Summary
In vitro-analyser för att mäta virusreplikation har förbättrats avsevärt genom utveckling av rekombinanta RNA-virus som uttrycker luciferas eller andra enzymer som kan mareld. Här har vi detalj en high-throughput screening pipeline som kombinerar dessa rekombinanta stammar av mässling och chikungunya virus att isolera antivirala bredspektrum från kemiska bibliotek.
Abstract
RNA-virus är ansvariga för viktiga mänskliga sjukdomar som influensa, bronkit, denguefeber, hepatit C eller mässling. De utgör också ett växande hot på grund av ökat utbyte över hela världen och befolknings tränger mer och mer naturliga ekosystem. Ett bra exempel på en sådan framväxande situation är chikungunya virusepidemier 2005-2006 i Indiska oceanen. De senaste framstegen inom vår förståelse av cellulära vägar som styr virusreplikation tyder på att substanser som värdcellfunktioner, snarare än själva viruset, kan hämma en stor panel av RNA-virus. Vissa brett spektrum antivirala föreningar har identifierats med värd målinriktade analyser. Men att mäta hämning av virusreplikation i cellkulturer med hjälp av reduktion av cytopatiska effekter som en avläsning fortfarande utgör en avgörande screening strategi. Sådana funktionella skärmar har förbättrats avsevärt genom utveckling av rekombinanta virus som uttrycker reporter enzymer cakapabel av bioluminescens såsom luciferas. I denna rapport, vi detalj en high-throughput screening pipeline, som kombinerar rekombinanta mässling och chikungunya virus med cellulär viabilitet analyser för att identifiera föreningar med ett brett spektrum antivirala profil.
Introduction
RNA-virus är ansvariga för ett stort antal mänskliga infektioner, och har en enorm inverkan på populationer över hela världen, både i fråga om folkhälsa och ekonomisk kostnad. Effektiva vacciner har utvecklats mot flera humana RNA-virus, och i stor utsträckning används som profylaktiska behandlingar. Det finns dock fortfarande en kritisk brist på terapeutiska läkemedel mot RNA-virusinfektioner. Faktum är effektiva vacciner är inte tillgängliga mot stora humana patogener såsom dengue-virus, hepatit C-virus eller humant respiratoriskt syncytialvirus (HRSV). Dessutom, RNA-virus är ansvarig för en majoritet av nya sjukdomar, som har ökat i frekvens på grund av globala utbyten och människans påverkan på ekologiska system. Mot detta hot som representerar RNA-virus, är ytterst begränsad och relativt ineffektiv 1-3 vår terapeutiska arsenal. Nuvarande behandlingar är i huvudsak baserade på rekombinant typ I interferoner (IFN-α / β) för att stimulera medfödd immunitet,eller administrering av ribavirin. Även om verkningsmekanismen för denna ribonukleosid analog är kontroversiell och förmodligen förlitar sig på olika mekanismer, är helt klart avgörande 4 hämning av cellulär IMPDH (inosinmonofosfatdehydrogenas), vilket tär intracellulära GTP pooler. Ribavirin i kombination med pegylerat IFN-α, är den viktigaste behandlingen mot hepatit C-virus. Men IFN-α / β och ribavirin behandlingar är av relativt dålig effekt in vivo mot de flesta RNA-virus som de effektivt trubbigt IFN-α / β signalering genom uttryck av virulens faktorer 5 och ofta fly ribavirin 3. Detta läggs till det faktum att ribavirin höjer viktiga frågor toxicitet, även om det var nyligen godkändes mot svår HRSV sjukdom med kontroversiella fördelar 6. På senare tid har vissa virusspecifika behandlingar marknadsförts, särskilt mot influensavirus med utveckling of neuraminidashämmare 3. Men den stora mångfalden och permanent uppkomsten av RNA-virus utgör hinder för utvecklingen av specifika behandlingar mot var och en av dem i en relativt nära framtid. Sammantaget understryker detta behovet av effektiva strategier för att identifiera och utveckla potenta antivirala molekyler inom en snar framtid.
Det är trivialt att säga att ett brett spektrum hämmare aktiva mot en stor panel av RNA-virus skulle lösa detta problem. Även om en sådan molekyl är fortfarande en virolog dröm, vår bättre förståelse av cellulära försvarsmekanismer och medfödda immunsystemet tyder på att vissa möjligheter finns 7,8. Flera akademiska och industriella laboratorier söker nu molekyler som stimulerar specifika aspekter av cellulära försvarsmekanismer eller metaboliska vägar att avtrubba virusreplikation. Även om sådana föreningar kommer förmodligen visa betydande biverkningar, kommer behandlingar mot akuta virusinfektioner vara administreraed under en relativt kort tid, vilket gör dem acceptabla trots vissa potentiella toxicitet på lång sikt. Olika strategier har utvecklats för att identifiera sådana bredspektrum antivirala molekyler. Vissa forskningsprogram syftar till att hitta molekyler som är riktade till särskilda försvars-eller metaboliska vägar. Detta inkluderar till exempel, patogen erkännande receptorer att framkalla antiviral genuttryck 9 och aktivera antivirala faktorer såsom RNaseL 10, autophagy maskiner för att främja virus nedbrytning 11, spridningsvägar nukleosid syntes 12,13, eller apoptotiska kaskader att fälla döden av virusinfekterade celler 14. Andra grupper har utvecklat fenotypiska skärmar som inte rikta-baserade 13,15-17. I så fall är antivirala molekyler helt enkelt identifieras genom sin förmåga att blockera virusreplikation i ett givet cellsystem. Det generella antagandet är att en förening hämmande 2-3 orelaterade RNA-virus skulle ha en lämplig profil för en bred-spectrum antivirala molekylen. Verkningsmekanismen för drabbade föreningar som valts med en sådan empirisk metod bara bestäms i en andra gång och så småningom kan leda till identifiering av nya cellulära mål för antivirala läkemedel. Intressant nog har en retrospektiv analys av nya läkemedel som godkänts av US Food and Drug Administration mellan 1999 och 2008 visade att i allmänhet, sådana fenotypiska filmvisningar tenderar att prestera bättre än mål-baserade metoder för att upptäcka först i klassen småmolekylära läkemedel 18 .
