatdehydrogenase, fjerde enzym pyrimidin biosyntesevejen, med en potent antiviral aktivitet in vitro 30,31. Når man ser på IC50-værdier mindre end en størrelsesorden adskilt denne reference molekyle fra mest aktive hits identificeret ved screening. Dette etablerede stærke antivirale aktivitet af udvalgte forbindelser.
Fig. 1. Resumé af screeningen rørledningen. Venstre panel viser primær skærm, hvor forbindelserne er udvalgt til den manglende toksicitet og evne til at blokere MV replikation. Højre panel viser den sekundære skærm, hvor den antivirale aktivitet af udvalgte forbindelser er bekræftet, og deres evne til at blokere CHIKV replikation bestemmes. Forbindelser, der effektivt blokerer MV og CHIKV uden nogen signifikant toksicitet betragtes som potentielle bredspektrede inhibitorer af RNA-vira. Klik her for at se større billede .
Figur 2. Genomisk organisation af rekombinante RNA-virusser, som bærer luciferasegenet. (A) rMV2/Luc: MV negativ-sense-RNA-genomet er vist med sin 3'-ende til venstre med de seks generangivet med versaler og afbildet som hvide rektangler. Den ekstra transkriptionsenheder kodning for reporter genet indsættes mellem P-og M-gener og afbildet som en gul firkant (B) CHIKV / Ren:. Den CHIKV positiv-sense RNA-genomet er vist med dets 5'-udjævnede ende til venstre, med den åbne læseramme koder for de fire ikke-strukturelle proteiner (nsP1-4). Klik her for at se større billede .
Fig. 3. Repræsentative resultater for en 96-brønds screening plade. (A) Luciferase værdier opnået med luciferase-baserede levedygtighedsassay. Kolonne 1 og 12 svarer til alternative kontroller med DMSO alene ("+", ingen toksicitet) eller IGEPAL ("-"; high toksi by). Blå farve fremhæve forbindelser, der anses for ikke giftigt i henhold til ATP-koncentrationer detekteret i dyrkningsbrønde, mens hvide brønde svarer til giftige forbindelser (luciferase værdier <12.203 x 10 3). (B) Luciferaseaktiviteter værdier opnået med rMV2/Luc-infected celler. Kolonne 1 og 12 svarer til alternative kontroller, dvs ikke-inficerede HEK-293T-celler ("-") eller rMV2/Luc-infected celler behandlet med DMSO alene ("+"). For hver testet forbindelse, er den figur, der viser både luciferase luminescenssignal og den procentvise inhibering i forhold til kontrolbrønde. Forbindelser hæmmer luminescenssignal med mere end 75% er markeret med gult eller grønt afhængigt af, om de blev betragtet som giftige eller ikke som bestemt i (A). Således er grøn farve viser hit stoffer, som hæmmer MV replikation og ikke påvirker cellulær levedygtighed.t = "_blank"> Klik her for at se større billede.
Figur 4.. Dosis-respons antiviral aktivitet og toksicitet af forbindelser C864, C648 og C062. (A) HEK 293T-celler blev inficeret med rMV2/Luc stamme af MV udtrykker luciferase (MOI = 0,1) og inkuberet med stigende doser af C864, C648, C062 eller DMSO alene. Efter 24 timer blev luciferaseekspression bestemt. * Viser at observerede luciferase hæmninger var statistisk signifikante med alle tre forbindelser (p-værdier <0,05). (B) HEK 293T-celler blev inficeret med CHIKV / Ren stamme af CHIKV udtrykker Renilla luciferase (MOI = 0,2) og inkuberet med stigende doser af C864, C648, C062 eller DMSO alene. Efter 24 timer blev Renilla luciferaseekspression bestemmes. * Angiver statistisktisk væsentlige hæmninger med alle tre forbindelser (p-værdier <0,05). (C) HEK 293T-celler blev inkuberet med stigende doser af C864, C648, C062 eller DMSO alene. Som en kontrol for toksicitet blev cellekulturer suppleret med 2,5 pi af en 0,5% IGEPAL opløsning. Efter 24 timer blev antallet af levende celler bestemmes ved hjælp af den luciferase-baserede levedygtighedsassay. Klik her for at se større billede .
