Summary
Nous décrivons ici une méthode de mesure rapide et précise des performances de vol chez la drosophile, permettant le criblage à haut débit.
Abstract
Drosophila s'est avéré être un système de modèle utile pour l'analyse du comportement, y compris le vol. Le testeur de vol chute impliqué initiale vole dans une huile revêtu graduée; hauteur d'atterrissage a permis de mesurer les performances de vol en évaluant comment les mouches loin tomberont avant de produire une poussée suffisante pour prendre contact avec la paroi du cylindre. Nous décrivons ici une version mise à jour de l'appareil de contrôle de vol avec quatre améliorations majeures. Tout d'abord, nous avons ajouté un "tube de descente" de veiller à ce que toutes les mouches entrent dans le cylindre de vol à une vitesse similaire entre les essais, ce qui élimine la variabilité entre les utilisateurs. Deuxièmement, nous avons remplacé le revêtement de l'huile de feuilles de plastique amovibles revêtus de Tangle-Trap, un adhésif conçu pour capturer des insectes vivants. Troisièmement, nous utilisons un cylindre plus de permettre la discrimination plus précise de la capacité de vol. Quatrième nous utilisons un appareil photo numérique et des logiciels d'imagerie pour automatiser la notation des performances de vol. Ces améliorations permettent de rapIdentifiant, l'évaluation quantitative du comportement de vol, utile pour les grands ensembles de données et les écrans génétiques à grande échelle.
Introduction
Drosophila a longtemps été utilisée pour étudier la base génétique du comportement 1, et les chercheurs ont mis au point un certain nombre de façons d'analyser différents types de comportements 2-6. Les mouches ont été particulièrement utiles pour fournir des modèles utiles de troubles neuromusculaires 7. Un test couramment utilisé pour étudier le comportement locomoteur des performances de vol. Le testeur de vol initial est utile pour identifier les ponts mutants défectueux et pour l'évaluation quantitative de la capacité de vol 1, mais il a plusieurs inconvénients qui limitent son application pour les écrans à haut débit: l'utilisation de bouteilles enduites d'huile est salissant et fastidieux, certaines fonctionnalités telles que la longueur du cylindre et l'introduction des mouches dans le tube avec une force variable de réduire la précision quantitative, et il est difficile de récupérer vol direct à partir de l'appareil d'essai. Pour surmonter ces limitations, nous avons modifié le testeur de vol pour inclure un certain nombre d'améliorations. Nous avons ajouté un "drop tuêtre "d'introduire mouches pour éliminer la variabilité entre les expériences et les utilisateurs. Nous utilisons des feuilles d'acrylique amovibles recouvertes d'un adhésif qui permet de faciliter le nettoyage et la récupération de vol individuels. Nous avons augmenté la longueur du tube de vol d'améliorer la précision quantitative et de fiabilité. Enfin , nous utilisons un appareil photo numérique et des logiciels d'imagerie pour calculer les hauteurs d'atterrissage de vol. Nous croyons que ces améliorations seront utiles à tous les laboratoires intéressés à mener des écrans génétiques à grande échelle pour les défauts de performances de vol.
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Protocol
Une. Assembler Vol testeur
- Vol sécurisé cylindre Ring Stand 1 aide de colliers de chaîne. (Laissez environ 3 cm en dessous du cylindre pour peser plat.)
(Note: Le cylindre de vol, nous utilisons est de 90 cm de long avec un diamètre de 13,5 cm.) - Insérez peser plat avec une fine couche d'huile minérale sous le cylindre de vol.
- Entonnoir sécurisé Ring Support 2 en utilisant un collier de serrage et griffe pince. Ajuster la hauteur de l'entonnoir de sorte que le fond de l'entonnoir est de niveau avec la partie supérieure du cylindre de vol. (Note: le diamètre de l'entonnoir d'extrémité doit être inférieur au diamètre externe de flacons placés dans les tubes de descente de façon que les flacons ne tombent pas à travers.)
- Insérer le tube de chute dans la partie supérieure de l'entonnoir et le fixer à l'aide d'une pince à griffes.
(Note: Nous utilisons un tube de descente qui est de 25 cm de long goutte volent contenant des flacons de cette hauteur permet éjection cohérente de toutes les mouches avec force uniforme Le diamètre intérieur du tube de chute devrait être sligh..TLY plus grand que le diamètre extérieur de la cuvette pour permettre à la fiole de tomber librement.) - Couper feuille (s) de polyacrylamide à la bonne taille. (Remarque: Pour aider à l'insertion et le retrait de la feuille, dont la largeur doit être légèrement plus petite que la circonférence intérieure du cylindre de vol).
- Appliquez une fine couche de Tangle-Trap à la feuille. Laisser reposer pendant 1 heure avant de l'utiliser. (Remarque: Laissez suffisamment d'espace en haut et en bas de la feuille (environ 3 cm) non couché à saisir la feuille pour l'insertion / retrait.)
- Insérer la feuille de polyacrylamide dans le cylindre de vol.