Viral replikation i hög genomströmning cellbaserade analyser bestäms vanligen från virus cytopatiska effekter. Celler infekteras och odlas i 96 - eller 384-brunnars plattor i närvaro av testade föreningar. Efter några dagar, är cellskikt fixeras och färgas med färgämnen såsom kristallviolett. Slutligen är absorbansen bestäms med en plattläsare och föreningar som hämmar virusreplikation identifieras genom sin förmåga att bevara cellskikt tillbakam virusinducerad cytopatisk effekt. Alternativt är viralt medierade cytopatiska effekter bedöms med hjälp av vanliga lönsamhetsanalyser såsom MTS reduktion. Sådana analyser är mycket lätthanterlig och kostnadseffektiv, men lider av tre stora begränsningar. Först kräver de ett virus-cell kombination där virusreplikation är cytopatisk på bara några dagar, men det är inte alltid möjligt, vilket kräver alternativa metoder 19. För det andra, de är dåligt kvantitativa eftersom de bygger på ett indirekt mått på virusreplikation. Slutligen kan giftiga föreningar görs som positiva hits, och därför måste elimineras med en räknare skärm som mäter cellulär livsduglighet. För att övervinna några av dessa hinder har rekombinanta virus eller replikoner konstruerats genom omvänd genetik för att uttrycka reporter proteiner såsom EGFP eller luciferas, från ytterligare en transkriptionsenhet eller i ram med virala proteingener (några exempel är 20 till 23). När dessa virus replikera, reporter proteins produceras tillsammans med virala proteiner själva. Detta ger en mycket kvantitativ analys för att mäta virusreplikation och utvärdera den hämmande aktiviteten av kandidatmolekyler. Detta gäller särskilt för rekombinanta virus som uttrycker luciferas (eller andra enzymer som kan mareld) eftersom denna reporter systemet uppvisar ett brett dynamiskt omfång med en hög känslighet och nästan ingen bakgrund. Vidare finns det inget excitationsljuskälla, vilket förhindrar interferens med förening fluorescens 24.
Här, för att vi i detalj en hög genomströmning protokoll screena kemiska bibliotek för bredspektrum hämmare av RNA-virus. Föreningar testas först på humana celler infekterade med ett rekombinant mässlingsvirus (MV) som uttrycker eldflugeluciferas 25 (rMV2/Luc, figur 1, primär skärmen). MV tillhör Mononegavirales ordning, och anses ofta som en prototypisk medlem av negativ-RNA-viruses. Som sådan, är MV genomet används som mall vid den virala polymeraset att syntetisera mRNA-molekyler som kodar för virusproteiner. I den rekombinanta MV-stammen kallas rMV2/Luc är luciferasuttryck uttryckt från en ytterligare transkriptionsenhet införd mellan P-och M-gener (Figur 2A). Parallellt finns föreningar testas för sin toxicitet på humana celler med hjälp av ett kommersiellt luciferas-reagens som utvärderar, genom ATP-kvantifiering, antalet metaboliskt aktiva celler i kultur (Figur 1, primär skärm). Hela kemiska bibliotek kan enkelt screenas med dessa två analyser för att välja föreningar som inte är giftiga och effektivt blockerar MV replikering. Därefter träffar testas för dos-respons inhibering av MV replikering, bristen på toxicitet samt för deras förmåga att försämra chikungunya virus (CHIKV) replikering (Figur 1, sekundär skärm). CHIKV är medlem i Togaviridae familjen och dess genom är apositive enkelsträngad RNA-molekyl. Som sådan är den helt utan samband med mässling och föreningar som hämmar både MV och CHIKV står en stor chans att förhindra en stor panel av RNA-virus. CHIKV icke-strukturella proteinerna är direkt översatt från det virala genomet, medan strukturproteinerna kodas av transkription och translation av en subgenomiska mRNA-molekyl. Våra in vitro-replikation assay för CHIKV är baserat på en rekombinant stam kallas CHIKV / Ren, som uttrycker Renilla-luciferas-enzymet som en klyvd del av den icke-strukturella polyproteinet genom en insättning av reportergenen mellan nsP3 och nsP4 sekvenser 26 (Figur 2B). Måttet på Renilla luciferasaktivitet medger övervakning av viral replikation i ett tidigt skede av CHIKV livscykel.