| Kemisk Familie | Forbindelse | MV (IC50 uM) | CHIKV (IC50 uM) | CC50 (uM) |
| 1 | C864 | 0.6 | 0.6 | > 5 |
| 1 | C877 | 0.2 | 0.2 | > 5 |
| 1 | C957 | 1.2 | 1.2 | > 5 |
| 1 | C963 | 1.2 | 0.9 | > 5 |
| 1 | C967 | 1.7 | 1.6 | > 5 |
| 1 | C 348 | 0.25 | 0.3 | > 5 |
| 1 | C265 | 0.25 | 0.3 | > 5 |
| 1 | C270 | 0.5 | 0.5 > 5 | |
| 1 | C350 | 0.4 | 0.5 | > 5 |
| 2 | C646 | 0.16 | 0.15 | > 5 |
| 2 | C814 | 1.9 | 1.1 | > 5 |
| 2 | C648 | 0.7 | 0.4 | > 5 |
| 3 | C062 | 1 | 1.2 | > 5 |
| Brequinar | 0,04 | 0,04 | > 5 |
Tabel 1. Antiviral aktivitet og cytotoksicitet af de 13forbindelser valgt fra den oprindelige kemiske bibliotek. Resultaterne udtrykkes som IC50-værdierne for inhibering af MV eller CHIKV replikation. CC50 værdier blev fundet> 5 uM for alle stoffer i dosis-respons eksperimenter fra den sekundære skærm. Men scoring filter tærsklen for cytotoksicitet fra den primære screening tyder på, at CC50 værdier er endda> 20 uM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Screeningen pipeline her beskrevet sigter mod at udvælge forbindelser med en passende profil som bredspektrede inhibitorer af RNA-virus. Når et bibliotek på 10.000 forbindelser blev screenet med denne protokol og førnævnte filtrering kriterier blev anvendt, dvs hæmning af MV replikation overlegen til 75%, 40 forbindelser (0,4%) scorede positiv. Udover, omkring halvdelen af dem viste nogle toksicitet i luciferase-baserede levedygtighedsassay, og blev der set bort af denne grund. Endelig blev et dusin hits let tilgængelige i større mængde testes igen. Denne lille sæt let blev gentestet for både cellulær toksicitet og inhibering af viral replikation mod MV CHIKV i dosis-respons-eksperimenter (figur 4). Den antivirale aktivitet af alle valgte forbindelser blev bekræftet, og den samlede identifikation hit sats for denne screening rørledning var 1,3 ‰. Dette resultat er meget lig med resultater opnået ved andre grupper med forskellige højt gennemløbreplikation-baserede screening assays for antivirale 27,32, og falder i det forventede interval for cellebaserede fænotypiske analyser i almindelighed (1-5 ‰ 33). Men en hit rate er meget afhængig af både den sammensatte bibliotek, der screenes og scoring filter tærskler, som kan justeres afhængigt af profilen af indsamlede data. Her blev udvalgt tærskler for hæmning af MV replikation og cellulær toksicitet empirisk bestemt, og afvejningen blev sat til at opnå en medgørlig antal hits, der let kan gentestes i den sekundære skærm mod CHIKV.
I den primære screening, blev forbindelser testet for både deres evne til at blokere MV replikation og manglen på cellulær toksicitet. Antiviral aktivitet blev bestemt ved en koncentration på 2 uM på rMV2/Luc-infected celler, mens cellulær toksicitet blev bestemt ved 20 uM. Disse eksperimentelle indstillinger blev fundet værdifuldt at vælge direkte for stoffer med en høj antiviral aktivitet i forhold til celletoksicitet. Desuden blev den primære screening udføres i nærværelse af uridin. Nyere publikationer tyder på, at forbindelser rettet mod tidlige trin i pyrimidinbiosyntese vej ofte er isolerede, når de søger hæmmere af RNA-vira 13,16,27,28. Især har forskergrupper på udkig efter antivirale molekyler fundet hæmmere af dihydroorotatdehydrogenase, den fjerde enzym denne metaboliseringsvej 31. Uridin dyrkningsmedium effektivt trans-komplementer til inhibering af dette enzym og dermed genskaber viral replikation. På denne måde, er forbindelser, der forhindrer MV replikation ved inhibering af pyrimidin biosyntesevejen direkte udelukket fra de antivirale hits. Endelig blev Z'-faktor sig at være systematisk over 0,5, hvilket viser den høje styrke og kvalitet af assayet.
