Summary
这里，我们描述了一种用于飞行性能果蝇快速和准确的测量，从而实现高通量筛选。
Abstract
果蝇已经被证明是对行为的分析，一个有用的模型系统，包括飞行。在初始飞行测试涉及的滴飞入的油包覆的量筒;降落高度产生足够的推力，使其与圆筒的内壁接触之前提供通过评估多远苍蝇落入飞行性能的量度。在这里，我们描述了飞行测试仪有四个重大改进的更新版本。首先，我们增加了一个“落管”，以确保所有的苍蝇进入飞行圆柱体试验之间类似的速度，用户之间消除了变异。其次，我们与涂在缠结陷阱，旨在捕捉活虫粘合剂可拆卸的塑料片代替油涂层。第三，我们使用一个较长的气缸以使飞行能力更精确鉴别。第四，我们使用数码相机和成像软件，可以自动飞行性能得分。这些改进允许说唱ID，的飞行行为的定量评估，对于大型数据集和大规模遗传筛选有用的。
Introduction
果蝇一直被用来研究行为1的遗传基础，而且研究人员已经设计出多种方法来分析不同类型的行为2-6。苍蝇一直在提供神经肌肉疾病7的有用模型特别有用。用来研究自发行为的普遍分析是飞行性能。原飞航测试仪是用于识别飞行缺陷突变体和对飞行能力1量化考核有用的，但它有几个缺点，限制了它的高通量筛选应用：采用涂油气缸是凌乱和繁琐，某些功能如气缸和介绍的苍蝇入管具有可变的力的长度减少量化精度，以及它是很难从测试仪恢复活苍蝇。为了克服这些限制，我们修改了飞行测试，包括了一些改进。我们增加了一个“降恩被“引入果蝇消除实验和用户之间的可变性，我们使用涂有粘合剂，其允许更容易清洗和个人蝇恢复可拆卸的压克力板，我们已经增加了飞行管的长度，以提高定量精度和可靠性。最后，我们使用数码相机和成像软件计算苍蝇降落的高度，我们相信这些改进将是有益的兴趣在飞行性能缺陷进行大规模遗传筛选任何实验室。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1。组装测试飞行
- 安全飞行缸环站1用链钳。 （留约3厘米的圆柱体重量菜的下面。）
（注：飞行汽缸我们用90厘米长，直径13.5厘米）。 - 插入称量皿上一薄层矿物油的飞行筒的下方。
- 安全漏斗环站2使用环钳爪和钳。调整漏斗的高度，使得漏斗的底部是与飞行圆筒的顶部齐平。 （注：该漏斗的前端的直径必须小于放入滴管，使得小瓶不会掉下通过小瓶的外径）。
- 插入落料管进入漏斗的顶部上，并用一个卡爪夹紧。
（注：我们使用滴管即25厘米长滴飞含小瓶从这个高度可以让所有的苍蝇与受力均匀一致弹射落管的内径应为史赖。TLY比小瓶允许小瓶以自由落下的外径大。） - 切割聚丙烯片材（S）到合适的大小。 （注：为了有助于插入和移除的薄片，其宽度应比飞行筒的内周面稍小）。
- 涂抹薄薄的一层缠结陷阱的表。允许使用前坐了1小时。 （注：保留足够的空间，在表的顶部和底部（大约3公分）无涂层把握片插入/删除）。
- 将飞行气缸内的聚丙烯酰胺片。
- 用松木支架组装相机的轨道。 （注：确保轨道的底部可以支持摄像头没有挡住了镜头参见图1B。）
- 添加瓶塞和螺旋到位。 （注：发生在位置的限位器，将让相机以查看全景模式下，整个塑料片。）
2。运行试验
- <李>收集苍蝇被测试的小瓶。为了获得最佳效果，请使用不超过20苍蝇/瓶。
- 轻轻拍打苍蝇小瓶的底部，拔出，再插入滴管和释放瓶中。
（注：将小瓶落下的落料管，直到它碰到漏斗窄口当小瓶击中漏斗，苍蝇被喷入气缸的飞行。） - 提起落管，以去除空瓶。
（注：苍蝇相同的测试组的多个小瓶可以在一个单一的聚丙烯酰胺片被检测我们发现，高达200苍蝇（10瓶20苍蝇每个）可以用于测试和成像随手在一张纸上。 - 取出塑料片，将它放在一个平坦的白色表面。
（注：白色的海报板可以使用，如果台面是深色。） - 组装相机在轨道的塑料片。相机应足够高的片材具有在视场中的片材的顶部和底部之上。
- 沿滑动个摄像头E导轨抱着“捕获”按钮获取全景图像时。
- 苍蝇降落在油的数量可以手动对每个试验进行计数。
- 用于在给定的实验条件下都重复步骤2.2-2.7。苍蝇可以从每次试验之间的片材被移除。可选地，几个薄片可以被使用，以对每个试验的新表。
3。数据收集
- 使用ImageJ软件打开图像文件。
- 如果需要的话，只包括着陆表面积作物图像。 （这是涂在缠结陷阱的区域。）
- 图像转换成8位灰度。
- 创建一个“门槛”，以筛选出的白色背景。
（图像→调整→阈值）。 - 设置参数来识别每个使用“分析粒子”菜单苍蝇。
（分析→分析颗粒）定义用于识别粒子的参数。与我们建立，我们发现使用5-90像素2和0.4-1.0的圆形区域将准确地识别所有的样品。 - 采用坐标为每个粒子的生成的列表中的每个测量苍蝇的位置。的像素的x坐标可以被转换成厘米来计算降落高度。
- 表导入到电子表格（如Microsoft Excel）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
图1A示出了更新后的航班仪组件的示意图。 图1B示出的轨道设计允许相机拍摄的全景图像而不阻塞的视野。代表性的结果示于图2，其中slowpoke突变体果 蝇，它具有已知的飞行缺陷8-10的飞行性能，进行比较，野生型广-S苍蝇。控制苍蝇一贯降落靠近圆筒的顶部，与个体之间的非常小的扩散和73±2.0厘米平均降落高度。相比之下，slowpoke苍蝇显示更加多样化登陆蔓延，土地显著降低，平均44±4.1厘米所有的苍蝇都3天，在室温（23℃）升高。