- Assembler les rails de la caméra avec supports de pin. (Remarque: veiller à ce que le bas de la piste peut soutenir la caméra sans blocage de la lentille Reportez-vous à la figure 1B..)
- Ajouter bouchons et visser en place. (Remarque: place les bouchons dans des endroits qui permettront à l'appareil photo pour voir la feuille de plastique toute en mode panoramique.)
2. Exécutez l'expérience
- <li> Récupérer flacons de mouches à tester. Pour de meilleurs résultats, ne pas utiliser plus de 20 mouches / flacon.
- Tapoter doucement vol à bas de flacon, débrancher, puis insérez dans le tube de chute et libérer flacon.
(Note: Le flacon tombe vers le bas du tube de descente jusqu'à ce qu'il frappe l'ouverture étroite de l'entonnoir Lorsque le flacon frappe l'entonnoir, les mouches sont éjectées dans le cylindre de vol.). - Soulevez le tube de descente pour enlever le flacon vide.
(Remarque: les flacons multiples de mouches du même groupe de test peuvent être analysés sur une feuille de polyacrylamide unique Nous constatons que jusqu'à 200 mouches (10 flacons de 20 mouches chacun) peuvent être testées et imagées facilement sur une seule feuille.. - Retirer la feuille de plastique et placez-le sur une surface plate et blanche.
(Remarque: carton blanc peut être utilisé si les paillasses sont de couleur foncée.) - Assembler les rails de la caméra sur la feuille de plastique. La caméra doit être suffisamment élevée au-dessus de la feuille pour avoir à la fois le haut et le bas de la feuille dans le champ de vision.
- Faites glisser la caméra le long ee piste tout en maintenant la touche "capture" d'acquérir une image panoramique.
- Le nombre de mouches atterrissent dans l'huile peut être compté manuellement pour chaque essai.
- Répétez les étapes 02.02 à 02.07 pour toutes les conditions d'une expérience donnée. Les mouches peuvent être retirées de la feuille entre chaque essai. Sinon, plusieurs feuilles peuvent être utilisées, avec une nouvelle feuille pour chaque essai.
3. Collecte de données
- Ouvrez des fichiers image en utilisant le logiciel ImageJ.
- les images des cultures, si nécessaire d'inclure uniquement la surface d'atterrissage. (Il s'agit de la zone revêtue dans Tangle-Trap.)
- Convertir des images en 8 bits en niveaux de gris.
- Créer un «seuil» pour filtrer le fond blanc.
(Image → Ajuster → Seuil). - Définissez les paramètres pour identifier chaque volée en utilisant le menu "analyser des particules".
(Analyser → analyser des particules) Définir les paramètres utilisés pour identifier une particule. Avec notre mis en place, nous constatons que l'aide d'unzone de 5-90 pixels 2 et une circularité de 0,4-1,0 permettra d'identifier avec précision tous les échantillons. - Mesurer l'emplacement de chaque volée en utilisant la liste générée de coordonnées pour chaque particule. Les coordonnées x en pixels peuvent être converties en centimètres pour calculer la hauteur d'atterrissage.
- Importer la table dans un tableur (comme Microsoft Excel).
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Representative Results
La figure 1A montre un schéma de l'ensemble de testeur de vol mis à jour. Figure 1B illustre la conception de la voie permettre à l'appareil de prendre une image panoramique sans bloquer le champ de vision. Les résultats représentatifs sont présentés dans la figure 2, où les performances de vol de mouches mutantes slowpoke, qui ont un vol défaut 8-10 connu, sont comparées au type sauvage Canton-S vole. Contrôle vole toujours atterrir près du sommet du cylindre, avec très peu d'écart entre les individus et une hauteur d'atterrissage moyenne de 73 ± 2,0 cm. En revanche, les mouches slowpoke affichent un écart beaucoup plus varié d'atterrissage, et des terres nettement plus faible, avec une moyenne de 44 ± 4,1 cm. Toutes les mouches étaient âgés de 3 jours, élevés à la température ambiante (23 ° C).
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Figure 1. Diagrammes de vol Tester, Appareil photo, et des pistes. (A) Illustration de la mise en place de l'appareil de contrôle de vol mis à jour. Anneau Stand 1 détient le cylindre de vol de 90 cm de haut; Anneau stand 2 cales de l'entonnoir et le "tube de descente" de long cm-10. (B) Schéma de l'appareil photo et la piste utilisée pour produire une image panoramique. L'appareil doit être pris en charge par la piste sans obstruer la vue de l'objectif. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 2. Les résultats représentatifs d'une expérience de vol de l'échantillon de comparaison. Des capacités de vol de vieux de 3 jours Cacontrôle nton-S vole à slowpoke mutants (slo TS1). (A) des captures d'écran pour les mouches slowpoke et de contrôle affichant les hauteurs d'atterrissage de vol individuels. Chaque cercle bleu représente l'emplacement d'une mouche individu. Ces hauteurs d'atterrissage sont utilisés pour calculer la hauteur moyenne d'atterrissage (B) ainsi que la distribution globale (C) pour chaque génotype. Les mâles et femelles ont été regroupées dans chaque échantillon. Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne. Cliquez ici pour agrandir l'image .
