Summary
כאן אנו מתארים שיטה למדידה מהירה ומדויקת של ביצועי טיסה בדרוזופילה, המאפשרים תפוקה גבוהה הקרנה.
Abstract
דרוזופילה הוכיחה להיות מערכת שימושית מודל לניתוח של התנהגות, כוללים טיסה. ההטלה מעורבת בוחן טיסה הראשונית של זבובים לתוך מצופה נפט סיים גליל; גובה נחיתה סיפק מדד של ביצועי טיסה על ידי הערכה איך זבובים רחוקים ייפלו לפני מייצר מספיק דחף ליצור קשר עם הקיר של הגליל. כאן אנו מתארים גרסה מעודכנת של בוחן הטיסה עם ארבעה שיפורים משמעותיים. ראשית, הוספנו "צינור ירידה" כדי להבטיח שכל הזבובים נכנסים לצילינדר הטיסה במהירות דומה בין ניסויים, ביטול השוני בין המשתמשים. שנית, אנו החלפנו את ציפוי שמן ביריעות פלסטיק נשלפים מצופות בסבך-מלכודת, דבק נועד ללכוד חרקים חיים. שלישית, אנו משתמשים בצילינדר יותר כדי לאפשר אפליה מדויקת יותר של יכולת טיסה. הרביעית אנחנו משתמשים במצלמה דיגיטלית ותוכנת הדמיה כדי להפוך את הניקוד של ביצועי טיסה. שיפורים אלה מאפשרים לראפid, הערכה כמותית של טיסה התנהגות, שימושית עבור מערכי נתונים גדולים והמסכים גנטיים בקנה מידה גדולה.
Introduction
דרוזופילה משמשת כבר זמן רב כדי ללמוד את הבסיס הגנטי של התנהגות 1, וחוקרים פיתחו מספר דרכים לנתח סוגים שונים של התנהגות 2-6. זבובים היו שימושיים במיוחד במתן מודלים שימושיים של הפרעות התוקפת 7. Assay נפוץ המשמש ללמוד התנהגות של תנועה הוא ביצועי טיסה. בוחן הטיסה המקורי הוא שימושי לזיהוי מוטציות פגומות טיסה ולהערכה כמותית של יכולת הטיסה 1, אבל יש לו כמה חסרונות המגבילים את היישום שלה למסכי תפוקה גבוהה: השימוש בצילינדרים מצופה שמן הוא מבולגן ומסורבל, תכונות מסוימות, כגון האורך של הגליל והכנסה של זבובים לתוך הצינור בעוצמה משתנה להפחית דיוק הכמותי; וקשה להתאושש זבובים חיים מהבוחן. כדי להתגבר על המגבלות האלה, יש לנו שונה בוחן הטיסה לכולל מספר השיפורים. הוספנו "טיפת tuלהיות "להציג את הזבובים לחסל את השונות בין ניסויים ומשתמשים. אנו משתמשים בגיליונות אקריליק נשלפים מצופים בדבק המאפשר ניקוי ושחזור של זבובים בודדים קלים יותר. הגדלנו את אורכו של צינור הטיסה כדי לשפר את הדיוק ואמינות כמותית. לבסוף , אנו משתמשים במצלמה דיגיטלית ותוכנת הדמיה כדי לחשב את הגבהים הנחיתה של זבובים. אנו מאמינים שיפורים אלו יהיו שימושיים לכל מעבדה מעוניינת לנהל מסכי גנטיים בקנה מידה גדולה לליקויים בביצועי טיסה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. להרכיב טיסת Tester
- גליל טיסה מאובטח לטבעת Stand 1 באמצעות מלחציים שרשרת. (יש להשאיר סנטימטר כ 3 מתחת לגליל למשקל מנה.)
(הערה: גליל הטיסה אנו משתמשים הוא ארוך 90 סנטימטר בקוטר של 13.5 סנטימטר.) - הכנס שוקל צלחת בשכבה דקה של שמן מינרלים מתחת לצילינדר הטיסה.
- משפך מאובטח לטבעת Stand 2 באמצעות מהדק טבעת ומהדק טופר. התאם את הגובה של המשפך, כך שהחלק התחתון של המשפך הוא מיושר עם החלק העליון של גליל הטיסה. (הערה: קוטר הקצה של המשפך חייב להיות פחות מ הקוטר החיצוני של בקבוקונים להציב לתוך צינורות הירידה, כך שהמבחנות לא ייפלו דרכו.)
- הכנס צינור טיפה לתוך החלק העליון של המשפך ומאובטח באמצעות מהדק טופר.