s/ftp_upload/51223/51223fig1.jpg“宽度=”600px的“/>
图1。飞行测试仪，摄像头，并跟踪图。（A）插图的设置为更新后的飞行测试。环支架1成立90厘米高的飞行缸;环站2持有漏斗和10厘米长的“滴管”。摄像头（二）图和线路上使用，以产生一个全景图像。该相机应该由轨道不从镜头阻碍观点得到支持。 点击这里查看大图 。
图2。从样品的飞行试验代表性的结果。的3日龄钙飞行能力的比较广-S控制飞往slowpoke突变体（SLO TS1）。 （A）屏幕捕获的slowpoke和控制苍蝇显示个别苍蝇降落高度。每一个蓝色圆圈代表一个人飞的位置。这些降落高度被用来计算平均降落高度（B），以及对每种基因型总体分布（C）。雄性和雌性果蝇汇集在一起每个样品中。误差棒代表平均值的标准误差。 点击这里查看大图 。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
使用这里介绍的方法，我们已经能够快速评估大量的果蝇突变体的飞行性能，提供比以前更高的效率。对于我们的实验中，我们经常分开的男性和女性，并提高他们在密度低（小于20苍蝇/瓶），以限制攻击可能会破坏翅膀。另一个重要的考虑是控制适当的，由于遗传背景的差异在飞行性能上的差异。我们还发现它有助于让苍蝇至少24小时的麻醉与二氧化碳在飞行试验之前恢复。另外，苍蝇可能暴露于低温（4℃），以便更快的恢复没有可能影响行为进行麻醉。
在这个协议中的限速步骤是从试验之间的塑料片材除去苍蝇。一种方法来提高效率是使用大量Ò同时f床单，撇开，因为它们使用的床单和清洗一次全部以下数据集合。该落下至底部苍蝇将需要手工计数，因为它们将不包括在片材上。尽管如此，与手工计算落地的高度相比，这很容易。重新申请缠结陷阱给每个表需要会因涂层厚也有所不同。根据我们的经验，个人结算将持续一个月了新的镀膜之前需要。
一个附加的优点，以使用缠结陷阱以上的矿物油，是从纸张恢复活苍蝇的能力。由于苍蝇只是坚持缠结陷阱的表面，而不是变得浸泡，个别苍蝇可以很容易地删除。 “飞的”苍蝇落到底部，也可通过与空烧瓶代替矿物油托盘回收。
我们相信，这里所描述的飞行行为的自动测量提供了一个NUMBER优于先前方法的优点，允许对遗传筛选更高层次的吞吐量，重现性和准确性。自动评分也被用于提高吞吐量进行行为分析，如环法11。此外，直接测量着陆高度提供了比简单的合格/不合格测量（％传单等 ）有较大的敏感性，使我们能够检测到更细微的差别在飞行性能。
这里所描述的实验可以由测量的飞行行为更为复杂的方面，包括飞行速度12和自由飞行应对运动13视觉控制后续进一步分析加以补充。虽然这些测试是更费时的并且不适合于大规模的遗传筛选，它们可帮助提供有关在一个运动反应的特定基因的功能的详细信息。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
该作者有没有利益冲突披露。
Acknowledgments
这项工作是由美国国立卫生研究院支持的授予F32 NS078958（DTB）和R01 AG033620（BG）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Putty knife | Home Depot | 630147 | www.homedepot.com |
| Pine back band moulding (2x) | Home Depot | 156469 | www.homedepot.com |
| Furring Strip Board | Home Depot | 164704 | www.homedepot.com |
| Tangle-Trap Insect Trap Coating | BioControl Network | 268941 | www.biconet.com |
| Laptop Computer | Apple | www.apple.com/mac/ | |
| Mineral oil | Fisher Scientific | BP26291 | www.fishersci.com |
| White poster board | Staples | 247403 | www.staples.com |
| Polystyrene weighing dish | Fisher Scientific | S67091A | www.fishersci.com |
| ImageJ Software | National Institutes of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| Digital camera | Sony | DSC-TX7 | www.store.sony.com |
| Fine forceps | Fine Science Tools | www.finescience.com | |