Denna hög genomströmning protokoll användes för att snabbt identifiera föreningar med en lämplig profil för antivirals bredspektrum i en kommersiell bibliotek av 10.000 molecmoduler anrikad på kemisk mångfald. Föreningar i huvudsak följande Lipinski styre av fem, med molekylvikter från 250 till 600 dalton, och log D-värden under 5. Flesta av dessa molekyler var nya kemiska enheter som inte finns i andra kommersiella bibliotek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av 96 brunnar Dotter Plattor med föreningar
- Flytta 96-brunnars moderplattor innehållande 10 mM stamlösningar av kemiska föreningar i DMSO från -20 ° C till rumstemperatur. Späd föreningar 5x i DMSO för att erhålla mellan 96 brunnar utspädningsplattor på 2 mM. Utspädning sker genom att pipettera 5 | il i 20 ^ il DMSO och blandas.
- Pipettera 1 pl från utspädningsplattorna till torra brunnar av vitt, streckkodade för vävnadsodling med 96 brunnar. Denna första uppsättning av dotterplattor (D1) kommer att användas för att utvärdera toxiciteten av föreningarna vid en slutlig koncentration av 20 pM. Store dotter plattorna vid -20 ° C fram till användning.
- Späd föreningar igen 1:10 genom att pipettera 4 pl från utspädningsplattor i 36 l av DMSO och blandning. Pipettera 1 l till torra brunnar av vit, platt botten, bar-kodade vävnadskultur 96-brunnar plattor. Denna andra uppsättning av dotterplattor (D2) kommer att användas för att utvärdera inhiberingen av MV replication av föreningarna vid en slutlig koncentration av 2 | iM. Store dotter plattorna vid -20 ° C fram till användning.
2. Beredning av cellkulturer att bestämma Förening toxicitet
- Grow HEK-293T-celler vid 37 ° C och 5% CO2 i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) med stabiliserad L-glutamin och kompletterat med 10% fetalt kalvserum (FCS), streptomycin (100 | ig / ml) och penicillin (100 lU / ml). Celler passerades genom trypsinering var 4-5 dagar, och späddes 1:10 in i en ny kolv. Celler bör vara i log fas för experiment.
- På dagen för experimentet, återställa celler genom trypsinering och utför cellräkning. Pelletera celler genom centrifugering och återsuspendera dem i 3 x 10 5 celler / ml i odlingsmedium. Tänk på att 12,5 ml cellsuspension krävs för varje skärmplåt.
- Överför celler till ett tråg, och dosera 100 l cellsuspension i D1 plattor som innehåller spetsiga kemiska sammanFONDERNA. Cellsuspension inuti tråget regelbundet skakas för att undvika sedimentering.
- Spike kontroll brunnar A1, C1, E1, G1, A12, C12, E12 och G12 med 1 pl DMSO. Motsvarande brunnar kommer att användas som referens för levande celler (ingen toxicitet). Spike kontrollbrunnar B1, D1, F1, H1, B12, D12, F12 och H12 med 1 l av DMSO och 2,5 l av en 0,5% IGEPAL lösning för att döda celler. Motsvarande brunnar kommer att användas som en referens för döda celler (hög toxicitet).
- Inkubera cellerna under 24 h vid 37 ° C och 5% CO2.
3. Beredning av cellkulturer infekterade av rMV2/Luc
- Väx och återvinna celler som beskrivs i 2.1 och 2.2. Återigen, återsuspendera cellerna vid 3 x 10 5 celler / ml i odlingsmedium. Tänk på att 12,5 ml cellsuspension krävs för varje skärmplåt.
- Valfritt: komplettera odlingsmediet med uridin vid 20 pg / ml.
Obs: När screening kemiska bibliotek för viral replication hämmare, verkar det som om substanser som tidiga stegen av pyrimidinbiosyntes vägen ofta är isolerade 13,16,27,28. Tillsatsen av uridin till odlingsmedium används för att filtrera bort sådana antivirala molekyler. I själva verket återställer detta effektivt virusreplikation vid uppströms enzymer av pyrimidinbiosyntes vägen blockeras. - Spara 01:10 av cellsuspension för kontrollbrunnar med icke-infekterade celler, och fortsätt till infektion med återstående volymen.
- Tina lämplig volym rMV2/Luc stamlösning. MS-stamlösningar är vanligtvis på 10 6 -10 8 infektiösa partiklar per ml. Kultur måste vara smittad med 0.1 infektiösa partiklar av rMV2/Luc per målceller, vilket motsvarar 0,1 mångfald av infektion (MOI). OBS: rMV2/Luc kommer från MV-vaccin (Schwarz stam) och manipuleras i ett BSL2 miljö.
- Lägg viruset till cellsuspensionen och blanda försiktigt. Överför infekterade celler till ett tråg, och dosera 100il infekterad cellsuspension i kolumnerna 2 till 11 i D2 plattor som innehåller spetsade kemiska föreningar. Cellsuspension inuti tråget regelbundet blandas försiktigt.
- I kolumnerna 1 och 12, dispensera 100 l av icke-infekterade celler en väl på två. Infekterade celler fördelas i de andra brunnarna.
- Inkubera cellerna under 24 h vid 37 ° C och 5% CO2.
4. Luciferasaktivitet Åtgärder och dataanalys
- Ta D1 plattor från inkubatorn, och bestämma cellulär livsduglighet genom att tillsätta 50 pl luciferas-baserade lönsamheten reagens direkt till odlingsbrunnar. Blanda och inkubera under 10 min vid rumstemperatur. Avläs plattorna med en luminometer. Integrationstiden är satt till 100 msek per brunn.