(הערה: אנו משתמשים בצינור ירידה שהוא ארוך 25 סנטימטר השמטת בקבוקונים מהגובה הזה מאפשר פליטה של כל הזבובים בכוח אחיד עקבית המכיל לטוס הקוטר הפנימי של צינור הירידה צריך להיות sligh..tly גדול יותר מהקוטר החיצוני של הבקבוקון על מנת לאפשר לבקבוקון לרדת באופן חופשי). - חותכים גיליון polyacrylamide (ים) לגודל המתאים. (הערה: כדי לסייע בהחדרת והוצאת הגיליון, הרוחב צריך להיות מעט קטן יותר מההיקף הפנימי של גליל הטיסה).
- למרוח שכבה דקה של סבך-מלכודת לגיליון. אפשר לשבת במשך שעה 1 לפני השימוש. (הערה: יש להשאיר מספיק מקום בחלק העליון והתחתון של הגיליון (כ 3 ס"מ) ללא ציפוי לתפוס את הגיליון להכנסה / הוצאה).
- הכנס את גיליון polyacrylamide בצילינדר הטיסה.
- להרכיב את מסלול המצלמה באמצעות סוגריים תמיכת אורן. (הערה: לוודא שהחלק התחתון של המסלול יכול לתמוך את המצלמה מבלי לחסום את העדשה עיין באיור 1 ב.).
- הוספת פקקים ובורג למקומו. (הערה: מקום פקקים במקומות שיאפשר את המצלמה כדי להציג את הגיליון כולו פלסטיק במצב פנורמי.)
2. הפעל ניסוי
- <li> איסוף בקבוקונים של זבובים להיבדק. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, השתמש לא יותר מ 20 זבובים / בקבוקון.
- לטפוח בעדינות זבובים לתחתית בקבוקון, ניתק, ולאחר מכן להכניס לתוך צינור ירידה ולשחרר את הבקבוקון.
(הערה: הבקבוקון נופל במורד צינור הטיפה עד שהוא מגיע לפתיחת המשפך הצרה כאשר הבקבוקון פוגע במשפך, הזבובים הם נפלטו לתוך צילינדר הטיסה..) - הרם את שפופרת הטיפה כדי להסיר את הבקבוקון הריק.
(הערה: בקבוקונים מרובים של זבובים מאותה קבוצת הבדיקה ניתן assayed על גיליון polyacrylamide אחת אנו מוצאים כי עד 200 זבובים (10 בקבוקונים של 20 זבובים כל אחד), ניתן לבדוק וצלמו בקלות על גיליון אחד.. - הסר את יריעת הפלסטיק ומניח אותו על משטח לבן שטוח.
(הערה: לוח הפוסטר לבן עשוי לשמש אם צמרות ספסל הן בצבע כהות.) - להרכיב את מסלול המצלמה מעל יריעת הפלסטיק. המצלמה צריכה להיות גבוהה מספיק מעל לסדין כדי לקבל את שניהם העליונים ותחתון של הגיליון בשדה הראייה.
- חלק את המצלמה יחד המסלול דואר תוך כדי לחיצה על הכפתור "ללכוד" לרכוש תמונה פנורמית.
- מספר הזבובים שנחתו בנפט עשוי ייספר באופן ידני עבור כל ניסוי.
- חזור על השלבים 2.2-2.7 לכל התנאים בניסוי נתון. הזבובים ניתן להסיר מגיליון בין כל ניסוי. לחלופין, ניתן להשתמש בכמה גיליונות, עם גיליון חדש עבור כל משפט.
3. איסוף נתונים
- קבצי תמונה להרחיב באמצעות תוכנת ImageJ.
- חיתוך תמונות במידת צורך כדי לכלול רק את פני שטח הנחיתה. (זהו האזור שמצופה בסבך-מלכודת.)
- המרת תמונות לגוונים אפור 8 סיביות.
- יצירה "סף" לסנן את הרקע הלבן.
(תמונה → התאם סף →). - הגדר את הפרמטרים לזיהוי כל זבוב באמצעות התפריט "לנתח חלקיקים".
(לנתח → לנתח חלקיקים) הגדר את הפרמטרים המשמשים לזיהוי חלקיקים. עם שלנו להגדיר, אנו מוצאים כי באמצעותאזור של 5-90 פיקסלים 2 ומעגלי של 0.4-1.0 במדויק יהיה לזהות את כל הדגימות. - למדוד את מיקומו של כל זבוב באמצעות הרשימה שנוצרה של קואורדינטות עבור כל חלקיק. קואורדינטת x בפיקסלים ניתן להמיר סנטימטרים כדי לחשב את גובה הנחיתה.