Samtidig blev cellulær toksicitet bestemmes ved hjælp af en high-throughput luciferase-assay, der bestemmer antallet af metabolisk aktive celler i kultur er baseret på kvantificering af ATP. I hver screening plade blev IGEPAL tilføjet i brønde for toksicitet kontrol. Denne ikke-denaturerende, ikke-ionisk detergent har den fordel at dræbe effektivt alle celletyper ikke-specifikt uden at påvirke luciferase enzymaktivitet. Z'-faktor var systematisk over 0,5 over 125 plader, hvilket viser den høje robusthed og kvalitet i analysen. En begrænsning af denne cellulær toksicitet assay er dets relativt høje pris. Som et alternativ assay til bestemmelse af cellulær levedygtighed, har nogle grupper anvendt cellelinier konstitutivt udtrykker luciferase fra en stabil transgen 34. I sådanne analyser, er giftige forbindelser forventes at falde eller endda undertrykke luciferaseekspression der berører cellulær levedygtighed. Vi har for nylig udviklet en stabil cellelinie, der udtrykker luciferase på IFN-β stimulation 35, og denne cellelinje blev anvendt til at teste en staining sæt af 80 forbindelser til celletoksicitet. Overraskende, korrelationskoefficienten (CC) mellem denne analyse og luciferase-baserede levedygtighedsassay beskrevet ovenfor var forholdsvis lav (CC = 0,67). Faktisk har adskillige forbindelser svækket luciferaseekspression fra transgen, mens ATP stofskifte var upåvirket. Nogle bredspektrede antivirale forbindelser er sandsynligvis påvirke cellulære funktioner såsom celle signalering, gentranskription eller protein oversættelse, hvilket også vil forringe cellulær genekspression. Selv om der ikke er nogen perfekt screening for cellulær levedygtighed, er det på risikoen for, at filtrering giftige forbindelser baseret på cellulær genekspression vil potentielt føre til at udelukke bona fide antivirale molekyler.
Den sekundære skærm til formål at skabe den antivirale aktivitet af udvalgte forbindelser mod to helt uafhængige RNA-vira, mens fastsættelsen netop deres IC50. Interessant, bør det bemærkes, at luciferaseenzymetinhibitorer kunne fejlagtigt scoret som positive i rMV2/Luc assay men sådanne falske positiver vil blive filtreret ud af den sekundære skærm, når testet for inhibering af CHIKV / Ren. Faktisk rMV2/Luc og CHIKV / Ren udtrykke ildflue og Renilla luciferase henholdsvis og disse to enzymer er uafhængige og katalysere forskellige kemiske reaktioner. Forbindelser, der hæmmer ildflueluciferase journalist fra rMV2/Luc i den primære skærm vil ikke vise nogen aktivitet mod CHIKV / Ren og vil blive kasseret, og dermed forhindre deres fejlagtige udvælgelse som antivirale lægemidler. Uventet alle 13 primære hits blokerer MV replikation inhiberede også CHIKV i denne sekundære screening. Dette er ikke altid tilfældet, da nogle MV-specifikke inhibitorer blev isoleret ved screening andre biblioteker (data ikke vist). Desuden udvalgte forbindelser deler strukturelle ligheder, og kan inddeles i kun tre kemiske familier (tabel 1). Forbindelser inden for en kemisk familie sandsynligvis have den samme tilstand af aktipå, og derfor kan betragtes som analoger af den samme kemiske enhed. Dette sætter perspektiv på, at alle 13 udvalgte forbindelser hæmmede både MV og CHIKV replikation. Ikke desto mindre kunne disse resultater antyder også, at bredspektrede antivirale er hyppigere identificeret end virus-specifikke inhibitorer. Den rationelle bag denne hypotese er, at