- Ta D2-plattor från inkubatorn, och bestämma luciferasaktivitet genom att tillsätta 50 pl luciferas substrat direkt till odlingsbrunnar. Inkubera under 6 minuter vid rumstemperatur, och läs-plattor med en luminometer som descrisäng ovan.
- Beräkna en Z'-faktor för varje D1 platta av assay toxiciteten för att motivera att kvaliteten på skärmen 29. Z '= 1-3 * (σ + + σ-) / (μ + - μ-), där μ + och σ + motsvarar hjälp av luminiscens och standardavvikelser för HEK-293T celler med enbart DMSO (ingen toxicitet), och μ-och σ-är medel för luminiscens och standardavvikelser för odlingsbrunnar som behandlats med IGEPAL att döda celler. Z 'är förväntas vara högre än 0,5, eller den motsvarande plattan kastas.
- Ställ in tröskeltoxicitet vid μ + / 2. Släng föreningar med luminiscens värden under denna cut-off (Figur 3A).
- Beräkna en Z'-faktor för varje D2 platta av det antivirala analysen. Här, μ + och σ + motsvarar hjälp av luminiscens och standardavvikelser för infekterade celler odlade med enbart DMSO, och μ-och σ-är medel för luminiscens och standardavvikelser för icke-infekterade celler. Återigen, plattor med Z & #39; värden under 0,5 kasseras.
- Beräkna den inhibering av viral replikation som följer: procent inhibering = (μ + - luciferasaktiviteten för förening X) / (μ + - μ-) * 100. Ställ in tröskel hämning vid 75%, och väljer föreningar som både reducerar luminiscens värden under denna cut-off (Figur 3B) och inte är giftiga enligt kriterierna i 4.4.
5. Sekundär skärm för toxicitet och brett spektrum Antiviral aktivitet
- Gör 01:02 seriespäd för varje träff förening i DMSO, från 500 ^ M till 4 ^ M (8 spädningar). Fyll vit, streckkodade vävnadsodlingsplattor med 50 | il av odlingsmediet. Lägg till en fil av varje förening utspädning i odlingsbrunnar. Upprepa två gånger för att ha 3 odlingsplattor med dubbla seriespädningar för varje träff förening.
- Förbered 37,5 ml av en HEK-293T cellsuspension på 6 x 10 5 celler / ml i odlingsmedium som beskrivs ovan (2.1 och 20,2). Fördela 2x 12,5 ml i Falcon rör och infektera celler med antingen rMV2/Luc vid MOI = 0,1 eller rekombinant CHIKV uttrycker Renilla luciferas (CHIKV / Ren) vid MOI = 0,2. Blanda genom att vända.
OBS: CHIKV / Ren härstammar från en vild typ stam av CHIKV och därför bör hanteras i ett BSL3 miljö. Plattorna kan flyttas från BSL3 till BSL1 gång Renilla substrat har lagts till odlingsbrunnar (se nedan). - Fördela 50 l av oinfekterade, rMV2/Luc-infected eller CHIKV / Ren-infekterade celler i odlingsplattor innehållande seriespädningar av träffföreningar. Inkubera 24 timmar vid 37 ° C.
- Addera 50 pl av eldflugeluciferas substrat för att bestämma firefly luciferasaktiviteten i rMV2/Luc-infected brunnar. Lägg 50 pl Renilla luciferas substrat för att bestämma Renilla luciferas aktivitet i CHIKV / Ren-infekterade brunnar. Slutligen, tillsätt 50 | il luciferas-baserad viabilitet analysreagens till icke-infekterade celler för att bestämma cellulär viabilitet.
- Handling data (Figur 4) och bestämma drabbats föreningskoncentrationer som hämmar MV och CHIKV replikation med 50%. Bortse förening visande viss toxicitet i denna analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denna screening rörledning är man först på valet av föreningar som hämmar MV replikering och inte visar någon signifikant cellulär toxicitet (Figur 1, primär skärm). Det drar nytta av luciferas-baserade analyser för att bestämma cellulär toxicitet och hämning av virusreplikation. Alla pipetteringssteg och dataöverföring kan utföras i en hög genomströmning inställning med en robotplattform.
Cellulär toxicitet av föreningarna utvärderas med användning av en luciferas-baserad viabilitetsanalys som utvärderar antalet levande celler i odling baserat på kvantifiering av ATP närvarande, vilket motsvarar metaboliskt aktiva celler. Eftersom luciferin oxidation av luciferas är ATP-beroende, är luminiscens signalen direkt proportionell mot cellulär ATP från levande celler. Figur 3A visar resultat för en representativ skärmplåt. Som förväntat, mycket distinkta luciferasaktivitet värdena var mäted i kontrollbrunnar som innehöll antingen levande celler eller döda celler dödas med IGEPAL. Tröskeln är empiriskt satt till μ + / 2 för att filtrera bort föreningar visar några cellulär toxicitet och i det aktuella fallet var 21 föreningar från denna platta kasseras. Parallellt har antiviral aktivitet mäts med rMV2/Luc, en rekombinant stam av MV som uttrycker luciferas (Figur 2). Mänskliga HEK-293T-celler används eftersom de är mycket känsliga för MV-infektion. Som ett resultat är luciferasaktivitet i infekterade odlingsbrunnar mycket hög (200-300 x 10 3 luciferasaktivitet enheterna i kontrollbrunnarna). Detta tillhandahåller ett stort dynamiskt omfång som underlättar valet av MV replikerings inhibitorer. Figur 3B visar representativa resultat som erhållits för en skärmplåt. Fyra föreningar hämmade virusreplikation med mer än 75% i detta exempel och valdes ut.