- לייבא טבלה לגיליון אלקטרוני (כגון Microsoft Excel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 א מציג סכמטי של ההרכבה בוחן טיסה המעודכנת. איור 1 מדגים את עיצוב המסלול לאפשר את המצלמה לצילום תמונה פנורמית ללא חסימת שדה הראייה. נציג תוצאות מוצגות באיור 2, שבו ביצועי הטיסה של זבובים מוטנטים זחילה, שיש לי טיסה ידועה פגם 8-10, הם בהשוואה לפרא מהסוג קנטון-S זבובים. בקרת זבובים נוחתים בעקביות בחלק העליון של הגליל, עם התפשטות מעט מאוד בקרב אנשים וגובה נחיתה ממוצע של 73 ± 2.0 סנטימטר. לעומת זאת, זבובי זחילה להציג הרבה יותר מגוון נחיתה התפשטו, וקרקע נמוכה באופן משמעותי, עם ממוצע של 44 ± 4.1 סנטימטר. כל הזבובים היו בן 3 ימים, העלו בטמפרטורת חדר (23 מעלות צלזיוס).
"Width =" s/ftp_upload/51223/51223fig1.jpg "/> 600px
איור 1. דיאגרמות של הטיסה Tester, מצלמה, ומסלול איור. (א) שלהוקם לבוחן הטיסה המעודכן. טבעת Stand 1 מחזיק 90 סנטימטר גבוה צילינדר טיסה; טבעת Stand 2 מחזיק משפך ו" צינור הירידה "10 ס"מ הארוך. (ב) תרשים של מצלמה ומסלול המשמש לייצור תמונה פנורמית. המצלמה צריכה להיות נתמכת על ידי המסלול ללא הפרעה את הנוף מהעדשה. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 2. נציג תוצאות מניסוי טיסה מדגם. השוואה של יכולת טיסה של Ca 3 בן יומושליטת nton-S טסה לזחילת מוטציות (TS1 slo). () מסך לוכד זבובים לזחילה ושליטה בו מוצגות הגבהים הנחיתה של זבובים בודדים. כל עיגול הכחול מייצג את מיקומו של זבוב בודד. גבהים נחיתה אלה משמשים לחישוב הגובה הממוצע נחיתה (ב '), כמו גם הפצה כוללת (C) עבור כל גנוטיפ. זבובי זכרים ונקבה היו נקווים יחד במדגם זה. ברים שגיאה מייצגים את שגיאת התקן של הממוצע. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שימוש בשיטות שתוארו כאן, היינו מסוגל להעריך במהירות את ביצועי טיסה של מספר רב של מוטציות דרוזופילה, מתן יעילות רבה יותר מאשר בעבר. בניסויים שלנו, אנו נפרדים באופן שגרתי זכרים ונקבות ולגדל אותם בצפיפות נמוכה (פחות מ 20 זבובים / בקבוקון) כדי להגביל את התוקפנות שעלולה לפגוע בכנפיים. שיקול חשוב נוסף הוא לשלוט כראוי להבדלים בביצועי טיסה תוצאה מהבדלים ברקע גנטי. אנו מוצאים גם זה עוזר כדי לאפשר זבובי מינימום של 24 שעות להתאושש מהרדמה עם פחמן דו חמצני לפני בדיקת טיסה. לחלופין, זבובים יכולים להיות מורדמים על ידי חשיפה לטמפרטורה קרה (4 ° C), כדי לאפשר התאוששות מהירה יותר מבלי שעלול להשפיע על התנהגות.
צעד שער הגבלה בפרוטוקול זה הוא להסיר את הזבובים מיריעת הפלסטיק בין ניסויים. שיטה אחת כדי להגביר את היעילות היא להשתמש o מספר גדולגיליונות ו בו זמנית, המבטלים את הגיליונות כפי שהם נמצאים בשימוש וניקוי כולם בבת אחת הבאה איסוף הנתונים. זבובים שנופלים לתחתית יצטרכו ייספרו באופן ידני, כפי שהם לא ייכללו בגיליון. ובכל זאת, זה קל בהשוואה לחישוב גובה נחיתה באופן ידני. הצורך להחיל מחדש סבך-מלכודת לכל גיליון ישתנה בהתאם לכמה עבה הציפוי. מניסיוננו, גיליון בודד יימשך חודש לפני שדרוש ציפוי חדש.
יתרון נוסף לשימוש בסבך-מלכודת מעל שמן מינרלים הוא היכולת לשחזר זבובים חיים מגיליון. מאז הזבובים פשוט להיצמד אל פני השטח של סבך-מלכודת ולא הופך שקוע, זבובים בודדים ניתן להסיר בקלות. זבובים "לעוף" שנופלים לתחתית גם ניתן לשחזר על ידי החלפת מגש שמן מינרלים עם בקבוק ריק.