trods tydelige særtræk, alle RNA-vira er afhængige af de samme grundlæggende cellulære funktioner til at gentage, såsom ribosomale maskiner cytoskelettet eller mitokondrier som en kilde til energi. Disse funktionelle moduler er komplekse molekylære systemer, som giver en relativt stor panel af potentielle mål for bredspektrede antivirale lægemidler. I modsætning hertil er der kun et begrænset sæt af virale eller cellulære faktorer, der repræsenterer passende mål at øge virus-specifikke inhibitorer. I fremtiden skal nye paneler af antivirale lægemidler identificeret ved fænotypisk screening levere de nødvendige data til at bekræfte eller afkræfte denne hypotese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Yves L. Janin for hans frugtbare kommentarer og forslag. Vi vil gerne takke HH Gad for Chik / Ren og C. Combredet for hendes teknisk support. Dette arbejde blev støttet af Institut Pasteur, Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), Institut Carnot - Pasteur Maladies Infectieuses (Program STING til POV og HM- L), Agence Nationale pour la Recherche (ANR-RPIB, Program STING 2.0 til POV), og "Conseil Régional d'Ile-de-France" (kemisk Library Project, tilskud n ° I 06-222 / R og jeg 09-1739 / R til HM-L.). Arbejdet på CHIKV / Ren blev støttet af projektet ArbOAS (ANR tilskud 2010-INTB-1601-1602).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freedom EVO platform | TECAN | Robotic platform | |
| 96-well polystyrene cell culture microplates, white | Greiner Bio One | 655083 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7570 | Luciferase-based viability assay |
| Bright-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2610 | Reagent containing firefly luciferase substrate |
| Renilla-Glo luciferase Assay System | Promega | E2710 | Reagent containing Renilla luciferase substrate |
| Britelite plus Reporter Gene Assay System | Perkin-Elmer | 6016761 | Reagent containing firefly luciferase substrate. Can be used as an alternative to Brigh-Glo reagent to determine luciferase activity. |
References
- De Clercq, E. Antiviral drugs in current clinical use. J Clin Virol. 30, 115-133 (2004).
- Debing, Y., Jochmans, D., Neyts, J. Intervention strategies for emerging viruses: use of antivirals. Curr Opin Virol. , (2013).
- Leyssen, P., De Clercq, E., Neyts, J. Molecular strategies to inhibit the replication of RNA viruses. Antiviral Res. 78, 9-25 (2008).
- Leyssen, P., Balzarini, J., De Clercq, E., Neyts, J. The predominant mechanism by which ribavirin exerts its antiviral activity in vitro against flaviviruses and paramyxoviruses is mediated by inhibition of IMP dehydrogenase. J Virol. 79, 1943-1947 (2005).
- Wang, B. X., Fish, E. N. The yin and yang of viruses and interferons. Trends Immunol. 33, 190-197 (2012).
- Empey, K. M., Peebles, R. S., Kolls, J. K. Pharmacologic advances in the treatment and prevention of respiratory syncytial virus. Clin Infect Dis. 50, 1258-1267 (2010).
- Tan, S. L., Ganji, G., Paeper, B., Proll, S., Katze, M. G. Systems biology and the host response to viral infection. Nat Biotechnol. 25, 1383-1389 (2007).
- Prussia, A., Thepchatri, P., Snyder, J. P., Plemper, R. K. Systematic Approaches towards the Development of Host-Directed Antiviral Therapeutics. Int J Mol Sci. 12, 4027-4052 (2011).
- Connolly, D. J., O'Neill, L. A. New developments in Toll-like receptor targeted therapeutics. Curr Opin Pharmacol. , (2012).