Slutligen, föreningar som inte är giftig och gjordepositiva i den virala replikationsanalysen väljs (Figur 3A och 3B). Deras halv maximal hämmande koncentration (IC50) bestäms på både MV och CHIKV, som är två obesläktade RNA-virus (Figur 1, sekundär skärm). Antiviral aktivitet av träff föreningarna bestämmes med användning av rekombinant-virusstammar som uttrycker antingen eldfluga (rMV2/Luc) eller Renilla (CHIKV / Ren) luciferas. Figur 4A och 4B visar representativa hämningskurvor för MV och CHIKV replikering, respektive. Dessa kurvor används för att bestämma IC50 för träff föreningar. Samtidigt är bristen på cellulär toxicitet av utvalda föreningar bekräftas i en dos-responsexperiment med hjälp av luciferas-baserade lönsamheten analys som beskrivs ovan (Figur 4C). Tabell 1 visar IC50-värden för MV och CHIKV replikering på en uppsättning av 13 icke -toxiska föreningar som identifierats från ett kemiskt bibliotek med 10.000 molekyler. Dessa komponenterFONDERNA är nya både vad gäller kemisk struktur och biologisk aktivitet. Några av dessa molekyler delade strukturella likheter, och kan samlas in i tre distinkta kemiska familjer. Som referens är IC50-värden erhållna med brequinar också i Tabell 1. Brequinar är en hämmare av dihydrooratdehydrogenas, den fjärde enzym av pyrimidin-biosyntes-vägen, med en potent antiviral aktivitet in vitro 30,31. När man tittar på IC50-värden, mindre än en storleksordning separerade denna referensmolekyl från mest aktiva hits som identifierats genom screening. Detta etablerade starka antivirala aktiviteten av utvalda föreningar.
Figur 1. Sammanfattning av screening pipeline. Vänster panel visar att primary skärm där föreningarna är valda för avsaknaden av toxicitet och förmåga att blockera MV replikering. Höger panel visar den sekundära skärm där den antivirala aktiviteten hos utvalda föreningar har bekräftats, och deras förmåga att blockera CHIKV replika bestäms. Föreningar som effektivt blockerar MV och CHIKV utan någon signifikant toxicitet betraktas som potentiella bredspektrum hämmare av RNA-virus. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 2. Genomisk organisation av rekombinanta RNA-virus som bär luciferasgenen. (A) rMV2/Luc: MV negativ-sense-RNA-genomet visas med sin 3'-ände till vänster, med de sex genernaanges med versaler och avbildas som vita rektanglar. Den ytterligare transkriptionsenheter som kodar för reportergenen infogas mellan P och M-gener och avbildas som en gul rektangel (B) CHIKV / Ren:. Den CHIKV positiva sens-RNA genomet visas med dess 5'-begränsade änden till vänster, med den öppna läsram som kodar för de fyra icke-strukturella proteiner (nsP1-4). Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3. Representativa resultat för en 96-väl screening platta. (A) Luciferas-värden som erhålls med luciferas-baserad viabilitetsanalys. Kolumnerna 1 och 12 motsvara alternativa kontroller med enbart DMSO ("+", ingen toxicitet) eller IGEPAL ("-"; hög toxi stad). Blå färg är att lyfta fram ämnen som anses inte giftig enligt ATP-halter detekteras i odlingsbrunnar, medan vita brunnar motsvarar giftiga föreningar (luciferas värden <12.203 x 10 3). (B) luciferas värden som erhållits med rMV2/Luc-infected celler. Kolumnerna 1 och 12 motsvara alternativa kontroller, dvs icke-infekterade HEK-293T-celler ("-") eller rMV2/Luc-infected celler behandlade med enbart DMSO ("+"). För varje testad förening, är det tal som visar både luciferas-luminescens-signalen och den procentuella hämningen i förhållande till kontrollbrunnar. Föreningar som hämmar luminiscens signal med mer än 75% är markerade i gult eller grönt beroende på om de ansågs vara giftig eller inte enligt bestämning i (A). Således är grön färg visar träff substanser som hämmar MV replikering och inte påverkar cellulära livskraft.t = "_blank"> Klicka här för att visa en större bild.
Figur 4. Dos-respons antiviral aktivitet och toxicitet av föreningar C864, C648 och C062. (A) HEK-293T celler infekterade med rMV2/Luc stam av MV som uttrycker luciferas (MOI = 0,1), och inkuberades med ökande doser av C864, C648, C062 eller DMSO ensam. Efter 24 timmar fick luciferasuttryck bestämdes. * Indikerar att observerade luciferas hämningar var statistiskt signifikanta med alla tre föreningarna (p-värden <0,05). (B) HEK-293T-celler infekterades med CHIKV / Ren stam av CHIKV uttrycker Renilla-luciferas (MOI = 0,2), och inkuberades med ökande doser av C864, C648, C062 eller enbart DMSO. Efter 24 timmar fick Renilla luciferasuttryck bestämd. * Anger statisttiskt signifikanta hämningar med samtliga tre föreningar (p-värden <0,05). (C) HEK-293T-celler inkuberades med ökande doser av C864, C648, C062 eller DMSO enbart. Som en kontroll för toxicitet, var cellkulturer kompletterat med 2,5 l av en 0,5% IGEPAL lösning. Efter 24 timmar, var antalet levande celler bestäms med hjälp av luciferas-baserad viabilitetsanalys. Klicka här för att visa en större bild .