אנו מאמינים המדידה האוטומטית של טיסה שתוארה כאן התנהגות מספקת numבער של יתרונות על פני שיטות קודמות, המאפשר רמה גבוהה יותר של תפוקה, שחזור, ודיוק למסכים גנטיים. ניקוד אוטומטי שימש גם כדי להגדיל את התפוקה למבחני התנהגות כגון assay RING 11. יתר על כן, המדידה הישירה של גובה נחיתה מספקת רגישות רבה יותר מאשר מדידה עוברת / נכשל פשוטה (פליירים%, וכו '.), ומאפשר לנו לזהות את ההבדלים דקים יותר בביצועי טיסה.
Assay המתואר כאן יכול להיות כהשלמה מבחני נוספים לאחר שמתייחסים להיבטים מורכבים יותר של טיסה התנהגות, כוללים בקרה חזותית של מהירות טיסה 12 ותגובות חופשית טיסה לתנועה 13. למרות שהבדיקות אלה הן יותר עתיר זמן, ולא נוח למסכים גנטיים בקנה מידה גדולה, הם עשויים לעזור לספק מידע נוסף בנוגע לתפקודו של גן מסוים בתגובה של תנועה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות מעניק F32 NS078958 (DTB) וR01 AG033620 (BG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Putty knife | Home Depot | 630147 | www.homedepot.com |
| Pine back band moulding (2x) | Home Depot | 156469 | www.homedepot.com |
| Furring Strip Board | Home Depot | 164704 | www.homedepot.com |
| Tangle-Trap Insect Trap Coating | BioControl Network | 268941 | www.biconet.com |
| Laptop Computer | Apple | www.apple.com/mac/ | |
| Mineral oil | Fisher Scientific | BP26291 | www.fishersci.com |
| White poster board | Staples | 247403 | www.staples.com |
| Polystyrene weighing dish | Fisher Scientific | S67091A | www.fishersci.com |
| ImageJ Software | National Institutes of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| Digital camera | Sony | DSC-TX7 | www.store.sony.com |
| Fine forceps | Fine Science Tools | www.finescience.com | |
| Polycarbonate cylinder (drop tube) | McMaster-Carr | 8585K62 | www.mcmaster.com |
| Flight cylinder (acrylic) | McMaster-Carr | 8486K943 | www.mcmaster.com |
| Polycarbonate sheets | McMaster-Carr | 85585K25 | www.mcmaster.com |
| ring stand (2x) | Fisher Scientific | S47808 | www.fishersci.com |
| Ring support | Fisher Scientific | S47791 | www.fishersci.com |
| Three-prong extension clamps (x2) | Fisher Scientific | 05-769-7Q | www.fishersci.com |
| Funnel | Fisher Scientific | 10-500-3 | www.fishersci.com |
| chain clamps (2x) | VWR | 21573-275 | www.vwr.com |
| Glass vials | VWR | 66020-198 | www.vwr.com |
References
- Benzer, S. Genetic dissection of behavior. Sci. Am. 229, 24-37 (1973).
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. J. Vis. Exp. , e2504 (2011).
- de Vries, S. E., Clandinin, T. Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. , e50192 (2013).
- Mundiyanapurath, S., Certel, S., Kravitz, E. A. Studying aggression in Drosophila (fruit flies). J. Vis. Exp. , e155 (2007).
- Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J. Vis. Exp. , e3795 (2012).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. J. Vis. Exp. , e193 (2007).
- Lloyd, T. E., Taylor, J. P. Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1184, e1-e20 (2010).
- Atkinson, N. S., et al. Molecular separation of two behavioral phenotypes by a mutation affecting the promoters of a Ca-activated K channel. J. Neurosci. 20, 2988-2993 (2000).
- Atkinson, N. S., Robertson, G. A., Ganetzky, B. A component of calcium-activated potassium channels encoded by the Drosophila slo locus. Science. 253, 551-555 (1991).
- Elkins, T., Ganetzky, B., Wu, C. F. A Drosophila mutation that eliminates a calcium-dependent potassium current. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 8415-8419 (1986).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp. Gerontol. 40, 386-395 (2005).
- Fry, S. N., Rohrseitz, N., Straw, A. D., Dickinson, M. H. Visual control of flight speed in Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 212, 1120-1130 (2009).
- Mronz, M., Lehmann, F. O. The free-flight response of Drosophila to motion of the visual environment. J. Exp. Biol. 211, 2026-2045 (2008).