| Polycarbonate cylinder (drop tube) | McMaster-Carr | 8585K62 | www.mcmaster.com |
| Flight cylinder (acrylic) | McMaster-Carr | 8486K943 | www.mcmaster.com |
| Polycarbonate sheets | McMaster-Carr | 85585K25 | www.mcmaster.com |
| ring stand (2x) | Fisher Scientific | S47808 | www.fishersci.com |
| Ring support | Fisher Scientific | S47791 | www.fishersci.com |
| Three-prong extension clamps (x2) | Fisher Scientific | 05-769-7Q | www.fishersci.com |
| Funnel | Fisher Scientific | 10-500-3 | www.fishersci.com |
| chain clamps (2x) | VWR | 21573-275 | www.vwr.com |
| Glass vials | VWR | 66020-198 | www.vwr.com |
References
- Benzer, S. Genetic dissection of behavior. Sci. Am. 229, 24-37 (1973).
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. J. Vis. Exp. , e2504 (2011).
- de Vries, S. E., Clandinin, T. Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. , e50192 (2013).
- Mundiyanapurath, S., Certel, S., Kravitz, E. A. Studying aggression in Drosophila (fruit flies). J. Vis. Exp. , e155 (2007).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J. Vis. Exp. , e3795 (2012).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. J. Vis. Exp. , e193 (2007).
- Lloyd, T. E., Taylor, J. P. Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1184, e1-e20 (2010).
- Atkinson, N. S., et al. Molecular separation of two behavioral phenotypes by a mutation affecting the promoters of a Ca-activated K channel. J. Neurosci. 20, 2988-2993 (2000).
- Atkinson, N. S., Robertson, G. A., Ganetzky, B. A component of calcium-activated potassium channels encoded by the Drosophila slo locus. Science. 253, 551-555 (1991).
- Elkins, T., Ganetzky, B., Wu, C. F. A Drosophila mutation that eliminates a calcium-dependent potassium current. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 8415-8419 (1986).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp. Gerontol. 40, 386-395 (2005).
- Fry, S. N., Rohrseitz, N., Straw, A. D., Dickinson, M. H. Visual control of flight speed in Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 212, 1120-1130 (2009).
- Mronz, M., Lehmann, F. O. The free-flight response of Drosophila to motion of the visual environment. J. Exp. Biol. 211, 2026-2045 (2008).