| Kemisk familj | Förening | MV (IC50 ^ M) | CHIKV (IC50 ^ M) | CC50 (^ M) |
| 1 | C864 | 0,6 | 0,6 | > 5 |
| 1 | C877 | 0,2 | 0,2 | > 5 |
| 1 | C957 | 1,2 | 1,2 | > 5 |
| 1 | C963 | 1,2 | 0,9 | > 5 |
| 1 | C967 | 1,7 | 1,6 | > 5 |
| 1 | C348 | 0,25 | 0,3 | > 5 |
| 1 | C265 | 0,25 | 0,3 | > 5 |
| 1 | C270 | 0,5 | 0,5 > 5 | |
| 1 | C350 | 0,4 | 0,5 | > 5 |
| 2 | C646 | 0,16 | 0,15 | > 5 |
| 2 | C814 | 1,9 | 1,1 | > 5 |
| 2 | C648 | 0,7 | 0,4 | > 5 |
| 3 | C062 | 1 | 1,2 | > 5 |
| Brequinar | 0,04 | 0,04 | > 5 |
Tabell 1. Antiviral aktivitet och cytotoxicitet av den 13föreningar valda från den ursprungliga kemiska bibliotek. Resultaten uttryckes som IC50-värden för inhibering av MV eller CHIKV replikering. CC50 värdena befanns> 5 ^ M för alla föreningar i dos-responsförsök från den sekundära skärmen. Men poängfiltertröskeln för cytotoxicitet från den primära skärmen tyder på att CC50 värden är även> 20 pM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Screeningen rörledning som beskrivs här syftar till att välja föreningar med en lämplig profil som bredspektrum hämmare av RNA-virus. När ett bibliotek av 10.000 föreningar screenades med detta protokoll och nämnda filterkriterier tillämpades, såsom hämning av MV replikering överlägsen 75%, 40 föreningar (0,4%) gjorde positivt. Dessutom, ungefär hälften av dem visade någon toxicitet i luciferas-baserad viabilitetsanalys, och beaktades inte av detta skäl. Slutligen har ett dussin träffar lätt tillgängliga i större mängd testas. Denna lilla uppsättning kunde enkelt testas på nytt för både cellulär toxicitet och hämning av virusreplikation mot MV och CHIKV i dos-respons-experiment (figur 4). Den antivirala aktiviteten av alla utvalda föreningar bekräftades, och den totala identifieringen träff för denna screening pipeline var 1,3 ‰. Denna poäng är mycket lik resultaten erhållna av andra grupper med olika hög genomströmningreplikationsbaserad screeninganalyser för antivirala läkemedel 27,32, och faller inom det förväntade intervallet för cellbaserade fenotypiska analyser i allmänhet (1-5 ‰ 33). Det är dock mycket beroende av både föreningsbiblioteket som silas och trösklarna scoring filter en träffsäkerhet, som kan justeras beroende på den profil av insamlade data. Här, utvalda tröskelvärden för hämning av MV-replikation och cellulär toxicitet empiriskt bestämd, och avvägning var inställd på att få en lätthanterlig antal träffar som lätt kan Förnyad analys i den sekundära skärmen mot CHIKV.
I den primära skärmen, var föreningarna testades för såväl deras förmåga att blockera MV replikation och avsaknad av cellulär toxicitet. Antiviral aktivitet bestämdes vid en koncentration av 2 | iM på rMV2/Luc-infected celler medan cellulär toxicitet bestämdes vid 20 pM. Dessa experimentella inställningar befanns värdefullt att direkt välja för föreningar med en hög antiviral aktivitet i förhållande till cellulär toxicitet. Dessutom var den primära skärmen utföras i närvaro av uridin. Faktum senaste publikationer tyder på att substanser som tidiga stegen av pyrimidinbiosyntes vägen ofta är isolerade när de letar efter hämmare av RNA-virus 13,16,27,28. I synnerhet har forskargrupper söker antivirala molekyler hittade hämmare av dihydrooratdehydrogenas, den fjärde enzym av denna metaboliska väg 31. Uridin i odlingsmedium på ett effektivt trans-komplementen för hämning av detta enzym, och sålunda återställer viral replikation. På detta sätt är föreningar som förhindrar MV replikering genom hämning av pyrimidin-biosyntes-vägen direkt uteslutas från de antivirala träffar. Slutligen tillsattes Z'-faktor befanns vara systematiskt över 0,5, vilket visar hög robusthet och kvalitet av analysen.