- Thakur, C. S., et al. Small-molecule activators of RNase L with broad-spectrum antiviral activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9585-9590 (2007).
- Shoji-Kawata, S., et al. Identification of a candidate therapeutic autophagy-inducing peptide. Nature. 494, 201-206 (2013).
- Hoffman, E. S., Smith, R. E., Renaud, R. C. From the analyst's couch: TLR-targeted therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 4, 879-880 (2005).
- Bonavia, A., et al. Identification of broad-spectrum antiviral compounds and assessment of the druggability of their target for efficacy against respiratory syncytial virus (RSV). Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 6739-6744 (2011).
- Rider, T. H., et al. Broad-spectrum antiviral therapeutics. PLoS One. 6, (2011).
- Krumm, S. A., et al. Potent host-directed small-molecule inhibitors of myxovirus RNA-dependent RNA-polymerases. PLoS One. , (2011).
- Hoffmann, H. H., Kunz, A., Simon, V. A., Palese, P., Shaw, M. L. Broad-spectrum antiviral that interferes with de novo pyrimidine biosynthesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5777-5782 (2011).
- Harvey, R., et al. GSK983: a novel compound with broad-spectrum antiviral activity. Antiviral Res. 82, 1-11 (2009).
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nat Rev Drug Discov. 10, 507-519 (2011).
- Jochmans, D., Leyssen, P., Neyts, J. A novel method for high-throughput screening to quantify antiviral activity against viruses that induce limited CPE. J Virol Methods. 183, 176-179 (2012).
- Puig-Basagoiti, F., et al. High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery. Antimicrob Agents Chemother. 49, 4980-4988 (2005).
- Panchal, R. G., et al. Development of high-content imaging assays for lethal viral pathogens. J Biomol Screen. 15, 755-765 (2010).
- Pohjala, L., et al. Inhibitors of alphavirus entry and replication identified with a stable Chikungunya replicon cell line and virus-based assays. PLoS One. 6, (2011).
- Zou, G., Xu, H. Y., Qing, M., Wang, Q. Y., Shi, P. Y. Development and characterization of a stable luciferase dengue virus for high-throughput screening. Antiviral Res. 91, 11-19 (2011).
- Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology. Chem Biol. 17, 646-657 (2010).
- Komarova, A. V., et al. Proteomic analysis of virus-host interactions in an infectious context using recombinant viruses. Mol Cell Proteomics. , (2011).
- Henrik Gad, H., et al. The E2-E166K substitution restores Chikungunya virus growth in OAS3 expressing cells by acting on viral entry. Virology. 434, 27-37 (2012).
- Wang, Q. Y., et al. Inhibition of dengue virus through suppression of host pyrimidine biosynthesis. J Virol. 85, 6548-6556 (2011).
- Smee, D. F., Hurst, B. L., Day, C. W. D282, a non-nucleoside inhibitor of influenza virus infection that interferes with de novo pyrimidine biosynthesis. Antivir Chem Chemother. 22, 263-272 (2012).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).
- Qing, M., et al. Characterization of dengue virus resistance to brequinar in cell culture. Antimicrob Agents Chemother. 54, 3686-3695 (2010).
- Munier-Lehmann, H., Vidalain, P. O., Tangy, F., Janin, Y. L. On dihydroorotate dehydrogenases and their inhibitors and uses. J Med Chem. 56, 3148-3167 (2013).
- Yoon, J. J., et al. High-throughput screening-based identification of paramyxovirus inhibitors. J Biomol Screen. 13, 591-608 (2008).
- Maréchal, E., Roy, S., Lafanechère, L. Chemogenomics and Chemical Genetics: A User's Introduction for Biologists, Chemists and Informaticians. , Springer. (2011).
- Gentzsch, J., et al. Hepatitis C virus complete life cycle screen for identification of small molecules with pro- or antiviral activity. Antiviral Res. 89, 136-148 (2011).
- Caignard, G., et al. The V protein of Tioman virus is incapable of blocking type I interferon signaling in human cells. PLoS One. 8, (2013).