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Discussion
En utilisant les méthodes décrites ici, nous avons été en mesure d'évaluer rapidement les performances de vol d'un grand nombre de mutants de drosophile, offrant une plus grande efficacité qu'auparavant. Pour nos expériences, nous nous séparons systématiquement hommes et les femmes et les élever à faible densité (moins de 20 mouches / flacon) pour limiter l'agression qui pourrait endommager les ailes. Une autre considération importante est de bien contrôler les différences de performances de vol en raison de différences de fond génétique. Nous constatons aussi qu'il contribue à permettre à vol d'un minimum de 24 heures pour se remettre de l'anesthésie avec du dioxyde de carbone avant les essais en vol. Alternativement, les mouches peuvent être anesthésiés par l'exposition au froid (4 ° C) pour permettre une récupération plus rapide sans risquer influence du comportement.
L'étape de limitation de vitesse dans ce protocole est de supprimer les mouches de la feuille de plastique entre les essais. Un procédé pour augmenter l'efficacité est d'utiliser un grand nombre of feuilles simultanément, annulant les feuilles comme ils sont utilisés et tous de nettoyage à la fois après la collecte de données. Mouches qui tombent au fond devront être comptés manuellement, car ils ne seront pas inscrits sur la feuille. Pourtant, c'est facile comparé à calculer manuellement la hauteur de l'atterrissage. La nécessité de présenter une nouvelle demande Tangle-Trap pour chaque feuille peut varier en fonction de l'épaisseur du revêtement est. Dans notre expérience, une feuille individuelle durera un mois avant un nouveau revêtement est nécessaire.
Un avantage supplémentaire à l'aide de Tangle-Trap sur l'huile minérale est la capacité de récupérer mouches vivantes de la feuille. Depuis les mouches collent tout simplement à la surface de Tangle-Trap plutôt que de devenir immergé, vol individuels peuvent être facilement enlevés. vol "de voler" qui tombent au fond peuvent également être récupérés par le remplacement du bac d'huile minérale avec un flacon vide.
Nous croyons que la mesure automatisée de comportement en vol décrit ici fournit un certainnombre d'avantages par rapport aux procédés antérieurs, ce qui permet un niveau de débit, de la reproductibilité, et une plus grande précision pour les cribles génétiques. Notation automatique a également été utilisé pour augmenter le débit de tests comportementaux tels que le test de RING 11. En outre, la mesure directe de la hauteur d'atterrissage fournit une plus grande sensibilité que la simple mesure (% de tracts, etc.) De réussite / échec, nous permettant de détecter des différences plus subtiles dans les performances de vol.
L'essai décrit ici peut être complétée par d'autres analyses ultérieures qui mesurent les aspects les plus complexes de comportement en vol, y compris le contrôle visuel de la vitesse de vol de 12 et de vol libre réponses au mouvement 13. Bien que ces tests sont plus de temps à forte intensité et ne se prêtent pas à des écrans génétiques à grande échelle, ils peuvent aider à fournir plus d'informations sur la fonction d'un gène particulier dans une réponse locomotrice.
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Disclosures
Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêt à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la santé accorde F32 NS078958 (DTB) et R01 AG033620 (BG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Putty knife | Home Depot | 630147 | www.homedepot.com |
| Pine back band moulding (2x) | Home Depot | 156469 | www.homedepot.com |
| Furring Strip Board | Home Depot | 164704 | www.homedepot.com |
| Tangle-Trap Insect Trap Coating | BioControl Network | 268941 | www.biconet.com |
| Laptop Computer | Apple | www.apple.com/mac/ | |
| Mineral oil | Fisher Scientific | BP26291 | www.fishersci.com |
| White poster board | Staples | 247403 | www.staples.com |
| Polystyrene weighing dish | Fisher Scientific | S67091A | www.fishersci.com |
| ImageJ Software | National Institutes of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| Digital camera | Sony | DSC-TX7 | www.store.sony.com |
| Fine forceps | Fine Science Tools | www.finescience.com | |
| Polycarbonate cylinder (drop tube) | McMaster-Carr | 8585K62 | www.mcmaster.com |
| Flight cylinder (acrylic) | McMaster-Carr | 8486K943 | www.mcmaster.com |
| Polycarbonate sheets | McMaster-Carr | 85585K25 | www.mcmaster.com |
| ring stand (2x) | Fisher Scientific | S47808 | www.fishersci.com |
| Ring support | Fisher Scientific | S47791 | www.fishersci.com |
| Three-prong extension clamps (x2) | Fisher Scientific | 05-769-7Q | www.fishersci.com |
| Funnel | Fisher Scientific | 10-500-3 | www.fishersci.com |
| chain clamps (2x) | VWR | 21573-275 | www.vwr.com |
| Glass vials | VWR | 66020-198 | www.vwr.com |
References
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