Parallellt blev cellulär toxicitet bestämdes med användning av en hög-throughput luciferas-baserad analys som bestämmer antalet metaboliskt aktiva celler i kultur baserad på kvantifiering av ATP. I varje skärmplåt, till IGEPAL sätts i kontrollbrunnar för toxicitet. Denna icke-denaturerande, icke-jonisk detergent har fördelen av att döda effektivt alla celltyper icke-specifikt utan att påverka luciferas enzymaktivitet. Z'-faktor var systematiskt över 0,5 över 125 plattor, vilket visar den höga robusthet och kvalitet av analysen. En begränsning hos denna assay cellulär toxicitet är dess relativt höga kostnad. Som ett alternativ analys för att bestämma cell livskraft, har vissa grupper använt cellinjer konstitutivt uttrycker luciferas från en stabil transgen 34. I sådana analyser är giftiga föreningar väntas minska eller till och med undertrycka luciferasuttryck när påverkar cellulära livskraft. Vi utvecklade nyligen en stabil cellinje som uttrycker luciferas vid IFN-β-stimulering 35 och denna cellinje användes för att testa en training uppsättning av 80 föreningar för cellulär toxicitet. Överraskande, korrelationskoefficienten (CC) mellan denna analys och luciferas-baserad viabilitetsanalys beskrivits ovan var relativt låg (CC = 0,67). I själva verket flera föreningar nedsatt luciferasuttryck från transgenen, medan ATP-metabolism var opåverkad. Vissa brett spektrum antivirala föreningar kommer sannolikt att påverka cellulära funktioner såsom cellsignalering, gentranskription eller protein översättning, vilket också försämrar cellens genuttryck. Även om det inte finns någon perfekt screening system för cellulär viabilitet, är det riskerar att filtrera giftiga föreningar baserade på cellens genuttryck potentiellt leder till utesluta seriösa antivirala molekyler.
Den sekundära skärmen syftar till att fastställa den antivirala aktiviteten hos utvalda föreningar mot två helt orelaterade RNA-virus, samtidigt bestämma exakt deras IC50. Intressant, bör det noteras att luciferas-enzymetinhibitorer skulle kunna felaktigt bedömdes som positiva i rMV2/Luc analysen men sådana falskt positiva kommer att filtreras ut genom den sekundära skärm när den testades för inhibition av CHIKV / Ren. Faktum rMV2/Luc och CHIKV / Ren uttrycka eldfluga och Renilla luciferas, respektive, och dessa två enzymer är orelaterade och katalysera olika kemiska reaktioner. Föreningar som hämmar eldfluga luciferas reporter från rMV2/Luc i den primära skärmen inte visar någon aktivitet mot CHIKV / Ren och ska kasseras, vilket förhindrar deras felaktiga val som antivirala medel. Oväntat, alla 13 primära hits blockerar MV replikering hämmade också CHIKV i denna sekundära skärm. Detta är inte alltid fallet så få MV-specifika hämmare isolerades vid screening andra bibliotek (data visas ej). Dessutom utvalda föreningar dela strukturella likheter och kan grupperas i endast tre kemiska familjer (tabell 1). Föreningar inom en kemisk familj har troligen samma läge av aktividare, och därför kan anses vara analoger av samma kemiska enhet. Detta sätter i perspektiv av att alla 13 utvalda föreningar hämmade både MV och CHIKV replikering. Likväl kan dessa resultat också tyder på att antivirala läkemedel bredspektrum oftare identifieras än virus-specifika hämmare. Det rationella bakom denna hypotes är att, trots uppenbara särdrag, alla RNA-virus är beroende av samma grundläggande cellulära funktioner för att replikera, såsom ribosomal maskiner, cytoskelettet eller mitokondrier som en energikälla. Dessa funktionella moduler är komplexa molekylära system, som ger en relativt stor panel av potentiella mål för antivirala läkemedel bredspektrum. Däremot finns det bara ett begränsat antal virala eller cellulära faktorer som utgör lämpliga mål att höja virusspecifika inhibitorer. I framtiden bör nya paneler av antivirala läkemedel som identifieras av fenotypisk screening lämna nödvändiga uppgifter för att bekräfta eller vederlägga denna hypotes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Dr Yves L. Janin för hans givande kommentarer och förslag. Vi vill tacka HH Gad för CHIK / Ren och C. Combredet för sin tekniska support. Detta arbete stöddes av Institut Pasteur, Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), Institut Carnot - Pasteur Maladies Infectieuses (Programme STING till POV-och HM- L), Agence Nationale pour la Recherche (ANR-RPIB, Program STING 2,0 till POV), och "Conseil Regional d'Ile-de-France" (Chemical Library Project, stipendier n ° I 06-222 / R och jag 09-1739 / R till HM-L.). Arbetet med CHIKV / Ren stöddes av projekt ArbOAS (ANR bidrag 2010-INTB-1601-1602).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freedom EVO platform | TECAN | Robotic platform | |
| 96-well polystyrene cell culture microplates, white | Greiner Bio One | 655083 | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7570 | Luciferase-based viability assay |
| Bright-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2610 | Reagent containing firefly luciferase substrate |
| Renilla-Glo luciferase Assay System | Promega | E2710 | Reagent containing Renilla luciferase substrate |
| Britelite plus Reporter Gene Assay System | Perkin-Elmer | 6016761 | Reagent containing firefly luciferase substrate. Can be used as an alternative to Brigh-Glo reagent to determine luciferase activity. |
References
- De Clercq, E. Antiviral drugs in current clinical use. J Clin Virol. 30, 115-133 (2004).
- Debing, Y., Jochmans, D., Neyts, J. Intervention strategies for emerging viruses: use of antivirals. Curr Opin Virol. , (2013).
- Leyssen, P., De Clercq, E., Neyts, J. Molecular strategies to inhibit the replication of RNA viruses. Antiviral Res. 78, 9-25 (2008).
- Leyssen, P., Balzarini, J., De Clercq, E., Neyts, J. The predominant mechanism by which ribavirin exerts its antiviral activity in vitro against flaviviruses and paramyxoviruses is mediated by inhibition of IMP dehydrogenase. J Virol. 79, 1943-1947 (2005).
- Wang, B. X., Fish, E. N. The yin and yang of viruses and interferons. Trends Immunol. 33, 190-197 (2012).
- Empey, K. M., Peebles, R. S., Kolls, J. K. Pharmacologic advances in the treatment and prevention of respiratory syncytial virus. Clin Infect Dis. 50, 1258-1267 (2010).
- Tan, S. L., Ganji, G., Paeper, B., Proll, S., Katze, M. G. Systems biology and the host response to viral infection. Nat Biotechnol. 25, 1383-1389 (2007).
- Prussia, A., Thepchatri, P., Snyder, J. P., Plemper, R. K. Systematic Approaches towards the Development of Host-Directed Antiviral Therapeutics. Int J Mol Sci. 12, 4027-4052 (2011).
- Connolly, D. J., O'Neill, L. A. New developments in Toll-like receptor targeted therapeutics. Curr Opin Pharmacol. , (2012).
- Thakur, C. S., et al. Small-molecule activators of RNase L with broad-spectrum antiviral activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9585-9590 (2007).
- Shoji-Kawata, S., et al. Identification of a candidate therapeutic autophagy-inducing peptide. Nature. 494, 201-206 (2013).
- Hoffman, E. S., Smith, R. E., Renaud, R. C. From the analyst's couch: TLR-targeted therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 4, 879-880 (2005).
- Bonavia, A., et al. Identification of broad-spectrum antiviral compounds and assessment of the druggability of their target for efficacy against respiratory syncytial virus (RSV). Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 6739-6744 (2011).
- Rider, T. H., et al. Broad-spectrum antiviral therapeutics. PLoS One. 6, (2011).
- Krumm, S. A., et al. Potent host-directed small-molecule inhibitors of myxovirus RNA-dependent RNA-polymerases. PLoS One. , (2011).
- Hoffmann, H. H., Kunz, A., Simon, V. A., Palese, P., Shaw, M. L. Broad-spectrum antiviral that interferes with de novo pyrimidine biosynthesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5777-5782 (2011).
- Harvey, R., et al. GSK983: a novel compound with broad-spectrum antiviral activity. Antiviral Res. 82, 1-11 (2009).
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nat Rev Drug Discov. 10, 507-519 (2011).
- Jochmans, D., Leyssen, P., Neyts, J. A novel method for high-throughput screening to quantify antiviral activity against viruses that induce limited CPE. J Virol Methods. 183, 176-179 (2012).
- Puig-Basagoiti, F., et al. High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery. Antimicrob Agents Chemother. 49, 4980-4988 (2005).
- Panchal, R. G., et al. Development of high-content imaging assays for lethal viral pathogens. J Biomol Screen. 15, 755-765 (2010).
- Pohjala, L., et al. Inhibitors of alphavirus entry and replication identified with a stable Chikungunya replicon cell line and virus-based assays. PLoS One. 6, (2011).
- Zou, G., Xu, H. Y., Qing, M., Wang, Q. Y., Shi, P. Y. Development and characterization of a stable luciferase dengue virus for high-throughput screening. Antiviral Res. 91, 11-19 (2011).
- Thorne, N., Inglese, J., Auld, D. S. Illuminating insights into firefly luciferase and other bioluminescent reporters used in chemical biology. Chem Biol. 17, 646-657 (2010).
- Komarova, A. V., et al. Proteomic analysis of virus-host interactions in an infectious context using recombinant viruses. Mol Cell Proteomics. , (2011).
- Henrik Gad, H., et al. The E2-E166K substitution restores Chikungunya virus growth in OAS3 expressing cells by acting on viral entry. Virology. 434, 27-37 (2012).
- Wang, Q. Y., et al. Inhibition of dengue virus through suppression of host pyrimidine biosynthesis. J Virol. 85, 6548-6556 (2011).
- Smee, D. F., Hurst, B. L., Day, C. W. D282, a non-nucleoside inhibitor of influenza virus infection that interferes with de novo pyrimidine biosynthesis. Antivir Chem Chemother. 22, 263-272 (2012).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).
- Qing, M., et al. Characterization of dengue virus resistance to brequinar in cell culture. Antimicrob Agents Chemother. 54, 3686-3695 (2010).
- Munier-Lehmann, H., Vidalain, P. O., Tangy, F., Janin, Y. L. On dihydroorotate dehydrogenases and their inhibitors and uses. J Med Chem. 56, 3148-3167 (2013).
- Yoon, J. J., et al. High-throughput screening-based identification of paramyxovirus inhibitors. J Biomol Screen. 13, 591-608 (2008).
- Maréchal, E., Roy, S., Lafanechère, L. Chemogenomics and Chemical Genetics: A User's Introduction for Biologists, Chemists and Informaticians. , Springer. (2011).
- Gentzsch, J., et al. Hepatitis C virus complete life cycle screen for identification of small molecules with pro- or antiviral activity. Antiviral Res. 89, 136-148 (2011).
- Caignard, G., et al. The V protein of Tioman virus is incapable of blocking type I interferon signaling in human cells. PLoS One. 8, (2013).
